CN101054594A - 双功能融合蛋白CBD－ProA载体及其制备的免疫磁性微球和应用 - Google Patents

Abstract

一种双功能融合蛋白CBD－ProA载体及其制备的免疫磁性微球和应用。本发明采用基因工程技术将金黄色葡萄球菌的蛋白A基因定向克隆至含有纤维素结合域标签的pET系列载体，构建了同时具有IgG抗体结合活性和纤维素结合活性的双功能融合蛋白CBD－ProA的载体，并转入E.Coli BL21感受态菌株，经IPTG低温诱导表达，获得高含量的CBD－ProA融合表达蛋白。并利用CBD－ProA作为生物桥联剂，将IgG抗体固定于纤维素磁性微球表面。以生物特异性偶联法代替传统的物理吸附法和化学键合法，即可高效率的结合抗体，得到可用于蛋白分离和病原微生物捕获鉴定的免疫磁性微球。本发明提供的纤维素免疫磁性微球可用于，混合样品中目的蛋白的免疫磁性分离，或污染、或病原样品中微生物的捕获与鉴定以及细胞的分离。

Description

双功能融合蛋白CBD-ProA载体及其制备的免疫磁性微球和应用

【技术领域】：本发明涉及纤维素结合域—金黄色葡萄球菌蛋白A(CBD-ProA)融合蛋白的克隆表达；利用CBD-ProA融合蛋白特异性的偶联抗体，制备纤维素免疫磁性微球；以及利用该技术进行目的蛋白的分离纯化和靶细胞的捕获及鉴定，属于生物技术领域。

【背景技术】：磁性微球(Magnetic Microspheres，MMS)，或叫磁性微珠(Magnetic Beads，MB)作为一种新型多功能试剂，近年来发展起来并广泛应用于磁性材料、生物工程以及生物医药等领域。磁性微球是指利用含有磁性金属或金属氧化物(如Fe、Co、Ni及其氧化物)超细粉末制备的具有磁响应性的高分子微球。由于其具有超顺磁性，给目标生物产品的分离带来了革命性的发展；而且由于其在磁性环境可以快速富集，因此为实现免疫学分析、分离，以及靶向给药提供了可能。纤维素磁性微球以其成本低廉，材质优良以及生物相容性高等优点，已经被应用于蛋白纯化、临床检验和酶固定化等方面。

抗体的固定化是实现磁性微球生物学特性的重要手段。早期用于固定化的方法主要采用物理吸附和化学偶联的方法。前者结合效率低、非特异性强，且存在抗体泄漏等问题。化学偶联法克服了前者的诸多缺点，但化学试剂的引入增加了工艺的危险性，给操作人员的身体健康带来隐患，同时抗体的偶联借助于化学官能团存在的随机性，从而引入一定的空间位阻，降低了其结合抗原的活性，这无疑影响了磁性微球在蛋白纯化以及检验检疫等方面的应用。因此需要研究一种操作简单、安全可靠、高效稳定的配体偶联方法，拓展磁性微球在生物医学领域的发展空间。

【发明内容】：本发明的目的是为纤维素磁性微球的抗体固定化开辟一条简易、安全、可靠的途径，涉及纤维素结合域—蛋白A(CBD-ProA)双功能融合蛋白的克隆和表达；纤维素磁性微球的生物特异性抗体偶联；以及上述免疫磁性微球在蛋白分离纯化、微生物的捕获以及鉴定等领域的应用。

本发明首先提供了一种具有IgG抗体结合活性和纤维素结合活性的双功能融合蛋白CBD-ProA，其碱基序列如序列表1所示。

本发明同时提供了一种含有上述序列的表达载体，也就是可以在大肠杆菌中表达来源于嗜纤维梭菌(Clostridium cellulovorans)纤维素结合域的pET系列载体。

