CN103275217A

CN103275217A - 磁珠法快速纯化抗体

Info

Publication number: CN103275217A
Application number: CN2013102570626A
Authority: CN
Inventors: 李华; 梁永波; 陆启玉
Original assignee: Henan University of Technology
Current assignee: Henan University of Technology
Priority date: 2013-06-26
Filing date: 2013-06-26
Publication date: 2013-09-04

Abstract

本发明涉及生物和制药行业，其利用亲和层析原理，将羧基磁珠活化后，连接上能与人和多种哺乳动物IgG分子Fc段结合的葡萄球菌A蛋白（SPA），所得Protein A磁珠可用于血清、腹水或细胞培养液中抗体的纯化。Protein A磁珠在抗体纯化方面特异性强、方便快捷，可广泛应用于生物和制药行业。

Description

磁珠法快速纯化抗体

技术领域

本发明涉及生物和制药行业，可以更方便和快捷地从动物腹水、血清或细胞培养物中纯化IgG类抗体。

背景技术

常用的抗体纯化方法有辛酸硫酸铵沉淀法、离子交换色谱法和SPA亲和色谱法等，这些方法在对抗体纯化的过程中，都需要大量的化学试剂和实验仪器（如离心机、纯化色谱工作站等）、配制多种缓冲液、进行多步的操作（如离心、沉淀、色谱纯化等），整个过程时间较长，且在有效工作时间内，人为操作或机器纯化的方法，其纯化的样本数量有限。磁珠法纯化抗体在操作方法、溶液用量、环保、多个（或批量）样本方面，较传统的纯化方法相比，优势明显，如表1所示。

纳米磁性粒子（magnetic nanoparticles，MNPs）是以磁性Fe₃O₄或γ-Fe₂O₃等为晶核，高分子基质或表面活性剂为壳经包被或包埋而形成的一种新型复合功能材料。微米级磁球除具有超顺磁性和功能基特性外，还具有尺寸小，偶联容量大，扩散速度快和悬浮稳定性高等优点，逐渐成为当今生物学和医学研究的重要手段。

金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）是一种从金黄色葡萄菌细胞壁分离的蛋白质，具有良好的免疫学特性。SPA具有和人及多种哺乳动物（如豚鼠、猪、小鼠、猴等）IgG分子结合的能力，其结合的部位是Fc段（结晶片段crystalline fragment，FC段）而不是Fab段（抗原结合片段，antigen-binding fragment，Fab段）。这种结合不会影响抗体的活性，而且在一定的pH值或离子强度下，又能将抗体和SPA分离开来。因此，利用这一性质，先将SPA通过EDC/NHS法偶联到微米级的磁珠上，即可从血清、腹水或细胞培养液中纯化IgG抗体。SPA对IgG免疫球蛋白的不同亚型其结合力是有差别的。

因此，ProteinA磁珠在抗体纯化方面特异性强、方便快捷，在生物和制药行业中将得到广泛应用。

表1 磁珠法纯化抗体与其他纯化方法比较

发明内容

本发明的目的在于提供一种快捷有效的抗体纯化方法，能在简单的实验条件下（磁力架和满足自己实验要求的离心管即可），在相同时间内可以人为纯化更多样本，效率更高。本发明包括下列步骤：

1、SPA亲和磁珠的制备

（1）取5mL羧基磁珠于15mL EP管中；

（2）加蒸馏水10mL涡旋10s，置于磁力架上吸附1min，吸走上清液，重复2次；

（3）pH 5.0的MES缓冲溶液清洗羧基磁珠，方法同（2）；

（4）根据羧基磁珠上羧基的量配制EDC/NHS，（本专利中使用的羧基磁珠上羧基的量大约是200uM，用MES缓冲液配制50mg/mL的EDC和25mg/mL的NHS），羧基磁珠上羧基的量/EDC/NHS的摩尔比大约为1-3/1-2/1-5（优选1/1/1）；

