CN112964702A - 基于可视化多色电化学发光技术快速检测沙门氏菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了多色传感器及其应用。本发明还公开基于可视化多色电化学发光技术快速检测沙门氏菌的方法，通过沙门氏菌免疫磁珠特异性识别并捕获沙门氏菌，孵育形成复合物，再利用ITO双极电极联用电致化学发光技术检测得到沙门氏菌浓度与颜色变化的关系，最终确定待测样品中沙门氏菌的浓度。本方法不需要预增菌，电极片上无需固定修饰，直接滴加免疫磁珠‑沙门氏菌复合物即可，检测时间仅需0.5 h，检测限低至10 CFU/mL；利用免疫磁分离技术捕获沙门氏菌，随着ITO双极电极阴极端菌浓度的增加，双极电极阳极端发光颜色由红色变为黄色再到绿色，用时短，颜色变化明显，可肉眼检测，灵敏度高，操作简便，检测成本低且特异性好的优点。
Description
技术领域
本发明属涉及生物传感技术领域，尤其涉及基于可视化多色电化学发光技术快速检测沙门氏菌的方法。
背景技术
“民以食为天，食以安为先”，在全国各级食药监部门高度重视食品安全，不断加大食品安全监督抽检力度的大环境下，我国食品安全得到有力保障，但由沙门氏菌引起的食物中毒事件依然情况严峻。因此，在传统食源性疾病爆发事件中，快速、溯源引起疾病暴发的生物致病性食品并对食源性致病菌进行高效鉴定，对食品安全有重要意义。
平板计数法是行业内检测沙门氏菌的“金标准”，其包括预富集、选择性富集、分离和生化鉴定，操作步骤比较繁琐，依赖人员的感官经验，对工作人员和实验环境都具有较高的要求，检测周期长，一般需要4-7d才能确定检测结果，时效性相较于其他方法存在劣势。而其他主流各种快速检测技术可分为两类；一类是分子生物学方法：包括聚合酶链式反应(PCR)，环介导等温扩增(LAMP)和生物传感器检测法；另一类是免疫学法：如酶联免疫吸附试验(ELISA)，侧向流动免疫分析(LIFA)和免疫传感器。即使“金标准”平板计数法和分子生物学方法都具有很高的灵敏度和特异性，但为此付出的是更长的检测时间、专业的研究人员、复杂的操作和精密的仪器，使得这些方法无法适用于现场快速检测应用。而后者方便、成本低廉，但缺乏现场快速检测所需的准确性和特异性。本方法将能快速分离待测目标的免疫传感器与电致变色传感器结合，快速、经济、准确、独特的光学信号转换能力的糅合，得到一种在复杂食品基质中能快速、准确、全面分析的强有力的快速检测方法。
电致化学发光(Electrochemiluminescence，简称ECL)是化学发光和电化学相结合的产物，其特征在于电生物质之间或电生的物质与体系中其他的组分之间产生电子转移从而形成激发态，再由激发态返回到基态并在此过程中产生发光的现象。由于该方法结合了电化学方法和化学发光方法，使得它不仅具有荧光和化学发光分析方法的优势，同时还具有电化学分析方法的特点。双极电极(BPE)是一导体或半导体置于溶液电场中，当电场达到一定强度时，会引起溶液中的电活性物质在导体或者半导体的两端发生氧化还原反应，该导体或半导体称为双极电极。与传统的三电极系统只关注于工作电极不同，双极电极作为“电子导体”类似于“电池”，研究的是在其阳极和阴极发生的反应。并且由于双极电极的阴阳极可将反应体系与信号测量体系进行物理隔离，避免了光活性分子与复杂反应体系的直接接触，能有效抑制假阳性现象。因此，将BPE与ECL传感相结合，不仅可以简化仪器装置、节约电化学试剂的消耗而且它可以将电化学信号直接转化为光学信号，可直接通过可视化发光进行检测。由于人眼对颜色强弱敏感性低于颜色变化，故我们一直想要找到一种可以通过调节某种条件而导致颜色发生变化的方法来提高可视化检测方法中的准确性。近年来，研究发现铱(III)络合物的ECL发射峰值横跨整个可见光，这为多色ECL发射提供了新方向。