CN101782578A - 一种包被金黄色葡萄球菌蛋白的免疫磁性微球的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种包被金黄色葡萄球菌蛋白的免疫磁性微球的制备方法，其包括如下步骤：a.将1～5体积份的磁性微球置入50体积份的金黄色葡萄球菌发酵裂解液中；b.向上述溶液中加入1～5体积份1～3％Tween和1～5体积份0.3～0.8％的戊二醛溶液；c.向上述溶液中加入5～25体积份0.2～0.8％的NaBH4；d.磁性分离得到免疫磁性微球。本发明的制备方法制得的免疫磁性微球，可以分离纯化各种兔源IgG，分离纯化抗体步骤简单，方法简便，可以直接从血清中分离纯化抗体，得到的产品纯度高，且免疫磁性微球重复使用次数可达5次以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种免疫磁性微球的制备方法，特别是涉及一种包被金黄色葡萄球菌蛋白的免疫磁性微球的制备方法，本发明还涉及这种免疫磁性微球的应用。
背景技术
金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal Protein A，PROA)是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质。它能与人及多种哺乳动物血清IgG分子中的Fc片段结合，不同种属其亲和性各不相同；PROA除与IgG结合外，还能与血清中少量的IgM和IgA结合。由于该蛋白具有免疫球蛋白Fc部位结合的特异性，因此被广泛的应用于种属及亚类抗体的检测和分离纯化、酶的固定化和各类生物分子的检测等研究中。
在以往的研究中，应用于抗体分离以及微生物检测的磁性微球类产品多为物理吸附和化学交联法。物理吸附的方法存在PROA易脱落，吸附抗体不稳定等缺点，而化学交联法则一般是利用化学反应将磁性微球表面材料的特征性官能团和PROA结合，再利用PROA与IgG生物特异性结合的特点实现吸附抗体的目的，这种方法虽然克服了上述缺点，但是由于引入化学物质造成的不必要空间位阻，使磁性微球吸附抗体效率低下，严重影响了磁性微球的应用。所以及其需要操作简单，安全可靠，且高效稳定的方法来解决此领域目前存在的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种包被金黄色葡萄球菌蛋白的免疫磁性微球的制备方法，以使PROA固定在磁性微球表面，可以用于分离纯化各种兔源lgG，分离纯化抗体步骤简单，方法简便，而且免疫磁性微球可以多次使用。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种包被金黄色葡萄球菌蛋白的免疫磁性微球的制备方法，其包括如下步骤：
a将1～5体积份的磁性微球置入50体积份的金黄色葡萄球菌发酵裂解液中；
b向上述溶液中加入1～5体积份1～3％Tween和1～5体积份0.3～0.8％的戊二醛溶液；
c向上述溶液中加入5～25体积份0.2～0.8％的NaBH4；
d磁性分离得到免疫磁性微球。
上述免疫磁性微球的制备方法，其中，步骤a中的磁性微球可以采用现有技术中的磁性微球，也可以采用下述方法制备的磁性微球：
a将纤维素和甲基氧化吗啉溶液以重量比5～10∶100混合均匀，其中甲基氧化吗啉的含水量低于11％，所用纤维素可以为微晶纤维素或脱脂棉花；
b将5～8重量份的FeCl2·4H2O溶于100重量份的去离子水中，加入70～80重量份的聚乙二醇，之后加入100～110重量份质量浓度为15％的H2O2，混合均匀后，加入6N的NaOH溶液调解pH值至10.5，溶液在50～60℃反应，得到棕黑色磁流体。
