CN108296013A - 一种超顺磁纳米微粒的分离装置及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种超顺磁纳米微粒的分离装置，属于磁分离装置技术领域，包括相对独立的超顺磁纳米微粒分离柱和磁分离装置；所述超顺磁纳米微粒分离柱自上而下包括依次连通的加样槽、分离区和液流区；所述磁性分子筛分离柱顶端与过渡区连通，所述磁性分子筛分离柱底端连接液流区的收集空心柱。所述超顺磁纳米微粒分离装置利用所述磁性分子筛分离柱中的磁性镍颗粒和磁分离装置的高强度外加磁场的共同作用下实现对结合有外泌体的超顺磁纳米微粒分离，分离速度快，效率高。
Description
技术领域
本发明属于超顺磁纳米微粒分离技术领域，具体涉及一种超顺磁纳米微粒的分离装置及其应用。
背景技术
超顺磁纳米微粒是20世纪80年代出现的一种新兴材料，具有超顺磁性、单分散性好、磁饱和强度大、分离速度快等优点，不仅可以作为磁免疫亲和载体，而且可以作为磁信号传感元件和信号的放大系统，因此在生化分析领域中得到了广泛的应用。
在应用过程中，通常将氨基、羧基、醛基等功能基团修饰在纳米磁微粒的表面，表面修饰过的纳米磁微粒直径大小从几十纳米到几百纳米不等。近年来，超顺纳米磁微粒在生化分析中的应用受到越来越多的关注，但是对于超顺磁纳米微粒的分离通常利用离心法或直接的磁铁吸引，现有的方法普遍存在分离效率低的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种分离效率高的超顺磁纳米微粒的分离装置。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种超顺磁纳米微粒的分离装置，包括相对独立的超顺磁纳米微粒分离柱和磁分离装置；所述超顺磁纳米微粒分离柱自上而下包括依次连通的加样区、分离区和液流区；所述加样区包括自上而下连接的加样槽和过渡槽；所述分离区包括自上而下连接的初始分离柱和窄缩分离柱；所述液流区包括自上而下链接的收集空心柱和窄缩收集空心柱；
所述初始分离柱的顶端设置有分子滤网，所述分子滤网设置在加样槽过渡区和初始分离柱之间；窄缩分离柱的底部设置有球形铁珠；在所述分子滤网和球形铁珠之间填充球形镍微粒。
优选的，所述分子滤网的孔径为5～10μm。
优选的，所述球形镍微粒的粒径为10～1000μm。
优选的，所述初始分离柱的垂直高度为3.80～7.20mm；外径为7.00～8.00mm，内径为6.50～7.50mm。
优选的，所述窄缩分离柱的垂直高度为4.80～9.20mm，外径为2.80～6.20mm，内径为2.10-5.80mm。
优选的，所述收集空心柱的外径为2.50～5.00mm，内径为1.50～4.00mm，柱高为6～12mm；
优选的，所述窄缩收集空心柱的外径为1.50～4.50mm，内径为1.00～3.00mm,柱高为1.00～3.50mm。
优选的，所述磁分离装置为中空磁分离箱，所述中空磁分离箱顶面设置若干磁分离柱卡槽，所述磁分离箱在对应磁分离柱卡槽两侧面分别平行设置有磁铁，所述磁分离箱底部连接负压引流管路。
优选的，所述磁分离装置为磁分离套管支具；所述磁分离套管支具为圆柱状，顶面设置磁分离柱插孔，所述磁分离柱插孔两侧分别设置磁铁插孔；所述磁铁插孔内固定磁铁。
优选的，所述磁分离套管支具的外侧壁对称设置离心支撑把，所述离心支撑把用于将套管支具悬挂于离心管管口。
本发明还提供了所述超顺磁纳米微粒的分离装置在分离捕获外泌体的超顺磁纳米微粒中的应用。
本发明的有益效果：本发明提供超顺磁纳米微粒的分离装置，包括相对独立的超顺磁纳米微粒分离柱和磁分离装置；所述超顺磁纳米微粒分离柱中包括磁性分子筛分离柱，利用所述磁性分子筛分离柱中的磁性分子筛和磁分离装置的高强度外加磁场的共同作用下实现对结合有外泌体的超顺磁纳米微粒分离，分离速度快，效率高。
将所述超顺磁纳米微粒的分离装置应用于分离捕获外泌体的超顺磁纳米微粒中能够快速高效的分离出生物样品中捕获外泌体的超顺磁纳米微粒，从而利于生物样品外泌体的快速检测。
