CN114308153A - 一种用于检测那非类物质的固相萃取微流控芯片及用于检测那非类物质的系统 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测那非类物质的固相萃取微流控芯片及用于检测那非类物质的系统。所述系统包含固相萃取微流控芯片、荧光免疫探针及免疫层析试纸条。所述固相萃取微流控芯片具备样品过滤、固相萃取、溶剂蒸发和蒸汽吸收四大功能，用于完成样品检测前的萃取处理。以荧光强度高、背景低的荧光介孔硅球作为信号载体，标记广谱性的那非类物质抗体，形成荧光免疫探针，进一步提升检测的灵敏度。将免疫层析试纸条置于发明人前期已开发的小型读数装置中，通过智能手机检测APP完成定量检测。本发明具有操作简单、灵敏度高、检测靶标多等优点，能够在短时间内同时对样品中多种那非类物质进行实时实地的定量检测。

Description

一种用于检测那非类物质的固相萃取微流控芯片及用于检测 那非类物质的系统
技术领域
本发明涉及药品与食品安全检测技术领域，具体地，涉及一种用于检测那非 类物质的固相萃取微流控芯片及用于检测那非类物质的系统。
背景技术
那非类药物为男性性功能障碍治疗药物，属于处方药，应在医生指导下服用。 非法添加该类成分，导致消费者在不知情的情况下服用，极易引发毒副作用，出 现头晕、视觉异常、肾脏、心脏功能障碍等。更严重的是，冠心病、高血压、脑 血栓等患者会因此引起心肌梗死甚至死亡，造成伤害事件。尽管目前国际上只批 准了3种那非类物质(西地那非、伐地那非和他达拉非)作为临床药物，但其结 构类似物也被不法分子复配添加到食源性产品中。因此，针对那非类物质非法添 加乱象，建立多靶标、广谱性的分析方法十分重要。
目前针对补肾壮阳类中成药及保健食品中的那非类物质的检测方法主要有 仪器分析法(如高效液相色谱法、高效液相色谱-串联质谱法和气相色谱-串联质 谱法等)和免疫分析法(如酶联免疫吸附法和免疫层析法)。仪器分析法虽然准 确度、精准度高，但样品前处理复杂，而且需要昂贵的仪器设备；酶联免疫吸附 法虽然灵敏度高，分析速度快，但需要洗板机和大型酶标仪定量，限制了其在食 品安全现场筛查中的应用。而免疫层析法操作更为简便、反应速度更快，且不需 要大型检测仪器，在现场筛查中具有很大的潜力。但现有的那非类物质免疫层析 法检测灵敏度比较低，检测对象较单一。
发明内容
为克服现有技术中检测那非类物质的样品前处理复杂、灵敏度低、检测对象 单一的问题，本发明提供一种用于检测那非类物质的固相萃取微流控芯片及用于 检测那非类物质的系统。
本发明的第一个目的是提供一种用于检测那非类物质的固相萃取微流控芯 片。
本发明的第二个目的是提供一种用于检测那非类物质的系统。
本发明的第三个目的是提供一种那非类物质的检测方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
一种用于检测那非类物质的固相萃取微流控芯片，包括第一层基片及设置在 第一层基片上的过滤区、用于装设固相萃取填料的固相萃取区和用于蒸发溶剂的 溶剂蒸发区，其中过滤区设有过滤装置；所述过滤装置由微柱阵列组成。
优选地，所述过滤装置的一端设有过滤装置进样口、另一端设有过滤装置出 样口；所述固相萃取区设有填料槽，填料槽的一端设有填料槽进样口、另一端设 有填料槽出样口；所述溶剂蒸发区设有用于蒸发溶剂的蒸发池、用于蒸气流通的 通气孔、用于收集蒸气的储气容器；所述储气容器设置于蒸发池的顶端；所述通 气孔设置于蒸发池和储气容器之间；所述蒸发池的一端设有蒸发溶剂进样口、另 一端设有蒸发溶剂出样口。
进一步地，所述第一层基片上还设有第二层基片及第三层基片，第二层基片 设置在第一层基片的顶面，第三层基片设置在第二层基片的顶面；固相萃取区和 蒸发池设置在第一层基片上；过滤区和通气孔设置在第二层基片上；储气容器设 置在第三层基片上；所述蒸发溶剂出样口包括第一蒸发溶剂出样口及第二蒸发溶 剂出样口；所述第一蒸发溶剂出样口设置于第一层基片，第二蒸发溶剂出样口设 置于第二层基片；填料槽进样口、填料槽、填料槽出样口、蒸发溶剂进样口、蒸 发池和第二蒸发溶剂出样口通过设置于第一层基片的第一微流管道连接；过滤装 置进样口、过滤装置和过滤装置出样口通过设置于第二层基片的第二微流管道连 接。
更优选地，所述过滤装置的微柱的直径和/或相邻微柱之间的间隔由250 μm～100μm从过滤装置进样口到过滤装置出样口的方向依次递减。
更优选地，所述微柱的直径按照250μm、200μm、150μm和100μm的梯 度依次递减，相邻微柱之间的间隔按照250μm、200μm、150μm和100μm的 梯度依次递减。
