CN1226418C - 天然活性蛋白质和肽的分离纯化方法 - Google Patents

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Abstract

天然活性蛋白质和肽的分离纯化方法，其特点是将富含蛋白质的天然原料，经脱脂、清洗并进行匀浆，称取匀浆后的原料100重量份和去离子水100～250重量份加入到生化反应器中，调节pH＝5～8，升温70～90℃，保温搅拌10～30分钟，然后迅速降温至30～50℃，加入复合蛋白酶0.02～0.5重量份，搅拌均匀后，进行酶解反应，获得蛋白质和肽的混合物，采用经OMEGA技术处理的聚醚砜超低蛋白质吸附膜和切向流超滤技术，将其按分子量的大小进行分级后，再通过离子交换色谱分离模式纯化，即阴离子交换柱，磷酸盐缓冲系统，色谱柱的平衡、上样、淋洗、洗脱等工序，获得不同分子量和不同分子结构的纯天然活性蛋白和肽。

Description

天然活性蛋白质和肽的分离纯化方法
一、技术领域
本发明涉及天然活性蛋白质和肽的分离纯化方法，属于生物制品加工领域。
二、背景技术
近年来，蛋白质和肽的研究进展迅速，已从动物、植物、细菌、真菌中分离出了多种天然生物活性蛋白质和肽。无论从结构和功能来说，天然生物活性蛋白质和肽是自然界中种类、功能最复杂的化合物。大量的研究证实活性蛋白质和肽具有促进免疫、激素、酶抑制剂、抗菌、抗血脂等作用。随着研究的深入，更多的生物活性蛋白质和肽的生理和药理功能已逐渐被人们所确认。但天然活性蛋白质和肽的分离纯化一直是阻碍其应用的最大障碍。其主要原因是：
1、大多数蛋白质和肽产品是生物活性物质，在分离纯化过程中，有机溶剂、溶液pH值、离子强度的变化均可使蛋白质失活；
2、含蛋白质和肽产品的物料不稳定，蛋白质产品易受蛋白酶降解；
3、很多蛋白质和肽产品作为医药、食品被人类利用，因而要求蛋白质产品必须是高度纯化的，产品要求无菌、无致热源等；
4、具有生物活性是蛋白质和肽的最重要的特性，而蛋白质的活性是由其特定的分子结构和分子大小所决定的。
我国是农业大国，动物皮、卵清、大豆或玉米等天然原料相当丰富，它们都富含蛋白质，就现有的应用水平来说，还处在初级阶段，造成了资源的极大浪费和环境的污染，经济效益低下。
由天然蛋白质原料提取的活性蛋白质和肽是分子量大小不同片段的混合物，研究表明天然蛋白质和肽具有很多生理功能，某些天然肽片段具有特殊的生物活性和功能。天然蛋白质肽和其他蛋白质一样，不同分子结构和分子大小的蛋白质肽，也具有不同的生物活性，其应用也各不相同。因此，按不同的应用目的将其进行分离纯化，是对天然蛋白质和肽深度开发和利用的核心技术，是将天然蛋白质和肽制备技术进行升级的关键。若能利用现代分离手段，分离纯化出不同级分的活性蛋白质和肽，将其进一步深加工为具有特殊功能的医药保健、生物医学材料、美容整形品等，其社会效益、经济效益将更显著。
三、发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种天然活性蛋白质和肽的分离纯化方法，其特点是将富含蛋白质的天然原料经过高效多元复合酶生物降解后，获得的蛋白质和肽的混合物，经切向流超滤按分子量的大小进行分级之后，采用离子交换色谱的分离模式进行分离纯化，获得高纯度的不同分子结构和不同分子量的天然活性蛋白质和肽。
本发明的目的由以下技术措施实现，其中所述原料份数除特殊说明外，均为重量份数。
天然活性蛋白质和肽的分离纯化方法：
1、将富含蛋白质的天然原料，经脱脂、清洗并进行匀浆，称取匀浆后的原料100份和去离子水100～250份加入到生化反应器中，调节pH＝5～8，升温70～90℃，保温搅拌10～30分钟，然后迅速降温至30～50℃，加入复合蛋白酶0.02～0.5份，搅拌均匀后，进行酶解反应，获得蛋白质和肽的混合物，采用经OMEGA技术处理的聚醚砜超低蛋白质吸附膜和切向流超滤技术，将蛋白质和肽的混合物按分子量的大小进行分级；
2、采用离子交换色谱分离模式，其分离纯化的条件：
色谱柱：阴离子交换柱，有效孔径10～30nm；
流动相：A：0.001～0.5摩尔/升 磷酸盐缓冲液(pH＝6.0～8.0)，
        B：0.1～1.0摩尔/升 NaCl(pH＝6.0～8.0)；
流速：50～100毫升/分；
梯度：经10～30分钟流动相由0.001～0.5摩尔/升Tris-HCl(pH＝6.0～8.0)到
      0.1～1.0摩尔/升 NaCl(pH＝6.0～8.0)；
柱温：20～25℃；
进样量：50～100毫升；
紫外检测：260nm。
3、离子交换色谱的操作步骤如下：
(1)色谱柱的平衡：0.001～0.5摩尔/升 磷酸盐缓冲液(pH＝6.0～8.0)，冲洗至基
                 线平稳；
(2)上样：50～100毫升；
