CN108593742B - 一种定量检测黄曲霉毒素b1的电化学适配体传感器及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种定量检测黄曲霉毒素B1的电化学适配体传感器及其应用，涉及纳米生物传感器以及电化学检测领域。该电化学适配体传感器为三电极体系传感器，工作电极是在金片电极表面依次修饰MoS₂和纳米金的复合膜、DNA四面体和黄曲霉毒素B1适配体后得到的；所述DNA四面体携带与黄曲霉毒素B1适配体部分互补的序列。采用本发明电化学适配体传感器对黄曲霉毒素B1进行定量检测，具有操作简单、准确性高、检测范围广、灵敏度高、特异性强、稳定性高、重现性好等优点。

Description

一种定量检测黄曲霉毒素B1的电化学适配体传感器及其应用

技术领域

本发明涉及纳米生物传感器以及电化学检测领域，具体涉及一种定量检测黄曲霉毒素B1的电化学适配体传感器及其应用。

背景技术

真菌毒素是有毒真菌产生的次级代谢产物，极容易污染农作物产品。如果人们吃了被真菌毒素污染的食品，将对他们的身体造成严重的伤害甚至导致死亡。在一系列的真菌毒素中，黄曲霉毒素B1在食品中最频繁的被检测到，同时它的毒性也是最强的，这是由于它具有很强的与DNA和蛋白质的结合能力，可以破坏细胞。在致癌物里，黄曲霉毒素B1被国际癌症研究机构认定为一类致癌物。

近年来，研究人员开发了色谱和免疫技术来检测黄曲霉毒素B1，其中包括高效液相色谱法、液相色谱与质谱联用法、酶联免疫吸附测定法、免疫传感法和比色免疫法。尽管这些方法具有较好的灵敏度，但是还存在一些不足之处，如对设备要求高费用大，对操作人员要求具备一定的知识背景和培训，对于小分子检测所需的抗体制备较为困难。在过去的十年里，研究人员开发了电化学适配体传感器用于检测黄曲霉毒素B1。与其它方法相比，电化学适配体方法展现出了优越的性能，如样品制备简单，所需设备费用不高，所需检测时间较短，但是现有电化学适配体传感器定量检测黄曲霉毒素B1的灵敏度和稳定性较低。

发明内容

本发明的目的是提供一种定量检测黄曲霉毒素B1的电化学适配体传感器及其应用，该电化学适配体传感器对黄曲霉毒素B1进行定量检测，具有操作简单、准确性高、检测范围广、灵敏度高、特异性强、稳定性高、重现性好等优点。

本发明的目的采用如下技术方案实现。

一种定量检测黄曲霉毒素B1的电化学适配体传感器，该电化学适配体传感器为三电极体系传感器，工作电极是在金片电极表面依次修饰MoS₂和纳米金的复合膜、DNA四面体和黄曲霉毒素B1适配体后得到的；所述DNA四面体携带与黄曲霉毒素B1适配体部分互补的序列。

在本发明中，采用如下方法在金片电极表面修饰MoS₂和纳米金的复合膜：

(1)在金片电极表面形成三维SiO₂纳米球阵列；

(2)在所述三维SiO₂纳米球阵列的间隙中沉积MoS₂和纳米金的复合膜；

(3)溶解所述三维SiO₂纳米球阵列。

在本发明中，步骤(2)中通过电沉积方法在所述三维SiO₂纳米球阵列的间隙中沉积MoS₂和纳米金的复合膜。

在本发明中，所述电沉积方法中的电解液是含有HAuCl₄·4H₂O和(NH₄)₂MoS₄的KCl溶液。其中HAuCl₄·4H₂O浓度为0.1-0.5mM，(NH₄)₂MoS₄浓度为1-8mM，KCl溶液浓度为0.05-0.5M；优选的，HAuCl₄·4H₂O浓度为0.2mM，(NH₄)₂MoS₄浓度为5mM，KCl溶液浓度为0.1M。进一步的，电沉积方法为恒电位法，其中电位为-1.5-0V，沉积电量为2.58-25.8mC；更进一步的，电位为-1V，沉积电量为18.7mC。

