CN111308066A - 一种磁微粒富集检测生物医学及环境标本新方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种磁微粒富集检测生物医学及环境标本新方法，该方法主要包括以下步骤：制备免疫磁珠：使用偶联方法将磁小体与SPA偶联，制得免疫磁珠；连接免疫磁珠和相应的抗体：将所述SPA的Bdomain与抗体非可变区FC端结合，制得结合抗体的免疫磁珠；富集：将生物医学及环境标本与连接相应的抗体的磁珠混合，富集与抗体对应的抗原；本发明提供的方法对生物医学及环境标本中抗原的富集效果好，优于合成磁珠。

Description

一种磁微粒富集检测生物医学及环境标本新方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，特别涉及一种磁微粒富集检测生物医学及环境标本新方法。
背景技术
随着人口数量和密度的增加，大规模爆发流行性传染病(瘟疫)的风险日益增加，近年，SARS、禽流感、新冠肺炎在我国的爆发，都体现了这种严峻的趋势，空气传播是流行性疾病最主要的传播途径，尽早、迅速、准确、简便、低成本、高通量地确诊感染者，是控制瘟疫爆发的关键，然而，要做到这一点却并非易事，在2019年新冠肺炎的疫情中，我们可以看到如下问题：
①感染者的隐蔽性强：有不少感染者在早期没有明显症状，但依然具有较强的传染性，他们进入人口聚集的区域后，往往会造成大范围感染，如何发现并确诊这类患者，目前还没有一种有效的方法；
②医院成了传染源：有症状但未经确诊的患者，在就医时缺乏防护措施，从而造成病原体的大量传播；
③医护工作者缺乏：由于瘟疫突然爆发、疫情蔓延迅速，患者急剧增加，使得医护工作者的数量严重不足；同时，在诊疗过程中，大量医护工作者的感染，又加剧了这一状况；
④医疗资源缺乏：由于患者数量暴增，原有的病房、医疗器械、防护装备等资源严重不足；
⑤确诊速度缓慢：对于新发现的病毒，由于还没有相应的抗体，只能进行核酸检测，而核酸检测的灵敏度较低、假阴性比例高，有的病人甚至到第六次检测才确定为阳性，大大延误了确诊时间；
⑥取样部位尚未确定：新病毒在患者体内的分布规律还没有完全掌握，因此很难做到准确取样，而取样部位的准确与否，直接关系到检测结果的可靠性，虽然知道新冠病毒集中于肺部，但肺泡灌洗液操作复杂，需要特殊设备，很难进行高通量检测；而咽拭子等方法虽然简单、快速，但采集的病毒量小，依然有较高的假阴性比例。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供了一种磁微粒富集检测生物医学及环境标本新方法，该方法主要包括以下步骤：
制备免疫磁珠：使用偶联方法将磁小体与SPA偶联，制得免疫磁珠；
连接免疫磁珠和相应的抗体：将SPA的Bdomain与抗体非可变区FC端结合，制得结合抗体的免疫磁珠；
富集：将生物医学及环境标本与连接相应的抗体的磁珠混合，富集与抗体对应的抗原。
进一步地，SPA为SPA重组蛋白，该SPA重组蛋白的序列如下：
GGATCC CGSGSGSADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAAIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKGSGSGSADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAAIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAAGCTT。
进一步地，SPA重组蛋白是在对来自金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus的SPA基因的结构进行改造的基础上进行的，重组蛋白的合成方法包括以下步骤：
(a)在天然SPA基因的B domain的N端添加一个半胱氨酸引入巯基；
(b)在引入巯基的SPA基因的两端分别添加BamHⅠ与HindⅢ酶切位点；
(c)将步骤(b)的SPA基因克隆进入PET28(a+)载体，并转化进入E·coli BL21内；
(d)用IPTG进行诱导表达；
(e)用亲和层析柱进行分离纯化得到纯净蛋白，即得重组蛋白。
进一步地，制备免疫磁珠时使用的偶联剂为3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯。
