CN105170042A - 一种磁性微球的制备及其抗体分离的新方法 - Google Patents
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Abstract
发明公开了一种磁性微球的制备及其抗体分离的新方法。具体步骤如下：1)磁性微球基质制备。2)磁性微球基质的活化。3)功能配基的偶联。4)将微球加入单抗细胞液中，并在振荡混合吸附抗体。5)用磁铁在三角瓶外壁吸住微球，倾倒掉细胞液，平衡缓冲液冲洗。6)加入解吸缓冲液，充分振荡，用磁铁从三角瓶外壁吸住微球，收集含有产品的解吸缓冲液。本发明所研制的具有疏水性电荷诱导效应的新型磁性微球，结合了疏水性电荷诱导效应和磁性响应的特点，具有高蛋白载量、解吸条件温和以及分离操作简便等优点，可用于直接从含有固体杂质的料液中高效分离抗体。
Description
技术领域
本发明涉及一种磁性微球的制备及其抗体分离的新方法，属于生物技术领域。
背景技术
抗体是一类重要的生物大分子，能特异性识别相应的抗原。目前，抗体已经广泛应用于疾病治疗、体外诊断和检测、肿瘤定位显像和生物分离等领域。
无论是从血液、腹水、初乳还是从细胞培养液中分离抗体，通常需要通过离心或者过滤等方法去除料液中的细胞和固体杂质颗粒，再结合亲和层析等步骤进行纯化。整个过程步骤多，操作繁琐，同时亲和层析填料存在配基易脱落和价格昂贵等缺点。因此，亟待开发更为经济高效的抗体分离技术。
疏水性电荷诱导层析(Hydrophobicchargeinductionchromatography，HCIC)，通过疏水作用力吸附蛋白，并通过调节溶液pH使得蛋白和配基产生静电排斥来协助蛋白洗脱(J.Chromatogr.A，1998，814：71)，在抗体分离中显示出良好的应用前景。Guerrier等人(Bioseparation2000，9：211)报道了以巯基杂环化合物为相关HCIC功能配基进行抗体吸附分离，专利(USPatent5,652,348)描述了相关介质及其制备方法。专利(CN101279243；CN101279244；CN101284224)报道了在含碳化钨的纤维素微球上偶联HCIC配基制备扩张床介质，采用扩张床模式分离抗体。此外，专利(CN104096544A；CN104117345A)公开了以氨基苯并咪唑为功能基团的HCIC层析介质的制备方法，并引入第二个官能基团进一步提高抗体的选择性。以上研究的研究重点在于HCIC功能配基的设计和改造，仍然将层析基质作为偶联载体，以层析方式进行蛋白分离。层析过程对原料液的澄清度有较高的要求，料液中存在的固体杂质颗粒(细胞及细胞碎片或培养基组分等)容易堵塞床层。因此，在实际层析分离过程，需要对原料进行离心过滤等步骤去除相关固体杂质。尽管扩张床模式也可以避免对料液进行固体颗粒的去除步骤，但是扩张床模式操作复杂，对设备和工艺参数控制要求高。因此，开发更为简便的抗体分离新方法，对于提高抗体分离效率具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种磁性微球的制备及其抗体分离的新方法。
所述的一种磁性微球的制备及其抗体分离的新方法包括以下步骤：
1)按照质量比2∶1∶1∶50分别称取琼脂糖、纳米四氧化三铁、氯化钠和去离子水，超声混合并加热融化琼脂糖，制得水相；
2)按照质量比5∶30∶1称取水相、真空泵油和聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯80(吐温80)混合，70℃下高速搅拌进行乳化2小时，置于冰水浴中降温，收集微球；