并且一些关于混合金属螯合物铱(III)和钌(II)的ECL体系报道已经出现，通过改变施加电压，对铱、钌等配合物进行选择性激发就可调控体系的发光颜色，经典的传统沙门氏菌检测方法包括预富集、选择性富集、分离和生化鉴定，操作步骤比较繁琐，依赖人员的感官经验，对工作人员和实验环境都具有较高的要求，检测周期长，一般需要4-7d才能确定检测结果，时效性相较于其他方法存在劣势。且在研究中的其他主流各种快速检测新技术如酶联免疫吸附法(ELISA)、环介导等温扩增技术(LAMP)、也都需要多步分析、各种设备和训练有素的研究员，且检测限最低大部分也仅能达到35CFU/mL，这不利于对食品中沙门氏菌的现场快速检测；且不同致病菌生长习性和营养要求的不同也在很大程度上限制了如多重PCR、多通道SRP生物分子相互仪、多通道BLI生物分子相互作用仪等高通量检测技术在实际检测中的应用。全自动微生物鉴定系统是目前最先进、自动化程度最高的细菌鉴定仪器之一，其检测沙门氏菌只需4h，但携带不便且价格昂贵，不适用于现场快速检测中。
因此开发一种信号强、用时短、灵敏度高的检测食品中沙门氏菌新方法对于控制食品安全发生具有重要意义！
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了多色传感器及其应用。
本发明还要解决的技术问题是提供了基于可视化多色电化学发光技术快速检测沙门氏菌的方法。本发明在ITO双极电极阴极端滴加通过免疫磁分离技术得到的食源性致病菌-免疫磁珠复合物，阳极端滴加铱配合物和钌联吡啶混合ECL试剂。由于[Ir(ppy)3]和[Ru(bpy)3 2+]的激发具有电位差异性，故通过调节BPE的阳极和阴极的外接电位来实现对ECL的选择性激发，使ITO双极电极阳极端的ECL发射色随着底物浓度增加而呈现由红变黄到绿的变化，达到可视化检测目的。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种多色传感器，所述多色传感器包括沙门氏菌免疫磁珠、ITO双极电极和阳极混合发光剂。
其中，所述阳极混合发光剂为铱配合物[Ir(ppy)3]和钌配合物[Ru(bpy)3 2+]。
其中，所述铱配合物[Ir(ppy)3]浓度为0.375mM-3.75mM，所述钌配合物[Ru(bpy)3 2+]浓度为0.125mM-1mM。
其中，所述ITO双极电极施用恒电压为6.3V。
本发明内容还包括所述的多色传感器在检测食品中的沙门氏菌中的应用。
其中，所述食品包括但不仅限于牛奶、牛肉或蛋糕，其他食品也适用。
本发明内容还包括基于所述的多色传感器的可视化多色电化学发光技术快速检测沙门氏菌的方法，所述方法是通过沙门氏菌免疫磁珠特异性识别并捕获沙门氏菌(S.typhimurium)，孵育形成IMBs-S.typhimurium复合物，在磁场作用下实现复合物的快速提取，再利用ITO双极电极联用电致化学发光技术检测得到S.typhimurium浓度与颜色变化的关系，最终确定待测样品中S.typhimurium的浓度。
其中，所述沙门氏菌为鼠伤寒沙门氏菌。
其中，所述S.typhimurium浓度101-106CFU/mL。
本发明的应用方法具体包括以下步骤：
1)ITO双极电极的设计与制备；
2)铱配合物[Ir(ppy)3]、钌配合物[Ru(bpy)3 2+]两种发光剂在ITO双极电极阳极端的电致化学发光(ECL)谱图调试；
3)鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)的培养；
4)免疫磁珠(immunomagnetic beads，IMBs)特异性吸附鼠伤寒沙门氏菌；
5)利用免疫磁分离技术，通过抗原-抗体特异性识别形成免疫磁珠-鼠伤寒沙门氏菌复合物(IMBs-S.typhimurium)，在磁场作用下实现复合物的快速提取；
6)使用数码相机采集ITO双极电极阴极端为不同浓度(101-106CFU/mL)IMBs-S.typhimurium时阳极端阳极混合发光剂的ECL图像；
7)使用数码相机采集在不同外接电位时ITO双极电极阳极端阳极混合发光剂的ECL图像；