附图说明
图1为实施例1中超顺磁纳米微粒分离柱结构示意图,左图为剖面图，右图为正视图；
图2为实施例1中超顺磁纳米微粒分离装置结构示意图；
图3为实施例2中超顺磁纳米微粒分离装置结构以及分离步骤示意图；
图4为GPC1+外泌体化学发光免疫学检测技术原理示意图；
图5为GPC1+外泌体的检测校准曲线图；
图6为GPC1+外泌体在胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌患者中的表达水平差异对比图；
图7为GPC1+外泌体对胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌诊断ROC曲线图
图8为胰腺癌患者术前及术后5天血清GPC1+外泌体水平变化图。
具体实施方式
本发明提供了一种超顺磁纳米微粒的分离装置，结构如图1～3所示；包括相对独立的超顺磁纳米微粒分离柱(图1)和磁分离装置(图2或图3)；所述超顺磁纳米微粒分离柱自上而下包括依次连通的加样槽(1)、分离区(2)和液流区(3)；
本发明中所述加样槽(1)优选的自上而下依次包括圆柱形加样区(4)和漏斗状过渡区(5)，所述加样槽(1)优选的可容纳2～3ml液体，更优选的为2.5ml；在本发明中所述加样槽(1)的总高度优选的为17.5～18.5mm；更优选的为18mm。在本发明中，所述圆柱形加样区(4)的垂直高度优选的为12～14mm，更优选的为13mm；所述圆柱形加样区(4)的外径优选的为11.5～12.5mm，更优选的为12mm；所述圆柱形加样区(4)的内径优选的为11～12mm，更优选的为11.50mm。在本发明中所述漏斗状过渡区(5)的垂直高度优选的为1.5～2.5mm，更优选的为2.00mm。本发明中所述漏斗状过渡区(5)的大口直径优选的为12.0mm、所述漏斗状过渡区(5)的小口直径优选的为7.5mm。
在发明中所述加样槽漏斗状过渡区(5)的末端与分离区(2)直接相连；本发明中所述分离区优选的可容纳0.45～0.85mL液体，更优选的为0.7ml。本发明中所述分离区(2)的垂直总高度优选的为11.50～14.50mm，更优选的为13.00mm。本发明中所述分离(2)包括初始分离柱(6)和窄缩分离柱(7)；所述初始分离柱(6)的垂直高度优选的为3.80～7.20mm，更优选的为5.00mm；所述初始分离柱(6)的外径优选的为7.00～8.00mm，更优选的为7.50mm，所述圆柱形初始过渡区的内径优选的为6.50～7.50mm，更优选的为6.00mm。本发明中所述窄缩分离柱(7)的垂直高度优选的为4.80～9.20mm，更优选的为8.00mm。本发明中所述窄缩分离柱(7)的外径优选的2.80～6.20mm，更优选的为5.5mm，所述窄缩分离柱内径优选的为2.10-5.80mm，更优选的为4.6mm。
所述初始分离柱(6)的顶端设置有分子滤网，底端设置有球形铁珠；在所述分子滤网和球形铁珠之间填充球形镍微粒。在本发明中，所述分子滤网的孔径优选的为5～10μm，更优选的为8μm；所述球形镍微粒的粒径优选的为10～1000μm。在本发明中所述磁性分子筛分离柱通过在分子滤网和球形铁珠之间填充的球形镍微粒形成的磁性分子筛分离所述捕获外泌体的超顺磁纳米微粒。
在本发明中所述窄缩分离区(7)的末端与液流区(3)直接相连；本发明中所述液流区(3)包括顺次连接的收集空心柱(8)和窄缩收集空心柱(9)；在本发明中，所述收集空心柱(8)的外径优选的为2.50～5.00mm，更优选的为3.80mm；所述收集空心柱(8)的内径优选的为1.50～4.00mm，更优选的为2.50mm；所述收集空心柱(8)的柱高优选的为6～12mm，更优选的为8.50mm。所述窄缩收集空心柱(9)的外径优选的为1.50～4.50mm，更优选的为1.80mm；所述窄缩收集空心柱(9)的内径优选的为1.00～3.00mm，更优选的为1.00mm；所述窄缩收集空心柱(9)的柱高优选的为1.00～3.50mm，更优选的为2.00mm。
