CN103305462A

CN103305462A - 一种富集分离人外周血cd34+和cd91+淋巴细胞的方法

Info

Publication number: CN103305462A
Application number: CN2013102194172A
Authority: CN
Inventors: 许恒毅; 傅芬; 黄小林; 刘雯婷; 范丽娟; 熊勇华
Original assignee: Nanchang University
Current assignee: Hebei Youren Biotechnology Co ltd; Uren Beijing Biotechnology Co ltd
Priority date: 2013-06-05
Filing date: 2013-06-05
Publication date: 2013-09-18
Anticipated expiration: 2033-06-05
Also published as: CN103305462B

Abstract

本发明公开了分离富集外周血中CD34⁺和CD90⁺干细胞的方法，更好地为CD34⁺和CD90⁺干细胞进行后续研究提供基础，涉及生物医学领域。方法包括多臂井星聚合物与鼠抗人CD34⁺或CD90⁺单克隆抗体共价偶联、鼠抗人CD34⁺或CD90⁺单克隆抗体修饰的多臂井星聚合物再包被长链生物素分子、鼠抗人CD34⁺或CD90⁺单克隆抗体和长链生物素共修饰的多臂井星聚合物捕获外周血样品中的CD34⁺和CD90⁺干细胞、链霉亲和素修饰的纳米磁珠识别并偶联外周血中长链生物素化多臂井星聚合物、被捕获CD34⁺和CD90⁺干细胞的分离及重悬等步骤。重悬液可以直接进行后续分析，与传统的细胞分离方法相比，该方法更适用于在复杂外周血样品中对CD34⁺和CD90⁺干细胞进行磁分离，提高了外周血样品中CD34⁺和CD90⁺干细胞分离效率。

Description

一种富集分离人外周血CD34+和CD91+淋巴细胞的方法

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体是涉及基于纳米磁珠的CD34⁺和CD90⁺干细胞分离方法。

背景技术

干细胞分离和纯化是研究干细胞各种生物学特性的基本手段，有潜在的临床治疗价值。目前认为CD34⁺细胞是较早期的干细胞，但CD34⁺细胞是异质性的，其中多能干细胞只占一小部分，更原始的部分应该是CD34⁺/CD90⁺等。纯化出这些更原始的部分进行体外培养，才能更加真实地了解原始造血干细胞的特性和增殖、分化特征。然而，正常人外周血中CD34⁺和CD90⁺干细胞的含量很低，现有方法还无法对外周血中痕量CD34⁺和CD90⁺干细胞直接分离和采集。因此，建立一种高效分离和纯化人外周血中CD34⁺和CD90⁺干细胞的方法，并对其进行表型及生物学功能鉴定，为更好的研究CD34⁺和CD90⁺干细胞的功能提供基础。

免疫磁分离技术是外周血细胞快速分离富集技术的重要组成部分之一，该技术可高效捕获、浓缩人外周血样品中靶细胞，提高靶细胞检测灵敏度。近年来，基于磁性微珠的免疫磁分离法（IMS）是将抗体连接到磁珠上，然后再将连有抗体的磁珠投入样品液中对目标细胞进行捕获、富集以及磁分离（具体原理见图2A）。然而，目前基于微米级免疫磁珠的分离技术存在诸多局限性：1）与纳米磁珠相比，微米磁珠的比表面积相对较小，降低了磁珠捕获效率；2）由于微米磁珠自身的颗粒性质，其与细胞之间通过多相反应（multiphase reaction）结合，通常需要更长的时间去特异性捕获食品基质中的细胞；3）微米磁珠单分散性较差，在外周血基质中容易发生自身聚集或形成沉淀；4）传统的免疫磁分离技术，往往是将抗体直接偶联于免疫磁珠上，此操作常常会引起抗体活性大幅度降低以及导致抗体的空间方向发生改变，并增大了抗体间的空间位阻效应，从而降低了抗体的捕获效率5）血液粘稠度高并且其中非CD34⁺和CD90⁺干细胞的血细胞浓度大，微米磁珠容易产生非特异性吸附，难以实现对血液中CD34⁺和CD90⁺干细胞的特异性分离；6）微米磁珠的浓度过高会造成CD34⁺和CD90⁺干细胞的破损（磁场导致细胞表面磁珠互相吸引，使细胞受到挤压甚至破裂），导致分离的失败；7）磁珠偶联抗体时，一般采用疏水吸附或化学偶联方式将具有活性的抗体联接在磁珠表面。抗体与磁珠表面距离太近，磁珠本身性质及其表面残留的疏水或强亲水基团容易引起抗体空间构象发生改变，导致抗体生物活性下降。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种捕获效率高、简便分离时间短，低梯度磁场下（小于30 T/m）复杂的外周血基质中CD34⁺和CD90⁺干细胞特异性快速分离的方法。包括如下步骤：