在本发明中，步骤(1)中在金片电极表面形成三维SiO₂纳米球阵列的方法如下：将金片电极插入SiO₂分散液中，溶剂蒸发后，在电极表面形成三维SiO₂纳米球阵列，然后煅烧。

优选的技术方案中，采用氢氟酸溶解电极表面的三维SiO₂纳米球阵列。

在本发明中，所述DNA四面体是由四条寡核苷酸链A、B、C和D形成的，四条寡核苷酸链A、B、C和D的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-4所示，寡核苷酸链A、B、C的5’端均修饰有巯基；所述黄曲霉毒素B1适配体的序列如SEQ ID NO:5所示。

本发明还提供采用所述电化学适配体传感器检测黄曲霉毒素B1的方法，包括如下步骤：将样品溶液滴加至所述电化学适配体传感器的工作电极表面进行反应，滴加信号探针进行反应；将所述工作电极、对电极和参比电极置于电解液中，采用差分脉冲伏安法，获得峰电流变化值的绝对值；根据以峰电流变化值的绝对值为应变量、AFB1浓度对数值的相反数为自变量的标准曲线，计算AFB1溶液的浓度。

在本发明中，制作标准曲线的方法如下：将浓度在0.01fg/mL-1μg/mL范围内的AFB1溶液，滴加到工作电极表面进行反应，滴加信号探针进行反应；将电化学适配体传感器的工作电极、对电极和参比电极置于电解液中，采用差分脉冲伏安法，获得峰电流变化值的绝对值；以峰电流变化值的绝对值为应变量、以AFB1浓度对数值的相反数为自变量，制作标准曲线。

在本发明中，所述信号探针是将辅助DNA和辣根过氧化物酶采用AuNPs-SiO₂@Fe₃O₄标记后得到的；所述辅助DNA的核苷酸序列如SEQ IN NO:6所示、且3’端修饰了巯基；所述AuNPs-SiO₂@Fe₃O₄是在SiO₂@Fe₃O₄表面包裹了一层纳米金后得到的；所述电解液含有H₂O₂和硫堇。

本发明电化学适配体传感器的工作电极是通过在金片电极表面依次修饰MoS₂和纳米金的复合膜、DNA四面体和黄曲霉毒素B1适配体后构建得到的。当样品溶液中没有AFB1时，黄曲霉毒素B1适配体(APT)与DNA四面体(TDNs)杂交链能够稳定存在。当样品溶液中存在AFB1时，APT的构象发生改变，与AFB1牢固结合，并从杂交链上脱落下来。然后信号探针中的辅助DNA通过杂交反应连接到工作电极表面，通过HRP催化H₂O₂氧化硫堇产生电化学放大信号。溶液中AFB1的浓度越大，结合到电极表面的HRP越多，电化学放大信号越大。因此，可以采用本发明电化学适配体传感器定量检测黄曲霉毒素B1。本发明电化学适配体传感器可以通过改变适配体应用于其它真菌毒素的检测，具有普适性。

实验结果证明，本发明用于检测黄曲霉毒素B1具有较高的灵敏度。当黄曲霉毒素B1浓度在0.1fg/mL-0.1μg/mL范围内，获得较好的线性关系，检测限低至0.01fg/mL。重复实验结果表明，本发明电化学适配体传感器检测黄曲酶毒素B1具有良好的重现性。特异性结果表明，本发明电化学适配体传感器除了黄曲酶毒素B1之外不会与其它四种真菌毒素(黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素M1、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A)特异性结合，说明本发明传感器具有良好的特异性。稳定性结果分析表明，本发明传感器在4℃储存一个月，每隔五天对1pg/mL黄曲霉毒素B1溶液测试一次，发现响应电流没有明显的下降，一个月后仍然保持91％，说明本发明传感器具有良好的稳定性。本发明电化学适配体传感器检测大米和小麦粉末样品中黄曲霉毒素B1，结果与商用液质联用结果具有一致性。