在本发明中所述分离装置还包括配套的磁分离装置；所述配套的磁分离装置优选为中空磁分离箱结构如图2所示，所述中空磁分离箱顶面设置若干磁分离柱卡槽(10)，所述磁分离卡槽(10)优选的等间距设置在所述中空磁分离箱的顶面；所述磁分离柱卡槽(10)优选的为10～15个，更优选的为12个。本发明中，所述磁分离箱(12)对应磁分离柱卡槽两侧面分别平行设置磁铁(11)穿过箱体，所述磁铁(11)优选的为圆柱体N52钕铁硼强磁磁铁，本发明中所述磁铁提供强磁力，从而在分离过程中吸留超顺磁纳米微粒。
本发明中，所述磁分离箱(12)底部连接负压引流管路。在本发明具体实施过程中，将所述超顺磁纳米微粒分离柱插入磁分离柱卡槽上，在所述中空磁分离箱的箱体下方添加负压引流设备，超顺磁纳米微粒在磁铁的作用下停留在超顺磁纳米微粒分离柱中，其它物质通过磁分离箱(12)底部连接负压引流管路快速引流于废液瓶。
本发明在所述分离完毕后，转移超顺磁纳米分离柱，静置1～5min，待超顺磁性微粒磁力完全消失后，通过正压推流装置完全收集分离柱内超顺磁纳米微粒。本发明中所述正压推流装置的推气速率优选的≥22L/min；正压调节范围优选的为0.02～0.09MPa(150～680mmHg)；噪声优选的≤20dB(A)；电源参数优选的为220V、50Hz。
在本发明中，所述配套的磁分离装置还可以为磁分离套管支具，结构和分离流程如图3所示；所述磁分离套管支具为圆柱状，所述磁分离套管支具的直径优选的为18～19mm，更优选的为18.50mm；所述磁分离套管支具的柱高优选的为19.00～21.00mm，更优选的为20.00mm；本发明中所述磁分离套管支具的外侧壁对称设置离心支撑把，所述离心支撑把用于将套管支具悬挂于离心管管口。
在本发明中，所述磁分离套管支具顶面中心设置磁分离柱插孔(13)，所述磁分离柱插孔(13)的直径优选的为3.50mm～4.50mm，更优选的为4.00mm；所述磁分离柱插孔(13)的垂直高度优选为19.00～21.00mm，更优选的为20.00mm。
本发明中，所述磁分离柱插孔(13)两侧分别设置磁铁插孔(14)，用于固定磁铁；本发明中所述磁铁插孔(14)与磁分离柱插孔(13)的垂直间距优选的为2.00～4.00mm；所述磁铁插孔优选的为长方形，所述磁铁插孔的长优选的为10-20cm，宽优选的为4-8cm，垂直高度优选的为6-9cm。本发明中所述磁铁插孔中优选的放置N52钕铁硼强磁磁铁(15)。
在本发明具体实施过程中，将放入磁铁后的整个磁分离套管支具放于离心管上方，然后将所述超顺磁纳米微粒分离柱插入套管支具的磁分离柱插孔中，加入洗涤液离心，从而快速分离洗涤液体于离心管中；洗涤完毕后，转移超顺磁纳米分离柱，静置1～5min，待超顺磁性微粒磁力完全消失后，通过正压推流装置完全收集分离柱内超顺磁纳米微粒以及表面捕获的蛋白囊泡。本发明中所述正压推流装置的推气速率优选的≥22L/min；正压调节范围优选的为0.02～0.09MPa(150～680mmHg)；所述正压推流装置的噪声优选的≤20dB(A)；电源参数优选的为220V、50Hz。
下面结合实施例对本发明提供的超顺磁纳米微粒的分离装置及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
捕获外泌体的超顺磁纳米微粒的分离装置
包括超顺磁纳米微粒分离柱和中空磁分离箱，所述超顺磁纳米微粒分离柱的结构如附图1所示，所述超顺磁纳米微粒分离柱自上而下依次包括加样槽、过渡区和分离区。所述加样槽自上而下依次包括圆柱形加样区和漏斗状储样区，所述加样槽可容纳2.5ml液体，总高度为18mm。在本实施例中，所述圆柱形加样区的垂直高度为13mm；所述圆柱形加样区的外径为12mm；所述圆柱形加样区的内径为11.50mm。在本实施例中所述漏斗状储样区的垂直高度为2.00mm。在本实施例中所述加样槽的漏斗状过渡区的末端与分离区直接相连；本实施例中所述分离区可容纳0.7mL液体。