CN1524878A - 纯化基因工程重组干扰素的免疫磁性分离技术 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基因工程重组蛋白的分离技术，特别是利用免疫磁性分离技术分离纯化基因工程重组干扰素(interferon，IFN)，属于生物技术领域。本发明采用不同材料制备含有羟基的磁性微球，经环氧氯丙烷活化后，导入活性氨基，用戊二醛作为连接臂与抗干扰素抗体连接，即得到可用于干扰素分离纯化的免疫磁性微球。用该免疫磁性微球和磁性分离装置对基因工程重组干扰素的发酵菌体裂解液进行分离纯化，活性回收率超过50％，纯化后的干扰素比活性高于1.0×10⁸IU/mg，SDS－PAGE凝胶电泳分析纯度接近100％。

Description

纯化基因工程重组干扰素的免疫磁性分离技术

技术领域

本发明涉及一种基因工程重组蛋白的分离技术，特别是利用免疫磁性分离技术纯化干扰素，属于生物技术领域。

背景技术

干扰素(Interferon，IFN)是机体受外源刺激产生的一类调节蛋白，具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节活性。在临床上对病毒性肝炎、带状疱疹、淋巴瘤、白血病等均有一定的疗效。基因重组人干扰素α-2b(α-2bIFN)作为最早的基因重组蛋白质类药物之一，1986年即在欧美上市(美国Schering-Plough公司)。1990年，国内通过自主研制及引进国外技术，相继有多家企业投入商业化生产，目前国内市场年销售额已达10亿元，美国年销售额20多亿美元。基因重组人干扰素主要利用基因工程菌发酵生产，系胞内活性表达产物，分离纯化过程复杂，要经过细胞破碎、离心分离、盐析沉淀、溶解沉淀、疏水层析、阴阳离子交换层析和凝胶过滤层析等过程。由于分离过程步骤多，造成产品收率较低、成本高。目前，一些公司通常采用亲和层析以提高纯化效率和特异性，但在亲和层析之前也要经过盐析、疏水或离子交换层析等处理才能获得较高的纯化效率。另外，亲和层析介质同特异性抗体的连接多采用巨毒的溴化氰作为偶联剂，增加了工艺的危险性。目前国内外各企业均致力于干扰素分离纯化的新技术的开发与生产工艺的更新。

发明内容

本发明的目的是为蛋白类基因工程产物的分离纯化开辟一条新的途径，涉及纯化基因工程重组干扰素的磁性微球的制备、活化和致敏，以及磁性分离装置的制备。

本发明采用琼脂糖、聚乙烯醇、纤维素等材料分别制备了表面带有羟基的磁性微球，以环氧氯丙烷对微球进行活化，导入活性氨基后，并采用戊二醛作为连接臂与抗干扰素IgG抗体连接，得到可用于干扰素分离纯化的免疫磁性微球。所使用的抗干扰素IgG抗体可以是经纯化精制的抗干扰素单克隆或多克隆IgG抗体。

用上述免疫磁性微球和磁性分离装置对干扰素的发酵菌体裂解液或预处理的菌体裂解液进行免疫磁性分离，活性回收率超过50％，纯化后的人干扰素(IFN)比活性高于1.0×10⁸IU/mg，SDS-PAGE凝胶电泳分析纯度接近100％，符合国家标准。纯化后样品中动物源性抗体含量低于国家规定的每个剂量100ng以下的要求。

本发明的有益效果是：利用该免疫磁性分离技术纯化基因工程重组干扰素(IFN)，操作简便、快速，无须对样品进行复杂的前处理，可以直接从发酵菌体的裂解液中，一步纯化得到高纯度的目的蛋白，大大简化分离纯化的步骤，提高产品收率。分离纯化条件温和，该免疫磁性微球可重复使用10次以上。本发明可望替代免疫亲和层析柱，成为一种快速、高效分离纯化干扰素的新技术。

