CN104096544B - 以氨基苯并咪唑为功能配基的层析介质及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以氨基苯并咪唑为功能配基的层析介质及其制备方法。以亲水性多孔微球为层析基质，采用烯丙基溴活化，偶联氨基苯并咪唑，得到以氨基苯并咪唑为功能配基的介质。层析基质中依次加入二甲基亚砜和烯丙基溴进行活化；活化的层析基质和N-溴代丁二酰亚胺反应，进行溴代醇化；将溴代醇化后的层析基质与氨基苯并咪唑溶液混合，偶联氨基苯并咪唑配基；最后采用乙醇胺水溶液对未反应的溴代醇化末端进行封闭，得到以氨基苯并咪唑为功能基团的疏水性电荷诱导层析介质。本发明的新型层析介质制备过程简便，抗体吸附容量高，具有非盐依赖吸附的特性，通过改变溶液pH至弱酸性即可实现解吸和回收，可以用于疏水性电荷诱导层析分离抗体。
Description
技术领域
本发明涉及一种以氨基苯并咪唑为功能配基的层析介质及其制备方法，属于生物化工领域中的蛋白层析分离技术。
背景技术
抗体能与相应抗原特异性结合，产生各种免疫效应。随着生物技术的迅猛发展和抗体工程技术不断突破，单克隆抗体、多克隆抗体以及基因工程抗体已经广泛应用于生物学和医学领域。抗体用途主要包括疾病治疗、体外诊断和检测、肿瘤定位显像以及作为亲和配基用于分离纯化等。
抗体产品往往纯度要求较高，同时还必须保持生物活性，因此传统的分离过程往往难以满足要求。蛋白A或蛋白G亲和层析介质能够特异性结合抗体，但蛋白类亲和配基易被料液中蛋白酶降解脱落，污染产品，且重复使用次数低，介质价格昂贵，操作成本极高，限制了其大规模应用。而传统的离子交换层析和疏水相互作用层析等方法虽然能够结合抗体，但是特异性和选择性较差，分离步骤多，纯化效果有限。因此，开发具有抗体选择性的非蛋白类配基成为研究热点。
目前报道的针对抗体分离的非蛋白配基较多，有仿生亲和配基Ligand22/8（J.Chromatogr.BBiomed.Sci.Appl.2000，740：1）、多肽配基TG19318（J.Mol.Recognit.1998，11：128）、D2AAG（J.Chromatogr.A2012，1225：158）和HWRGWV（J.Chromatogr.A2009，1216：910）等。这些配基往往过于关注特异性和亲和力，而造成抗体洗脱条件较为苛刻或者收率较低。Burton和Harding提出疏水电荷诱导层析（Hydrophobicchargeinductionchromatography,HCIC），通过疏水作用力吸附蛋白，采用调节溶液pH使得蛋白和配基产生静电排斥来协助洗脱（J.Chromatogr.A,1998,814:71）。Boschetti等（Bioseparation2000,9:211）提出了利用含巯基杂环化合物为配基吸附抗体，结合静电排斥协助洗脱，专利（USPatent5,652,348）描述了相关介质及其制备方法。中国专利（CN101279243；CN101279244；CN101284224）也报道了在HCIC介质空间臂中引入砜基，提高介质对抗体的选择性。这些介质主要采用含巯基的杂环化合物为配基，通过配基的巯基位点与基质偶联，偶联效率较低，且洗脱时只能借助杂环上的质子化氮原子与蛋白间的排斥力进行洗脱，静电排斥力有限，完全洗脱的pH较低，易造成抗体活性的损失。因此，开发性能更优良的HCIC介质，对于抗体的大规模分离纯化有着重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种以氨基苯并咪唑为功能配基的层析介质及其制备方法。
以氨基苯并咪唑为功能配基的层析介质包括层析基质和配基，所述的层析基质为带有羟基的亲水性多孔微球，配基为经烯丙基溴活化后偶联的氨基苯并咪唑，所述的氨基苯并咪唑为2-氨基苯并咪唑、4-氨基苯并咪唑或5-氨基苯并咪唑。
当氨基苯并咪唑为2-氨基苯并咪唑时，层析介质的结构组成为：
，
当氨基苯并咪唑为4-氨基苯并咪唑时，层析介质的结构组成为：
，
当氨基苯并咪唑为5-氨基苯并咪唑时，层析介质的结构组成为：
。
所述的层析基质为具有多孔结构和表面羟基的亲水性微球。
所述的层析基质为琼脂糖凝胶或纤维素微球。
所述的层析介质的配基密度为40-150μmol/ml。
所述的以氨基苯并咪唑为功能配基的层析介质的制备方法包括如下步骤：
1）将层析基质抽干后，加入0.2-1倍层析基质质量的20%（v/v）二甲基亚砜、0.1-1倍层析基质质量的烯丙基溴和0.1-0.5倍层析基质质量的氢氧化钠，25℃下150rpm摇床中活化8-48小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化层析基质；
2）将活化层析基质和0.1-0.5倍层析基质质量的N-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应1-5小时，抽滤，用去离子水洗涤，得到溴代醇化的基质；
3）将溴代醇化的基质和0.1-0.3倍层析基质质量的氨基苯并咪唑以及0.5-1M碳酸钠缓冲液混合，碳酸钠缓冲液的pH为10-12，25℃下150rpm摇床中反应8-24小时，得到氨基苯并咪唑偶联后的介质；
4）将氨基苯并咪唑偶联后的介质抽滤，去离子水洗涤，加入到含有1-5倍层析基质质量的乙醇胺中，25℃下150rpm摇床中反应2-8小时，去离子水洗涤，得到以氨基苯并咪唑为功能配基的疏水性电荷诱导层析介质。