更优选地，第一微流管道包括填料槽进样管道、填料槽出样管道和蒸发池出 样管道，填料槽进样口、填料槽进样管道、填料槽、填料槽出样管道、蒸发溶剂 进样口、蒸发池、蒸发池出样管道和第一蒸发溶剂出样口相连。
更优选地，第二微流管道包括过滤装置进样管道和过滤装置出样管道，过滤 装置进样口、滤装置进样管道、过滤装置、过滤装置出样管道和过滤装置出样口 依次相连。
更优选地，所述储气容器装有活性炭。
更优选地，所述活性炭的颗粒直径大于通气孔的孔径，活性炭不能通过通气 孔落入蒸发池。
更优选地，所述填料槽为若干个并联的填料槽。
更优选地，所述填料槽的数量为3个。
更优选地，所述填料槽装载有固相萃取的填料。
更优选地，所述固相萃取的填料为MCX填料。
更优选地，所述填料槽进样口与第二层基片的过滤装置出样口相连通，即为 填料槽进样口与第二层基片的过滤装置出样口对齐，保证液体从过滤装置出样口 直接流入填料槽进样口，不发生撒漏，用于使第二层基片的液体全部流入第一层 基片。
更优选地，所述蒸发池与第二层基片的通气孔对齐，用于散发因蒸发产生的 气体。
更优选地，所述第一蒸发溶剂出样口与第二蒸发溶剂出样口相连通，即为第 一蒸发溶剂出样口与第二蒸发溶剂出样口对齐，保证液体从第一蒸发溶剂出样口 直接流至第二蒸发溶剂出样口，不发生撒漏，用于使第一层基片的液体全部经过 第二蒸发溶剂出样口流出。
更优选地，所述第一层基片和第二层基片还设有定位装置，所述定位装置为 第一层基片的第一标定孔和第二标定孔、第二层基片的第三标定孔和第四标定孔； 所述第一标定孔与第三标定孔相连通，第二标定孔和第四标定孔相连通。
本发明提供的固相萃取微流控芯片集样品过滤、固相萃取、溶剂蒸发和蒸汽 吸收四大功能于一体。第二层基片的过滤装置用于过滤样品中的大分子杂质，第 一层基片填料槽中的MCX填料用于对过滤后的样品进行固相萃取，萃取样品进 入样品蒸发池进行加热，产生的蒸汽经由通气孔被第三层基片的装载有活性炭的 储气容器吸收。便于快速完成样品检测前的萃取处理。
一种用于检测那非类物质的系统，包含上述的固相萃取微流控芯片、荧光免 疫探针和免疫层析试纸条；
所述荧光免疫探针的制备方法为：介孔硅球耦联荧光素即得到荧光介孔硅球； 将荧光介孔硅球与那非类物质的抗体充分混合均匀；离心；封闭，即得到荧光免 疫探针；
所述免疫层析试纸条包括依次相连接的底板、样品垫、基膜和吸水垫；所述 基膜上设置标准线C线和若干测试线T线；所述C线上包被二抗；所述T线上 分别包被不同的那非类物质的抗原；
用固相萃取微流控芯片对检测的样品进行前处理；将荧光免疫探针与前处理 后的样品混合，得到混合液；将混合液置于免疫层析试纸条的样品垫。
优选地，所述介孔硅球的制备方法为：称取0.5g十六烷基三甲基溴化铵， 溶于30mL超纯水中，匀速搅拌下依次加入9mL无水乙醇和15mL乙醚；再逐 滴加入3mL硅酸四乙酯和0.5mL氨水，30℃下搅拌4小时后，即得到硅球；先 用无水乙醇高速离心清洗硅球3次，再用超纯水重复清洗3次；硅球重悬于40mL 含0.1M盐酸的甲醇中，浸泡24小时，去除多余的十六烷基三甲基溴化铵；先 用无水乙醇高速离心清洗硅球3次，再用超纯水重复清洗3次；将硅球至于60℃ 烘箱烘干，即得到介孔硅球。
优选地，所述荧光介孔硅球的制备方法包括以下步骤：将介孔硅球置于无水 乙醇中，分散；离心取上清；洗涤；加入荧光素搅拌充分；洗涤；加入多巴胺溶 液，充分搅拌；洗涤。
更优选地，所述荧光介孔硅球的制备方法包括以下步骤：称取10mg干燥的 介孔硅球，溶于200μL无水乙醇中，超声分散，离心取上清，再用200μL 0.01M 的PBS溶液(pH 7.2)清洗一次；加入200μL浓度为1mg/mL的羧基荧光素， 室温下搅拌12小时；用PBS离心清洗2次后，去上清，加入200μL浓度为0.0625 mg/mL的多巴胺溶液(Tris-HCl,pH 8.5)，室温敞口搅拌40分钟后，用PBS清 洗产物3次。
优选地，所述得到荧光免疫探针的方法包括以下步骤：取100μL上述荧光 介孔硅球，加入2μL那非类物质的抗体A和2μL那非类物质抗体B，涡旋30s， 混合均匀；所述抗体A及抗体B为针对不同的那非类物质的抗原的抗体；室温 下震荡搅拌50分钟后，离心去上清，再加入200μL浓度为5％的BSA溶液(wt％)， 封闭探针1小时；再次离心弃去上清，将沉淀物重悬于100μL PBS溶液中(pH 7.2)。
荧光介孔硅球以介孔硅球为载体，通过静电作用吸附大量的羧基荧光素，然 后在其表面包裹一层多巴胺薄膜，一方面可以防止荧光素的泄露，另一方面大大 提高的硅球的生物相容性，提高抗体偶联效率。