本发明同时还提供了一种重组菌株，即用上述的表达载体pCBD-ProA转化的E.ColiBL21菌株。

本发明采用基因工程技术将金黄色葡萄球菌(Cowan I 6538)蛋白A(简称：ProA)具有和IgG的Fc段结合活性的基因片段，定向克隆至含有纤维素结合域(简称：CBD)的pET系列载体，构建了同时具有IgG抗体结合活性和纤维素结合活性的双功能融合蛋白CBD-ProA的载体，并转入E.Coli BL21感受态菌株，经IPTG低温诱导表达，获得高含量的CBD-ProA融合表达蛋白。并利用CBD-ProA作为生物桥联剂，将IgG抗体固定于纤维素磁性微球表面。以生物特异性偶联法代替传统的物理吸附法和化学键合法，得到可用于蛋白分离和病原微生物捕获鉴定的免疫磁性微球。

本发明所使用的载体为在大肠杆菌中表达的带有CBD标签的pET系列载体(pET34b(+)，pET35b(+))，所偶联的IgG抗体可以为来源于腹水或细胞培养液的单克隆抗体，也可以为来源于抗血清中的多克隆抗体。

本发明所提供的纤维素免疫磁性微球的具体制备方法是：是将纤维素磁性微球直接与权利要求3所述的重组菌株pCBD-ProA/E.Coli BL21的发酵菌体裂解液或其离心后的上清液混合，室温下振荡反应1至2小时，或4℃过夜，将融合蛋白CBD-ProA结合在纤维素磁性微球的表面；将用于特异性捕获和分离抗原的IgG抗体经缓冲液稀释后，直接进行振荡或静置吸附连接，抗体的浓度在0.1至20mg/mL范围内，温度保持在4至37℃之间，连接时间控制在0.5至24小时之内，即可制得可供一次性使用的抗体致敏的纤维素免疫磁性微球。

若需要反复使用免疫磁性微球，则可以采用化学交联的方法将CBD-ProA和IgG固定于纤维素磁性微球表面。交联剂可以使用1至100mM二甲基庚二酸酯(DMP)或0.05至1.0％戊二醛(GA)，反应时间控制在0.2至5小时之内。经过量的甘氨酸(Gly)中和，充分洗净后即得到抗体交联的纤维素免疫磁性微球。

本发明提供的纤维素免疫磁性微球可用于，混合样品中目的蛋白的免疫磁性分离，或污染、或病原样品中微生物的捕获与鉴定以及细胞的分离。

目的蛋白的分离纯化：

将偶联有抗目的蛋白抗体的纤维素免疫磁性微球，直接置于含有目的蛋白并适当稀释后的缓冲液中，振荡反应后；磁性吸附固定磁性微球，弃去反应液，经PBS充分洗净后，采用甘氨酸盐酸缓冲液(pH 1.5至3.5)解离吸附的目的蛋白；再次用磁力固定微球，收集解离液，并立即采用1M高浓度的磷酸盐缓冲液(pH 6.5至10.0)进行中和，得到纯化的目的蛋白。该免疫磁性微球经PBS洗净后，可重复使用。与常规的分离纯化方法相比较，采用该方法可大大的简化纯化步骤，一步纯化目的蛋白的纯度可以达到95％以上。

微生物的捕获与鉴定：

将偶联有抗目的微生物抗体的免疫磁性微球，直接置于适当稀释后的含有待测微生物的样品混悬液中，例如：污染的食物、水样品或者患者排泄物等。室温振荡反应后，磁性分离上述微球，充分淋洗后即可得到捕获有微生物细胞的免疫磁性微球。结合有微生物细胞的微球可作为富集的样品，直接用于进一步的微生物的常规鉴定或分子鉴定。与未经微球捕获富集的直接鉴定方法相比较，采用该方法可以提高灵敏度10-100倍。