8)分别进行10，103，105CFU/mL不同浓度的三种方案E.coli O157：H7，S.typhimurium和E.coli O157：H7、S.typhimurium的混合物的测试，显示该传感器对S.typhimurium的特异性；
9)实际样品(鲜牛奶(保质期2天)，酱牛肉，鸡蛋糕(预包装))的检测。
其中，所述步骤1)ITO双极电极的制备步骤如下：
ITO双极电极由两部分构成：ITO导电玻璃和PDMS基底，将PDMS与ITO玻璃不可逆地键合。首先，将ITO(氧化铟锡)切成一片(4m×1cm)，利用设计好的丝网印刷模板将油墨(主要成分丙烯酸树脂)渗透到ITO层形成固定的电极形状。刷涂后的ITO自然干燥后进行化学蚀刻，刻蚀液配比为HF∶NH4F∶HNO3＝1∶0.5∶0.5，用作ITO双极电极的底片。为获得PDMS将玻璃板在设计图案的掩膜下于UV下曝光，随后用0.5％NaOH溶液显影，之后用0.2M硝酸铈(IV)氨除去Cr层，然后浸泡在1M HF-NH4F溶液(40℃)中水浴40min形成实验需要的PDMS玻璃模板。最后将除去气泡的PDMS浇注在玻璃模板上在80℃加热1h。室温冷却后从掩膜中剥离PDMS，产生PDMS微流体通道(长3.2cm，宽1.2cm，深度1.1mm)和直径2mm孔的PDMS储存模式。
其中，所述步骤2)中ECL谱图调试包括：
①ITO双极电极阳极端铱配合物[Ir(ppy)3]、钌配合物[Ru(bpy)3 2+]两种发光剂的浓度与配比优化；
②不同电位下使用数码相机采集ITO双极电极阳极端阳极混合发光剂的发光颜色变化。
作为优选，所述数码相机采集图像时，ITO双极电极阴极端均滴加20μL 10×PBS溶液。作为优选，所述图像均在施加电压30秒后用数码相机采集。
作为优选，所述步骤4)中表征IMBs-S.typhimurium时鼠伤寒沙门氏菌浓度为100CFU/mL。
作为优选，所述步骤6)中阳极混合发光剂浓度为1.5mM[Ir(ppy)3]，0.125mM[Ru(bpy)3 2+]，50mM TPrA，0.1M TBAPF6/acetonitrile。
作为优选，当所述ITO双极电极施用恒电压为6.3V时，当样品中没有沙门氏菌时，ECL发射显示为红色，当沙门氏菌浓度为10CFU/mL时，ECL发射变为黄色，当沙门氏菌浓度为105CFU/mL，ECL发射为绿色。
本发明内容还包括所述的方法在检测食品中的沙门氏菌中的应用。
本发明所述沙门氏菌的培养如下步骤：①从-80℃冰箱取出保藏在50％(v/v)甘油中的菌种，解冻后，以1％接种量接种至10mL的LB(Luria-Bertani)液体培养基中，在37℃、130rpm恒温摇床中培养18-24h；②将活化的菌液取100μL接入40mL的LB液体培养基中，在37℃、130rpm恒温摇床中培养2h；③培养2h后，取1μL菌液加入1.5mL离心管中，向其中加入1mL0.85％无菌的生理盐水；涡旋，混匀后取80μL的菌液加入40mL的LB液体培养基中，在37℃、130rpm恒温摇床中培养5.5h；④培养5.5h后取5mL菌液加入10mL离心管中，8000rpm离心10min，去除上清液，用0.85％无菌的生理盐水复溶，将涡旋好的细菌悬浮液进行梯度稀释，得到浓度为102-107CFU/mL的菌液。
其中，所述的LB液体培养基为：NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，用超纯水定容至1L。
本发明的原理：该方法基于双极电极与电致化学发光技术的联用，由于两种发光剂的激发具有电位差异性，故可通过调节BPE阴阳极的电势差实现对ECL的选择性激发。在施加较低电位时仅观察到发光剂的绿色发射；随着电压升高，绿色的发光剂和红色的发光剂会被同时激发，混合产生黄色发射；但在较高电位下仅监测到发光剂的红色发射，这是由于在高电位下TPrA自由基阳离子被激发态的绿色发光剂的氧化淬灭。随着ITO双极电极表面阴极端电位的升高，阳极端呈现由红变黄到绿的变化；这是因为沙门氏菌在阴极端的存在降低了电路中阳极端影响电化学发光体的电压，从而产生了电致变色响应，由红至黄到绿的变化。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