优选地，所述免疫层析试纸条的制备方法包括以下步骤：将样品垫、基膜和 吸水垫依次衔接在PVC底板上，再用切条机将其切成3.05mm宽的试纸条。
优选地，所述测试线T线的数量为2条。
所述二抗为与那非类物质的抗体结合的抗体。
优选地，所述二抗为羊抗兔IgG。
荧光免疫探针与未知浓度的游离抗原结合后，在层析作用下流向固定在试纸 条上的那非类物质抗原。当样品液中游离的那非类物质浓度较高时，结合位点已 饱和的探针不会与试纸条上的固定抗原结合，导致试纸条的荧光很弱；反之，当 样品液中游离的那非类物质浓度较低时，结合位点不饱和的探针大量被试纸条上 的固定抗原捕获，导致试纸条的荧光很强。
优选地，所述系统还包含用于加热蒸发池中的液体的加热装置。
更优选地，所述加热装置为陶瓷加热片。
上述系统在检测食品和/或药品中那非类物质含量的应用也应在本发明的保 护范围之内。
优选地，所述食品为茶、咖啡和/或酒中的一种或几种；所述药品为胶囊和/ 或药丸中的一种或几种。
一种那非类物质的检测方法，包括以下步骤：
S1.使用上述的系统；所述系统装有活化的固相萃取的填料；
S2.将待测样品的标准品注入固相萃取微流控芯片；待标准品流尽后，将洗 脱液注入固相萃取微流控芯片，并加热；待洗脱液流尽后；将复溶液注入固相萃 取微流控芯片，收集从芯片流出的液体，即为样品的萃取液；将萃取液与荧光免 疫探针混匀，得到混合液；将免疫层析试纸条放入混合液中充分反应；待反应结 束后，取出免疫层析试纸条检测荧光强度；
所述洗脱液为甲醇溶液；所述复溶液为PB溶液；
S3.根据标准品的浓度和步骤S2测得的荧光强度，绘制浓度与荧光强度的 标准曲线；
S4.将标准品替换为待测样品，重复步骤S2，测得样品的荧光强度，利用 步骤S3绘制的标准曲线计算得到样品中那非类物质的浓度。
优选地，步骤S1中，所述活化的固相萃取的填料为用甲醇溶液注入固相萃 取微流控芯片进行活化。
优选地，步骤S2中，所述甲醇溶液含0.1％乙酸(v/v)。
优选地，步骤S2中，所述PB溶液的浓度为0.02M。
优选地，步骤S2中，所述加热的温度为60℃～65℃。
更优选地，步骤S2中，所述加热的温度为60℃。
优选地，步骤S2中，所述检测荧光强度的装置为专利“CN113399007A” 图3所示的便携式生物传感器的改装装置，将原LED灯换为波长为470nm的蓝 光LED灯，将原滤光片换为580nm的黄色滤光片。
更优选地，步骤S2中，利用智能手机检测APP采集上述装置的荧光信号， 拍照获取图像，计算得到荧光强度的数值。
优选地，所述那非类物质为西地那非、他达拉非、N-去甲基他达拉非、N- 丁基去甲他达拉非、乙酰氨基他达拉非、去甲基西地那非、红地那非、羟基红地 那非、伪伐地那非、乌地那非和/或豪莫西地那非中的任一种或几种。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供一种那非类物质的检测系统，该系统采用基于固相萃取微流控芯 片的荧光免疫层析法。所述固相萃取微流控芯片具备样品过滤、固相萃取、溶剂 蒸发和蒸汽吸收四大功能，用于完成样品检测前的萃取处理。以荧光强度高、背 景低的荧光介孔硅球作为信号载体，标记广谱性的那非类物质抗体，形成荧光免 疫探针，进一步提升检测的灵敏度。将免疫层析试纸条置于发明人前期已开发的 小型读数装置中，通过智能手机检测APP完成定量检测。本发明具有操作简单、 灵敏度高、检测靶标多等优点，能够在短时间内同时对样品中多种那非类物质进 行实时实地的定量检测。
附图说明
图1为本发明固相萃取微流控芯片的结构示意图；1-过滤区；2-固相萃取区；3-溶剂蒸发区。
图2为本发明固相萃取微流控芯片的第一层基片的示意图；201-填料槽；202- 填料槽进样口；203-填料槽出样口；301-蒸发池；304-蒸发溶剂进样口；3051- 第一蒸发溶剂出样口；4-第一微流管道；401-填料槽进样管道；402-填料槽出样 管道；403-蒸发池出样管道；6-第一标定孔；7-第二标定孔。
图3为本发明固相萃取微流控芯片的第二层基片的示意图；101-过滤装置； 102-过滤装置进样口；103-过滤装置出样口；302-通气孔；3052-第二蒸发溶剂出 样口；5-第二微流管道；501-过滤装置进样管道；502-过滤装置出样管道；8-第 三标定孔；9-第四标定孔。
图4为本发明固相萃取微流控芯片的第三层基片的示意图；303-储气容器。
图5为本发明微萃取微流控芯片的整体透视图；101-过滤装置；102-过滤装 置进样口；103-过滤装置出样口；201-填料槽；202-填料槽进样口；301-蒸发池； 302-通气孔；303-储气容器；3051-第一蒸发溶剂出样口；3052-第二蒸发溶剂出 样口。