附图说明

图1磁性微球的扫描电镜照片

其中  A图为琼脂糖磁性微球(×1500)；B图为纤维素磁性微球(×1200)；C图为聚乙烯醇磁性微球(×300)。

图2磁性分离装置示意图

其中(1)柱状的反应密封容器；(2)免疫磁性微球；(3)磁铁；(4)末端出液阀；(5)反应液；(6)上端通气阀；(7)收集容器。

图3干扰素的SDS-PAGE凝胶电泳分析

图中各泳道条件为：泳道a：标准分子量蛋白；泳道b：α-2b干扰素发酵菌体裂解液；泳道c：硫胺沉淀处理的菌体裂解液；泳道d：琼脂糖免疫磁性微球分离结果；泳道e：纤维素免疫磁性微球分离结果；泳道f：聚乙烯醇免疫磁性微球分离结果。

具体实施方式

一.抗干扰素IgG抗体的制备：

1)Anti-IFN血清的制备：

取人干扰素(IFN)标准品，与等体积的弗氏完全佐剂充分混合乳化即得人干扰素(IFN)抗原，取人干扰素(IFN)抗原，分别对2只日本大耳白雄性家兔(体重2Kg)肌肉及皮下进行多点注射。追加注射采用弗氏不完全佐剂乳化制备抗原，每隔两周加强注射一次，共三次，剂量递减。最后一次免疫3天后静脉取血，用间接ELISA法测定抗体效价，测得血清的抗体中和效价为大于1∶10000后，腹动脉放血，将全血静置2小时，3000rpm离心20分钟，收集血清于55℃水浴中灭活30分钟，分装后于-20℃冷冻保存；

2)Anti-IFN IgG抗体的纯化：

取Anti-IFN血清，加入等体积的PBS混匀后，分别加入等体积的饱和硫铵沉淀，离心收集沉淀，沉淀物溶于PBS中，4℃透析过夜，得到粗提的Anti-IFN免疫球蛋白，将上述免疫球蛋白粗品，采用DEAE-cellulose 52离子交换层析进行梯度洗脱，收集合并IgG洗脱峰，经蒸馏水透析，冷冻干燥后得精制兔抗干扰素IgG多克隆抗体。

二.免疫磁性微球的制备：

磁性微球，包括反相物理包埋法制备的琼脂糖磁性微球和纤维素磁性微球，反相悬浮交联法制备的聚乙烯醇磁性微球等含有活性羟基基团的磁性微球；制备工艺包括下属过程：

1)磁流体的制备：

取FeCl₂·4H₂O溶于去离子水中，经微孔滤膜过滤除杂质，然后加入一定量的聚乙二醇和双氧水，混匀后用NaOH溶液调至pH9～11，在50～80℃水浴中反应3～6小时，得到棕黑色磁性胶体粒子的稳定悬浮液即磁流体；

2)琼脂糖磁性微球的制备：

取甲苯，四氯化碳以及Span-80，预热至60～80℃，作为有机相；将一定量的磁流体加入到琼脂糖溶液中，于沸水浴中加热溶解，并迅速转移至有机相中，在2000～5000rpm搅拌下反应5～30分钟后，迅速冷却至室温；最后用乙醚、蒸馏水清洗，筛分粒径在100～300μm之间的琼脂糖磁性微球，于2～8℃保存备用。

3)聚乙烯醇磁性微球的制备：

取200^#汽油、四氯化碳以及Span-80混匀，作为有机相；配制一定浓度聚乙烯醇溶液，加入一定量的磁流体，冰浴5～20分钟，加入戊二醛溶液和盐酸，混匀后迅速倒入有机相中，在2000～5000rpm下分散0.5～2小时，缓慢升温至60～80℃再继续反应1～3小时；最后用乙醚、蒸馏水淋洗，筛分粒径在100～300μm之间的聚乙烯醇磁性微球，于2～8℃保存备用；