c将步骤a和b制得的纤维素溶液和棕黑色磁流体以体积比3～8∶1混合加入到含有1～2.5％(质量浓度)Tween的10～15体积份的四氯化碳溶液中，在8000～12000rpm转速下搅拌6～15分钟，之后在400～2500rpm下，于45～60℃下搅拌50～120分钟，磁性分离磁性微球。
上述的免疫磁性微球的制备方法，其中，所述步骤b中将溶液涡旋30～60分钟，静置40～80分钟。
上述免疫磁性微球的制备方法，其中，所述制得的免疫磁性微球的粒径为5～7微米。
本发明还提供了一种兔lgG的纯化方法，其包括如下步骤，
a在兔lgG血清中加入前述制备方法制得的免疫磁性微球，震荡后静置，磁性分离免疫磁性微球；
b将分离的免疫磁性微球用pH为7.4磷酸盐缓冲液洗涤，之后放入层析装置中；
c用pH值为2.5的甘氨酸-盐酸缓冲液洗涤，搜集洗脱液，中和洗脱液；
d将中和后的洗脱液透析，将透析后的液体冻干得到抗体纯品。
上述兔lgG的纯化方法，其中，所述步骤d中将中和后的洗脱液在4℃下去离子水中透析12小时。
本发明进一步还提供了一种兔抗人血清白蛋白lgG-PROA-免疫磁性微球的制备方法，其包括如下步骤：
a在4～7体积份的兔抗人血清白蛋白血清中加入1～2.5体积份的前述方法制备的免疫磁性微球，震荡后静置，磁性分离磁性微球；
b用pH为7.4磷酸盐缓冲溶液洗涤磁性微球后，加入1～2.5体积份0.1～0.5％的戊二醛溶液，震荡后静置，分离磁性微球；
c用pH为7.4磷酸盐缓冲液洗涤步骤b分离的磁性微球表面残留的戊二醛，之后加入1～2.5体积份pH值为7.4的磷酸盐缓冲液；
d在步骤c得到的溶液中加入1～2.5体积份的5～10％的NaBH4，震荡，磁性分离磁性微球，得到兔抗人血清白蛋白lgG-PROA-免疫磁性微球。
进一步，本发明还提供了一种人血清白蛋白的纯化方法，其包括如下步骤，
a在含有人血清白蛋白的溶液中，加入前述制备方法制得的兔抗人血清白蛋白lgG-PROA-免疫磁性微球，震荡后静置，分离磁性微球；
b用pH为7.5的甘氨酸-盐酸缓冲液洗涤磁性微球；
c将步骤b的洗脱液进行透析，将透析后的液体冻干得到纯化的人血清白蛋白。
上述人血清白蛋白的纯化方法，其中，所述步骤c中将洗脱液在4℃下去离子水中透析12小时。
本发明的包被金黄色葡萄球菌蛋白的免疫磁性微球的制备方法，利用戊二醛交联固定蛋白，将PROA固定在磁性微球表面，制得的免疫磁性微球可以分离纯化各种兔源IgG，分离纯化抗体步骤简单，方法简便，可以直接从血清中分离纯化抗体，避免了前期对样品的复杂处理，得到的产品纯度高，且免疫磁性微球重复使用次数可达5次以上，是一种高效，简便，价格低廉的抗体分离纯化方法，可以代替经典的层析分离装置。
具体实施方式
下面结合实施例详细描述本发明。
一包被金黄色葡萄球菌蛋白的免疫磁性微球的制备
实施例1
将由现有技术制备的1体积份的磁性微球置入50体积份的金黄色葡萄球菌发酵裂解液中，之后加入1体积份1％Tween和1体积份0.3％的戊二醛溶液，涡旋30分钟，静置40分钟，加入5体积份0.5％的NaBH4，涡旋30分钟后静置，用磁性分离装置分离收集磁性微球，用二次水充分清洁磁性微球表面，得到免疫磁性微球，将制得的免疫磁性微球保存在0.5％的NaN3溶液中保存。
制得的免疫磁性微球形状均匀，粒径在5～7微米。
实施例2
(一)磁性微球的制备
a纤维素溶液的制备
将甲基氧化吗啉(即NMMO)在60℃下减压蒸除水分，用非水滴定仪检测溶液中的水分，至含水量低于11％。
将微晶纤维素(固体粉末)与NMMO溶液以重量比8∶100混合，放置过夜成均匀的溶液。
b超顺磁性铁芯的制备
将5重量份的FeCl2·4H2O溶于100重量份的去离子水中，加入70重量份的聚乙二醇8000中，使之溶解，缓慢加入100重量份质量浓度为15％的H2O2，混匀后，开始缓慢加热，并用6N的NaOH溶液调节pH至10.5，在50℃的水浴中反应2小时，获得棕黑色磁流体。