图6为荧光介孔硅球的表征鉴定结果；A为介孔硅球的透射电镜图；B为介 孔硅球吸附FAM前后吸收光谱图；C为荧光介孔硅球的紫外-荧光光谱图。
图7为双T线免疫层析试纸条的结构示意图；10-底板；11-样品垫；12-基膜； 13-吸水垫；14-C线；15-T线；1501-第一T线；1502-第二T线。
图8为基于固相萃取微流控芯片的荧光免疫层析检测系统的操作流程。
图9为SDS鉴定FMSNs/PDA-AbSildenafil和FMSNs/PDA-AbTadalafil的偶 联效率。
图10为西地那非和他达拉非的标准曲线。
图11为去甲基西地那非和红地那非标准曲线。
图12为羟基红地那非和伪伐地那非标准曲线。
图13为乌地那非和豪莫西地那非标准曲线。
图14为N-去甲基他达拉非、N-丁基去甲他达拉非和乙酰氨基他达拉非标准 曲线。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实 施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试 验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明， 为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1固相萃取微流控芯片
本发明的固相萃取微流控芯片的结构如图1所示，包括过滤区1、固相萃取 区2和溶剂蒸发区3，其中过滤区1设有过滤装置101。过滤装置101由微柱阵 列组成，微柱的直径及相邻微柱之间的间隔按照从过滤装置进样口到过滤装置出 样口的方向依次递减，微柱的直径按照250μm、200μm、150μm和100μm的 梯度依次递减，相邻微柱之间的间隔按照250μm、200μm、150μm和100μm 的梯度依次递减，用于过滤液体中的杂质。
过滤区1设有过滤装置101、过滤装置进样口102、过滤装置出样口103。
固相萃取区2设有填料槽201，填料槽201的一端设有填料槽进样口202、 另一端设有填料槽出样口203。
溶剂蒸发区3设有用于蒸发溶剂的蒸发池301、用于蒸气流通的通气孔302、 用于收集蒸气的储气容器303；所述储气容器303设置于蒸发池301的顶端；所 述通气孔302设置于蒸发池301和储气容器303之间；所述蒸发池301的一端设 有蒸发溶剂进样口304、另一端设有蒸发溶剂出样口305；所述蒸发溶剂出样口 305包括第一蒸发溶剂出样口3051及第二蒸发溶剂出样口3052。
如图2～4所示，该固相萃取微流控芯片设有第一层基片、第二层基片和第 三层基片，第二层基片设置在第一层基片的顶面，第三层基片设置在第二层基片 的顶面。
固相萃取区2和蒸发池301设置在第一层基片上。
第一层基片还设有第一微流管道4，所述第一微流管道4包括填料槽进样管 道401、填料槽出样管道402和蒸发池出样管道403。填料槽进样口202、填料 槽进样管道401、3个并联的装载MCX填料的填料槽201、填料槽出样管道402、 蒸发溶剂进样口304、蒸发池301、蒸发池出样管道403和第一蒸发溶剂出样口 3051依次相连。
过滤区1和通气孔302设置在第二层基片上。
第二层基片还设有第二微流管道5，所述第二微流管道5包括过滤装置进样 管道501和过滤装置出样管道502。过滤装置进样口102、滤装置进样管道501、 过滤装置101、过滤装置出样管道502和过滤装置出样口103依次相连。过滤装 置出样口103与第一层基片的填料槽进样口202对齐，保证液体从过滤装置出样 口103直接流入填料槽进样口202，不发生撒漏，用于使第二层基片的液体全部 流入第一层基片。
储气容器303设置于第三层基片，储气容器303内置有活性炭，用于收集液 体蒸发过程中散发的气体，避免造成空气污染。活性炭的颗粒直径比通气孔302 的孔径大，避免活性炭通过通气孔302掉入蒸发池301。
第一蒸发溶剂出样口3051设置于第一层基片，第二蒸发溶剂出样口3052 设置于第二层基片，第一蒸发溶剂出样口3051与第二蒸发溶剂出样口3052对齐， 保证液体从第一蒸发溶剂出样口3051直接流至第二蒸发溶剂出样口3052，不发 生撒漏，用于使第一层基片的液体全部经过第二蒸发溶剂出样口3052流出。
此外，第一层基片和第二层基片都设有定位装置，即第一层基片的第一标定 孔6和第二标定孔7，第二层基片的第三标定孔8和第四标定孔9。第一标定孔 6与第三标定孔8对齐，第二标定孔7和第四标定孔9对齐，便于将第二层基片 和第一层基片对齐固定，保证第二层基片的过滤装置出样口103与第一层基片的 填料槽进样口202对齐、第二层基片的通气孔302与第一层基片的蒸发池301 对齐、第二蒸发溶剂出样口3052与第一蒸发溶剂出样口3051对齐。