一种富集分离人外周血CD34⁺和CD91⁺淋巴细胞的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）每取1.0 mg多臂井星聚合物溶解于2 mL，0.02 M，pH 6.5 PBS，加入0.6 mg NHSS，0.4 mg EDC，室温置于混匀仪上搅拌，活化15 min；取2.14 mg 鼠抗人CD34⁺抗体加入上述反应液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；将上述溶液减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥得多臂井星聚合物-鼠抗人CD34⁺抗体复合物。

（2）每取1.0 mg多臂井星聚合物溶解于2 mL，0.02 M，pH 6.5 PBS，加入0.6 mg NHSS，0.4 mg EDC，室温置于混匀仪上搅拌，活化15 min；取2.14 mg 鼠抗人CD90⁺抗体加入上述反应液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；将上述溶液减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥；

（3）每取22.5 mg 长链生物素，5.4 mg NHSS，3.6 mg EDC溶解于3 mL 0.02 M pH 6.5 PBS缓冲液中；将0.8 mg多臂井星聚合物-抗体复合物加入到上述溶液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；将上述溶液减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥得相应长链生物素-多臂井星聚合物-抗体复合物。

（4）富集捕获：取待测样品溶液1mL，加入0.1 mg 长链生物素-多臂井星聚合物-CD34⁺抗体复合物，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min形成长链生物素-多臂井星聚合物-抗体-CD34⁺细胞抗原复合物；加入0.1 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠，置于混匀仪上，以30 rpm的转速再室温孵育15 min，将离心管插入常规磁力架充分分离。磁分离后，用等体积的PBS溶液重悬细胞，即为CD34⁺细胞；将分离后的上清液用等体积的PBS溶液洗涤，离心300rpm/min，20℃ 10 min，弃去上清，用等体积的PBS溶液重悬细胞；加入0.1 mg 长链生物素-多臂井星聚合物-CD90⁺抗体复合物，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min形成长链生物素-多臂井星聚合物-抗体-CD90⁺细胞抗原复合物；加入0.1 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠，置于混匀仪上，以30 rpm的转速再室温孵育15 min，将离心管插入常规磁力架充分分离，即得到CD90⁺细胞；

（5）去离子水轻轻清洗后，用PBS缓冲液混重悬即得富集有CD34⁺或CD90⁺细胞的复合物即纳米磁珠-链霉亲和素-生物素-多臂井星聚合物-抗体-CD34⁺或CD90⁺细胞抗原。

所述多臂井星聚合物为多臂井星化聚酰胺-胺，其分子量为 70000 Da。结构如图1。

所述修饰了链霉亲和素的纳米磁珠粒径为20-50 nm ，优选为30 nm。

所述外周血干细胞的采集的方法包括如下步骤：用COBE.Spectra.AutoPBMC^TM干细胞采集仪，输入病人身高、体重、红细胞压积，液体参数：起始液体为1000 mL 9 g/L NaCl，血浆收集体积和干细胞收集体积均设为100 mL，起始抗凝剂比例1:13，收集速度50 mL/min。