本实施例中所述分离区的垂直总高度为13.00mm；本发明中所述分离区包括初始分离柱和窄缩分离柱；所述初始分离柱的垂直高度为5.00mm；所述初始分离柱的外径为7.50mm，内径为6.00mm。本发明中所述窄缩分离柱(7)的垂直高度为8.00mm。本发明中所述窄缩分离柱(7)的为5.5mm，所述窄缩分离柱内径为4.6mm。所述初始分离柱(6)的顶端设置有分子滤网，底端设置有球形铁珠；在所述分子滤网和球形铁珠之间填充球形镍微粒。所述分子滤网的孔径为8μm；所述球形镍微粒的粒径为10～1000μm。所述磁性分子筛分离柱通过在分子滤网和球形铁珠之间填充的球形镍微粒形成的磁性分子筛分离所述捕获外泌体的超顺磁纳米微粒。所述窄缩分离区的末端与液流区直接相连；所述液流区包括顺次连接的收集空心柱和窄缩收集空心柱；所述收集空心柱的外径为3.80mm；所述收集空心柱内径为2.50mm；所述收集空心柱的柱高为8.50mm。所述窄缩收集空心柱的外径为1.80mm；所述窄缩收集空心柱的内径为1.00mm；所述窄缩收集空心柱的柱高为2.00mm。
所述中空磁分离箱的结构如附图2所示，所述中空磁分离箱顶面等间距设置12个磁分离柱卡槽，所述磁分离箱对应磁分离柱卡槽两侧面分别平行设置圆柱体N52钕铁硼强磁磁铁，所述磁分离箱底部连接负压引流管路。
在使用过程中，将装有超顺磁纳米微粒的超顺磁纳米微粒分离柱置于磁分离柱卡槽上，在所述中空磁分离箱的箱体下方添加负压引流设备，超顺磁纳米微粒在磁铁的作用下停留在超顺磁纳米微粒分离柱中，洗涤液体通过磁分离箱底部连接负压引流管路快速引流于废液瓶。在所述分离完毕后，转移超顺磁纳米分离柱，静置2min，待超顺磁性微粒磁力完全消失后，通过正压推流装置完全收集分离柱内磁微粒及其表面捕获的囊泡蛋白。本发明中所述正压推流装置的推气速率≥22L/min；正压调节范围为0.02～0.09MPa(150～680mmHg)；噪声≤20dB(A)；电源参数为220V、50Hz。
实施例2
捕获外泌体的超顺磁纳米微粒的分离装置
，所述超顺磁纳米微粒分离柱的结构如附图1所示，所述超顺磁纳米微粒分离柱自上而下依次包括加样槽、过渡区和分离区。所述加样槽优选的自上而下依次包括圆柱形加样区和漏斗状储样区，所述加样槽可容纳2.5ml液体，总高度为18mm。所述圆柱形加样区的垂直高度为13mm；所述圆柱形加样区的外径为12mm；所述圆柱形加样区的内径为11.50mm。所述漏斗状储样区的垂直高度为2.00mm。在本实施例中所述加样槽的漏斗状过渡区的末端与分离区直接相连；所述分离区可容纳0.7mL液体。所述分离区的垂直总高度为13.00mm；本发明中所述分离区包括初始分离柱和窄缩分离柱；所述初始分离柱的垂直高度为5.00mm；所述初始分离柱的外径为7.50mm，内径为6.00mm。本发明中所述窄缩分离柱(7)的垂直高度为8.00mm。本发明中所述窄缩分离柱(7)的外径为5.5mm，所述窄缩分离柱内径为4.6mm。所述初始分离柱(6)的顶端设置有分子滤网，底端设置有球形铁珠；在所述分子滤网和球形铁珠之间填充球形镍微粒。在本发明中，所述分子滤网的孔径为8μm；所述球形镍微粒的粒径优选的为10～1000μm。在本发明中所述磁性分子筛分离柱通过在分子滤网和球形铁珠之间填充的球形镍微粒形成的磁性分子筛分离所述捕获外泌体的超顺磁纳米微粒。在本发明中所述窄缩分离区的末端与液流区直接相连；本发明中所述液流区包括顺次连接的收集空心柱和窄缩收集空心柱；在本发明中，所述收集空心柱的外径为3.80mm；所述收集空心柱内径为2.50mm；所述收集空心柱的柱高为8.50mm。所述窄缩收集空心柱的外径为1.80mm；所述窄缩收集空心柱的内径为1.00mm；所述窄缩收集空心柱的柱高为2.00mm。