可以采用如下的方法制备本发明的固相萃取微流控芯片：
1、以高精度光敏树脂为材料为原材料，通过3D打印的方式分别制造出芯 片的第一层基片、第二层基片、第三层基片的模具。
2、将聚二甲基硅烷(PDMS)倒入上一步所得三个模具中，抽真空排静气 泡，再置于65℃固化3小时后，脱模。
3、将MCX填料装满第三层基片的填料槽201。
4、将活性炭颗粒装入第三层基片的储气容器303中，将储气容器303的开 口端贴合在第二层基片上，与通气孔302对齐。
5、将第一层基片和第二层基片通过定位装置标定位置，通过等离子体清洗 技术对第一层基片、第二层基片和第三层基片的表面进行键合，最终合成如图5 所示的固相萃取微流控芯片。
实施例2基于介孔硅球的荧光免疫探针的制备方法
1、介孔硅球的合成
称取0.5g CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，溶于30mL超纯水中，匀速搅 拌下依次加入9mL无水乙醇和15mL乙醚。再逐滴加入3mL TEOS(硅酸四乙 酯)和0.5mL氨水，30℃下搅拌4小时后，得到介孔硅球。
先用无水乙醇高速离心(11000转/分钟，10分钟)清洗介孔硅球3次，再 用超纯水重复清洗3次。介孔硅球重悬于40mL含0.1M盐酸的甲醇中，浸泡 24小时，去除多余的CTAB。
再用无水乙醇高速离心清洗介孔硅球3次(11000转/分钟，10分钟)，再 用超纯水重复清洗3次。将介孔硅球至于60℃烘箱烘干备用。
介孔硅球的形态如图6A所示。
2、荧光介孔硅球的制备
称取10mg干燥的介孔硅球，溶于200μL无水乙醇中，超声分散，离心取 上清。再用200μL 0.01M的PBS溶液(pH 7.2)清洗一次，去上清。
加入200μL浓度为1mg/mL的FAM(羧基荧光素)，室温下搅拌12小时。
用PBS离心清洗2次后，去上清，加入200μL浓度为0.0625mg/mL的多巴 胺溶液(Tris-HCl,pH 8.5)，室温敞口搅拌40分钟后，即得到耦联了FAM的荧 光介孔硅球(Fam-MSNs,FMSNs)。用PBS清洗荧光介孔硅球3次。
如图6B和图6C所示，介孔硅球成功耦联FAM。
3、抗体标记
取100μL上述荧光介孔硅球，加入2μL的抗体A和2μL抗体B，涡旋30s， 混合均匀。抗体A、抗体B为针对不同抗原的抗体。室温下震荡搅拌50分钟后， 离心弃去上清，再加入200μL浓度为5％的BSA溶液(wt％)，封闭探针1小时， 最后再次离心弃去上清，将沉淀物重悬于100μL PBS溶液中(pH 7.2)，即获得 基于介孔硅球的荧光免疫探针。
4、保存
配制含0.05％叠氮化钠(wt％)的PBS溶液作为保存液。上清分离，加入 200μL保存液，涡旋15s，离心弃上清。重复此操作两次。再加入200μL保存 液，充分混合，4℃保存备用。
5、鉴定
采取SDS凝胶电泳法，用抗体A和抗体B与上述步骤3中的两种抗体上清 液，分别加入不同泳道，最后通过比较各泳道颜色的深浅来评价偶联效率。
实施例3双T线免疫层析试纸条的制备方法
1、制膜
(1)含有抗原的基膜
准备一张长30cm宽25mm的长方形硝酸纤维膜(UniSart CN95,德国赛多 利斯公司)作为基膜12。以基膜12的长边为水平边，短边为垂直边，从左到右 依次画3条1mm竖直线，分别记为第一T线1501、第一T线1502、C线14， 第一T线1501距离左侧短边7mm，第一T线1501与第一T线1502相隔6mm， C线14与第一T线1502相隔6mm。
将抗体A特异性免疫结合的抗原命名为抗原A，将抗体B特异性免疫结合 的抗原命名为抗原B。通过三维划膜仪分别将20μL他达拉非抗原(0.219mg/mL) 和西地那非抗原(0.188mg/mL)喷涂到第一T线1501、第一T线1502上，同 时，将抗体A和抗体B的二抗(即20μL浓度为0.2mg/mL的羊抗兔IgG)喷涂 到C线14上。
将喷涂了抗原的基膜12至于37℃烘箱中干燥6小时。
(2)样品垫
将长30cm宽25cm的璃纤维膜(SB08，上海良信科技有限公司)浸泡在 40mL的PB溶液(0.05M)中，PB溶液含有5mg/mL PVP、5mg/mL蔗糖、5mg/mL 牛血清蛋白和1.5％吐温-20。充分浸润后置于60℃烘箱中烘干备用，作为样品垫 11。
(3)吸水纸
吸水纸型号为CH37K，购于上海良信科技有限公司，作为吸水垫13。
2、组装
以PVC板作为底板10，将样品垫11、含有抗原的基膜12和吸水垫13依次 黏贴在底板10上，再用切条机将其切成3.05mm宽的试纸条，即得到如图7所 示的双T线免疫层析试纸条。