多臂井星聚合物通过氨基和CD34⁺或CD90⁺干细胞抗体的羧基实现多臂井星聚合物和抗体的共价偶联。

多臂井星聚合物通过氨基和长链生物素分子的羧基，实现多臂井星聚合物和长链生物素的共价偶联；加入过量长链生物素以保证封闭多臂井星聚合物上裸露的氨基位点。

具体原理见图2B。

本方法特别适用于复杂样品的分离，如人外周血样品等。样品处理按照常规处理方法即可。

采用本发明技术方案具有如下有益效果：

1、本发明借助了多臂井星聚合物的级联放大效应，将磁细胞信号成指数级扩大，在较低的磁场强度下就能实现磁细胞的分离，且在相同的时间内，较常规免疫磁珠分离方法相比，分离到目的细胞能力更强，特别适用于复杂样品的分离，如外周血样品等。针对单纯采用抗体修饰后的20-50 nm免疫磁珠分离复杂基质样品中的目的细胞速度慢、磁场要求高的缺陷，采用多臂井星聚合物实现纳米磁珠磁信号的放大，从而提高了复杂基质样品中目的细胞分离效率，实现了在低梯度磁场下（小于30 T/m）复杂的食品基质中目的细胞特异性快速分离。

2、本方案为将抗体分子偶联于多臂井星聚合物上，避免了常规方法中将抗体分子偶联于磁珠表面导致抗体活性降低和空间位阻大的缺点。

3、本发明采用多臂井星聚合物，可以使反应溶液更加稳定，不易发生沉淀，增加了抗体与目标细胞接触的机会，有利于提高捕获效率；同时，多臂井星聚合物上连有大量的长链生物素分子，可以结合链霉亲和素修饰的纳米磁珠，从而使多臂井星聚合物上结合大量的纳米磁珠，实现了磁细胞信号的级联放大，有利于缩短磁细胞的分离时间。

4、以纳米磁珠（20-50 nm）代替微米级磁性微粒后，由于纳米磁珠粒径小，比表面积大，与细胞表面抗原结合的位阻小，细胞表面磁珠的覆盖效率显著提高，且磁性纳米粒子覆盖的细胞可以保持正常的形状，纳米磁珠在复杂基质中也有较好的分散性和稳定性，因此纳米磁珠的使用可以克服上述种种由于使用微米磁珠造成的缺陷。

5、本发明在分离过程中，引入了多臂井星聚合物，多臂井星聚合物上连有大量的长链生物素分子，可以特异且高亲和性地与分散在基质溶液中偶联有链霉亲和素纳米磁珠识别，从而使多臂井星聚合物上结合大量的纳米磁珠，大大增加了靶细胞表面结合的磁珠数量，实现了在磁场下快速分离所捕获的靶细胞。与传统的细胞磁分离方法相比，因加入的是在基质中更为稳定的纳米磁珠，该方法更适用于在复杂基质中对细胞进行磁分离，提高了复杂基质样品中目的细胞分离效率。

6、磁珠偶联抗体时，一般采用疏水吸附或化学偶联方式将具有活性的抗体联接在磁珠表面。抗体与磁珠表面距离太近，磁珠本身性质及其表面残留的疏水或强亲水基团容易引起抗体空间构象发生改变，导致抗体生物活性下降。然而本实验方案在偶联过程中引入多臂井星聚合物，其具有一定的空间大小，从而使抗体分子远离磁珠和磁珠表面，避免了磁珠本身性质及表面对抗体分子的不利影响。同时，引入的多臂井星聚合物却不会影响抗体空间构象，从而起到了保护抗体分子生物活性的作用。

附图说明

图1 多臂井星聚合物的结构示意图。

图2 常规磁分离技术（A）及本发明所涉及的磁分离技术（B）的操作流程图。

具体实施方式

为了使本发明更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

长链生物素为购买于美国Thermo Fisher Scientific 公司羧基化长链生物素（EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin，分子量556.59）。

修饰有链霉亲和素的纳米磁珠（30 nm）购买于美国Ocean NanoTech 公司。

氨基化的多臂井星聚合物为多臂井星化聚酰胺-胺，其分子量为70000 Da，购自于威海晨源化工新材料有限公司。

常规磁力架分离磁场强度小于30T/m。

N-羟基丁二酰亚胺NHSS, 乙基3-（3-二甲氨基）碳二亚胺盐酸盐EDC等均为常规试剂，不再赘述。

0.1%PBST 配制方法：8.0 g NaCl、0.2 g KCl、0.24 g KH₂PO₄、1.44 g Na₂HPO₄溶解于800 mL蒸馏水中，用5 M NaOH调整pH至7.4，再定容至1000 mL即得0.01M PBS。再以1/1000(V/V)的体积比加入Tween 20，即获得0.1%PBST。