(1)目前大部分可视化检测基本都是基于颜色变化强弱去判定阴性阳性，由于人眼对颜色变化敏感度强于对颜色强弱变化，本方法有效地利用了电化学发光特性，通过外接电源连接双极电极，避免光活性物质与复杂基质的接触，利用颜色从红-黄-绿的变化来判定沙门氏菌的浓度，且无需其余的信号读出装置，用肉眼即可得到结果，大大提高了肉眼读数的准确性，可视化多色变化去判定阴阳性更为准确，受主观因素干扰更少。
(2)本发明检测灵敏度高且特异性好，检测限低至10CFU/mL；检测时间短，不需要复杂的预增菌过程，整个过程仅需0.5h。
(3)本发明的双极电极阴阳两极的物理隔离不仅避免了分析物与光活性分子的直接接触，而且本方法中BPE的表面无需任何修饰，直接将免疫磁珠-鼠伤寒沙门氏菌复合物滴至阴极即可，操作简单、检测过程更快速、高效，极大地降低了检测成本、易于携带、操作简便这些优点使其在现场快速检测应用中有良好市场前景。
附图说明
图1为基于可视化多色电化学发光技术快速检测沙门氏菌的方法的流程图。
图2为混合发光剂铱配合物、钌配合物在施加不同外接电位时的发光机理图。
图3为基于可视化多色电化学发光技术快速检测沙门氏菌的方法的工作原理图。
图4为浓度为0.375mM-3.75mM铱配合物在施加恒电压30s(A)和60s(B)时的ECL图像和灰度图(C)。
图5为裸磁珠和1.5mM铱配合物与不同浓度钌配合物比例优化的ECL图像(阴极滴加10CFU/mL的IMBs-S.typhimurium)。
图6为施以不同恒电压下铱配合物、钌配合物混合而成的混合发光剂用数码相机采集的多色ECL图像(阴极滴加20uL 10×PBS)。
图7为分别在5.7V、6.3V、6.7V恒电压下的不同浓度(0-106CFU/mL)IMBs-S.typhimurium在该装置上用数码相机采集的ECL图像。
图8为6.3V恒电位下ECL图像表示的HSV光谱变化图。
图9为本传感器对鼠伤寒沙门氏菌的特异性。
图10为用数码相机采集实际样品(鲜牛奶(保质期2天)、酱牛肉、鸡蛋糕(预包装))的ECL图像。
图11为ITO双极电极比例尺寸示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
本发明所需要的试剂：
1、三[2-苯基吡啶-C2，N]铱(III)[Ir(ppy)3]、钌联吡啶[Ru(bpy)3 2+]、三正丙胺(TPrA)、四丁基六氟磷酸盐(TBAPF6)、乙腈、PBS、氯化钠、蛋白胨、酵母浸粉、琼脂粉，均购自于上海阿拉丁生化科技有限公司；
2、鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 14028)；
3、牛肉、蛋糕，均购自南京农贸市场和超市；
4、牛奶，购自南京卫岗乳业有限公司；
5、沙门氏菌免疫磁珠，粒径3μM，购自北京勤邦生物技术有限公司。
本发明选用的仪器：
1、电化学工作站(CHI750E)；
2、荧光分光光度计(F-4700)；
3、混合涡旋仪(IKAGerman)；
4、离心机(Eppendorf German)；
5、组合式摇床(HYL-C2)；
6、相机索尼6000。
实施例1 ITO双极电极的制备