将双T线免疫层析试纸条装入有干燥剂的铝箔袋中，保存备用。
实施例4基于固相萃取微流控芯片的荧光免疫层析检测系统的构建及使用方法
1、检测系统的构建方法
(1)按照实施例1～3的方法，制备固相萃取微流控芯片、基于介孔硅球的 荧光免疫探针及双T线免疫层析试纸条。
(2)将固相萃取微流控芯片和酶标板的小孔固定在同一块玻璃底板上，水 平放置于桌面。
(3)准备两根塑料管，分别作为系统进样管和系统出样管。其中，系统进 样管的一端用于连接注射器的针口，另一端用于连接固相萃取微流控芯片的过滤 装置进样口102；系统出样管的一端连接固相萃取微流控芯片的过滤装置出样口 103，另一端连接用于乘废液的烧杯(过滤阶段)。待洗脱阶段，再将液体接入 酶标板的小孔中。
(4)将基于介孔硅球的荧光免疫探针置于盛有样品洗脱溶液的酶标板小孔 中。
2、检测系统的使用方法
检测系统的操作流程如图8所示，具体方法如下：
(1)活化
用注射器吸取纯甲醇，固定在注射泵上，开启注射泵，将纯甲醇经系统进样 管注入固相萃取微流控芯片，活化MCX填料。多余的液体经由系统出样管排出， 进入废液接收烧杯。
(2)进样
用注射器吸取样品，将装有样品的注射器固定在注射泵上，开启注射泵，将 样品经系统进样管注入固相萃取微流控芯片，多余的液体经由系统出样管排出， 进入废液接收烧杯。
(3)洗脱
用注射器吸取洗脱液，将装有洗脱液的注射器固定在注射泵上，开启注射泵， 将洗脱液经系统进样管注入固相萃取微流控芯片。在注射泵开始推进洗脱液的同 时，在芯片的溶剂蒸发区下方垫一个陶瓷加热片持续加热，直至洗脱液全部推入 芯片。多余的液体经由系统出样管排出，进入酶标板的小孔。
(3)洗脱液复溶
用注射器吸取复溶液，将装有复溶液的注射器固定在注射泵上，开启注射泵， 将复溶液经系统进样管注入固相萃取微流控芯片。复溶液经由系统出样管排出， 进入酶标板的小孔，再向小孔中加入介孔硅球荧光免疫探针。
(4)检测萃取物中待测物质的浓度
将测定待测物质相应标准品、收集的萃取物分别与基于介孔硅球的荧光免疫 探针混合后，加到酶标板中孵育，插入双T线免疫层析试纸条，双T线免疫层 析试纸条的样品垫11伸入液面以下，反应结束后，取出试纸条。
对专利“CN113399007A”图3所示的便携式生物传感器进行改装，将其LED 灯换为470nm的蓝光LED灯，将滤光片换为黄色滤光片(580nm)。
将试纸条置于改装后的装置中，参考专利“CN113399007A”的实施例4， 利用智能手机检测APP采集上述装置的荧光信号，拍照获取图像，计算得到荧 光强度的数值。
根据测得标准品的荧光强度，绘制浓度与荧光强度的标准曲线；根据测得样 品的荧光强度，结合标准曲线计算样品中待测物质的浓度。
实施例5同时检测西地那非和他达拉非的方法
1、实验方法
(1)按照实施例1的方法制备固相萃取微流控芯片。
(2)按照实施例2的方法制备荧光免疫探针，分别取5mg荧光介孔硅球， 加入2μL浓度为5mg/mL的西地那非抗体AbSildenafil(DOI: 10.1016/j.aca.2020.10.032)和2μL浓度为5mg/mL的他达拉非抗体AbTadalafil (DOI:10.1080/09540105.2019.1585417)，涡旋30s，混合均匀。室温下震荡搅 拌50分钟后，离心，分离上清至离心管中。向沉淀加入200μL浓度为5％的BSA 溶液(wt％)，封闭1小时。即获得标记AbSildenafil的荧光免疫探针 FMSNs/PDA-AbSildenafil和标记AbTadalafil的荧光免疫探针FMSNs/PDA-AbTadalafil。 保存待用。
分别取浓度为0.05mg/mL的AbSildenafil和AbTadalafil以及上述分离至离心管的 上清，采取SDS凝胶电泳法评价荧光介孔硅球与AbSildenafil和AbTadalafil的偶联效 率。
如图9所示，偶联后的两种抗体上清液中均没有蛋白染色条带，说明大部分 抗体都成功连上了探针，即FMSNs/PDA-AbSildenafil和FMSNs/PDA-AbTadalafil的抗 体偶联效率较高。
(3)按照实施例3的方法，分别将20μL浓度为0.219mg/mL西地那非抗 原(DOI:10.1016/j.aca.2020.10.032)和0.188mg/mL他达那非抗原 (DOI:10.1080/09540105.2019.1585417)通过三维划膜仪喷涂到相邻的两条T线 上，同时，将浓度为0.2mg/mL的羊抗兔IgG(北京全式金生物)喷涂到C线上， 制备得到含有西地那非抗原和他达拉非抗原的双T线免疫层析试纸条。