实施例1

1.多臂井星聚合物-鼠抗人CD34⁺抗体复合物，按照如下步骤制备:

（1）每取1.0 mg多臂井星聚合物多臂井星化聚酰胺-胺溶解于2 mL，0.02 M，pH 6.5 PBS，加入0.6 mg NHSS，0.4 mg EDC，室温置于混匀仪上搅拌，活化15 min；

（2）取2.14 mg 鼠抗人CD34⁺抗体加入上述反应液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；

（3）将上述溶液减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥。

2.多臂井星聚合物-鼠抗人CD90⁺抗体复合物，按照如下步骤制备:

（1）每取1.0 mg氨基化的多臂井星聚合物溶解于2 mL，0.02 M，pH 6.5 PBS，加入0.6 mg NHSS，0.4 mg EDC，室温置于混匀仪上搅拌，活化15 min；

（2）取2.14 mg 鼠抗人CD90⁺抗体加入上述反应液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；

3.长链生物素-多臂井星聚合物-抗体复合物按照如下步骤制备：

（1）每取22.5 mg 长链生物素，5.4 mg NHSS，3.6 mg EDC溶解于3 mL 0.02 M pH 6.5 PBS缓冲液中；

（2）将0.8 mg多臂井星聚合物-抗体复合物加入到上述溶液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；

4.富集捕获：取待测样品溶液1mL，加入0.1 mg 长链生物素-多臂井星聚合物-CD34⁺抗体复合物，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min形成长链生物素-多臂井星聚合物-抗体-CD34⁺细胞抗原复合物；加入0.1 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠，置于混匀仪上，以30 rpm的转速再室温孵育15 min，将离心管插入常规磁力架充分分离。磁分离后，用等体积的PBS溶液重悬细胞，即为CD34⁺细胞。将分离后的上清液用等体积的PBS溶液洗涤，离心（300rpm/min，20℃）10 min，弃去上清，用等体积的PBS溶液重悬细胞。加入0.1 mg 长链生物素-多臂井星聚合物-CD90⁺抗体复合物，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min形成长链生物素-多臂井星聚合物-抗体-CD90⁺细胞抗原复合物；加入0.1 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠，置于混匀仪上，以30 rpm的转速再室温孵育15 min，将离心管插入常规磁力架充分分离，即得到CD90⁺细胞。

5.去离子水轻轻清洗后，用PBS缓冲液混重悬即得富集有CD34⁺或CD90⁺细胞的复合物即纳米磁珠-链霉亲和素-生物素-多臂井星聚合物-抗体-CD34⁺或CD90⁺细胞抗原。

实施例2 富集效果实验

（1）取1 mL浓度为10⁴细胞/mL的CD34⁺或CD90⁺细胞于1.5 mL无菌离心管中，12000 rpm离心5 min，弃上清，用等体积无菌PBS溶液重悬。

（2）富集捕获：分别设置本发明技术方案组（CD34⁺或CD90⁺细胞抗体和长链生物素共修饰的多臂井星聚合物组）、CD34⁺或CD90⁺细胞特异性抗体修饰的纳米磁珠组、CD34⁺或CD90⁺细胞特异性抗体修饰的微米磁珠组富集靶细胞。

（3）磁分离后，将上清液倒入无菌离心管中，而分离出来捕获有CD34⁺或CD90⁺细胞的免疫磁珠则用PBST清洗两次，混合均匀，并用1 mL无菌PBS溶液重悬免疫磁珠复合物。

（4）捕获率计算：将各组富集的靶细胞重悬液进行梯度稀释后，用流式细胞仪（Flow Cytometer）检测数量，通过捕获效率公式计算靶细胞的捕获效率，每次实验重复三次。各组捕获效率的计算公式如下：（被富集吸附的靶细胞总数/所有的细胞总数）×100%。