进一步地，免疫磁珠的构建方法是将磁小体膜的氨基与重组蛋白SPA中的巯基进行偶联，构建方法包括以下步骤：
A.将3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯用DMSO溶解，3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯在DMSO中的浓度为5-15mg/mL，再加入PBS进行稀释，3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯在DMSO和PBS总体积中的浓度为0.5-1.5mg/mL，制得SPDP溶液；
B.取磁小体与SPDP溶液混合后置于EP管中，磁小体在SPDP溶液中的浓度为0.5-1.5mg/mL，超声波超声30次，超声1min，间歇1min；
C.用PBS(PH＝7.4)洗掉剩余的3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，然后加入1mg/mL的重组蛋白0.8-1.5mL，按照步骤B中操作方法进行偶联；
D.用PBS清洗偶联后的磁小体5-10次，即得免疫磁珠。
进一步地，连接免疫磁珠和相应的抗体的方法包括以下步骤：
Ⅰ.取免疫磁珠加入抗体中使免疫磁珠在抗体中的浓度为0.5-1.5mg/mL，超声波混匀，制得混合液；
Ⅱ.将混合液放置于摇床中在37℃、200rpm的条件下混合1.5-2.5h；
Ⅲ.将步骤B制得的混合物置于磁力架上磁力吸附0.5-1.5min,用PBS清洗5-10次，即得。
进一步地，富集的方法包括以下步骤：
S1:在待收集的样本中加入免疫磁珠，制得免疫磁珠-样本混合物；
S2:用超声混合器将免疫磁珠-样本混合物进行超声，超声时间不少于1min；
S3:再将免疫磁珠-样本混合物置于37℃，200rpm条件下混合，混合时间不少于30min；
S4:用磁力架对免疫磁珠-样本混合物进行磁力吸附后弃上清，用PBS(PH＝7.4)清洗三遍，即得磁珠-抗原混合物。
进一步地，方法还包括检测，检测的方法是直接加入辣根过氧化物酶标记的二抗或碱性磷酸没标记的二抗进行免疫检测。
进一步地，方法还包括检测，检测的方法是将抗原分离出来再进行检测，分离方法为：
(1)取浓度为100mM的甘氨酸溶液(PH＝2.5)，将磁珠抗原混合物加入后，混匀两分钟，磁珠抗原混合物在甘氨酸溶液中的浓度为4-6mg/mL；
(2)迅速将洗液转移至浓度为1M的Tris水溶液(PH＝8.0)中和，Tris与甘氨酸溶液的体积比为1-2:1-2，即得富集样本。
进一步地，分离后的检测方法包括血清学检测方法和核酸检测方法。
本发明提供的方法对生物医学及环境标本中抗原的富集效果好，优于合成磁珠。
说明书附图
图1.示出了重组蛋白SPA在大肠杆菌内表达的层析图；
图2.示出了重组蛋白SPA的亲和层析图。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供了一种磁微粒富集检测生物医学及环境标本新方法，该方法包括以下步骤：
制备免疫磁珠：使用偶联方法将磁小体与SPA偶联，制得免疫磁珠；
连接免疫磁珠和新冠肺炎抗体(购自北京义翘神州生物技术有限公司)：将SPA的Bdomain与抗体非可变区FC端结合，制得结合抗体的免疫磁珠；
富集：将生物医学及环境标本与连接相应的抗体的磁珠混合，富集与抗体对应的抗原；
其中，SPA为SPA重组蛋白，
SPA重组蛋白的序列如下：
GGATCC CGSGSGSADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAAIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKGSGSGSADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAAIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAAGCTT；
其中，SPA重组蛋白是在对来自金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus的SPA基因的结构进行改造的基础上进行的，重组蛋白的合成方法包括以下步骤：