附图说明

图1是本发明电化学适配体传感器检测原理示意图。

图2是3DOM MoS₂-AuNPs复合膜的SEM图。

图3是3DOM MoS₂-AuNPs复合膜的EDS图。

图4是电化学适配体传感器对不同浓度的黄曲霉毒素B1测定的DPV图，其中vs.SCE表示电位相对于饱和甘汞参比电极。

图5显示了采用本发明电化学适配体传感器检测不同浓度黄曲霉毒素B1获得的峰电流变化值的绝对值与黄曲霉毒素B1浓度对数值的相反数之间的线性关系。

图6是采用本发明电化学适配体传感器检测黄曲霉毒素B1的特异性。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作步骤，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

本发明使用的材料与试剂：合成DNA四面体(TDNs)的四条寡核苷酸链A、B、C和D、黄曲霉毒素B1适配体(APT)、辅助DNA(help DNA1，缩写为H1)的序列见表1，其中寡核苷酸链A、B和C的5’端修改有巯基，辅助DNA的3’端修饰了巯基，上述物质均购于宝生物工程(大连)有限公司。四硫代钼酸铵(英文名称为Ammonium tetrathiomolybdate，(NH₄)₂MoS₄)、6-巯基正己醇(英文名称为6-Mercaptohexanol，缩写为MCH)和聚二烯丙基二甲基氯化铵(英文名称为poly(diallyldimethylammonium chloride)，缩写为PDDA,20wt.％)均购于Sigma公司；SiO₂和硫堇均购于阿法埃莎(中国)化学有限公司；过氧化氢(H₂O₂)和氢氟酸(HF)均购于国药集团化学试剂有限公司；四水氯金酸(HAuCl₄·4H₂O)购于南京化学试剂有限公司；辣根过氧化物酶(HRP)购于上海雪满生物科技有限公司；黄曲霉毒素B1(AFB1)购于普瑞邦生物工程有限公司；其它试剂均购于国药集团化学试剂有限公司。

表1本发明涉及的DNA序列

本发明使用的仪器设备：马弗炉和恒温箱，来自上海博迅实业有限公司医疗设备厂；电子分析天平，来自北京赛多利斯仪器系统有限公司；超声波清洗机，来自昆山禾创超声仪器有限公司；电化学工作站，来自上海辰华仪器有限公司。

实施例1构建定量检测黄曲霉毒素B1的电化学适配体传感器

本发明定量检测黄曲霉毒素B1的电化学适配体传感器中，对电极为铂丝电极，参比电极为饱和甘汞电极，工作电极是在金片电极表面依次修饰MoS₂和纳米金的复合膜和DNA四面体后得到的。下面具体描述工作电极的构建方法。

一、三维有序多孔MoS₂-AuNPs电极的构建

金片在使用前，分别用丙酮、乙醇和纯水超声清洗10min，然后用氮气吹干，得到干净的金片电极，备用。

构建3DOM MoS₂-AuNPs电极的具体步骤如下：

(1)称取0.35g SiO₂分散于60mL乙醇-水混合溶液(乙醇与水的体积比为9:1)中，超声60min，制得SiO₂分散液；

(2)将干净的金片电极垂直插入上述分散液中，置入恒温箱中，控制温度为30℃，随着溶剂的蒸发，在电极表面形成三维SiO₂纳米球阵列，然后于马弗炉中在250℃条件下煅烧2h，以增加其机械强度；

(3)在绝缘胶布上打一个孔，孔的直径为4mm，然后粘贴在步骤(2)处理后的电极表面；(4)采用恒电位电沉积法在步骤(3)处理后的电极表面修饰MoS₂和纳米金(AuNPs)的复合膜(缩写为3DOM MoS₂-AuNPs复合膜)，具体方法如下：按照三电极体系，将步骤(3)处理后的电极、铂丝电极(对电极)和饱和甘汞电极(参比电极)浸入到含有0.2mM HAuCl₄·4H₂O和0.005M(NH₄)₂MoS₄的0.1M KCl溶液中5min，控制沉积电量为18.7mC，在-1V条件下，在步骤(3)处理后的电极表面绝缘胶布的孔内沉积3DOM MoS₂-AuNPs复合膜，具体来说是在三维SiO₂纳米球阵列的间隙沉积3DOM MoS₂-AuNPs复合膜。沉积过程中通氮气除氧保护。沉积3DOM MoS₂-AuNPs复合膜后，用5％氢氟酸处理2min，以溶解掉电极表面的三维SiO₂纳米球阵列，获得3DOM MoS₂-AuNPs复合膜修饰的金片电极，缩写为3DOM MoS₂-AuNPs电极(即三维有序多孔MoS₂-AuNPs电极)。