4)纤维素磁性微球的制备：

将NaOH溶液加入到一定量的脱脂棉中，浸泡1～4小时，挤去碱液，10～30℃下老化后，加入一定量的二硫化碳混匀，密封后继续反应2～8小时，再加入一定浓度的NaOH溶液反应5～10小时，得到橙红色的黄原酸酯粘胶液；取氯苯、四氯化碳和油酸钾，20～50℃水浴搅拌混匀后，加入一定量溶有磁流体的黄原酸酯粘胶液，在2000～5000rpm下分散20～60分钟后升温至75～100℃，再继续反应1～4小时；最后用乙醚、蒸馏水淋洗，筛分粒径在100～300μm之间的纤维素磁性微球，于2～8℃保存备用。

5)磁性微球的活化：

取一定量的磁性微球在碱性条件下加入一定体积的环氧氯丙烷，在25～40℃下进行活化2～4小时，洗净环氧氯丙烷后加入2～20％氨水，室温反应3～9小时，充分淋洗后再加2～20％戊二醛溶液，室温反应1～5小时，最后用蒸馏水洗掉过量的戊二醛。

6)磁性微球的致敏：

在2～8℃下，取一定量的活化好的磁性微球，加入含有抗干扰素的单克隆或多克隆IgG抗体的NaHCO₃-NaCO₃缓冲液，充分反应后经PBS淋洗，加入NaBH₄进行还原，然后用PBS洗净即得到可用于纯化干扰素(IFN)的免疫磁性微球，抗体偶联量为3～15mg/mL球。

三.干扰素(IFN)的免疫磁性分离：

取免疫磁性微球经PBS充分清洗后，置于磁性分离装置的容器中；加入用缓冲液稀释的基因工程重组干扰素(IFN)的发酵菌体裂解液或预处理的裂解液，于2～8℃缓慢振荡反应3～24小时，反应后将容器置于磁性分离装置上，吸附固定磁性微球，弃去反应液，经PBS清洗后再加入甘氨酸-盐酸缓冲液(pH1.5～3.5)，于2～8℃缓慢振荡反应1～5小时用于解离吸附的干扰素(IFN)，再将玻璃容器置于分离装置上，吸附磁性微球，收集解离液，立即用高浓度的PB缓冲液(pH6.5～8.0)中和，得到纯化的基因工程重组干扰素(IFN)。免疫磁性微球用PBS清洗后，于2～8℃保存可重复使用。

采用ELISA法测定纯化后的干扰素(IFN)免疫学活性，用细胞抑制病变法测定其生物学活性。纯化后干扰素(IFN)的各项纯度指标及动物源IgG含量均达到国家标准。直接纯化发酵菌体裂解液和经硫铵沉淀预处理的裂解液的干扰素(IFN)吸附量可达到9.6×10⁵IU/ml和8.0×10⁵IU/ml。用免疫磁性微球进行多次纯化实验，平均活性回收率大于50％，平均比活性大于1.0×10⁸IU/mg。SDS-PAGE凝胶电泳分析免疫磁性分离纯化的干扰素(IFN)纯度接近100％。

实施例一.

一.抗IFNα-2b抗体IgG的制备：

1.抗血清的制备：

取1mg/mL的IFNα-2b标准品2mL，与等体积的弗氏完全佐剂充分混合乳化后得IFNα-2b乳化抗原。取2mL IFNα-2b的乳化抗原，分别对2只家兔(日本大耳白，雄性，体重2Kg)进行肌肉及皮下的多点注射。追加注射采用弗氏不完全佐剂乳化制备抗原，每隔两周加强注射一次，共三次，剂量递减。最后一次免疫6天后，腹动脉采血，将全血静置2小时，3000rpm离心20分钟，收集血清于55℃水浴中灭活30分钟，分装后于-20℃冷冻保存。

2.抗IFNα-2b IgG抗体的纯化：

取抗IFNα-2b血清10mL，加入等体积的PBS混匀后，分别用50％和33％的饱和硫铵进行分级盐析，离心收集沉淀，沉淀物溶于PBS中，4℃透析过夜，得到粗提的抗IFNα-2b免疫球蛋白。将上述分级盐析的免疫球蛋白粗品，进行DEAE-cellulose 52离子交换层析，以0.02M PB缓冲液(pH8.0)洗脱，收集合并IgG组分，以去离子水透析，冷冻干燥后得精制兔抗IFNα-2b(Anti-IFNα-2b)IgG抗体，经SDS-PAGE检测为单一条带。