其中，本专利中采用标准的ELISA夹心法确定IgG抗体的偶联量，具体方法是测定偶联前后溶液中抗体含量的变化，即为被磁性微球吸附的抗体量。采用10μg/mL羊抗鼠/或兔IgG抗体100μL包被酶标板，加入系列稀释的标准浓度的鼠/或兔IgG抗体(或样品溶液)100μL，室温放置2小时，充分清洗后加入2000倍稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠/或兔IgG抗体100μL，室温反应1小时后，充分清洗，加入邻苯二胺(OPD)底物溶液，反应5至10分钟后，终止反应，并于492nm处测定吸光度，根据标准抗体浓度计算溶液中抗体含量，并折算抗体的偶联量。

本发明的优点和有益效果：本发明利用CBD-ProA生物桥联剂将IgG抗体特异性固定于纤维素磁性微球载体上，操作简单，方便快速，短时间内即可得到抗体致敏的免疫磁性微球，大大简化了固定化步骤。同时，该方法避免了有害化学试剂的引入，降低工艺操作的危险性，同时保证了偶联抗体的生物学活性，大大降低了生产成本，提高了效率。通过生物特异性偶联方法制备的免疫磁性微球可以应用于目的蛋白的分离纯化，靶细胞的捕获和相应的病原微生物的检验检疫中。本发明可望替代传统的抗体固定化方法，成为一种简便、安全、高效的纤维素微球配体偶联新技术。

【附图说明】：

图1是纤维素磁性微球的环境扫描电镜照片(×1500)。

图2是CBD-ProA的SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析，其中：

A图为SDS-PAGE电泳分析，B图为免疫印迹分析；各泳道条件分别为：M：标准分子量蛋白；1：E.Coli BL21菌体蛋白；2：E.Coli BL21表达CBD蛋白裂解液；3和5：E.Coli BL21表达CBD-ProA蛋白裂解液；4和6：纤维素磁性微球吸附后的CBD-ProA蛋白裂解液。

图3是IFNα-2b纯化产物的高效液相色谱(A)，SDS-PAGE电泳(B)和免疫印迹(C)分析。

图4是免疫磁性微球捕获大肠杆菌的电镜照片(×1500，×10,000)。

图5是免疫磁性微球捕获PCR分析技术检测志贺氏菌，

图中各泳道条件：M：核酸标准分子量Marker；+：阳性对照；-：阴性对照；条带1-5：常规PCR分析；条带6-10：免疫磁性捕获PCR分析。志贺氏菌浓度，条带1，6：20,000CFU/mL；条带2，7：2,000CFU/mL；条带3，8：200CFU/mL；条带4，9：20CFU/mL；条带5，10：2CFU/mL。

【具体实施方式】：

实施例1、CBD-ProA双功能融合蛋白的制备：

1.金黄色葡萄球菌基因组的提取：

选取金黄色葡萄球菌标准株Cowan I 6538按常规过夜培养，离心后TBS缓冲液重悬，采用蛋白酶K和SDS Tris缓冲液充分裂解菌体，经饱和酚抽提水相蛋白，以预冷的无水乙醇沉淀基因组DNA，并将其最后溶于灭菌的双蒸水中。

2.蛋白A(ProA)的基因PCR扩增：

根据ProA的基因序列，设计含有NcoI和EcoRI酶切位点的上游和下游引物。

P1：GCGCCATGGCGCAACACGATGAAGCTCAA；

P2：CGCGAATTCGGTTTTGGTGCTTGAGCATCG；

以提取金黄色葡萄球菌的基因组DNA作为模板，PCR扩增ProA基因。PCR反应条件为：95℃预变性5分钟；94℃1分钟，54℃1分钟，72℃1分钟，共30个循环；72℃延伸10分钟，对上述PCR扩增产物经序列分析，其结果与GenBank登陆的Cowan I 6538序列(E01690)相一致。

3.基于大肠杆菌BL21菌株的CBD-ProA融合表达系统的构建：

分别采用限制性内切酶NcoI和EcoRI双酶切ProA的基因PCR扩增产物，及带有CBD标签的pET35b(+)载体。采用DNA回收试剂盒回收目的片段，T4连接酶连接后转入E.coliBL21菌株的感受态细胞，重组质粒经PCR和双酶切鉴定，获得含有CBD-ProA融合基因的重组质粒pCBD-ProA的E.coli BL21原核表达系统。