c纤维素磁性微球的制备
将步骤a和b制得的纤维素溶液和超顺磁性铁芯以体积比3∶1混合加入到含有1％(质量浓度)Tween(即聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯)的10体积份的四氯化碳溶液中，在12000rpm转速下搅拌6分钟，之后在400rpm下，于45℃下搅拌120分钟，磁性分离磁性微球，用水和甲醇清洗备用。
(二)包被金黄色葡萄球菌蛋白的免疫磁性微球的制备
将前面制得的3体积份的磁性微球置入50体积份的金黄色葡萄球菌发酵裂解液中，之后加入3体积份2％Tween和3体积份0.5％的戊二醛溶液，涡旋40分钟，静置60分钟，加入15体积份0.2％的NaBH4，涡旋30分钟后静置，用磁性分离装置分离收集磁性微球，用二次水充分清洁磁性微球表面，得到免疫磁性微球，将制得的免疫磁性微球保存在0.5％的NaN3溶液中保存。
制得的免疫磁性微球形状均匀，粒径在5～7微米。
实施例3
(一)磁性微球的制备
a纤维素溶液的制备
将甲基氧化吗啉(即NMMO)在80℃下减压蒸除水分，用非水滴定仪检测溶液中的水分，至含水量低于11％。
将脱脂棉花与NMMO溶液以重量比5∶100混合，放置过夜成均匀的溶液。
b超顺磁性铁芯的制备
将6重量份的FeCl2·4H2O溶于100重量份的去离子水中，加入80重量份的聚乙二醇4000中，使之溶解，缓慢加入110重量份质量浓度为15％的H2O2，混匀后，开始缓慢加热，并用6N的NaOH溶液调节pH至10.5，在60℃的水浴中反应2小时，获得棕黑色磁流体。
c纤维素磁性微球的制备
将步骤a和b制得的纤维素溶液和超顺磁性铁芯以体积比8∶1混合加入到含有2％(质量浓度)Tween(即聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯)的15体积份的四氯化碳溶液中，在10000rpm转速下搅拌10分钟，在1800rpm下，于60℃下搅拌50分钟，磁性分离磁性微球，用水和甲醇清洗备用。
(二)包被金黄色葡萄球菌蛋白的免疫磁性微球的制备
将前面制得的5体积份的磁性微球置入50体积份的金黄色葡萄球菌发酵裂解液中，之后加入5体积份2％Tween和5体积份0.5％的戊二醛溶液，涡旋50分钟，静置60分钟，加入25体积份0.5％的NaBH4，涡旋30分钟后静置，用磁性分离装置分离收集磁性微球，用二次水充分清洁磁性微球表面，得到免疫磁性微球，将制得的免疫磁性微球保存在0.5％的NaN3溶液中保存。
制得的免疫磁性微球形状均匀，粒径在5～7微米。
实施例4
(一)磁性微球的制备
a纤维素溶液的制备
将甲基氧化吗啉(即NMMO)在50℃下减压蒸除水分，用非水滴定仪检测溶液中的水分，至含水量低于11％。
将微晶纤维素(固体粉末)与NMMO溶液以重量比10∶100混合，放置过夜成均匀的溶液。
b超顺磁性铁芯的制备
将8重量份的FeCl2·4H2O溶于100重量份的去离子水中，加入75重量份的聚乙二醇6000中，使之溶解，缓慢加入105重量份质量浓度为15％的H2O2，混匀后，开始缓慢加热，并用6N的NaOH溶液调节pH至10.5，在55℃的水浴中反应2小时，获得棕黑色磁流体。
c纤维素磁性微球的制备
将步骤(一)和(二)制得的纤维素溶液和超顺磁性铁芯以体积比6∶1混合加入到含有2.5％(质量浓度)Tween(即聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯)的12体积份的四氯化碳溶液中，在8000rpm转速下搅拌15分钟，在2500rpm下，于50℃下搅拌80分钟，磁性分离磁性微球，用水和甲醇清洗备用。
(二)包被金黄色葡萄球菌蛋白的免疫磁性微球的制备