ITO双极电极由两部分构成：ITO导电玻璃和PDMS基底，将PDMS与ITO玻璃不可逆地键合。首先，将ITO(氧化铟锡)切成一片(4m×1cm)，利用设计好的丝网印刷模板将油墨(主要成分丙烯酸树脂)渗透到ITO层形成固定的电极形状。刷涂后的ITO自然干燥后进行化学蚀刻，刻蚀液配比为HF∶NH4F∶HNO3＝1∶0.5∶0.5，用作ITO双极电极的底片。为获得PDMS将玻璃板在设计图案的掩膜下于UV下曝光，随后用0.5％NaOH溶液显影，之后用0.2M硝酸铈(IV)氨除去Cr层，然后浸泡在1M HF-NH4F溶液(40℃)中水浴40min形成实验需要的PDMS玻璃模板。最后将除去气泡的PDMS浇注在玻璃模板上在80℃加热1h。室温冷却后从掩膜中剥离PDMS，产生PDMS微流体通道(长3.2cm，宽1.2cm，深度1.1mm)和直径2mm孔的PDMS储存模式。
实施例2多色发光体系在ITO双极电极上多色发光原理验证
1、配制0.1M乙腈/四丁基六氟磷酸盐(TBAPF6/acetonitrile)溶液作为溶剂，常温避光保存备用；
2、分别配置含有50mM TPrA，0.1M TBAPF6/acetonitrile的0.375mM、0.5mM、0.75mM、1.5mM和3.75mM的铱配合物溶液，阴极端滴加20μL 0.1M PBS缓冲溶液，阳极端滴加20μL不同浓度的铱配合物溶液，施以6.3V恒电位并使用数码相机采集施加电压后30S和60S时的ECL图像，用Image J软件进行RGB分析处理所得ECL图像(Gray＝0.30R+0.59G+0.11B)。根据图像与数据显示(如图4)，最佳浓度为1.5mM[Ir(ppy)3]，50mM TPrA，0.1M TBAPF6/acetonitrile。
3、确定铱配合物浓度为1.5mM后，分别测试在6.3V恒电位下阴极滴加20μL 10CFU/mL IMBs-S.typhimurium，[Ir(ppy)3]：[Ru(bpy)3 2+]浓度比为1.5mM∶0.125mM(12∶1)、1.5mM∶0.25mM(6∶1)、1.5mM∶0.375mM(2∶5)、1.5mM∶0.5mM(3∶1)、和1.5mM∶1mM(3∶2)时在ITO双极电极上的电化学行为，并与沙门氏菌免疫磁珠在6.3V时采集得到的红色ECL图像对比。由图5可知，铱配合物与钌配合物配比为12∶1时，采集图像为黄色，与裸磁珠有明显颜色区分，故得到最终最优混合发光剂浓度为1.5mM[Ir(ppy)3]，0.125mM[Ru(bpy)3 2+]，50mM TPrA，0.1MTBAPF6/acetonitrile，称其为阳极混合发光剂。
4、200μL 3.75mM Ir(ppy)3、25μL 2.5mM Ru(bpy)3 2+、5μL 5M TPrA溶于0.1MTBAPF6/acetonitrile中，得到阳极混合发光剂浓度为1.5mM[Ir(ppy)3]，0.125mM[Ru(bpy)3 2+]，50mM TPrA，0.1M TBAPF6/acetonitrile。随后在ITO双极电极阳极端加入20μL阳极混合发光剂溶液，阴极端加入20μL 0.1M PBS，使用电化学工作站对其进行循环伏安法，观察阳极端上颜色变化。图6可以看出，在5.5V左右出现绿色，随着电压增至6.3V开始出现黄色，在7.3V开始出现红色，说明随着电压增加双极电极两端电势差随之变化从而导致阳极端产生绿-黄-红的变化。
实施例3沙门氏菌免疫磁珠吸附不同浓度的沙门氏菌在多色传感器上的验证
1、沙门氏菌的培养如下步骤：
①从-80℃冰箱取出保藏在50％(v/v)甘油中的菌种，解冻后，以1％接种量接种至10mL的LB(Luria-Bertani)液体培养基中，在37℃、130rpm恒温摇床中培养18-24h；
②将活化的菌液取100μL接入40mL的LB液体培养基中，在37℃、130rpm恒温摇床中培养2h；
③培养2h后，取1μL菌液加入1.5mL离心管中，向其中加入1mL 0.85％无菌的生理盐水；涡旋，混匀后取80μL的菌液加入40mL的LB液体培养基中，在37℃、130rpm恒温摇床中培养5.5h；
④培养5.5.h后取5mL菌液加入10mL离心管中，8000rpm离心10min，去除上清液，用0.85％无菌的生理盐水复溶，将涡旋好的细菌悬浮液进行梯度稀释，得到浓度为102-107CFU/mL的菌液。