(3)淋洗：0.001～0.5摩尔/升 磷酸盐缓冲液(pH＝6.0～8.0)，淋洗至基线平稳；
(4)洗脱：0.1～1.0摩尔/升 NaCl(pH＝6.0～8.0)，线性梯度洗脱，并收集相应的
         馏分；
(5)清洗：分别用0.5M NaOH和1.5M NaCl进行清洗和再生；
4、将所收集到的各馏分，经过透析、分别冷冻保存。
本发明具有如下优点：
1、由于在低温操作，可以保证天然蛋白和肽的的活性回收；
2、离子交换色谱具有浓缩作用，可在较高流速下进行操作；
3、采用离子交换树脂填料和一般酸碱盐缓冲液作为洗脱剂，其运行成本低，而且产品回收率高；
4、由于离子交换色谱的介质材料，以及含盐的缓冲流动相十分类似于蛋白质稳定存在的生理液条件，有利于增加活性回收率；
5、采用离子交换色谱分离纯化技术，无相变发生，无致热源导入，不使用有机溶剂，不改变溶液pH值和离子强度，这些都有利于天然蛋白和肽活性的保留；
6、整个工艺无三废产生，为环境友好的绿色工艺，其产品是安全绿色的。
四、具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步的说明，但不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容作出一些非本质的改进和调整。
实施例
1、天然活性胶原蛋白和肽的分离纯化
(1)将动物皮用3％Na2CO3溶液进行脱脂，用去离子水漂洗3次，进行匀浆，称取匀浆后的原料100千克与去离子水150千克混合，加入到生化反应器中；调节pH＝7，温度85℃，搅拌保持10分钟，迅速降温至40℃；加入复合蛋白酶20克，搅拌均匀后酶解，获得蛋白质和肽的混合物，根据天然活性蛋白质和肽不同的用途，采用经OMEGA技术处理的聚醚砜超低蛋白质吸附膜和切向流超滤技术，将蛋白质和肽的混合物按分子量的大小进行分级；
(2)采用离子交换色谱分离模式，其分离纯化的条件：
色谱柱：阴离子交换柱，有效孔径25nm；
流动相：A：0.001～0.5摩尔/升 磷酸盐缓冲液(pH＝6.0～8.0)，
        B：0.1～1.0摩尔/升 NaCl(pH＝6.0～8.0)；
流速：50～100毫升/分；
梯度：经10～30分钟流动相由0.001～0.5摩尔/升 磷酸盐缓冲液(pH＝6.0～8.0)
      到0.1～1.0摩尔/升 NaCl(pH＝6.0～8.0)；
柱温：20～25℃；
进样量：50～100毫升；
紫外检测：260nm。
(3)离子交换色谱的操作步骤如下：
a.色谱柱的平衡：0.001～0.5摩尔/升 磷酸盐缓冲液(pH＝6.0～8.0)，冲洗至基
                线平稳；
b.上样：50～100毫升；
c.淋洗：0.001～0.5摩尔/升 磷酸盐缓冲液(pH＝6.0～8.0)，淋洗至基线平稳；
d.洗脱：0.1～1.0摩尔/升 NaCl(pH＝6.0～8.0)，线性梯度洗脱，并收集相应的
        馏分；
e.清洗：分别用0.5M NaOH和1.5M NaCl进行清洗和再生；
(4)将所收集到的各馏分，经过透析、分别冷冻保存。
2、天然活性大豆、玉米蛋白和肽的分离纯化
(1)将经过严格检验的大豆或玉米，进行清洗、压榨、脱脂并匀浆，称取匀浆后的原料100千克与去离子水100千克混合，加入到生化反应器中；调节pH＝7，升温至40℃；加入复合蛋白酶25克，搅拌均匀后酶解，获得蛋白质和肽的混合物，根据天然活性蛋白质和肽不同的用途，采用经OMEGA技术处理的聚醚砜超低蛋白质吸附膜和切向流超滤技术，将蛋白质和肽的混合物按分子量的大小进行分级；
(2)采用离子交换色谱分离模式，其分离纯化的条件：
色谱柱：阴离子交换柱，有效孔径10nm；
流动相：A：0.001～0.5摩尔/升 磷酸盐缓冲液(pH＝6.0～8.0)，
        B：0.1～1.0摩尔/升 NaCl(pH＝6.0～8.0)；
流速：50～100毫升/分；
梯度：经10～30分钟流动相由0.001～0.5摩尔/升 磷酸盐缓冲液(pH＝6.0～8.0)
      到0.1～1.0摩尔/升 NaCl(pH＝6.0～8.0)；
柱温：20～25℃；
进样量：50～100毫升；
紫外检测：260nm。
(3)离子交换色谱的操作步骤如下：
a.色谱柱的平衡：0.001～0.5摩尔/升 磷酸盐缓冲液(pH＝6.0～8.0)，冲洗至基
                线平稳；
b.上样：50～100毫升；
c.淋洗：0.001～0.5摩尔/升 磷酸盐缓冲液(pH＝6.0～8.0)，淋洗至基线平稳；
d.洗脱：0.1～1.0摩尔/升 NaCl(pH＝6.0～8.0)，线性梯度洗脱，并收集相应的
        馏分；
e.清洗：分别用0.5M NaOH和1.5M NaCl进行清洗和再生；
(4)将所收集到的各馏分，经过透析、分别冷冻保存。