(a)在天然SPA基因的Bdomain的N端添加一个半胱氨酸引入巯基；
(b)在引入巯基的SPA基因的两端分别添加BamH Ⅰ与HindⅢ酶切位点；
(c)将步骤(b)的SPA基因克隆进入PET28(a+)载体，并转化进入E·coli BL21内；
(d)用终浓度为1mM的IPTG进行诱导表达；
(e)用亲和层析柱进行分离纯化得到纯净蛋白，即得重组蛋白；
免疫磁珠的构建方法是将磁小体膜的氨基与重组蛋白SPA中的巯基进行偶联，构建方法包括以下步骤：
E.将3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯用DMSO溶解，3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯在DMSO中的浓度为5mg/mL，再加入PBS进行稀释，3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯在DMSO和PBS总体积中的浓度为0.5mg/mL，制得SPDP溶液；
F.取磁小体与SPDP溶液混合后置于EP管中，磁小体在SPDP溶液中的浓度为0.5mg/mL，超声波超声30次，超声1min，间歇1min；
G.用PBS(PH＝7.4)洗掉剩余的3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，然后加入1mg/mL的重组蛋白0.8mL，按照步骤B中操作方法进行偶联；
A.用PBS清洗偶联后的磁小体5次，即得免疫磁珠。
连接免疫磁珠和相应的抗体的方法包括以下步骤：
Ⅰ.取免疫磁珠0.5mg加入1mL抗体中用超声波混匀，制得混合液；
Ⅱ.将混合液放置于摇床中在37℃、200rpm的条件下混合1.5h；
Ⅲ.将步骤B制得的混合物置于磁力架上磁力吸附0.5min,用PBS清洗5次，即得；
其中，富集的方法包括以下步骤：
S1:在待收集的样本中加入免疫磁珠，制得免疫磁珠-样本混合物；
S2:用超声混合器将免疫磁珠-样本混合物进行超声，超声时间不少于1min；
S3:再将免疫磁珠-样本混合物置于37℃，200rpm条件下混合，混合时间不少于30min；
S4:用磁力架对免疫磁珠-样本混合物进行磁力吸附后弃上清，用PBS(PH＝7.4)清洗三遍，即得磁珠-抗原混合物；
分离方法为：
(1)取200μL浓度为100mM的甘氨酸溶液(PH＝2.5)，将1mg磁珠抗原混合物加入后，混匀两分钟，磁珠抗原混合物在甘氨酸溶液中的浓度为4-6mg/mL；
(2)迅速将洗液转移至100μL浓度为1M的Tris水溶液(PH＝8.0)中和，即得富集样本；
其中，重组蛋白SPA在大肠杆菌内表达见图1，重组蛋白SPA的纯化见图2。
实施例2
本实施例提供了一种磁微粒富集检测生物医学及环境标本新方法，该方法包括以下步骤：
制备免疫磁珠：使用偶联方法将磁小体与SPA偶联，制得免疫磁珠；
连接免疫磁珠和蓖麻毒素抗体(购自北京百奥莱博科技有限公司)：将SPA的Bdomain与抗体非可变区FC端结合，制得结合抗体的免疫磁珠；
富集：将生物医学及环境标本与连接相应的抗体的磁珠混合，富集与抗体对应的抗原；
其中，SPA为SPA重组蛋白，
SPA重组蛋白的序列如下：
GGATCC CGSGSGSADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAAIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKGSGSGSADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAAIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAAGCTT；
其中，SPA重组蛋白是在对来自金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus的SPA基因的结构进行改造的基础上进行的，重组蛋白的合成方法包括以下步骤：
(a)在天然SPA基因的Bdomain的N端添加一个半胱氨酸引入巯基；
(b)在引入巯基的SPA基因的两端分别添加BamHⅠ与HindⅢ酶切位点；
(c)将步骤(b)的SPA基因克隆进入PET28(a+)载体，并转化进入E·coli BL21内；