将前面制得的1体积份的磁性微球置入50体积份的金黄色葡萄球菌发酵裂解液中，之后加入1体积份3％Tween和1体积份0.8％的戊二醛溶液，涡旋60分钟，静置80分钟，加入5体积份0.8％的NaBH4，涡旋30分钟后静置，用磁性分离装置分离收集磁性微球，用二次水充分清洁磁性微球表面，得到免疫磁性微球，将制得的免疫磁性微球保存在0.5％的NaN3溶液中保存。
制得的免疫磁性微球形状均匀，粒径在5～7微米。
二利用金黄色葡萄球菌蛋白免疫磁性微球进行兔lgG纯化
实施例5
在兔lgG血清中分别加入前述实施例1、2、3和4制得的免疫磁性微球，摇床震荡1小时后静置，磁性装置分离免疫磁性微球，将分离的免疫磁性微球用pH为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤，之后放入层析装置中，用pH值为2.5的甘氨酸-盐酸缓冲液洗涤，搜集洗脱液，中和洗脱液，将中和后的洗脱液透析，将透析后的液体在4℃下去离子水中透析12小时，每3小时换一次水，将透析得到的液体冻干，得到抗体纯品。
经SDS-PAGE凝胶电泳分析，IgG纯度达99％以上，每1ml免疫磁性微球分离100～130mg兔IgG。
三兔抗人血清白蛋白lgG-PROA-免疫磁性微球的制备
实施例6
在4体积份的兔抗人血清白蛋白血清中加入1体积份的前述实施例3制备的免疫磁性微球，摇床震荡1小时后静置，磁性分离磁性微球；用pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤磁性微球后，加入1体积份0.1％的戊二醛溶液，震荡后静置，分离磁性微球；用pH为7.4磷酸盐缓冲液洗涤步骤b分离的磁性微球表面残留的戊二醛，之后加入1体积份pH值为7.4的磷酸盐缓冲液；向上述溶液中加入1体积份的10％的NaBH4，震荡，磁性分离磁性微球，得到兔抗人血清白蛋白lgG-PROA-免疫磁性微球。
制得的免疫磁性微球形状均匀，粒径为5～7微米。
实施例7
在5体积份的兔抗人血清白蛋白血清中加入1.5体积份的前述实施例4制备的免疫磁性微球，摇床震荡1小时后静置，磁性分离磁性微球；用pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤磁性微球后，加入1.5体积份0.5％的戊二醛溶液，震荡后静置，分离磁性微球；用pH为7.4磷酸盐缓冲液洗涤步骤b分离的磁性微球表面残留的戊二醛，之后加入1.5体积份pH值为7.4的磷酸盐缓冲液；向上述溶液中加入1.5体积份的7％的NaBH4，震荡，磁性分离磁性微球，得到兔抗人血清白蛋白lgG-PROA-免疫磁性微球。
制得的免疫磁性微球形状均匀，粒径为5～7微米。
实施例8
在7体积份的兔抗人血清白蛋白血清中加入2.5体积份的前述实施例2制备的免疫磁性微球，摇床震荡1小时后静置，磁性分离磁性微球；用pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤磁性微球后，加入2.5体积份0.3％的戊二醛溶液，震荡后静置，分离磁性微球；用pH为7.4磷酸盐缓冲液洗涤步骤b分离的磁性微球表面残留的戊二醛，之后加入2.5体积份pH值为7.4的磷酸盐缓冲液；向上述溶液中加入2.5体积份的5％的NaBH4，震荡，磁性分离磁性微球，得到兔抗人血清白蛋白lgG-PROA-免疫磁性微球。
制得的免疫磁性微球形状均匀，粒径为5～7微米。
四利用兔抗人血清白蛋白IgG-PROA-免疫磁性微球分离纯化人学清白蛋白
实施例9
在含有人血清白蛋白的溶液中，分别加入实施例6、7和8制得的兔抗人血清白蛋白lgG-PROA-免疫磁性微球，震荡后静置，分离磁性微球，弃去上清液，用pH为7.5的甘氨酸-盐酸缓冲液洗涤磁性微球，将洗脱液置入透析袋中，在4℃下去离子水中透析12小时，每3小时换一次水，将透析后的液体冻干得到纯化的人血清白蛋白。