3)按照质量比2∶2∶1称取微球、1M的氢氧化钠和环氧氯丙烷混合，室温振荡反应1小时，添加0.1倍微球质量的硼氢化钠，室温振荡反应8小时，得到交联的磁性微球；
4)按照质量比2∶2∶1∶1称取微球、去离子水、烯丙基溴和氢氧化钠，室温振荡活化24小时，水洗，加入1倍微球质量的N-溴代丁二酰亚胺及3倍微球质量的去离子水，室温振荡反应1小时，水洗得到活化的磁性微球；
5)按照质量比2∶1∶3称取活化的磁性微球、4-氨基吲哚以及0.1M碳酸钠缓冲液(pH12)，室温振荡8小时，水洗，加入2倍微球质量的乙醇胺中，室温振荡反应2小时，得到偶联有4-氨基吲哚的磁性微球。
6)将微球与pH6-8的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠平衡缓冲液在具塞三角瓶中振荡混合，进行预平衡，用磁铁在三角瓶外壁吸住微球，倾倒掉平衡缓冲液；
7)按照每克微球加入10-100ml细胞液比例加入细胞液，振荡混合10-20分钟，用磁铁在三角瓶外壁吸住微球，倾倒掉细胞液；
8)按照每克微球加入20ml平衡缓冲液比例加平衡缓冲液，振荡混合1-5分钟，用磁铁在三角瓶外壁吸住微球，倾倒掉平衡缓冲液，完成微球的冲洗；
9)按照每克微球加入10ml缓冲液比例加入pH3-5的柠檬酸钠缓冲液作为解吸缓冲液，振荡混合3-5分钟，用磁铁在三角瓶外壁吸住微球，收集解吸缓冲液，得到抗体溶液。
所述的基质为包裹纳米四氧化三铁的多孔琼脂糖微球，配基为经烯丙基溴活化后偶联的4-氨基吲哚。
所述的新型磁性微球的配基密度为100-200μmol/ml。
本发明研制的以4-氨基吲哚为功能配基的磁性微球同时具有疏水性电荷诱导效应和磁性响应特点，可以用于抗体的高效分离。磁性微球的疏水性电荷诱导效应使得其抗体吸附容量大，耐盐吸附，洗脱只需通过调节溶液pH至弱酸即可实现。磁性响应特点使得微球可以通过外加磁场的施加实现微球与料液的快速分离，尤其在料液中含有细胞或其他固体杂质时。因此，采用具有疏水性电荷诱导效应的磁性微球可以从各种的复杂的料液中直接分离抗体，减少了离心过滤以及调节料液离子强度等步骤，极大地提高抗体分离的效率。此外，微球的性质稳定、配基结合牢固、清洗再生方便。
附图说明
附图1是本发明制备的具有疏水性电荷诱导效应的新型磁性微球的光学显微镜照片，图2是本发明直接从细胞培养液中分离单克隆抗体的电泳谱图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的描述：
实施例1
称取2g琼脂糖、1g纳米四氧化三铁、1g氯化钠和50g去离子水，超声混合并加热融化琼脂糖，制得水相；将水相与324g的真空泵油以及10.8g的吐温80混合，70℃下高速搅拌进行乳化2小时，乳化结束后置于冰水浴中降温，收集微球；取10g微球与10g1M的氢氧化钠以及2g环氧氯丙烷混合，室温振荡反应1小时，随后添加1g硼氢化钠，室温振荡反应8小时，得到交联的磁性微球基质；称取10g交联的磁性微球，加入10g去离子水、5g烯丙基溴和5g氢氧化钠，室温振荡活化24小时，水洗，5gN-溴代丁二酰亚胺和30g去离子水，室温振荡反应1小时，水洗得到活化的磁性微球；加入5g4-氨基吲哚以及15g0.1M碳酸钠缓冲液(pH12)混合，室温振荡8小时，水洗，加入20g乙醇胺，室温振荡反应2小时，得到偶联有4-氨基吲哚的磁性微球。称取4-氨基吲哚的磁性微球10g与100mlpH6的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠平衡缓冲液在具塞三角瓶中振荡混合，进行预平衡，用磁铁在三角瓶外壁吸住微球，倾倒掉平衡缓冲液，加入100ml单抗细胞液，振荡混合10分钟，用磁铁在三角瓶外壁吸住微球，倾倒掉细胞液；加入200ml平衡缓冲液，振荡混合1分钟，用磁铁在三角瓶外壁吸住微球，倾倒掉平衡缓冲液，完成微球的冲洗；加入100ml缓冲液比例加入pH3的柠檬酸钠缓冲液作为解吸缓冲液，振荡混合3分钟，用磁铁在三角瓶外壁吸住微球，收集解吸缓冲液，得到抗体溶液，纯度为98.1％。