(d)用终浓度为1mM的IPTG进行诱导表达；
(e)用亲和层析柱进行分离纯化得到纯净蛋白，即得重组蛋白；
免疫磁珠的构建方法是将磁小体膜的氨基与重组蛋白SPA中的巯基进行偶联，构建方法包括以下步骤：
A.将3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯用DMSO溶解，3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯在DMSO中的浓度为10mg/mL，再加入PBS进行稀释，3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯在DMSO和PBS总体积中的浓度为1mg/mL，制得SPDP溶液；
B.取磁小体与SPDP溶液混合后置于EP管中，磁小体在SPDP溶液中的浓度为1mg/mL，超声波超声30次，超声1min，间歇1min；
C.用PBS(PH＝7.4)洗掉剩余的3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，然后加入1mg/mL的重组蛋白1.2mL，按照步骤B中操作方法进行偶联；
D.用PBS清洗偶联后的磁小体8次，即得免疫磁珠；
连接免疫磁珠和相应的抗体的方法包括以下步骤：
Ⅰ.取1mg免疫磁珠加入1mL抗体中用超声波混匀，制得混合液；
Ⅱ.将混合液放置于摇床中在37℃、200rpm的条件下混合2h；
Ⅲ.将步骤B制得的混合物置于磁力架上磁力吸附1min,用PBS清洗8次，即得；
其中，富集的方法包括以下步骤：
S1：在待收集的样本中加入免疫磁珠，制得免疫磁珠-样本混合物；
S2：用超声混合器将免疫磁珠-样本混合物进行超声，超声时间不少于1min；
S3：再将免疫磁珠-样本混合物置于37℃，200rpm条件下混合，混合时间不少于30min；
S4：用磁力架对免疫磁珠-样本混合物进行磁力吸附后弃上清，用PBS(PH＝7.4)清洗三遍，即得磁珠-抗原混合物；
分离方法为：
(1)取200μL浓度为100mM的甘氨酸溶液(PH＝2.5)，将0.8mg磁珠抗原混合物加入后，混匀两分钟；
(2)迅速将洗液转移至200μL浓度为1M的Tris水溶液(PH＝8.0)中和，即得富集样本。
实施例3
本实施例提供了一种磁微粒富集检测生物医学及环境标本新方法，该方法包括以下步骤：
制备免疫磁珠：使用偶联方法将磁小体与SPA偶联，制得免疫磁珠；
连接免疫磁珠和氯氰菊酯抗体(购自上海将来实业股份有限公司)：将SPA的Bdomain与抗体非可变区FC端结合，制得结合抗体的免疫磁珠；
富集：将生物医学及环境标本与连接相应的抗体的磁珠混合，富集与抗体对应的抗原；
其中，SPA为SPA重组蛋白，
SPA重组蛋白的序列如下：
GGATCC CGSGSGSADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAAIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKGSGSGSADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAAIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAAGCTT；
其中，SPA重组蛋白是在对来自金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus的SPA基因的结构进行改造的基础上进行的，重组蛋白的合成方法包括以下步骤：
(a)在天然SPA基因的Bdomain的N端添加一个半胱氨酸引入巯基；
(b)在引入巯基的SPA基因的两端分别添加BamHⅠ与HindⅢ酶切位点；
(c)将步骤(b)的SPA基因克隆进入PET28(a+)载体，并转化进入E·coliBL21内；
(d)用终浓度为1mM的IPTG进行诱导表达；
(e)用亲和层析柱进行分离纯化得到纯净蛋白，即得重组蛋白；
免疫磁珠的构建方法是将磁小体膜的氨基与重组蛋白SPA中的巯基进行偶联，构建方法包括以下步骤：