二.琼脂糖免疫磁性微球的制备：

1.磁流体的制备：

取6克FeCl₂·4H₂O溶于400mL去离子水中，经微孔滤膜过滤除去杂质。然后加入150克聚乙二醇和100μL 30％H₂O₂混匀，用3M NaOH调溶液pH11，在50～60℃水浴中反应4小时，得到棕黑色磁性胶体粒子的稳定悬浮液即磁流体。

2.琼脂糖磁性微球的制备：

在250ml三角瓶中加入75mL甲苯，30mL四氯化碳以及1.2mL Span-80，预热至70℃，作为有机相；取1克磁流体，加入到30mL 6％琼脂糖溶液中，于100℃水浴中加热溶解作为水相。将水相迅速转移至有机相中，3000rpm搅拌15分钟，然后迅速冷却至室温，得琼脂糖磁性微球。分别用乙醚、蒸馏水淋洗，筛分粒径范围在100～300μm之间的磁性微球，于4℃保存备用。

3.琼脂糖磁性微球的活化和致敏：

取琼脂糖磁性微球1mL，加入2mL 2M NaOH和1mL环氧氯丙烷，30℃下，振荡反应2小时，抽滤后分别用丙酮，蒸馏水清洗。加入10％氨水2mL，室温静置反应6小时。充分洗涤后，加入5％戊二醛2mL，室温振荡反应2小时，再用蒸馏水洗去过量的戊二醛，得活化的琼脂糖磁性微球。在上述微球1mL中加入5mL含有15mgAnti-IFNα-2b多克隆IgG抗体的0.1MNaHCO₃-NaCO₃缓冲液(pH9.6)，4℃反应过夜。经PBS充分洗涤后，加入2mL0.5％NaBH₄进行还原，再经PBS充分洗涤后即得到可用于纯化IFNα-2b的琼脂糖免疫磁性微球。用Lowry法测定抗体的偶联量为12.8mg/mL球。

三.α-2bIFN的免疫磁性分离：

取致敏后的琼脂糖磁性微球1mL，置于磁性分离装置的玻璃容器中；取IFNα-2b发酵菌体裂解液1mL，10000rpm离心10分钟，取200μL上清液于10mLPBS中(稀释50倍)，然后加入到玻璃容器中，于4℃缓慢振荡反应过夜。反应后将玻璃容器置于磁性分离装置上，吸附固定磁性微球，弃去反应液，然后用PBS清洗6次。再加入4mL 0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH2.5)，4℃振荡2小时，解离被免疫磁性微球吸附的IFNα-2b。将玻璃容器置于分离装置上，吸附磁性微球，并收集解离液，立即用少量1M PB缓冲液(pH7.0)中和，得纯化的IFNα-2b。免疫磁性微球经PBS清洗后，于4℃保存，备再次使用。

采用ELISA法检测纯化后的IFNα-2b免疫学活性，用细胞抑制病变法测定其生物学活性。采用致敏的琼脂糖磁性微球直接纯化α-2bIFN发酵菌体裂解液，重复实验3次，平均吸附量为9.6×10⁵IU/ml，平均活性回收率为88.2％，平均比活性为1.5×10⁸IU/mg，经SDS-PAGE凝胶电泳进行纯度分析，纯度接近100％，各项指标及兔源IgG含量均达到国家标准，并显示了良好的重现性。

实施例二.