（5）将配制好的EDC/NHS溶液10mL，加入磁珠离心管中，涡旋10s，置于15-35℃（优选20℃）摇床上振荡1h进行羧基活化；

（6）活化完成，用MES缓冲液清洗磁珠2次，吸走上清；

（7）SPA蛋白连接：一定条件下进行偶联，反应缓冲液为0.02M pH7.4的磷酸缓冲液（PBS）；

（8）连接结束后，置于磁力架上，磁分离1min，吸走上清，注意不要吸到磁珠，并用差量法计算磁珠载体表面的SPA蛋白结合量；

（9）终止反应：加入1M甘氨酸溶液10mL，20℃摇床上振荡1h；

（10）磁分离1min，吸走上清，得到偶联好的ProteinA磁珠；

（11）用10mM pH7.4 的PBS缓冲液清洗ProteinA磁珠2次，并保存在缓冲液中备用。如果长期保存最好加入0.01%的NaN₃。

2、ProteinA磁珠纯化抗体

（1）根据纯化样本量，取ProteinA磁珠分装于适当的离心管中，用0.02M pH7.4 PBS缓冲液清洗磁珠2次；

（2）取血清样品，稀释1-3倍，与磁珠混匀，室温吸附10min，磁吸附，弃上清；

（3）用样品等体积PBS缓冲液清洗磁珠，磁吸附，弃上清，重复3次；

（4）用0.1M Glycine pH2.5-3.0缓冲液解离抗体；

（5）用适量的10mmol/L Tris-HCl缓冲液中和洗脱液，使其pH值大约为7.4左右，并保存抗体。

所述方法是利用磁珠的超顺磁性和SPA及抗体的Fc段特异性亲和反应的原理，更方便和快捷的方法从动物腹水、血清或细胞培养物中纯化IgG类抗体。所述 ProteinA磁珠可反复使用多次，还可用于除去抗体液中IgG和除去Fc段。另外，不同动物、不同样本中抗体与SPA结合的能力有差异，因此分离纯化的效果也不同。

附图说明

图1 ProteinA磁珠从人全血和猪血清中纯化抗体

Marker（M，从上到下次序）：97KD，66KD，43KD，30KD，15KD；

Lane 1：人全血；Lane 2：ProteinA磁珠从人全血（1mL）中纯化抗体；Lane 3：猪血清；Lane 4：ProteinA磁珠从猪血清（1mL）中纯化抗体。

图2 ProteinA磁珠从猪血清中纯化抗体

Marker（M，从上到下次序）：97KD，66KD，43KD，30KD，15KD；

Lane 1：猪血清；Lane 2-8：分别为第1-7次纯化；Lane 9：ProteinA磁珠清洗后，第8次纯化。

具体实施方式

以下是磁珠法快速纯化抗体的2个实例。

实施例1：ProteinA磁珠从人全血和猪血清中纯化抗体

1、抗体纯化

（1）取人全血0.5mL（或是猪血清0.1mL）于2mL EP管中；

（2）用pH 7.4 PBS缓冲液稀释人全血1-3倍；

（3）加入50uL ProteinA磁珠（使用前涡旋或用移液器吹打混匀磁珠）；

（4）涡旋振荡10s，室温孵育10min（期间可涡旋两次）；

（5）将离心管置于磁力架上，1min后吸走上清（离心管保持在磁力架上），注意不要吸到磁珠；

（6）加入500uL pH 7.4 PBS缓冲液，涡旋5s，清洗ProteinA磁珠；

（7）将离心管置于磁力架上，1min后吸走上清（离心管保持在磁力架上），注意不要吸到磁珠；

（8）重复步骤6和7，2次；

（9）吸尽离心管内的洗液，用pH2.6 0.1M 甘氨酸缓冲液50-100uL解离抗体，涡旋5-10s；

（10）将离心管置于磁力架上1-2min（至溶液澄清），转移上清到新的离心管内，即为纯化的抗体；

（11）加入10-20uL10mM Tris-HCl缓冲液中和洗脱液，-20℃保存抗体。

2、抗体浓度测定

使用Thermo Nanodrop 2000微量紫外分光光度计进行抗体浓度测定（操作见仪器使用说明）

（1）打开电脑和Nanodrop 2000微量紫外分光光度计；

（2）用洗脱液作对照进行调零；

（3）加样品进行浓度测定，可重复测定1-2次；

（4）纯净水进行清洗；

（5）记录测定结果，关闭Nanodrop 2000微量紫外分光光度计和电脑。

3、抗体纯度鉴定

电泳操作如下：

（1）取20uL解离样品，加入5uL 5X电泳上样Buffer，涡旋混匀，于沸水浴中，煮5min；

（2）按照SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳实验操作方法，配制5%的浓缩胶，15%的分离胶；

（3）加样，每孔20uL样品；

（4）电泳条件：恒压80V，电泳20min；然后恒压150V，电泳180min，待溴酚蓝前沿到达玻璃板底部时停止电泳，取出凝胶；在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色；