4.CBD-ProA融合蛋白的表达和鉴定：

将重组菌株接种于5mL含有卡那霉素50μg/mL的LB培养液中，37℃振荡培养至OD600达0.6时，采用终浓度为1mmol/L的IPTG于30℃诱导24小时。离心收集的菌体，采用PBS缓冲液重悬，超声波破碎处理5分钟，使菌体充分裂解，裂解产物分别进行CBD和ProA活性的鉴定。

5.CBD-ProA融合蛋白的鉴定：

将采用中国专利ZL03144274.9号所述方法制备的纤维素磁性微球(参见图1)与上述菌体裂解产物作用，将作用前后的溶液进行10％SDS-PAGE电泳分析。并进一步用半干式转印法将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，进行Western-blot鉴定，采用2000倍稀释的辣根过氧化物酶标记兔IgG作为示踪抗体，以二氨基联苯胺(DAB)作为显色底物。结果如图2所示，SDS-PAGE(A)和Western-blot(B)分析显示构建的重组菌株pCBD-ProA/E.ColiBL21表达一个57kDa的目的蛋白，并具有ProA的抗体结合活性(条带3，条带5)；在与纤维素磁性微球作用后，其目的蛋白的条带明显减弱(条带4，条带6)，表明其具有良好的纤维素结合活性。

实施例2、免疫磁性微球的制备1：

纤维素免疫磁性微球的制备是按照中国专利ZL03144274.9的方法所制备的纤维素磁性微球，取1mL纤维素磁性微球，室温下直接与50mL重组pCBD-ProA/E.Coli BL21菌株的发酵菌体裂解液振荡反应2小时(同实施例1)，用PBS缓冲液反复淋洗8次。再取1mL抗血清，以20mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)10倍稀释。将上述结合有CBD-ProA的纤维素磁性微球，室温下置于上述10mL的稀释液中，振荡吸附2小时。经PBS淋洗8次后，即得到可供一次性使用的抗体致敏的纤维素免疫磁性微球。

实施例3、免疫磁性微球的制备2：

实施例2中混合振荡反应1小时，吸附连接2小时。其余条件同例2。

为了使免疫磁性微球能反复利用，加入同微球等体积的10mM二甲基庚二酸酯(DMP)交联剂，室温反应时间2小时，采用化学交联的方法将CBD-ProA和IgG固定于纤维素磁性微球表面。再经等体积的1M甘氨酸(Gly)中和，用PBS缓冲液充分洗净后即得到抗体交联的纤维素免疫磁性微球。

实施例4、免疫磁性微球的制备3：

实施例3中的交联剂可以使用0.1％戊二醛(GA)，反应时间0.5小时。再经过量的甘氨酸(Gly)中和，充分洗净后也可以得到抗体交联的纤维素免疫磁性微球。

实施例5、免疫磁性微球的制备4：

实施例3中的交联剂可以使用25mM二甲基庚二酸酯(DMP)，反应0.5小时。再经过量的甘氨酸(Gly)中和，充分洗净后即得到抗体交联的纤维素免疫磁性微球。

实施例6、利用纤维素免疫磁性微球分离纯化干扰素α-2b：

干扰素α-2b(IFN α-2b)分离纯化用的纤维素免疫磁性微球，是按照中国专利ZL03144274.9的制备方法进行。取1mL纤维素磁性微球，室温下直接与50mL重组pCBD-ProA/E.Coli BL21菌株的发酵菌体裂解液振荡反应2小时，用PBS缓冲液反复淋洗8次。再取5mL鼠抗IFN α-2b单抗腹水，以20mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)10倍稀释。将上述结合有CBD-ProA的纤维素磁性微球，室温下置于50mL上述的稀释液中，振荡吸附2小时。经PBS充分洗净后，将微球重悬于10mL NaHCO₃-NaCO₃缓冲液中(pH8.5)，加入50mM的二甲基庚二酸酯(DMP)1mL，室温反应2小时，将CBD-ProA和捕获的IgG抗体交联固定于纤维素磁性微球的表面。最后加入1M甘氨酸(Gly)0.5mL终止反应，并充分洗净后即得到可用于干扰素分离纯化用的免疫磁性微球。采用ELISA夹心法确定其抗体偶联量为10.2mg/mL。