一.纤维素免疫磁性微球的制备：

1.纤维素磁性微球的制备：

取100g脱脂棉用19％NaOH溶液800mL浸泡2小时，挤去碱液，25℃老化3天；加入50mL二硫化碳混匀，密封后28℃振荡反应5小时，再加入750～850mL的6％NaOH溶液混匀，28℃振荡5小时则得到橙红色黄原酸酯粘胶液。在500ml三颈瓶中加入180mL氯苯、30mL四氯化碳以及0.5克油酸钾，40℃水浴搅拌混匀作为有机相。取含有1克磁流体的黄原酸酯粘胶液70mL，加入到有机相中，3000rpm分散30分钟后，迅速升温至90℃，继续反应2小时，得纤维素磁性微球。分别用乙醚、蒸馏水淋洗，筛分筛选粒径在100～300μm之间的纤维素磁性微球，于4℃保存备用。

2.纤维素磁性微球的活化和致敏：

取纤维素磁性微球1mL，加入2mL 3M NaOH和1mL环氧氯丙烷，40℃下振荡反应2.5小时，抽滤后分别用丙酮，蒸馏水清洗。加入4mL 5％氨水，室温静置反应9小时。充分洗涤后加入5mL 2％戊二醛，室温振荡5小时，再用蒸馏水洗去过量的戊二醛，得活化的纤维素磁性微球。在上述微球1mL中加入5mL含有12mg Anti-IFNα-2b IgG多克隆抗体的0.1MNaHCO₃-NaCO₃缓冲液(pH9.6)，4℃反应过夜。经PBS充分洗涤后，加入2mL0.5％NaBH₄进行还原，再经PBS充分洗涤后即得到可用于纯化IFNα-2b的纤维素免疫磁性微球。用Lowry法测定抗体的偶联量为11.8mg/mL球。

二.α-2bIFN的免疫磁性分离：

取纤维素磁性微球1mL，置于磁性分离装置的玻璃容器中；取α-2bIFN发酵菌体裂解液5mL，10000rpm离心10分钟，再取上清液加入等体积的PBS混匀，缓慢加入等体积预冷的饱和硫铵溶液，混匀，置于冰浴上，放置4小时。4℃，6000rpm离心15分钟，弃上清液，沉淀溶于5ml PBS，用0.1M PBS透析，取500μL透析液于10mL PBS中(稀释20倍)，然后加入到玻璃容器中，于4℃缓慢振荡反应过夜。反应后将玻璃容器置于磁性分离装置上，吸附固定磁性微球，弃去反应液，然后用PBS清洗5次。再加入4mL 0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH2.5)，4℃振荡2小时，解离被免疫磁性微球吸附的IFNα-2b。将玻璃容器置于分离装置上，吸附磁性微球，并收集解离液，立即用少量1M PB缓冲液(pH7.0)中和，得纯化的IFNα-2b。免疫磁性微球经PBS清洗后，于4℃保存，备再次使用。

采用ELISA法检测纯化后的IFNα-2b免疫学活性，用细胞抑制病变法测定其生物学活性。采用致敏的纤维素磁性微球纯化经硫胺沉淀预处理后的IFNα-2b发酵菌体裂解液，重复实验3次，平均吸附量为8.0×10⁵IU/ml，平均活性回收率为50.3％，平均比活性为1.4×10⁸IU/mg，经SDS-PAGE凝胶电泳进行纯度分析，纯度接近100％，各项指标及兔源IgG含量均达到国家标准，并显示了良好的重现性。

实施例三.

一.聚乙烯醇免疫磁性微球的制备：

1.聚乙烯醇磁性微球的制备：

在500ml三颈瓶中加入140mL 200^#汽油、110mL四氯化碳以及5mL Span-80混匀作为有机相；配制10％聚乙烯醇50ml，加入0.6克磁流体后冰浴15分钟，再加入25％戊二醛5mL和1N HCL 6mL；混匀后迅速加入有机相中，3000rpm搅拌30分钟，然后升温至70℃，继续搅拌反应2小时，得聚乙烯醇磁性微球。分别用乙醚、蒸馏水淋洗，筛选粒径在100～300μm之间的聚乙烯醇磁性微球，于4℃保存备用。