通过扫描电子显微镜(SEM)对3DOM MoS₂-AuNPs复合膜进行表征，从图2可以清晰看出三维有序多孔结构，表明成功合成了3DOM MoS₂-AuNPs复合膜。同时，也用X射线能谱(EDS)对3DOM MoS₂-AuNPs复合膜元素组成进行了表征，从图3可以看出该复合膜中含有Mo、S和Au元素，其中Mo和S的原子个数比约为1:2，进一步证明成功合成了3DOM MoS₂-AuNPs复合膜。

二、TDNs的合成

由于四条寡核苷酸链A、B、C和D(见表1)具有互补序列，因此能够形成DNA四面体(TDNs)。寡核苷酸链D还携带与APT部分互补的序列，因此该DNA四面体能够结合APT。由于寡核苷酸链A、B和C的5’端均修饰有巯基，因此DNA四面体能够固定在3DOM MoS₂-AuNPs电极表面。

将浓度均为10μM的四条寡核苷酸链溶液按照体积比为1：1：1：1混合，采用TEbuffer(含有50mM MgCl₂和20mM Tris的水溶液，pH 8.0)稀释至各寡核苷酸链浓度均为1μM，然后在95℃加热10min，迅速降温至40℃，并在40℃下维持30min，即可获得DNA四面体(TDNs，浓度为1μM)。

三、TDNs修饰的3DOM MoS₂-AuNPs电极

将3DOM MoS₂-AuNPs电极置于0.5M硫酸中进行电化学清洗，在0-1.6V电位范围内以100mV/s速度进行CV扫描，直到获得重复的CV曲线，然后取出用氮气吹干，得到电化学清洗后的3DOM MoS₂-AuNPs电极，备用。

将10μL、浓度为1μM的TDNs滴涂到电化学清洗后的3DOM MoS₂-AuNPs电极表面，在室温下进行过夜孵化10h。用PBS缓冲溶液清洗电极，然后氮气吹干，用2mM MCH(6-巯基正己醇)水溶液浸泡2h，以封闭电极表面未结合TDNs的活性位点，最后用PBS溶液清洗和氮气吹干，得到TDNs修饰的3DOM MoS₂-AuNPs电极，即得到了工作电极，备用。

四、工作电极的构建

工作电极的构建过程如图1所示。将8μL浓度为10μM的APT滴涂在TDNs修饰的3DOMMoS₂-AuNPs电极表面，37℃孵化2.5h，用PBS清洗残留的APT，即得到定量检测黄曲霉毒素B1电化学适配体传感器的工作电极。

五、信号探针的制备

信号探针是将辅助DNA和辣根过氧化物酶采用AuNPs-SiO₂@Fe₃O₄标记后得到的，制备步骤如下：(1)按照文献报道制备Fe₃O₄(Deng H,Li X,Peng Q,et al.Monodispersemagnetic single‐crystal ferrite microspheres[J].Angewandte Chemie,2005,117(18):2842-2845.)，Fe₃O₄平均粒径为245nm。在20mL水中加入0.1g Fe₃O₄，然后加入5mL 3％(质量百分浓度)PDDA溶液，搅拌20min，采用外加磁场磁性分离去除残余的PDDA，得到Fe₃O₄-PDDA复合物。将Fe₃O₄-PDDA复合物用纯水冲洗，然后加入到由10ml乙醇和2ml水组成的混合液中，超声10min，采用氨水调节pH至11，以2mL/h的速度加入浓度为20％(体积百分浓度)的TEOS(正硅酸乙酯)乙醇溶液，室温反应12h。采用磁性分离方法，收集产物并清洗数次，然后在60℃条件下真空干燥6h获得SiO₂@Fe₃O₄ 。