取1mL免疫磁性微球，置于磁性分离装置(选自中国专利ZL03144274.9)的玻璃容器中；取IFN α-2b发酵菌体裂解液5mL，12000rpm离心20分钟，取2.5mL上清液于50mLPBS缓冲液中(稀释20倍)，然后加入到玻璃容器中，于4℃振荡反应过夜。反应后采用磁性装置分离固定磁性微球，弃去反应液，然后用PBS清洗4次。再加入2mL 0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH2.5)，室温振荡反应1小时，解离被免疫磁性微球吸附的IFN α-2b。收集解离液，立即采用少量1M磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中和，得纯化IFN α-2b。免疫磁性微球经PBS清洗后，于4℃保存，备再次使用。经高效液相色谱(HPSEC)(图3A)，SDS-PAGE(图3B)和Western-blot(图3C)分析，纯度为95.5％，并显示了良好的重现性。

实施例7、污水中大肠杆菌的免疫磁性捕获与鉴定：

大肠杆菌捕获用的免疫磁性微球的制备方法是按照中国专利ZL03144274.9的制备方法进行。取1mL纤维素磁性微球，室温下直接与50ml重组pCBD-ProA/E.Coli BL21菌株的发酵菌体裂解液振荡反应2小时(同实施例1)，用PBS缓冲液反复淋洗。再将结合有CBD-ProA的纤维素磁性微球室温下，置于10mL以20mM NaHCO₃-NaCO₃缓冲液(pH8.5)10倍稀释后的兔抗大肠杆菌多抗血清中，振荡吸附2小时。经PBS充分洗净后，即得到用于大肠杆菌捕获用免疫磁性微球。采用ELISA夹心法确定其抗体偶联量为5.6mg/mL。

取上述制备的免疫磁性微球100μL，直接加入到50mL污水样品中，室温搅拌30分钟。将其置于磁珠收集器上(中国专利ZL03144274.9)收集磁性微球，并直接接种于LST肉汤管中。将接种的LST管放置35℃培养，检查和记录在24±2h时倒管内产气的试管，未产气的试管继续培养24h，在48±2h时检查和记录产气情况，对所有产气的试管进行确证试验。与直接取1mL污水样品接种LST管的传统检测方法相比，免疫磁性捕获鉴定方法可以直接从污水中直接富集目的大肠杆菌(图4)，再通过进一步的常规方法鉴定，且其灵敏度可以提高10倍以上。

实施例8：志贺氏菌的免疫磁性捕获PCR鉴定：

志贺氏菌捕获用免疫磁性微球是按照中国专利ZL03144274.9的制备方法进行。取1mL纤维素磁性微球，室温下直接与50ml重组pCBD-ProA/E.Coli BL21菌株的发酵菌体裂解液振荡反应2小时(同实施例1)，用PBS缓冲液反复淋洗。再将结合有CBD-ProA的纤维素磁性微球室温下，置于10mL以0.02M NaHCO3-NaCO3缓冲液(pH8.5)10倍稀释的兔抗志贺氏菌多抗血清中，振荡吸附2小时。经PBS充分洗净后，重悬于10mLNaHCO3-NaCO3缓冲液中(pH8.5)，加入0.5％的戊二醛(GA)1mL，室温反应30分钟，经PBS充分洗净后，加入1M甘氨酸溶液0.5mL终止反应，将CBD-ProA和捕获的IgG抗体固定于纤维素磁性微球的表面，即得到用于志贺氏菌特异性捕获的免疫磁性微球。采用ELISA夹心法确定其抗体偶联量为6.2mg/mL。