实施例2
称取2g琼脂糖、1g纳米四氧化三铁、1g氯化钠和50g去离子水，超声混合并加热融化琼脂糖，制得水相；将水相与324g的真空泵油以及10.8g的吐温80混合，70℃下高速搅拌进行乳化2小时，乳化结束后置于冰水浴中降温，收集微球；取10g微球与10g1M的氢氧化钠以及2g环氧氯丙烷混合，室温振荡反应1小时，随后添加1g硼氢化钠，室温振荡反应8小时，得到交联的磁性微球基质；称取10g交联的磁性微球，加入10g去离子水、5g烯丙基溴和5g氢氧化钠，室温振荡活化24小时，水洗，5gN-溴代丁二酰亚胺和30g去离子水，室温振荡反应1小时，水洗得到活化的磁性微球；加入5g4-氨基吲哚以及15g0.1M碳酸钠缓冲液(pH12)混合，室温振荡8小时，水洗，加入20g乙醇胺，室温振荡反应2小时，得到偶联有4-氨基吲哚的磁性微球。称取4-氨基吲哚的磁性微球10g与100mlpH8的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠平衡缓冲液在具塞三角瓶中振荡混合，进行预平衡，用磁铁在三角瓶外壁吸住微球，倾倒掉平衡缓冲液，加入1000ml单抗细胞液，振荡混合20分钟，用磁铁在三角瓶外壁吸住微球，倾倒掉细胞液；加入200ml平衡缓冲液，振荡混合5分钟，用磁铁在三角瓶外壁吸住微球，倾倒掉平衡缓冲液，完成微球的冲洗；加入100ml缓冲液比例加入pH5的柠檬酸钠缓冲液作为解吸缓冲液，振荡混合5分钟，用磁铁在三角瓶外壁吸住微球，收集解吸缓冲液，得到抗体溶液，纯度为99.2％。
实施例3
称取2g琼脂糖、1g纳米四氧化三铁、1g氯化钠和50g去离子水，超声混合并加热融化琼脂糖，制得水相；将水相与324g的真空泵油以及10.8g的吐温80混合，70℃下高速搅拌进行乳化2小时，乳化结束后置于冰水浴中降温，收集微球；取10g微球与10g1M的氢氧化钠以及2g环氧氯丙烷混合，室温振荡反应1小时，随后添加1g硼氢化钠，室温振荡反应8小时，得到交联的磁性微球基质；称取10g交联的磁性微球，加入10g去离子水、5g烯丙基溴和5g氢氧化钠，室温振荡活化24小时，水洗，5gN-溴代丁二酰亚胺和30g去离子水，室温振荡反应1小时，水洗得到活化的磁性微球；加入5g4-氨基吲哚以及15g0.1M碳酸钠缓冲液(pH12)混合，室温振荡8小时，水洗，加入20g乙醇胺，室温振荡反应2小时，得到偶联有4-氨基吲哚的磁性微球。称取4-氨基吲哚的磁性微球10g与100mlpH6的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠平衡缓冲液在具塞三角瓶中振荡混合，进行预平衡，用磁铁在三角瓶外壁吸住微球，倾倒掉平衡缓冲液，加入500ml单抗细胞液，振荡混合15分钟，用磁铁在三角瓶外壁吸住微球，倾倒掉细胞液；加入200ml平衡缓冲液，振荡混合3分钟，用磁铁在三角瓶外壁吸住微球，倾倒掉平衡缓冲液，完成微球的冲洗；加入100ml缓冲液比例加入pH4的柠檬酸钠缓冲液作为解吸缓冲液，振荡混合4分钟，用磁铁在三角瓶外壁吸住微球，收集解吸缓冲液，得到抗体溶液，纯度为98.5％。
实施例4