2、取2.5mL不同浓度菌液(102-107CFU/mL)加入22.5mL无菌生理盐水中，投入沙门免疫磁珠200μg，混匀；将溶液置于恒温摇床中37℃、130rpm富集30min；磁分离后用无菌0.01M PBS洗涤3次并重悬于50μL 1×PBS中，得到IMBs-S.typhimurium复合物放入4℃冰箱备用。
3、阳极混合发光剂(1.5mM[Ir(ppy)3]，0.125mM[Ru(bpy)3 2+]，50mM TPrA，0.1MTBAPF6/acetonitrile)溶液滴20μL加至ITO双极电极阳极，20μL不同浓度(101-106CFU/mL)IMBs-S.typhimurium滴加在ITO双极电极阴极后，电化学工作站施以6.3V恒电压，用数码相机拍摄ECL图像，然后用Image J软件进行图像分析和自动化裁剪，图像裁剪区域为圆形发光区域，像素为180×180。使用其内置的“Measure-RGB Values”函数得到圆形面积的平均RGB值。RGB作为图像处理中最常用的颜色空间，常用于颜色显示和图像处理，非常容易被理解。而HSV模型，是针对用户感观的一种颜色模型，侧重于色彩的表示：什么颜色、深浅如何、明暗如何。色调(H，Hue)，饱和度(S，Saturation)，明度(V，Value)。用H和S分量来表示颜色距离，颜色距离指代表两种颜色之间的数值差异。RGB代表红、绿、蓝三种颜色，HSV代表色相饱和度和亮度，前者是计算机表面颜色的使用方法，不够直观，后者模拟人视觉原理更为直观。故使用以下公式进行RGB数据的HSV变换(图8)：
M＝max(R，G，B)
m＝min(R，G，B)
If R＝M，H’＝(G-B)/(M-m)
If G＝M，H’＝2+(B-R)/(M-m)
If B＝M，H’＝4+(R-G)/(M-m)
H＝H’×60
S＝(M-m)/M
V＝max(R，G，B)
从图8可以看出，随着菌浓度增加，ECL图像明度减小，与裸眼所见变化趋势基本一致。
实施例4不同恒电位下免疫磁珠-沙门氏菌在多色传感器的ECL图像：
阳极上滴加20μL根据实施例2优化得到的阳极混合发光剂(1.5mM[Ir(ppy)3]，0.125mM[Ru(bpy)3 2+]，50mM TPrA，0.1M TBAPF6/acetonitrile)；ITO双极电极的阴极上滴加20μL由实施例3得到的IMBs-S.typhimurium复合物。
据前期原理验证实验中ECL图像发现，在施加6.3V恒电压时ECL图像呈现黄色，此电位下红色和绿色发光体都产生激发，说明在6.3V左右铱配合物与钌配合物都产生了电致化学响应。故选取三个低(5.7V)、中(6.3V)、高(6.7V)电位来采集不同浓度免疫磁珠-沙门氏菌ECL图像。从图7可以看出，恒电位6.3V下无沙门氏菌的沙门免疫磁珠的ECL发射是红色，沙门氏菌浓度为10CFU/mL时ECL发射变为黄色，到105CFU/mL又变为绿色，这表明该多色电化学发光传感器能检测最低限度低至10CFU/mL，且能通过颜色判断沙门氏菌浓度范围，达到半定量的目的。
实施例5传感器特异性检测
根据实施实例3分别得到九份待测样液：10、103、105CFU/mL的E.coli O157：H7；10、103、105CFU/mL的S.typhimurium；10、103、105CFU/mL的E.coli O157：H7和S.typhimurium混合物；阳极上滴加20μL 1.5mM[Ir(ppy)3]，0.125mM[Ru(bpy)3 2+]，50mM TPrA，0.1M TBAPF6/acetonitrile，阴极为20μL待测样液，施以6.3V恒电压在双极电极两端，得到图9，从图9可看出，样本中仅存在E.coli O157：H7时，无论多大浓度阳极都显现橙红色；样本中存在E.coli O157：H7和S.typhimurium混合物时，相应浓度对应的颜色与仅存在S.typhimurium所得图像基本一致，说明该传感器受其他污染物的影响较小，能在较复杂环境的实际中应用。