A.将3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯用DMSO溶解，3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯在DMSO中的浓度为15mg/mL，再加入PBS进行稀释，3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯在DMSO和PBS总体积中的浓度为1.5mg/mL，制得SPDP溶液；
B.取磁小体与SPDP溶液混合后置于EP管中，磁小体在SPDP溶液中的浓度为1.5mg/mL，超声波超声30次，超声1min，间歇1min；
C.用PBS(PH＝7.4)洗掉剩余的3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，然后加入1mg/mL的重组蛋白1.5mL，按照步骤B中操作方法进行偶联；
D.用PBS清洗偶联后的磁小体10次，即得免疫磁珠；
连接免疫磁珠和相应的抗体的方法包括以下步骤：
Ⅰ.取1.5mg免疫磁珠加入1mL抗体中用超声波混匀，制得混合液；
Ⅱ.将混合液放置于摇床中在37℃、200rpm的条件下混合2.5h；
Ⅲ.将步骤B制得的混合物置于磁力架上磁力吸附1.5min,用PBS清洗10次，即得；
其中，富集的方法包括以下步骤：
S1:在待收集的样本中加入免疫磁珠，制得免疫磁珠-样本混合物；
S2:用超声混合器将免疫磁珠-样本混合物进行超声，超声时间不少于1min；
S3:再将免疫磁珠-样本混合物置于37℃，200rpm条件下混合，混合时间不少于30min；
S4:用磁力架对免疫磁珠-样本混合物进行磁力吸附后弃上清，用PBS(PH＝7.4)清洗三遍，即得磁珠-抗原混合物；
分离方法为：
(3)取100μL浓度为100mM的甘氨酸溶液(PH＝2.5)，将1.2mg磁珠抗原混合物加入后，混匀两分钟；
(1)迅速将洗液转移至200μL浓度为1M的Tris水溶液(PH＝8.0)中和，即得富集样本。
试验例1对抗原的富集试验
免疫磁珠富集的回收率
取实施例1-3富集前的样本，测定其内的抗原数量，即为原始数量，使用实施例1-3的方法富集相应的抗原，再检测各组剩余上清液中抗原的数量，即为残留数量，按照以下公式计算富集回收率，结果见表1。
回收率＝(原始数量-残留数量)/原始数量.
与氯氰菊酯抗体对应的抗原和新冠抗体对应的抗原的浓度测定采取以下方法：
取各组富集前和富集后的抗原1μL稀释到6μLddH2O中，再加入1μLDNase和1μLRNase于37℃消化30min,完全去除样本外核酸干扰，100℃变性10min以充分释放基因组，加入1μL蛋白酶K56℃消化1h，10000rpm/min离心10min，转移上清液即制备好的抗原样品。
取合成质粒作为标准品，NanoDrop检测质粒浓度，样品拷贝数计算按照如下公式：
Figure BDA0002406428470000131
根据计算出的样品拷贝数数值将标准品稀释至终拷贝数为108、107、106、105、104、103标准品，以此为模板，每个做三个复孔，进行标准品和样品的qPCR扩增，最终根据标准品绘制标准曲线，根据抗原的CT值来计算抗原的拷贝数，拷贝数乘以体积即是数量；
与蓖麻毒素抗体对应的抗原采取高效液相色谱(HPLC)进行定量；具体包括以下步骤：
A.用天平准确称取标准品浓度，溶解并稀释至0、10、50、100、200、500mg/mL，选取合适流动相用高效液相色谱绘制标准曲线。
B.将样本在富集之前留样，加入免疫磁珠富集之后再留样，分别用液相色谱法测定其浓度，根据原始浓度和残留浓度即可计算出原始数量和残留数量。
表1.免疫磁珠富集的回收率实验结果.
组别 原始数量 残留数量 回收率(％)
实施例1 1×10<sup>5</sup> 5×10<sup>3</sup> 95％
实施例2 1×10<sup>5</sup> 7×10<sup>3</sup> 93％
实施例3 1×10<sup>5</sup> 7×10<sup>3</sup> 93％
由表1可知，实施例1-3组免疫磁珠富集的回收率均在90％以上，证明本发明提供的富集方法的回收率较高，能够很好地富集抗原。
试验例2灵敏度试验
取实施例1-3的样本，将各组样本进行梯度分别稀释5倍、10倍，并标记稀释倍数，分别按照实施例1-3的方法进行富集、分离，对捕获的样本依次进行PCR检测，直至PCR扩增不出特异性条带，将扩增不出特异性条带的样本进行绝对定量PCR来检测其拷贝数，该样本的拷贝数即为检测灵敏度，各组样本的灵敏度结果见表2。
表2.灵敏度试验结果.