所述配套的磁分离装置为磁分离套管支具；所述磁分离套管支具的结构如附图3所示；所述磁分离套管支具为圆柱状，所述磁分离套管支具的直径为18.50mm；所述磁分离套管支具的柱高为20.00mm；所述磁分离套管支具的外侧壁对称设置离心支撑把，所述离心支撑把用于将套管支具悬挂于离心管管口。在本发明中，所述磁分离套管支具顶面中心设置磁分离柱插孔，所述磁分离柱插孔的直径为4.00mm；所述磁分离柱插孔的垂直高度为20.00mm。本发明中，所述磁分离柱插孔两侧分别设置磁铁插孔内N52钕铁硼强磁磁铁；本发明中所述磁铁插孔与磁分离柱插孔的垂直间距为1-3mm；所述磁铁插孔为长方形，所述磁铁插孔直径为0.50-1.50cm，垂直高度为1.00-2.50cm。
在具体实施过程中，然后将放入磁铁后的整个磁分离套管支具放于离心管上方，然后将所述超顺磁纳米微粒分离柱插入套管支具的磁分离柱插孔中，加入洗涤液离心，从而快速分离洗涤液体于离心管中；洗涤完毕后，转移超顺磁纳米分离柱，静置2min，待超顺磁性微粒磁力完全消失后，通过正压推流装置完全收集分离柱内磁微粒及其表面捕获的囊泡蛋白。本发明中所述正压推流装置的推气速率优选的≥22L/min；正压调节范围优选的为0.02～0.09MPa(150～680mmHg)；所述正压推流装置的噪声优选的≤20dB(A)；电源参数优选的为220V、50Hz。
实施例3
GPC1+外泌体化学发光免疫学定量检测
利用实施例1或2中的分离装置分离捕获外泌体的超顺磁纳米微粒，并对分离到的GPC1+外泌体进行。
实验原理如图4：捕获抗体CD63被包被在超顺磁纳米微粒基体表面，将含外泌体样本分别加入1.5mL离心管，加入等量10％牛血清白蛋白(BSA)，取已偶联捕获抗体的超顺磁纳米微粒，加入150ng上述标记了吖啶酯的GPC1抗体，室温混匀反应2小时。2小时后，将分离柱置于实施例1或2所述的分离装置上，向分离柱中加入1.5mL反应管内的物质，待液体流尽后，用含0.01％吐温20(tween 20)的PBST缓冲液洗涤多余未结合物质，洗涤过程重复5次。待液体流尽后，将纳米磁分离柱从外加磁场中取出，静置2分钟，待柱内超顺纳米磁微粒的磁性消失后，通过正压推流装置将超顺磁纳米微粒收集到相应试管内，向管内添加H2O2及NaOH后，置于单管发光检测仪(型号：CLA-01)上检测化学发光信号。
吖啶酯标记抗体制备：取0.5mg自备GPC1抗体通过8000rpm离心6min，浓缩为1mg/mL。加入0.5mM的吖啶酯与之混合。在室温下，避光孵育12小时。标记抗体混合物在PBS缓冲液中透析过夜，并经Sephadex G-50纯化。最后将10％NaN3溶液按1：100比例添加到纯化的抗体溶液中，纯化标记抗体被储存在4℃。
校准品制备与赋值：取生长状态良好的胰腺癌细胞系Panc-1，待其生长密度至80％后，更换无FBS的RPMI 1640培养基继续培养36h；收集培养上清用于提取外泌体。将上清分装至50mL离心管，1000g离心10min去除细胞碎片；将上清继续10000g离心20分钟进一步去除微囊、以及细胞碎片；取上清110000g离心70分钟，去掉上清，用PBS重悬沉淀物质，再次110000g离心70分钟，沉淀即外泌体。用1ml PBS缓冲液重悬沉淀，分装并-80℃保存，作为后续实验的校准品原液使用。取部分校准品外泌体，加入高效组织细胞裂解液(Beyotime，P0013K)后在冰上裂解40分钟。通过GPC1检测试剂盒(GPC1Human ELISA kit，ABIN840422)定量检测GPC1蛋白总量。取相应量的定量样本加入正常体检者的血清，模拟基质效应，检测，完成GPC1蛋白总浓度的标准曲线。本发明中优选的对校准品进行赋值后，绘制以校准品浓度为横坐标，以发光值为纵坐标的标准曲线。结果如图5。
特异性外泌体定量检测的方法学性能指标：
(1)精密度：本发明的化学发光免疫法定量检测GPC1+外泌体，具有较高精密度，其批内变异系数(CV)<10％，日间变异系数(CV)<15％。
(2)分析线性测量范围：结果如图6，利用直接化学发光免疫测定技术测定，其在3.0 105/mL–7.68 107/mL之间呈现良好的线性关系(R2＝0.9697)。
(3)最低检测限：本专利方法可最低检测3.8 105/mL GPC1+的特异外泌体。