所述各组富集捕获靶细胞的方案如下：

a.本发明技术方案组（CD34⁺或CD90⁺细胞抗体和长链生物素共修饰的多臂井星聚合物组）富集捕获靶细胞方案如实施例1，具体如下：

将0.1 mg CD34⁺细胞抗体和生物素共修饰的多臂井星聚合物即生物素-多臂井星聚合物-抗体复合物加入到含靶细胞离心管中，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min。然后加入0.1 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠，置于混匀仪上，以30 rpm的转速再室温孵育15 min。最后，将离心管插入常规磁力架分离3 min。磁分离后，用等体积的PBS溶液重悬细胞，即为CD34⁺细胞。将分离后的上清液用等体积的PBS溶液洗涤，离心（300rpm/min，20℃）10 min，弃去上清，用等体积的PBS溶液重悬细胞。加入0.1 mg 长链生物素-多臂井星聚合物-CD90⁺抗体复合物，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min形成长链生物素-多臂井星聚合物-抗体-CD90⁺细胞抗原复合物；加入0.1 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠，置于混匀仪上，以30 rpm的转速再室温孵育15 min，将离心管插入常规磁力架充分分离，即得到CD90⁺细胞。

b. CD34⁺或CD90⁺细胞特异性抗体修饰的纳米磁珠组富集捕获靶细胞方案具体如下：

将0.1 mg制备好的 CD34⁺细胞特异性抗体修饰的纳米磁珠加入到含靶细胞离心管中，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min。最后，将离心管插入常规磁力架分离3 min。磁分离后，用等体积的PBS溶液重悬细胞，即为CD34⁺细胞。将分离后的上清液用等体积的PBS溶液洗涤，离心（300rpm/min，20℃）10 min，弃去上清，用等体积的PBS溶液重悬细胞。加入0.1 mg CD90⁺细胞特异性抗体修饰的纳米磁珠，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min，将离心管插入常规磁力架充分分离，即得到CD90⁺细胞。

所述CD34⁺或CD90⁺细胞特异性抗体修饰的纳米磁珠制备：（1）取10 mg纳米磁珠（30 nm，没有偶联链霉亲和素）依次用无水乙醇，1 M NaOH，1 M HCl各洗涤一次，PBS（0.02 M，pH 4.0）洗三次，无菌PBS重悬。加入NHSS 0.4 mg，EDC 0.35 mg，置于混匀仪上保持磁珠悬浮，37℃活化2 h。（2）磁力架回收磁珠，PBS（0.02 M，pH 4.0）洗涤三次后，磁珠重悬于无菌PBS中，按每mg磁珠加入80 μg CD34⁺或CD90⁺细胞特异性抗体，置于混匀仪上37℃偶联2 h。（3）加入乙醇胺室温封闭2 h。磁架回收磁珠，PBS 洗涤三次，10 ml PBS（含0.05% NaN₃, 0.5% BSA，pH 7.4）重悬免疫磁珠并于4℃冰箱保存备用。

c. CD34⁺或CD90⁺细胞特异性抗体修饰的微米磁珠组富集捕获靶细胞方案具体如下：

将0.1 mg制备好的CD34⁺细胞特异性抗体修饰的微米磁珠加入到含靶细胞离心管中，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min。最后，将离心管插入常规磁力架分离3 min。磁分离后，用等体积的PBS溶液重悬细胞，即为CD34⁺细胞。将分离后的上清液用等体积的PBS溶液洗涤，离心（300rpm/min，20℃）10 min，弃去上清，用等体积的PBS溶液重悬细胞。加入0.1 mg CD90⁺细胞特异性抗体修饰的微米磁珠，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min形，将离心管插入常规磁力架充分分离，即得到CD90⁺细胞。

所述CD34⁺或CD90⁺细胞特异性抗体修饰的微米磁珠制备：（1）取10 mg微米磁珠（1150 nm，没有偶联链霉亲和素）依次用无水乙醇，1 M NaOH，1 M HCl各洗涤一次，PBS（0.02 M，pH 4.0）洗三次，无菌PBS重悬。加入NHSS 0.4 mg，EDC 0.35 mg，置于混匀仪上保持磁珠悬浮，37℃活化2 h。（2）磁力架回收磁珠，PBS（0.02 M，pH 4.0）洗涤三次后，磁珠重悬于无菌PBS中，按每mg磁珠加入80 μg CD34⁺或CD90⁺细胞特异性抗体，置于混匀仪上37℃偶联2 h。（3）加入乙醇胺室温封闭2 h。磁架回收磁珠，PBS 洗涤三次，10 ml PBS（含0.05% NaN₃, 0.5% BSA，pH 7.4）重悬免疫磁珠并于4℃冰箱保存备用。