经SDS-PAGE测试人血清白蛋白纯度达99％以上，每1ml磁性微球可以分离大约100～130mg人血清白蛋白。
Claims (10)
1.一种包被金黄色葡萄球菌蛋白的免疫磁性微球的制备方法，其包括如下步骤：
a将1～5体积份的磁性微球置入50体积份的金黄色葡萄球菌发酵裂解液中；
b向上述溶液中加入1～5体积份1～3％Tween和1～5体积份0.3～0.8％的戊二醛溶液；
c向上述溶液中加入5～25体积份0.2～0.8％的NaBH4；
d磁性分离得到免疫磁性微球。
2.如权利要求1所述的免疫磁性微球的制备方法，其中，步骤a中的磁性微球的制备方法为：
a将纤维素和甲基氧化吗啉溶液以重量比5～10∶100混合均匀，其中甲基氧化吗啉的含水量低于11％；
b将5～8重量份的FeCl2·4H2O溶于100重量份的去离子水中，加入70～80重量份的聚乙二醇，之后加入100～110重量份质量浓度为15％的H2O2，混合均匀后，加入6N的NaOH溶液调解pH值至10.5，溶液在50～60℃反应，得到棕黑色磁流体。
c将步骤a和b制得的纤维素溶液和棕黑色磁流体以体积比3～8∶1混合加入到含有1～2.5％(质量浓度)Tween的10～15体积份的四氯化碳溶液中，在8000～12000rpm转速下搅拌6～15分钟，之后在400～2500rpm下，于45～60℃下搅拌50～120分钟，磁性分离磁性微球。
3.如权利要求1所述的免疫磁性微球的制备方法，其中，所述步骤b中将溶液涡旋30～60分钟，静置40～80分钟。
4.如权利要求1或2所述的免疫磁性微球的制备方法，其中，所述制得的免疫磁性微球的粒径为5～7微米。
5.如权利要求1或2所述的免疫磁性微球的制备方法，其中，所述制得的免疫磁性微球保存在0.5％的NaN3溶液中。
6.一种兔1gG的纯化方法，其包括如下步骤，
a在兔1gG血清中加入根据权利要求1或2的制备方法制得的免疫磁性微球，震荡后静置，磁性分离免疫磁性微球；
b将分离的免疫磁性微球用pH为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤，之后放入层析装置中；
c用pH值为2.5的甘氨酸-盐酸缓冲液洗涤，搜集洗脱液，中和洗脱液；
d将中和后的洗脱液透析，将透析后的液体冻干得到抗体纯品。
7.如权利要求6所述的纯化方法，其中，所述步骤d中将中和后的洗脱液在4℃下去离子水中透析12小时。
8.一种兔抗人血清白蛋白1gG-PROA-免疫磁性微球的制备方法，其包括如下步骤：
a在4～7体积份的兔抗人血清白蛋白血清中加入1～2.5体积份的根据权利要求1或2制备的免疫磁性微球，震荡后静置，磁性分离磁性微球；
b用pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤磁性微球后，加入1～2.5体积份0.1～0.5％的戊二醛溶液，震荡后静置，分离磁性微球；
c用pH为7.4磷酸盐缓冲液洗涤步骤b分离的磁性微球表面残留的戊二醛，之后加入1～2.5体积份pH值为7.4的磷酸盐缓冲液；
d在步骤c得到的溶液中加入1～2.5体积份的5～10％的NaBH4，震荡，磁性分离磁性微球，得到兔抗人血清白蛋白1gG-PROA-免疫磁性微球。
9.一种人血清白蛋白的纯化方法，其包括如下步骤，
a在含有人血清白蛋白的溶液中，加入权利要求8制得的兔抗人血清白蛋白1gG-PROA-免疫磁性微球，震荡后静置，分离磁性微球；
b用pH为7.5的甘氨酸-盐酸缓冲液洗涤磁性微球；
c将步骤b的洗脱液进行透析，将透析后的液体冻干得到纯化的人血清白蛋白。
10.如权利要求8所述的纯化方法，其中，所述步骤c中将洗脱液在4℃下去离子水中透析12小时。
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