2.聚乙烯醇磁性微球的活化和致敏：

取聚乙烯醇磁性微球1ml，加入10mL二甲基亚砜和3mL环氧氯丙烷，40℃，缓慢滴加2M NaOH 10mL，继续反应4小时后，抽滤，分别用丙酮，蒸馏水清洗。加入1.5mL15％氨水，室温静置反应3小时。充分洗涤后加入1mL 10％戊二醛，室温振荡1小时，再用蒸馏水洗去过量的戊二醛，得活化的聚乙烯醇磁性微球。在上述微球1mL中加入5mL含有8mgAnti-IFNα-2b Mab IgG抗体的0.1M NaHCO₃-NaCO₃缓冲液(pH9.6)，4℃反应过夜。经PBS充分洗涤后，加入2mL 0.5％NaBH₄进行还原，再经PBS充分洗涤后即得到可用于纯化IFNα-2b的聚乙烯醇免疫磁性微球。用Lowry法测定抗体的偶联量为3.7mg/mL球。

二.α-2bIFN的免疫磁性分离：

取聚乙烯醇磁性微球1mL，置于磁性分离装置的玻璃容器中；取α-2bIFN发酵菌体裂解液1mL，10000rpm离心10分钟，取100μL上清液于10mL PBS中(稀释100倍)，然后加入到玻璃容器中，于4℃缓慢振荡反应过夜。反应后将玻璃容器置于磁性分离装置上，吸附固定磁性微球，弃去反应液，然后用PBS清洗6次。再加入4mL 0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH2.5)，4℃振荡2小时，解离被免疫磁性微球吸附的IFNα-2b。将玻璃容器置于分离装置上，吸附磁性微球，并收集解离液，立即用少量1M PB缓冲液(pH7.0)中和，得纯化的IFNα-2b。免疫磁性微球经PBS清洗后，于4℃保存，备再次使用。

采用ELISA法检测纯化后的IFNα-2b免疫学活性，用细胞抑制病变法测定其生物学活性。采用致敏的聚乙烯醇磁性微球直接纯化α-2bIFN发酵菌体裂解液，重复实验3次，平均吸附量为4.5×10⁵IU/ml，平均活性回收率为93.9％，平均比活性为1.2×10⁸IU/mg，经SDS-PAGE凝胶电泳进行纯度分析，纯度接近100％，各项指标及鼠源IgG含量均达到国家标准，并显示了良好的重现性。

Claims (8)

1.一种纯化基因工程重组干扰素的免疫磁性分离技术，它包括：

1)采用琼脂糖、聚乙烯醇、纤维素等材料分别制备表面带有羟基的磁性微球；

2)对含有羟基的磁性微球进行活化，并引入戊二醛的侧臂；

3)通过与抗干扰素IgG抗体连接，将磁性微球致敏为免疫磁性微球；

4)利用该免疫磁性微球和磁性分离装置直接从基因工程菌的发酵菌体裂解液或经预处理的菌体裂解液中分离纯化干扰素。

2.根据权利要求1所述的纯化基因工程重组干扰素的免疫磁性分离技术，其特征在于：制备的微球是表面带有羟基的磁性微球，如反相悬浮包埋法制备的琼脂糖磁性微球和纤维素磁性微球，反相悬浮交联法制备的聚乙烯醇磁性微球等含有羟基活性基团的磁性微球；制备工艺包括下属过程：

1)磁流体的制备：

取FeCl₂·4H₂O溶于去离子水中，经微孔滤膜过滤除杂质，然后加入一定量的聚乙二醇和双氧水，混匀后用NaOH溶液调至pH9～11，在50～80℃水浴中反应3～6小时，得到棕黑色磁性胶体粒子的稳定悬浮液即磁流体；

2)琼脂糖磁性微球的制备：

在容器中加入甲苯，四氯化碳以及Span-80，预热至50～80℃，作为有机相；将一定量的磁流体加入到琼脂糖溶液中，于60～100℃水浴中加热溶解，并迅速转移至有机相中，快速搅拌后，迅速冷却至室温；最后用乙醚、蒸馏水清洗，经筛分处理后，于2～8℃保存备用；