(4)按照实施例4的方法构建并使用基于固相萃取微流控芯片的荧光免疫 层析检测系统。
用注射器吸取胶囊、保健茶和保健酒等21种样品的提取液，通过小型注射 泵以流速80μL/min注入固相萃取微流控芯片。
用含0.1％乙酸的甲醇溶液(v/v)作为洗脱液，以20μL/min的流速向固相 萃取微流控芯片推注洗脱液，洗脱样品；同时，在芯片的溶剂蒸发区下方垫一个 陶瓷加热片，设置温度为60℃。
用0.02M的PB溶液作为复溶液，通过小型注射泵以流速80μL/min向固相 萃取微流控芯片注入复溶液，收集流出的溶液，即为样品萃取物。
用含有西地那非抗原和他达拉非抗原的双T线免疫层析试纸条进行检测。 将西地那非的标准品和他达拉非的标准品、样品萃取物分别与 FMSNs/PDA-AbSildenafil和FMSNs/PDA-AbTadalafil混合后，加到96孔酶标板中，孵 育5分钟后，插入双T线免疫层析试纸条，反应6分钟后，取出试纸条，置于 实施例4步骤4中的改装装置中拍照定量。
(5)使用液质联用法对21种样品中的西地那非和他达拉非含量进行检测， 统计检测结果。
2、实验结果
如图10所示，成功构建了西地那非和他达拉非的标准曲线。
21种样品的检测结果如表1所示。
表1真实样品检测
Figure BDA0003418958250000141
Figure BDA0003418958250000151
从表1可以看出，使用本发明基于固相萃取微流控芯片的荧光免疫层析检测 系统和液质联用法都能成功鉴定出样品中是否含有西地那非和他达拉非。21种 样品中，共有3份样品(人参玛咖枸杞茶、泰国能量咖啡、美国能量咖啡)检测 出西地那非，1份样品(天然草药咖啡)检测出他达拉非。本发明的荧光免疫层 析检测系统与液质联用法的检测结果相关性高，说明本方法的准确度高。
实施例6检测西地那非类似物和他达拉非类似物的方法
1、实验方法
(1)按照实施例1的方法制备固相萃取微流控芯片。
(2)按照实施例2的方法，用荧光介孔硅球和西地那非的抗体AbSildenafil(DOI:10.1016/j.aca.2020.10.032)和他达拉非的抗体AbTadalafil (DOI:10.1080/09540105.2019.1585417)，制备荧光免疫探针。
西地那非的抗体AbSildenafil(DOI:10.1016/j.aca.2020.10.032)可检测西地那非类似物：去甲基西地那非、红地那非、羟基红地那非、伪伐地那非、乌地那非、 豪莫西地那非；他达拉非的抗体AbTadalafil(DOI:10.1080/09540105.2019.1585417) 可检测他达拉非类似物：N-去甲基他达拉非、N-丁基去甲他达拉非和乙酰氨基 他达拉非。
(3)按照实施例3的方法，用西地那非的抗原(DOI: 10.1016/j.aca.2020.10.032)和他达拉非的抗原 (DOI:10.1080/09540105.2019.1585417)制备双T线免疫层析试纸条。
(4)按照实施例4的方法构建并使用基于固相萃取微流控芯片的荧光免疫 层析检测系统。
用注射器吸取样品的提取液，通过小型注射泵以流速80μL/min注入固相萃 取微流控芯片。
用含0.1％乙酸的甲醇溶液(v/v)作为洗脱液，以20μL/min的流速向固相 萃取微流控芯片推注洗脱液，洗脱样品；同时，在芯片的溶剂蒸发区下方垫一个 陶瓷加热片，设置温度为60℃。
用0.02M的PB溶液作为复溶液，通过小型注射泵以流速80μL/min向固相 萃取微流控芯片注入复溶液，收集流出的溶液，即为样品萃取物。
用双T线免疫层析试纸条进行检测。
将双T线免疫层析试纸条置于实施例4步骤4中的改装装置中，利用智能 手机检测APP测得荧光强度。
2、实验结果
如图11～14所示，本发明成功构建了西地那非类似物(去甲基西地那非、 红地那非、羟基红地那非、伪伐地那非、乌地那非、豪莫西地那非)和他达拉非 类似物(N-去甲基他达拉非、N-丁基去甲他达拉非和乙酰氨基他达拉非)的标 准曲线，可用于西地那非类似物及他达拉非类似物的检测。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发 明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础 上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予 以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均 应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于检测那非类物质的固相萃取微流控芯片，其特征在于，包括第一层基片及设置在第一层基片上的过滤区(1)、用于装设固相萃取填料的固相萃取区(2)和用于蒸发溶剂的溶剂蒸发区(3)，其中过滤区(1)设有过滤装置(101)；所述过滤装置(101)由微柱阵列组成。