初步临床应用结果
(1)临床标本的准备。
标本采集：采集初诊未受治疗的且有明确病理诊断的患者血液标本。其中胰腺癌42例，良性胰腺疾病38例；前列腺癌56例，良性前列腺疾病48例；乳腺癌62例，良性乳腺疾病57例；健康体检者60例。
标本处理：将血液标本置于黄头促凝管，用2500g在4℃下离心30分钟去除细胞，10000g离心20mi去除大囊泡，后将去掉沉淀，取上清于-80℃储存。
(2)血清GPC1+外泌体含量测定：采用具体实施方案6中操作对于血清标本中GPC1+外泌体进行定量检测。
(3)统计分析：用SPSS 19.0(SPSS Inc.Chicago,USA)软件进行统计分析。
(4)临床标本测定结果：
如图6所示：血清GPC1+外泌体在乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌中相对于良性有明显的升高(P<0.01)；此外在良性疾病患者的血清中，GPC1+外泌体相对健康人无明显的升高。
如图7所示：GPC1+外泌体在乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌具有良好的特异性和敏感性。尤其在胰腺癌中，诊断特异性及敏感性均达到了100％。
在上述42例胰腺癌患者中选取16例，比较其术前及术后(术后5天)血清中GPC1+外泌体的水平。如图8所示，术后的胰腺癌患者血清GPC1+外泌体水平较术前有明显下降(P<0.05)，提示血清GPC1+外泌体与肿瘤负荷有关，可作为肿瘤复发的监测指标。
由上述实施例可知，本发明提供的超顺磁纳米微粒的分离装置，在磁性分子筛和高强度外加磁场的共同作用下实现对结合有外泌体的超顺磁纳米微粒的快速有效分离。利于实现简便、快速分离捕获外泌体的超顺磁纳米微粒的、利于定量检测特异性外泌体。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种超顺磁纳米微粒的分离装置，其特征在于，包括相对独立的超顺磁纳米微粒分离柱和磁分离装置；所述超顺磁纳米微粒分离柱自上而下包括依次连通的加样区、分离区和液流区；所述加样区包括自上而下连接的加样槽和过渡槽；所述分离区包括自上而下连接的初始分离柱和窄缩分离柱；所述液流区包括自上而下链接的收集空心柱和窄缩收集空心柱；
所述初始分离柱的顶端设置有分子滤网，所述分子滤网设置在加样槽过渡区和初始分离柱之间；窄缩分离柱的底部设置有球形铁珠；在所述分子滤网和球形铁珠之间填充球形镍微粒。
2.根据权利要求1所述的分离装置，其特征在于，所述分子滤网的孔径为5～10μm。
3.根据权利要求1所述的分离装置，其特征在于，所述球形镍微粒的粒径为10～1000μm。
4.根据权利要求1所述的分离装置，其特征在于，所述初始分离柱的垂直高度为3.80～7.20mm；外径为7.00～8.00mm，内径为6.50～7.50mm；所述窄缩分离柱的垂直高度为4.80～9.20mm，外径为2.80～6.20mm，内径为2.10-5.80mm。
5.根据权利要求1所述的分离装置，其特征在于，所述收集空心柱的外径为2.50～5.00mm，内径为1.50～4.00mm，柱高为6～12mm。
6.根据权利要求1所述的分离装置，其特征在于，所述窄缩收集空心柱的外径为1.50～4.50mm，内径为1.00～3.00mm,柱高为1.00～3.50mm。
7.根据权利要求1所述的分离装置，其特征在于，所述磁分离装置为中空磁分离箱，所述中空磁分离箱顶面设置若干磁分离柱卡槽，所述磁分离箱在两侧面分别平行设置有磁铁，所述磁分离箱底部连接负压引流管路。
8.根据权利要求1所述的分离装置，其特征在于，所述磁分离装置为磁分离套管支具；所述磁分离套管支具为圆柱状，顶面设置磁分离柱插孔，所述磁分离柱插孔两侧分别设置磁铁插孔；所述磁铁插孔内固定磁铁。
9.根据权利要求8所述的分离装置，其特征在于，所述磁分离套管支具的外侧壁对称设置离心支撑把，所述离心支撑把用于将套管支具悬挂于离心管管口。