取细菌性痢疾患者的粪便排泄物，加入LB培养基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母浸出粉，10％NaCl，pH 7.4)中37℃培养16小时。取20μL免疫磁性微球加入培养基中，室温振荡反应15～30分钟，采用磁性分离装置(中国专利ZL03144274.9)收集磁性微球，并用PBS反复淋洗6次。加入100μL无菌水，于100℃热处理15分钟，离心去沉淀，以上清液为模板，直接采用种属特异性引物S1(CTGGATGGTATGGTGAGG)和S2(GGAGGCCAACAATTATTCC)进行PCR扩增。其反应条件为：94℃1分钟，56℃1分钟，72℃1分钟，经过40个循环后72℃延伸10分钟，扩增产物采用1％琼脂糖电泳分析，根据凝胶上相应分子量处出现扩增带与阳性模板对照判定结果。(图5)

采用生物特异性偶联方法制备的免疫磁性微球借助抗体的高活性结合，其最低检测限可以达到20CFU/mL。与传统的PCR方法相比，免疫磁性捕获-PCR技术可以直接从粪便排泄物和呕吐物中直接富集目的致病菌，通过热裂解进行PCR扩增，且其灵敏度可以提高100倍。

                        序列表1

<110>南开大学

<120>双功能融合蛋白CBD-ProA载体及其制备的免疫磁性微球和应用

<160>1

<210>1

<211>1566

<212>DNA

<213>嗜纤维梭菌(Clostridium cellulovorans)

     金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1，469，625，1498)

<223>n＝a或g或c或t

<220>

<221>CDS

<222>(279)...(389)

<400>1

atgtcagttg aattttacaa ctctaacaaa tcagcacaaa caaactcaat tacaccaata  60

atcaaaatta ctaacacatc tgacagtgat ttaaatttaa atgacgtaaa agttagatat  120

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cactaa                                                               1566

Claims (7)

1、一种具有IgG抗体结合活性和纤维素结合活性的双功能融合蛋白CBD-ProA，其碱基序列如序列表1所示。

2、一种表达载体，其特征在于含有权利要求1所述的序列，是可以在大肠杆菌中表达的pET系列载体，并含有来源于嗜纤维梭菌(Clostridium cellulovorans)的纤维素结合域。

3、一种重组菌株，其特征在于是用权利要求2的表达载体pCBD-ProA转化的E.ColiBL21菌株。

4、一种用于抗原捕获和分离的纤维素免疫磁性微球，其特征在于是以含有权利要求1所述的序列的融合蛋白CBD-ProA为生物桥联剂，在纤维素磁性微球表面特异性偶联抗体制成的纤维素免疫磁性微球。

5、一种权利要求4所述的纤维素免疫磁性微球的制备方法，其特征是将纤维素磁性微球直接与权利要求3所述的重组菌株pCBD-ProA/E.Coli BL21的发酵菌体裂解液或其离心后的上清液混合，室温下振荡反应1至2小时，或4℃过夜，将融合蛋白CBD-ProA结合在纤维素磁性微球的表面；将用于特异性捕获和分离抗原的IgG抗体经缓冲液稀释后，直接进行振荡或静置吸附连接，抗体的浓度在0.1至20mg/mL范围内，温度保持在4至37℃之间，连接时间控制在0.5至24小时之内，即可制得纤维素免疫磁性微球。

6、根据权利要求5所述的制备方法，其特征是通过交联剂将上述CBD-ProA和IgG固定在微球表面，经过量的甘氨酸中和，充分洗净后即得到抗体交联的纤维素免疫磁性微球；交联剂使用1至100mM二甲基庚二酸酯(DMP)或0.05至1.0％戊二醛(GA)，反应时间控制在0.5至5小时之内。

7、一种权利要求4所述的纤维素免疫磁性微球，在混合样品中目的蛋白的免疫磁性分离，或污染、或病原样品中微生物的捕获与鉴定以及细胞的分离中的应用。

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