各组捕获率如下：

CD34⁺细胞特异性抗体修饰的微米磁珠组捕获率	CD34⁺细胞特异性抗体修饰的纳米磁珠组捕获率	CD34⁺细胞抗体和长链生物素共修饰的多臂井星聚合物组捕获率
			55.2%	22.7%	85.8%
CD90⁺细胞特异性抗体修饰的微米磁珠组捕获率	CD90⁺细胞特异性抗体修饰的纳米磁珠组捕获率	CD90⁺细胞抗体和长链生物素共修饰的多臂井星聚合物组捕获率
			54.7%	21.4%	87.9%

实验结果表明，CD34⁺或CD90⁺细胞特异性抗体修饰的微米磁珠组的捕获效率明显高于纳米磁珠组的捕获效率，这说明对比纳米磁珠组，由于微米磁珠体积大、磁性强，在短时间内就能分离富集较多的靶细胞。但是，本发明技术方案组的捕获效率又远远大于CD34⁺或CD90⁺细胞特异性抗体修饰的微米磁珠组，这表明本发明技术方案借助多臂井星聚合物可以增加靶细胞表面纳米磁珠覆盖率，从而使磁性大大提高，进而实现了在短时间内（3min）高效分离富集CD34⁺或CD90⁺细胞。

实施例3 富集捕获实验

常规磁力架分离时间为30min，其余同实施例2.

各组捕获率如下：

CD34⁺细胞特异性抗体修饰的微米磁珠组捕获率	CD34⁺细胞特异性抗体修饰的纳米磁珠组捕获率	CD34⁺细胞抗体和长链生物素共修饰的多臂井星聚合物组捕获率
			57.2%	44.7%	86.3%
CD90⁺细胞特异性抗体修饰的微米磁珠组捕获率	CD90⁺细胞特异性抗体修饰的纳米磁珠组捕获率	CD90⁺细胞抗体和长链生物素共修饰的多臂井星聚合物组捕获率
			55.9%	43.9%	88.2%

实验结果表明，对比实施例2中分离3min，当分离时间达到30min时，三组的捕获效率都得到了提高，特别是CD34⁺或CD90⁺细胞特异性抗体修饰的纳米磁珠组的捕获效率提高最为明显，这表明通过延长时间可以大大地提高纳米磁珠组的捕获效率，但是其还是低于短时间分离（3min）时CD34⁺或CD90⁺细胞抗体和长链生物素共修饰的多臂井星聚合物组的捕获效率。这表明本发明技术方案可以在短时间内（3min）高效分离富集CD34⁺或CD90⁺细胞。

实施例4 纳米磁珠富集健康志愿者外周血中CD34⁺或CD90⁺干细胞的研究

用COBE.Spectra.AutoPBMC^TM干细胞采集仪健康志愿者外周血干细胞，输入病人身高、体重、红细胞压积，液体参数：起始液体为1000mL 9g/L NaCl，血浆收集体积和干细胞收集体积均设为100 mL（若外周血CD34⁺细胞数过少可设大些），起始抗凝剂比例1:13，收集速度50 mL/min。按每1mL血液含10⁹个细胞就行分离，其中含阳性细胞为3×10⁵个细胞。