3)聚乙烯醇磁性微球的制备：

在容器中加入汽油、四氯化碳以及Span-80混匀，作为有机相；用蒸馏水配制5～20％的聚乙烯醇溶液，加入一定量的磁流体，冰浴5～20分钟，加入戊二醛溶液和1N HCl，混匀后迅速倒入有机相中，充分搅拌后，缓慢升温至60～80℃再继续反应1～5小时；最后用乙醚、蒸馏水淋洗，经筛分处理后，于2～8℃保存备用；

4)纤维素磁性微球的制备：

在一定量的纤维素材料中加入10～30％NaOH溶液，浸泡1～4小时，挤去碱液，10～50℃下老化，加入一定量的二硫化碳混匀，密封，10～50℃后继续反应2～10小时，再加入2～20％NaOH溶液，10～50℃振荡反应2～10小时，得到橙红色的黄原酸酯粘胶液；在容器中加入氯苯、四氯化碳和油酸钾，10～50℃水浴，搅拌混匀后，加入一定量溶有磁流体的黄原酸酯粘胶液，充分搅拌后，升温至75～100℃，再继续反应1～4小时；最后用乙醚、蒸馏水淋洗，经筛分处理后，于2～8℃保存备用。

3.根据权利要求1所述的纯化基因工程重组干扰素的免疫磁性分离技术，其特征在于：抗干扰素的IgG抗体可以为抗干扰素的多克隆抗体或单克隆抗体。

4.根据权利要求1所述的纯化基因工程重组干扰素的免疫磁性分离技术，其特征在于：所述磁性微球的活化是在碱性条件下加入一定体积的环氧氯丙烷，在15～60℃下活化2～6小时，洗净环氧氯丙烷后加入2～20％氨水，室温反应3～12小时，充分淋洗后再加入2～20％戊二醛溶液，室温振荡反应1～5小时，最后再用蒸馏水洗掉过量的戊二醛。

5.根据权利要求1所述的纯化基因工程重组干扰素的免疫磁性分离技术，其特征在于：所述磁性微球的致敏是在2～8℃下，于NaHCO₃-NaCO₃缓冲液中与抗干扰素单克隆或多克隆的IgG抗体进行偶联，经PBS充分洗净后，加入NaBH₄进行还原，然后用PBS洗净即得到可用于纯化干扰素(IFN)的免疫磁性微球，其抗体偶联量为3～15mg/mL球。

6.根据权利要求1所述的纯化基因工程重组干扰素的免疫磁性分离技术，其特征在于：所述磁性分离装置见图2，其形状结构为柱状的反应密封容器(1)，内盛有免疫磁性微球(2)，倒立，容器外围(或两侧)设置磁铁(3)，末端的出口使用出液阀(4)来控制稀释的干扰素(IFN)发酵菌体裂解液或预处理的裂解反应液(5)，上端设有通气孔使用通气阀(6)来控制，下面设置一个盛放反应液的收集容器(7)。

7.根据权利要求1所述的纯化基因工程重组干扰素的免疫磁性分离技术，其特征在于：所述免疫磁性分离过程是取免疫磁性微球置于磁性分离装置的容器中，加入用缓冲液稀释的基因工程重组干扰素的发酵菌体裂解液或预处理的裂解液，于2～8℃缓慢振荡反应，反应后将容器置于磁性分离装置上，吸附固定磁性微球，弃去反应液，经PBS充分清洗后再加入甘氨酸-盐酸缓冲液(pH1.5～3.5)，于2～8℃缓慢振荡解离吸附的干扰素(IFN)，将玻璃容器置于分离装置上，吸附磁性微球，收集解离液，立即用高浓度的PB缓冲液(pH6.5～8.0)中和，得到纯化的干扰素，免疫磁性微球用PBS清洗后，于2～8℃保存可重复使用。

8.根据权利要求1所述的纯化基因工程重组干扰素的免疫磁性分离技术，其特征在于：该技术可直接纯化稀释10～100倍的人干扰素(IFN)发酵菌体裂解液；也可以纯化经预处理的菌体裂解液，预处理方法包括：硫铵沉淀、聚乙二醇沉淀、等电点沉淀等。

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