(2)将0.02g SiO₂@Fe₃O₄分散在10mL、3％的PDDA溶液中搅拌20min，通过磁性分离除去残留PDDA，再加入80mL纳米金胶(纳米金的平均粒径为13.7nm，按照下述文献制备：Grabar K C,Freeman R G,Hommer M B,et al.Preparation and characterization ofAu colloid monolayers[J].Analytical chemistry,1995,67(4):735-743.)搅拌8h。通过磁性分离除去残留纳米金获得紫黑色磁性粒子，即AuNPs–SiO₂@Fe₃O₄纳米复合物，用乙醇和水清洗数次，在60℃下真空干燥6h。最后，将AuNPs–SiO₂@Fe₃O₄分散到0.01mol/L、pH 7.4的PBS缓冲溶液中，得到20mg/mL的分散液，备用。

(3)在1mL浓度为20mg/mL的AuNPs–SiO₂@Fe₃O₄分散液中，加入75μL浓度为2mg/mL的HRP溶液和50μL浓度为10μM的H1溶液，室温过夜搅拌10h，通过磁性分离获得AuNPs-SiO₂@Fe₃O₄标记的辅助DNA和辣根过氧化物酶(缩写为HRP/H1/AuNPs–SiO₂@Fe₃O₄复合物)，作为信号探针，用PBS缓冲溶液清洗多次，最后分散在1mL PBS缓冲溶液中备用。

实施例2采用电化学适配体传感器检测AFB1

采用实施例1制备的电化学适配体传感器检测不同浓度AFB1溶液(0.01fg/mL-1μg/mL)，以考察该电化学适配体传感器对AFB1的线性检测范围和检出限。

配制电解液：在0.01M、pH 7.4的PBS缓冲溶液中添加终浓度为1mM的H₂O₂和25μM的硫堇后得到。

将浓度在0.01fg/mL-1μg/mL范围内的AFB1溶液，滴加到工作电极表面，37℃反应50min，用PBS清洗工作电极表面，将10μL浓度为20mg/mL的HRP/H1/AuNPs-SiO₂@Fe₃O₄复合物滴加到工作电极表面，37℃孵化2.5h，随后用PBS清洗电极表面。上述处理结束后，将工作电极、铂丝电极(对电极)和饱和甘汞电极(参比电极)置于电解液中，采用差分脉冲伏安法(DPV)，获得针对不同浓度AFB1溶液的电流-电位响应曲线(图4)。差分脉冲伏安法中扫描电位为-0.375～-0.075V。取AFB1浓度(C_AFB1，g/mL)对数值的相反数(-lgC_AFB1)为横坐标，峰电流变化值的绝对值(Δi_p，μA)为纵坐标，可得到散点图5，进行线性拟合后分析可知，实施例1中电化学适配体传感器对AFB1检测的线性范围为0.1fg/mL-0.1μg/mL，检出限为0.01fg/mL，线性方程是Δi_p＝0.402lgC_AFB1+9.647，R²＝0.9903。上述结果说明本发明电化学适配体传感器对AFB1检测具有宽的线性范围和低的检出限。

实施例3电化学适配体传感器的特异性

将浓度均为1pg/mL的AFB1、黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素M1(AFM1)、玉米赤霉烯酮(ZEN)和赭曲霉毒素A(OTA)溶液分别采用实施例1制备的电化学适配体传感器进行检测，以考察实施例1制备的电化学适配体传感器的特异性。

电解液同实施例2。将真菌毒素滴加到实施例1制备的电化学适配体传感器中工作电极的表面，37℃反应50min，用PBS清洗工作电极表面，将10μL浓度为20mg/mL的HRP/H1/AuNPs-SiO₂@Fe₃O₄复合物滴加到工作电极表面，37℃孵化2.5h，随后用PBS清洗工作电极表面。上述处理结束后，将工作电极、铂丝电极(对电极)和饱和甘汞电极(参比电极)置于电解液中，采用差分脉冲伏安法(DPV)进行检测，扫描电位为-0.375～-0.075V，获得电化学适配体传感器检测不同真菌毒素的柱状图。从图6，可以看出，电化学适配体传感器对AFB1产生较明显的电化学信号，而其他均没有明显变化，这表明该电化学适配体传感器对黄曲霉毒素B1具有较好的特异性。