10.根据权利要求1～9任意一项所述超顺磁纳米微粒的分离装置在分离捕获外泌体的超顺磁纳米微粒中的应用。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109294907A (zh) * | 2018-11-08 | 2019-02-01 | 浙江大学 | 基于微流控技术的超顺磁纳米微粒分离装置或分离系统在外泌体分离中的应用 |
Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5895631A (en) * | 1995-03-20 | 1999-04-20 | Precision System Science Co., Ltd. | Liquid processing method making use of pipette device and apparatus for same |
| US6471860B1 (en) * | 1998-03-12 | 2002-10-29 | Miltenyi Biotech Gmbh | Magnetic micro separation column and method of using it |
| US20030099954A1 (en) * | 2001-11-26 | 2003-05-29 | Stefan Miltenyi | Apparatus and method for modification of magnetically immobilized biomolecules |
| US20030201208A1 (en) * | 2000-04-26 | 2003-10-30 | Martin Koch | Dynamic superparamagnetic markers |
| CN1899698A (zh) * | 2006-06-30 | 2007-01-24 | 上海师范大学 | 磁性分离柱及其在生物样品分离中的应用 |
| CN101118202A (zh) * | 2007-08-06 | 2008-02-06 | 浙江大学 | 基于免疫磁珠的目标自动分离方法和分离装置 |
| JP2010042349A (ja) * | 2008-08-12 | 2010-02-25 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 高勾配磁気分離用フィルター |
| US20100273230A1 (en) * | 2007-09-11 | 2010-10-28 | X-zell Biotech Ltd | High gradient magnetic separation of biological material |
| CN101921706A (zh) * | 2009-06-15 | 2010-12-22 | 王全兴 | 磁力细胞分离器 |
| US20120273395A1 (en) * | 2010-10-20 | 2012-11-01 | Miltenyi Biotec Gmbh | Device and method for separation of neél- and brown-magnetic particles |
| CN106216091A (zh) * | 2016-08-25 | 2016-12-14 | 广东工业大学 | 一种分离回收磁性纳米颗粒的装置及方法 |
| CN207786802U (zh) * | 2018-03-02 | 2018-08-31 | 浙江大学 | 一种超顺磁纳米微粒的分离装置 |
-
2018
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Patent Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5895631A (en) * | 1995-03-20 | 1999-04-20 | Precision System Science Co., Ltd. | Liquid processing method making use of pipette device and apparatus for same |