取健康志愿者外周血1mL，加入0.1mg长链生物素-多臂井星聚合物-鼠抗人CD34⁺抗体复合物，充分混匀，在4-8℃孵育15 min。加入0.1 mg修饰有链霉亲和素的微米磁珠，置于混匀仪上，以30 rpm的转速再室温孵育15 min。最后，将离心管插入常规磁力架分离3 min。磁分离后，用等体积的PBS溶液重悬细胞，即为CD34⁺细胞。将分离后的上清液用等体积的PBS溶液洗涤，离心（300rpm/min，20℃）10 min，弃去上清，用等体积的PBS溶液重悬细胞。加入0.1 mg 长链生物素-多臂井星聚合物-CD90⁺抗体复合物，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min形成长链生物素-多臂井星聚合物-抗体-CD90⁺细胞抗原复合物；加入0.1 mg修饰有链霉亲和素的微米磁珠，置于混匀仪上，以30 rpm的转速再室温孵育15 min，将离心管插入常规磁力架充分分离，即得到CD90⁺细胞。磁分离后，将上清液倒入无菌离心管中，而分离出来捕获有CD34⁺或CD90⁺细胞的免疫磁珠则用PBST清洗两次，混合均匀，并用1 mL无菌PBS溶液重悬免疫磁珠。捕获率如实施例2方法获得，其余同实施例2。结果见表1，表明本方案能高效富集分离样品中的CD34⁺或CD90⁺细胞。表1 外周血中CD34⁺或CD90⁺淋巴细胞分离效果

实验组号	CD34⁺细胞抗体和长链生物素共修饰的多臂井星聚合物组捕获率	CD90⁺细胞抗体和长链生物素共修饰的多臂井星聚合物组捕获率
			实施例4	84.7%	83.1%

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种富集分离人外周血CD34⁺和CD91⁺淋巴细胞的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）每取1.0 mg多臂井星聚合物溶解于2 mL，0.02 M，pH 6.5 PBS，加入0.6 mg NHSS，0.4 mg EDC，室温置于混匀仪上搅拌，活化15 min；取2.14 mg 鼠抗人CD34⁺抗体加入上述反应液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；将上述溶液减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥得多臂井星聚合物-鼠抗人CD34⁺抗体复合物；（2）每取1.0 mg多臂井星聚合物溶解于2 mL，0.02 M，pH 6.5 PBS，加入0.6 mg NHSS，0.4 mg EDC，室温置于混匀仪上搅拌，活化15 min；取2.14 mg 鼠抗人CD90⁺抗体加入上述反应液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；将上述溶液减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥；（3）每取22.5 mg 长链生物素，5.4 mg NHSS，3.6 mg EDC溶解于3 mL 0.02 M pH 6.5 PBS缓冲液中；将0.8 mg多臂井星聚合物-抗体复合物加入到上述溶液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；将上述溶液减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥得相应长链生物素-多臂井星聚合物-抗体复合物；（4）富集捕获：取待测样品溶液1mL，加入0.1 mg 长链生物素-多臂井星聚合物-CD34⁺抗体复合物，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min形成长链生物素-多臂井星聚合物-抗体-CD34⁺细胞抗原复合物；加入0.1 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠，置于混匀仪上，以30 rpm的转速再室温孵育15 min，将离心管插入常规磁力架充分分离；磁分离后，用等体积的PBS溶液重悬细胞，即为CD34⁺细胞；将分离后的上清液用等体积的PBS溶液洗涤，离心300rpm/min，20℃ 10 min，弃去上清，用等体积的PBS溶液重悬细胞；加入0.1 mg 长链生物素-多臂井星聚合物-CD90⁺抗体复合物，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min形成长链生物素-多臂井星聚合物-抗体-CD90⁺细胞抗原复合物；加入0.1 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠，置于混匀仪上，以30 rpm的转速再室温孵育15 min，将离心管插入常规磁力架充分分离，即得到CD90⁺细胞；（5）去离子水轻轻清洗后，用PBS缓冲液混重悬即得富集有CD34⁺或CD90⁺细胞的复合物即纳米磁珠-链霉亲和素-生物素-多臂井星聚合物-抗体-CD34⁺或CD90⁺细胞抗原。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述多臂井星聚合物为多臂井星化聚酰胺-胺，其分子量为 70000 Da。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述修饰了链霉亲和素的纳米磁珠粒径为20-50 nm ，优选为30 nm。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2）所述外周血干细胞的采集的方法包括如下步骤：用COBE.Spectra.AutoPBMC^TM干细胞采集仪，输入病人身高、体重、红细胞压积，液体参数：起始液体为1000 mL 9 g/L NaCl，血浆收集体积和干细胞收集体积均设为100 mL，起始抗凝剂比例1:13，收集速度50 mL/min。