实施例4电化学适配体传感器的重现性

电解液同实施例2。根据实施例1中方法制备了5个不同的电化学适配体传感器，对1pg/mL AFB1溶液进行测定，获得峰电流变化值的绝对值。根据实施例2中线性方程，计算AFB1的浓度，结果分别为0.93、0.97、1.02、0.98和1.06pg/mL，比较5个电化学适配体传感器对AFB1浓度的检测结果，其RSD为5.0％。

另外，采用其中一个电化学适配体传感器，对1pg/mL AFB1溶液检测3次。根据实施例2中线性方程，计算AFB1的浓度，结果分别为0.97、0.98和1.02pg/mL，比较检测得到的3个浓度值，其RSD为2.7％。

本实施例中的试验结果表明：本发明制备的电化学适配体传感器重现性较好。

实施例5电化学适配体传感器的稳定性

将实施例1中制备的电化学适配体传感器在4℃储存，其间每隔五天对1pg/mLAFB1溶液测试一次，峰电流变化值的绝对值依次为4.87、4.79、4.68、4.61、4.52、4.465和4.43μA。通过分析，发现该电化学适配体传感器在4℃储存一个月后，峰电流变化值的绝对值仍然达到初始的91％，这表明该电化学适配体传感器的稳定性较好。

实施例6采用电化学适配体传感器检测大米样品中的AFB1

国家轻工业食品质量监督检测南京站提供了三种大米样品，分别编号为大米1、大米2、大米3。首先将大米样品用粉碎机粉碎，得到粉末状样品。取5g粉末状样品加入到50mL离心管中，然后加入15mL提取溶液，震荡45min，随后在室温下，4000转离心5min，收集上清液，用纯水将上清液稀释十倍，得到样品提取液。在每毫升大米1的提取液中添加0.3ngAFB1，在每毫升大米2的提取液中添加1.0ngAFB1，在每毫升大米3的提取液中添加2.5ngAFB1，采用实施例1制备的电化学适配体传感器进行检测，获得峰电流变化值的绝对值。根据实施例2中线性方程，计算AFB1的浓度及回收率。结果如表2所示，AFB1的回收率为97.7％-99.3％。实验结果表明，该电化学适配体传感器准确性高，可用于实际样品中AFB1的检测。

表2电化学适配体传感器检测大米样品中的AFB1

本实施例中的提取溶液是含有80％(质量百分浓度)甲醇、4％(质量百分浓度)NaCl的水溶液。

实施例7采用电化学适配体传感器检测小麦粉末样品中的AFB1

由国家轻工业食品质量监督检测南京站提供了三种小麦粉末样品，分别编号为小麦粉末1、2和3。首先将5g小麦粉末样品加入到50mL离心管中，然后再加入15mL提取溶液(成分同实施例6)得到混合液，震荡45min，随后在室温下，4000转离心5min，收集上清液，用纯水将上清液稀释十倍，得到各小麦粉末样品提取液。在每毫升小麦粉末1的提取液中添加0.3ngAFB1，在每毫升小麦粉末2的提取液中添加1.0ngAFB1，在每毫升小麦粉末3的提取液中添加2.5ngAFB1。采用实施例1制备的电化学适配体传感器进行检测，获得峰电流变化值的绝对值。根据实施例2中线性方程，计算AFB1的浓度及回收率。结果如表3所示，AFB1的回收率为98.6％-102.4％。实验结果表明，该电化学适配体传感器准确性高，可用于实际样品中AFB1的检测。

表3电化学适配体传感器检测小麦粉末样品中的AFB1

SEQUENCE LISTING

<110> 南京工业大学

<120> 一种定量检测黄曲霉毒素B1的电化学适配体传感器及其应用

<130> 20200512

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 55

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 寡核苷酸链A

<400> 1

tatcaccagg cagttgacag tgtagcaagc tgtaatagat gcgagggtcc aatac 55

<210> 2

<211> 55

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 寡核苷酸链B

<400> 2

tcaactgcct ggtgataaaa cgacactacg tgggaatcta ctatggcggc tcttc 55

<210> 3

<211> 55

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 寡核苷酸链C

<400> 3

ttcagactta ggaatgtgct tcccacgtag tgtcgtttgt attggaccct cgcat 55

<210> 4

<211> 85

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 寡核苷酸链D

<400> 4

agagacaaca cgtgcccaac tttttttttt acattcctaa gtctgaaaca ttacagcttg 60

ctacacgaga agagccgcca tagta 85

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> APT

<400> 5

gttgggcacg tgttgtctct ctgtgtctcg tgcccttcgc taggcccaca 50

Claims (9)