实施例6实际样品检测
根据GB 4789.4-2016《食品安全国家标准-食品微生物检验-沙门氏菌检验》，分别处理实际样品牛肉、牛奶和蛋糕。
1、无菌操作称取5g样品，置于盛有45mL 0.85％无菌生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。若样品为液态，不需要均质，直接取22.5mL加入100mL锥形瓶内；
2、无菌操作将样品转至100mL锥形瓶内，然后分别标记1-6号，并向其中依次加入2.5mL浓度为102-107CFU/mL的沙门氏菌；
3、取40mL菌液于100mL锥形瓶中，加入200μg沙门氏菌免疫磁珠，在37℃ 130rpm恒温培养箱孵育30min；
4、通过磁铁吸附分离去上清，用1mL 1×PBS清洗3次，最后用100μL 1×PBS复溶，即得待测样液。
5、在ITO双极电极阳极滴加20μL阳极混合发光剂(1.5mM[Ir(ppy)3]，0.125mM[Ru(bpy)3 2+]，50mM TPrA，0.1M TBAPF6/acetonitrile)，阴极滴加20μL待测样液；
6、使用电化学工作站在电极上施加6.3V恒电位，并用数码相机采集ECL图像，结果见图10，牛肉、牛奶和蛋糕的ECL图像颜色与它们的参考值相吻合，说明本方法可适用于对食品中鼠伤寒沙门氏菌快速检测。
Claims (10)
1.一种多色传感器，其特征在于，所述多色传感器包括沙门氏菌免疫磁珠、ITO双极电极和阳极混合发光剂。
2.根据权利要求1所述的多色传感器，其特征在于，所述阳极混合发光剂为铱配合物[Ir(ppy)3]和钌配合物[Ru(bpy)3 2+]。
3.根据权利要求2所述的多色传感器，其特征在于，所述铱配合物[Ir(ppy)3] 浓度为0.375 mM-3.75 mM，所述钌配合物[Ru(bpy)3 2+]浓度为0.125 mM-1 mM。
4.根据权利要求1所述的多色传感器，其特征在于，所述ITO双极电极施用恒电压为6.3V。
5.权利要求1~4任一项所述的多色传感器在检测食品中的沙门氏菌中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述食品为牛奶、牛肉或蛋糕。
7.基于权利要求1~4任一项所述的多色传感器的可视化多色电化学发光技术快速检测沙门氏菌的方法，其特征在于，所述方法是通过沙门氏菌免疫磁珠特异性识别并捕获沙门氏菌（S. typhimurium），孵育形成IMBs- S. typhimurium复合物，在磁场作用下实现复合物的快速提取，再利用ITO双极电极联用电致化学发光技术检测得到S. typhimurium浓度与颜色变化的关系，最终确定待测样品中S. typhimurium的浓度。
8.根据权利要求7所述的多色传感器的基于可视化多色电化学发光技术快速检测沙门氏菌的方法，其特征在于，所述沙门氏菌为鼠伤寒沙门氏菌。
9.根据权利要求7所述的多色传感器的基于可视化多色电化学发光技术快速检测沙门氏菌的方法，其特征在于，所述沙门氏菌浓度101-106 CFU/mL。
10.根据权利要求7所述的多色传感器的基于可视化多色电化学发光技术快速检测沙门氏菌的方法，其特征在于，所述ITO双极电极施用恒电压为6.3 V时，当样品中没有沙门氏菌时，ECL发射显示为红色；当沙门氏菌浓度为10 CFU/mL时，ECL发射变为黄色；当沙门氏菌浓度为105 CFU/mL，ECL发射为绿色。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN114235936A (zh) * | 2021-12-20 | 2022-03-25 | 南京工业大学 | 一种时间感应传感器及其制备方法和应用 |
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