组别 灵敏度
实施例1 10<sup>-3</sup>pfu·mL<sup>-1</sup>
实施例2 0.05ng·mL<sup>-1</sup>
实施例3 0.01ng·mL<sup>-1</sup>
由表2可知，使用本发明提供的方法富集抗原，灵敏度较高。
最后应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种磁微粒富集检测生物医学及环境标本新方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
制备免疫磁珠：使用偶联方法将磁小体与SPA偶联，制得免疫磁珠；
连接免疫磁珠和相应的抗体：将所述SPA的Bdomain与抗体非可变区FC端结合，制得结合抗体的免疫磁珠；
富集：将生物医学及环境标本与连接相应的抗体的磁珠混合，富集与抗体对应的抗原。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述SPA为SPA重组蛋白，所述SPA重组蛋白的序列如下：
GGATCC CGSGSGSADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAAIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKG
SGSGSADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAAIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAAGCTT。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述SPA重组蛋白是在对来自金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus的SPA基因的结构进行改造的基础上进行的，所述重组蛋白的合成方法包括以下步骤：
(a)在天然SPA基因的B domain的N端添加一个半胱氨酸引入巯基；
(b)在引入巯基的SPA基因的两端分别添加BamHⅠ与HindⅢ酶切位点；
(c)将步骤(b)的SPA基因克隆进入PET28(a+)载体，并转化进入E·coli BL21内；
(d)用IPTG进行诱导表达；
(e)用亲和层析柱进行分离纯化得到纯净蛋白，即得重组蛋白。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，制备所述免疫磁珠时使用的偶联剂为3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述免疫磁珠的构建方法是将磁小体膜的氨基与重组蛋白SPA中的巯基进行偶联，所述构建方法包括以下步骤：
A.将3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯用DMSO溶解，3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯在DMSO中的浓度为5-15mg/mL，再加入PBS进行稀释，3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯在DMSO和PBS总体积中的浓度为0.5-1.5mg/mL，制得SPDP溶液；
B.取磁小体与所述SPDP溶液混合后置于EP管中，所述磁小体在所述SPDP溶液中的浓度为0.5-1.5mg/mL，超声波超声30次，超声1min，间歇1min；
C.用PBS(PH＝7.4)洗掉剩余的3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，然后加入1mg/mL的重组蛋白0.8-1.5mL，按照步骤B中操作方法进行偶联；
D.用PBS清洗偶联后的磁小体5-10次，即得免疫磁珠。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，连接免疫磁珠和相应的抗体的方法包括以下步骤：
Ⅰ.取免疫磁珠加入抗体中使免疫磁珠在抗体中的浓度为0.5-1.5mg/mL，超声波混匀，制得混合液；
Ⅱ.将所述混合液放置于摇床中在37℃、200rpm的条件下混合1.5-2.5h；
Ⅲ.将步骤B制得的混合物置于磁力架上磁力吸附0.5-1.5min,用PBS清洗5-10次，即得。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，富集的方法包括以下步骤：
S1:在待收集的样本中加入免疫磁珠，制得免疫磁珠-样本混合物；
S2:用超声混合器将免疫磁珠-样本混合物进行超声，超声时间不少于1min；
S3:再将免疫磁珠-样本混合物置于37℃，200rpm条件下混合，混合时间不少于30min；
S4:用磁力架对免疫磁珠-样本混合物进行磁力吸附后弃上清，用PBS(PH＝7.4)清洗三遍，即得磁珠-抗原混合物。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括检测，所述检测的方法是直接加入辣根过氧化物酶标记的二抗或碱性磷酸没标记的二抗进行免疫检测。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括检测，所述检测的方法是将抗原分离出来再进行检测，所述分离方法为：
(1)取浓度为100mM的甘氨酸溶液(PH＝2.5)，将磁珠抗原混合物加入后，混匀两分钟，磁珠抗原混合物在甘氨酸溶液中的浓度为4-6mg/ml；
(2)迅速将洗液转移至浓度为1M的Tris水溶液(PH＝8.0)中和，Tris与甘氨酸溶液的体积比为1-2:1-2，即得富集样本。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，分离后的检测方法包括血清学检测方法和核酸检测方法。
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