Claims (1)

1、天然活性蛋白质和肽的分离纯化方法，其特征在于：
(1)将富含蛋白质的天然原料，经脱脂、清洗并进行匀浆，称取匀浆后的原料100重量份和去离子水100～250重量份加入到生化反应器中，调节pH＝5～8，升温70～90℃，保温搅拌10～30分钟，然后迅速降温至30～50℃，加入复合蛋白酶0.02～0.5重量份，搅拌均匀后，进行酶解反应，获得蛋白质和肽的混合物，采用经OMEGA技术处理的聚醚砜超低蛋白质吸附膜和切向流超滤技术，将其按分子量的大小进行分级后，再进行离子交换色谱模式的分离纯化；
(2)采用离子交换色谱分离模式，其分离纯化的条件：
色谱柱：阴离子交换柱，有效孔径10～30nm；
流动相：A：0.001～0.5摩尔/升磷酸盐缓冲液pH＝6.0～8.0，
        B：0.1～1.0摩尔/升NaCl pH＝6.0～8.0；
流速：50～100毫升/分；
梯度：经10～30分钟流动相由0.001～0.5摩尔/升磷酸盐缓冲液pH＝6.0～8.0到0.1～1.0摩尔/升NaCl pH＝6.0～8.0；
柱温：20～25℃；
进样量：50～100毫升；
紫外检测：260nm；
(3)离子交换色谱的操作步骤如下：
a.色谱柱的平衡：0.001～0.5摩尔/升磷酸盐缓冲液pH＝6.0～8.0，冲洗至基线平稳；
b.上样：50～100毫升；
c.淋洗：0.001～0.5摩尔/升磷酸盐缓冲液pH＝6.0～8.0，淋洗至基线平稳；
d.洗脱：0.1～1.0摩尔/升NaCl pH＝6.0～8.0，线性梯度洗脱，并收集相应的馏分；
e.清洗：分别用0.5M NaOH和1.5M NaCl进行清洗和再生色谱柱；
(4)将所收集到的各馏分，经过透析、分别冷冻保存。
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