1.一种定量检测黄曲霉毒素B1的电化学适配体传感器，该电化学适配体传感器为三电极体系传感器，其特征在于工作电极是在金片电极表面依次修饰MoS₂和纳米金的复合膜、DNA四面体和黄曲霉毒素B1适配体后得到的；所述DNA四面体携带与黄曲霉毒素B1适配体部分互补的序列；所述DNA四面体是由四条寡核苷酸链A、B、C和D形成的，四条寡核苷酸链A、B、C和D的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-4所示，寡核苷酸链A、B、C的5’端均修饰有巯基；所述黄曲霉毒素B1适配体的序列如SEQ ID NO:5所示。

2.根据权利要求1所述定量检测黄曲霉毒素B1的电化学适配体传感器，其特征在于采用如下方法在金片电极表面修饰MoS₂和纳米金的复合膜：

（1）在金片电极表面形成三维SiO₂纳米球阵列；

（2）在所述三维SiO₂纳米球阵列的间隙中沉积MoS₂和纳米金的复合膜；

（3）溶解所述三维SiO₂纳米球阵列。

3.根据权利要求2所述定量检测黄曲霉毒素B1的电化学适配体传感器，其特征在于步骤（2）中通过电沉积方法在所述三维SiO₂纳米球阵列的间隙中沉积MoS₂和纳米金的复合膜。

4.根据权利要求3所述定量检测黄曲霉毒素B1的电化学适配体传感器，其特征在于所述电沉积方法中的电解液是含有HAuCl₄·4H₂O和(NH₄)₂MoS₄的KCl溶液。

5.根据权利要求2-4之一所述定量检测黄曲霉毒素B1的电化学适配体传感器，其特征在于步骤（1）中在金片电极表面形成三维SiO₂纳米球阵列的方法如下：将金片电极插入SiO₂分散液中，溶剂蒸发后，在电极表面形成三维SiO₂纳米球阵列，然后煅烧。

6.根据权利要求5所述定量检测黄曲霉毒素B1的电化学适配体传感器，其特征在于采用氢氟酸溶解电极表面的三维SiO₂纳米球阵列。

7.采用权利要求1-6之一所述电化学适配体传感器检测黄曲霉毒素B1的方法，包括如下步骤：将样品溶液滴加至权利要求1-6之一所述电化学适配体传感器的工作电极表面进行反应，滴加信号探针进行反应；将所述工作电极、对电极和参比电极置于电解液中，采用差分脉冲伏安法，获得峰电流变化值的绝对值；根据以峰电流变化值的绝对值为应变量、AFB1浓度对数值的相反数为自变量的标准曲线，计算AFB1溶液的浓度。

8.根据权利要求7所述方法，其特征在于制作标准曲线的方法如下：将浓度在0.01 fg/mL-1 μg/mL范围内的AFB1溶液，滴加到工作电极表面进行反应，滴加信号探针进行反应；将电化学适配体传感器的工作电极、对电极和参比电极置于电解液中，采用差分脉冲伏安法，获得峰电流变化值的绝对值；以峰电流变化值的绝对值为应变量、以AFB1浓度对数值的相反数为自变量，制作标准曲线。

9.根据权利要求7-8之一所述方法，其特征在于所述信号探针是将辅助DNA和辣根过氧化物酶采用AuNPs-SiO₂@Fe₃O₄标记后得到的；所述辅助DNA的核苷酸序列如SEQ IN NO:6所示、且3’端修饰了巯基；所述AuNPs-SiO₂@Fe₃O₄是在SiO₂@Fe₃O₄表面包裹了一层纳米金后得到的；所述电解液含有H₂O₂和硫堇。

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