2.根据权利要求1所述的固相萃取微流控芯片，其特征在于，所述过滤装置(101)的一端设有过滤装置进样口(102)、另一端设有过滤装置出样口(103)；
所述固相萃取区(2)设有填料槽(201)，填料槽(201)的一端设有填料槽进样口(202)、另一端设有填料槽出样口(203)；
所述溶剂蒸发区(3)设有用于蒸发溶剂的蒸发池(301)、用于蒸气流通的通气孔(302)、用于收集蒸气的储气容器(303)；所述储气容器(303)设置于蒸发池(301)的顶端；所述通气孔(302)设置于蒸发池(301)和储气容器(303)之间；所述蒸发池(301)的一端设有蒸发溶剂进样口(304)、另一端设有蒸发溶剂出样口(305)。
3.根据权利要求2所述的固相萃取微流控芯片，其特征在于，所述第一层基片上还设有第二层基片及第三层基片，第二层基片设置在第一层基片的顶面，第三层基片设置在第二层基片的顶面；
固相萃取区(2)和蒸发池(301)设置在第一层基片上；过滤区(1)和通气孔(302)设置在第二层基片上；储气容器(303)设置在第三层基片上；
所述蒸发溶剂出样口(305)包括第一蒸发溶剂出样口(3051)及第二蒸发溶剂出样口(3052)；所述第一蒸发溶剂出样口(3051)设置于第一层基片，第二蒸发溶剂出样口(3052)设置于第二层基片；
填料槽进样口(201)、填料槽(202)、填料槽出样口(203)、蒸发溶剂进样口(304)、蒸发池(301)和第二蒸发溶剂出样口(3042)通过设置于第一层基片的第一微流管道(4)连接；
过滤装置进样口(102)、过滤装置(101)和过滤装置出样口(103)通过设置于第二层基片的第二微流管道(5)连接。
4.根据权利要求2～3所述的固相萃取微流控芯片，其特征在于，所述储气容器(303)装载有活性炭。
5.根据权利要求2～3所述的固相萃取微流控芯片，其特征在于，所述填料槽(201)装载有固相萃取的填料。
6.一种用于检测那非类物质的系统，其特征在于，包含权利要求1～5任一所述的固相萃取微流控芯片、荧光免疫探针和免疫层析试纸条；
所述荧光免疫探针的制备方法为：介孔硅球耦联荧光素即得到荧光介孔硅球；将荧光介孔硅球与那非类物质的抗体充分混合均匀；离心；封闭，即得到荧光免疫探针；
所述免疫层析试纸条包括相连接的底板(10)、样品垫(11)、基膜(12)和吸水垫(13)；所述基膜上设置标准线C线(14)和若干测试线T线(15)；所述C线(1501)上包被二抗；所述T线(1502)上分别包被不同的那非类物质的抗原；
用固相萃取微流控芯片对检测的样品进行前处理；将荧光免疫探针与前处理后的样品混合，得到混合液；将混合液置于免疫层析试纸条的样品垫(11)。
7.根据权利要求6所述的系统，其特征在于，还包含有用于加热蒸发池(301)中的液体的加热装置。
8.一种那非类物质的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.使用权利要求6～7所述的系统，其中填料槽(202)装有活化的固相萃取的填料；
S2.将待测样品的标准品注入固相萃取微流控芯片；待标准品流尽后，将洗脱液注入固相萃取微流控芯片，并加热；待洗脱液流尽后，将复溶液注入固相萃取微流控芯片，收集从芯片流出的液体，即为样品的萃取液；将萃取液与荧光免疫探针混匀，得到混合液；将免疫层析试纸条放入混合液中充分反应；待反应结束后，取出免疫层析试纸条检测荧光强度；
所述洗脱液为甲醇溶液；所述复溶液为PB溶液；
S3.根据标准品的浓度和步骤S2测得的荧光强度，绘制浓度与荧光强度的标准曲线；
S4.将标准品替换为待测样品，重复步骤S2，测得样品的荧光强度，利用步骤S3绘制的标准曲线计算得到样品中那非类物质的浓度。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，步骤S2中，所述甲醇溶液还含有0.1％乙酸(v/v)。
10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，步骤S2中，所述加热的温度为60℃～65℃。
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