（5）固定，染色；采用0.05%考马斯亮蓝R-250（内含20%磺基水杨酸）染色液，染色与固定同时进行，使染色液没过胶板，摇床上染色30-60min；

（6）10%冰醋酸+10%乙醇浸泡漂洗30-60min，直至背景蓝色褪去；

（7）在凝胶成像仪进行扫描，拍照，见图1。

实施例2：ProteinA磁珠从猪血清中（1mL）纯化抗体—连续使用多次

1、抗体纯化

（1）取猪血清0.2mL于2mL EP管中；

（2）用pH 7.4 PBS缓冲液稀释1-3倍；

（3）加入50uLProteinA磁珠（使用前涡旋或用移液器吹吸混匀磁珠）；

（4）涡旋振荡10s，室温孵育10min（期间可涡旋两次）；

（6）加入500uL pH 7.4 PBS缓冲液，涡旋5s，清洗ProteinA磁珠；

（8）重复步骤6和7，2次；

（9）吸尽离心管内的洗液，用0.1M Glycine pH2.6缓冲液50-100uL，涡旋5-10s；

（11）加入10-20uL10mM Tris-HCl缓冲液中和洗脱液，-20℃保存抗体；

（12）用PBS缓冲液清洗ProteinA磁珠2次，重复1-11操作，如此循环7次;

（13）ProteinA磁珠清洗后，再纯化：先用10mL 0.1M pH8.5 Tris含0.5M NaCl溶液清洗磁珠上的残存杂蛋白；再用10mL 0.1M pH4.5醋酸钠缓冲液含0.5M NaCl溶液清洗磁珠上残存的杂蛋白，最后用PBS缓冲液清洗后，进行第8次抗体纯化。

2、抗体浓度测定

（1）打开电脑和Nanodrop 2000微量紫外分光光度计；

（2）用洗脱液作对照进行调零；

（3）加样品进行浓度测定，可重复测定1-2次；

（4）纯净水进行清洗；

（5）关闭Nanodrop 2000微量紫外分光光度计和电脑，记录测定结果。

3、抗体纯度鉴定

电泳操作如下（SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳）：

（1）取20uL解离样品，加入5uL 电泳上样Buffer，涡旋混匀，于沸水浴中，煮5min；

（2）电泳胶配制，按照SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳实验操作方法，配制5%的浓缩胶，15%的分离胶；

（3）加样，每孔20uL样品；

（6）10%冰醋酸+10%乙醇浸泡漂洗30-60min，直至背景蓝色褪去；

（7）在凝胶成像仪进行扫描，拍照，见图2。

Claims

1.磁珠法快速纯化抗体，其特征包括以下步骤一：SPA亲和磁珠的制备

（1）取羧基磁珠；

（2）蒸馏水清洗磁珠；

（3）用pH值5.0 MES缓冲溶液清洗羧基磁珠；

（4）采用EDC/NHS法活化羧基磁珠：根据羧基磁珠上羧基的量，配制EDC/NHS溶液；

（5）摇床上，适宜温度下进行充分活化；

（6）活化完成，用MES缓冲液清洗磁珠2次；

（7）SPA蛋白连接：一定条件下进行偶联，反应缓冲液为0.02M pH7.4的PBS缓冲液；

（8）连接结束后，磁分离，上清用差量法计算磁珠载体表面的SPA蛋白结合量；

（9）终止反应：加入终止液，摇床上振荡；

（10）磁分离1min，吸走上清，得到偶联好的ProteinA磁珠；

（11）用10mM pH7.4 的PBS缓冲液清洗ProteinA磁珠2次，并保存在缓冲液中备用。

2.磁珠法快速纯化抗体，其特征包括以下步骤二：ProteinA磁珠纯化抗体

（1）取ProteinA磁珠，用PBS缓冲液清洗；

（2）取血清样品，进行适当稀释后，加入ProteinA磁珠中，并涡混匀，室温10min；

（3）用PBS缓冲液清洗磁珠3次；

（4）用缓冲液解离抗体；

（5）用适量的缓冲液中和洗脱液，使其pH值大约为7.4左右，并保存抗体。

3.根据权利要求书1所述的羧基磁珠的活化技术，其特征在于所述第（4）步，羧基磁珠上羧基的量/EDC/NHS的摩尔比大约是1/1/1。

4.根据权利要求书1所述的羧基磁珠的活化技术，其特征在于所述第（5）步，活化温度为20℃，活化时间为1h。

5.根据权利要求书1所述的SPA蛋白连接技术，其特征在于所述第（7）步，连接温度为20℃，连接时间为2h。

6.根据权利要求书1所述的SPA蛋白连接后终止技术，其特征在于所述第（9）步，终止液为1M 甘氨酸，20℃摇床上振荡1h。

7.根据权利要求书2所述的磁珠法快速纯化抗体，其特征在于所述第（4）步，所用缓冲液为0.1M pH2.5-3.0的甘氨酸。

8.根据权利要求书2所述的磁珠法快速纯化抗体，其特征在于所述第（5）步，缓冲液为10mM Tris-HCl（pH 8.0）。