称取2g琼脂糖、1g纳米四氧化三铁、1g氯化钠和50g去离子水，超声混合并加热融化琼脂糖，制得水相；将水相与324g的真空泵油以及10.8g的吐温80混合，70℃下高速搅拌进行乳化2小时，乳化结束后置于冰水浴中降温，收集微球；取10g微球与10g1M的氢氧化钠以及2g环氧氯丙烷混合，室温振荡反应1小时，随后添加1g硼氢化钠，室温振荡反应8小时，得到交联的磁性微球基质；称取10g交联的磁性微球，加入10g去离子水、5g烯丙基溴和5g氢氧化钠，室温振荡活化24小时，水洗，5gN-溴代丁二酰亚胺和30g去离子水，室温振荡反应1小时，水洗得到活化的磁性微球；加入5g4-氨基吲哚以及15g0.1M碳酸钠缓冲液(pH12)混合，室温振荡8小时，水洗，加入20g乙醇胺，室温振荡反应2小时，得到偶联有4-氨基吲哚的磁性微球。称取4-氨基吲哚的磁性微球10g与100mlpH7的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠平衡缓冲液在具塞三角瓶中振荡混合，进行预平衡，用磁铁在三角瓶外壁吸住微球，倾倒掉平衡缓冲液，加入200ml单抗细胞液，振荡混合10分钟，用磁铁在三角瓶外壁吸住微球，倾倒掉细胞液；加入200ml平衡缓冲液，振荡混合1分钟，用磁铁在三角瓶外壁吸住微球，倾倒掉平衡缓冲液，完成微球的冲洗；加入100ml缓冲液比例加入pH4.5的柠檬酸钠缓冲液作为解吸缓冲液，振荡混合3分钟，用磁铁在三角瓶外壁吸住微球，收集解吸缓冲液，得到抗体溶液，纯度为98.9％。
Claims (1)
1.一种磁性微球的制备及其抗体分离的新方法，其特征在于包括如下步骤：
1)按照质量比2∶1∶1∶50分别称取琼脂糖、纳米四氧化三铁、氯化钠和去离子水，超声混合并加热融化琼脂糖，制得水相；
2)按照质量比5∶30∶1称取水相、真空泵油和聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯80(吐温80)混合，70℃下高速搅拌进行乳化2小时，置于冰水浴中降温，收集微球；
3)按照质量比2∶2∶1称取微球、1M的氢氧化钠和环氧氯丙烷混合，室温振荡反应1小时，添加0.1倍微球质量的硼氢化钠，室温振荡反应8小时，得到交联的磁性微球；
4)按照质量比2∶2∶1∶1称取微球、去离子水、烯丙基溴和氢氧化钠，室温振荡活化24小时，水洗，加入1倍微球质量的N-溴代丁二酰亚胺及3倍微球质量的去离子水，室温振荡反应1小时，水洗得到活化的磁性微球；
5)按照质量比2∶1∶3称取活化的磁性微球、4-氨基吲哚以及0.1M碳酸钠缓冲液(pH12)，室温振荡8小时，水洗，加入2倍微球质量的乙醇胺中，室温振荡反应2小时，得到偶联有4-氨基吲哚的磁性微球。
6)将微球与pH6-8的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠平衡缓冲液在具塞三角瓶中振荡混合，进行预平衡，用磁铁在三角瓶外壁吸住微球，倾倒掉平衡缓冲液；
7)按照每克微球加入10-100ml细胞液比例加入细胞液，振荡混合10-20分钟，用磁铁在三角瓶外壁吸住微球，倾倒掉细胞液；
8)按照每克微球加入20ml平衡缓冲液比例加平衡缓冲液，振荡混合1-5分钟，用磁铁在三角瓶外壁吸住微球，倾倒掉平衡缓冲液，完成微球的冲洗；
9)按照每克微球加入10ml缓冲液比例加入pH3-5的柠檬酸钠缓冲液作为解吸缓冲液，振荡混合3-5分钟，用磁铁在三角瓶外壁吸住微球，收集解吸缓冲液，得到抗体溶液；
所述的磁性微球的基质为包裹纳米四氧化三铁的多孔琼脂糖微球，配基为经烯丙基溴活化后偶联的4-氨基吲哚，配基密度为100-200μmol/ml。
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