| US6471860B1 (en) * | 1998-03-12 | 2002-10-29 | Miltenyi Biotech Gmbh | Magnetic micro separation column and method of using it |
| US20030201208A1 (en) * | 2000-04-26 | 2003-10-30 | Martin Koch | Dynamic superparamagnetic markers |
| US20030099954A1 (en) * | 2001-11-26 | 2003-05-29 | Stefan Miltenyi | Apparatus and method for modification of magnetically immobilized biomolecules |
| CN1899698A (zh) * | 2006-06-30 | 2007-01-24 | 上海师范大学 | 磁性分离柱及其在生物样品分离中的应用 |
| CN101118202A (zh) * | 2007-08-06 | 2008-02-06 | 浙江大学 | 基于免疫磁珠的目标自动分离方法和分离装置 |
| US20100273230A1 (en) * | 2007-09-11 | 2010-10-28 | X-zell Biotech Ltd | High gradient magnetic separation of biological material |
| JP2010042349A (ja) * | 2008-08-12 | 2010-02-25 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 高勾配磁気分離用フィルター |
| CN101921706A (zh) * | 2009-06-15 | 2010-12-22 | 王全兴 | 磁力细胞分离器 |
| US20120273395A1 (en) * | 2010-10-20 | 2012-11-01 | Miltenyi Biotec Gmbh | Device and method for separation of neél- and brown-magnetic particles |
| CN106216091A (zh) * | 2016-08-25 | 2016-12-14 | 广东工业大学 | 一种分离回收磁性纳米颗粒的装置及方法 |
| CN207786802U (zh) * | 2018-03-02 | 2018-08-31 | 浙江大学 | 一种超顺磁纳米微粒的分离装置 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 王欢;张宝元;刘炜玮;: "SiO_2复合磁性纳米粒子的合成及表面性质的研究", 化工时刊, no. 11, pages 4 - 7 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109294907A (zh) * | 2018-11-08 | 2019-02-01 | 浙江大学 | 基于微流控技术的超顺磁纳米微粒分离装置或分离系统在外泌体分离中的应用 |
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| Publication number | Publication date |
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