本发明研制的以氨基苯并咪唑为功能配基的层析介质，可以用于疏水性电荷诱导层析分离，具有以下优点：（1）抗体吸附容量大，饱和吸附容量可达140mg/ml湿介质，处理能力强；（2）吸附过程不受盐影响，在很宽的电导率范围（0-100mS/cm）内，吸附容量基本保持不变，无需对料液进行稀释或加盐处理，可以直接捕获蛋白，减少了操作步骤；（3）洗脱方便，氨基苯并咪唑配基的pKa较高（6.5），容易质子化，只需通过调节溶液pH至5附近就可实现完全洗脱，避免过酸、过碱或高盐等对蛋白结构产生不良影响或活性损失；（4）配基密度高，电荷诱导效应强，通过配基上的伯氨基位点偶联配基，偶联效率高，且该氨基位点也可质子化，可提供辅助的静电排斥作用；（5）介质性质稳定，采用烯丙基溴活化并偶联配基，所得介质的配基稳定，清洗再生方便；（6）介质非特异性吸附小，采用乙醇胺封闭残余的溴醇基团，减少了介质的非特异性吸附，提高吸附选择性。本发明所研制的新型层析介质，以氨基苯并咪唑为功能配基，具有显著的疏水性电荷诱导层析分离特点，对抗体具有很高的吸附能力，可以用于抗体的规模化制备。
附图说明
图1是实施例1中的层析基质和偶联2-氨基苯并咪唑的层析介质的红外谱图；其中，605、1504.9和1635.1cm-1为苯环基团的特征峰，表明配基成功偶联;
图2是采用实施例1所得到的层析介质从单克隆抗体细胞培养上清液中分离纯化抗体的电泳分析图，其中洗脱1和洗脱2分别是pH5和pH4.5洗脱得到的抗体样品。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的描述：
实施例1
取抽干琼脂糖凝胶10g，加入2g20%（v/v）二甲基亚砜、1g烯丙基溴和1g氢氧化钠，25℃下150rpm摇床中活化48小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化基质；然后将活化基质、1gN-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应5小时，抽滤，用去离子水洗涤；接着将溴代基质和1g2-氨基苯并咪唑以及1M碳酸钠缓冲（pH12）混合，25℃下150rpm摇床中反应24小时；最后将介质抽滤，用去离子水洗涤，加入到10g乙醇胺中，25℃下150rpm摇床中反应8小时，去离子水洗涤，得到以2-氨基苯并咪唑为配基的层析介质，配基密度为40μmol/ml。
实施例2
取抽干琼脂糖凝胶10g，加入10g20%（v/v）二甲基亚砜、10g烯丙基溴和5g氢氧化钠，25℃下150rpm摇床中活化8小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化基质；然后将活化基质、5gN-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应1小时，抽滤，用去离子水洗涤；接着将溴代基质和3g2-氨基苯并咪唑以及0.5M碳酸钠缓冲（pH10）混合，25℃下150rpm摇床中反应8小时；最后将介质抽滤，用去离子水洗涤，加入到50g乙醇胺中，25℃下150rpm摇床中反应2小时，去离子水洗涤，得到以2-氨基苯并咪唑为配基的层析介质，配基密度为150μmol/ml。
实施例3
取抽干琼脂糖凝胶10g，加入2g20%（v/v）二甲基亚砜、1g烯丙基溴和1g氢氧化钠，25℃下150rpm摇床中活化48小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化基质；然后将活化基质、1gN-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应5小时，抽滤，用去离子水洗涤；接着将溴代基质和1g4-氨基苯并咪唑以及1M碳酸钠缓冲（pH12）混合，25℃下150rpm摇床中反应24小时；最后将介质抽滤，用去离子水洗涤，加入到10g乙醇胺中，25℃下150rpm摇床中反应8小时，去离子水洗涤，得到以4-氨基苯并咪唑为配基的层析介质，配基密度为40μmol/ml。
实施例4
取抽干琼脂糖凝胶10g，加入10g20%（v/v）二甲基亚砜、10g烯丙基溴和5g氢氧化钠，25℃下150rpm摇床中活化8小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化基质；然后将活化基质、5gN-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应1小时，抽滤，用去离子水洗涤；接着将溴代基质和3g4-氨基苯并咪唑以及0.5M碳酸钠缓冲（pH10）混合，25℃下150rpm摇床中反应8小时；最后将介质抽滤，用去离子水洗涤，加入到50g乙醇胺中，25℃下150rpm摇床中反应2小时，去离子水洗涤，得到以4-氨基苯并咪唑为配基的层析介质，配基密度为150μmol/ml。
实施例5
取抽干琼脂糖凝胶10g，加入2g20%（v/v）二甲基亚砜、1g烯丙基溴和1g氢氧化钠，25℃下150rpm摇床中活化48小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化基质；然后将活化基质、1gN-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应5小时，抽滤，用去离子水洗涤；接着将溴代基质和1g5-氨基苯并咪唑以及1M碳酸钠缓冲（pH12）混合，25℃下150rpm摇床中反应24小时；最后将介质抽滤，用去离子水洗涤，加入到10g乙醇胺中，25℃下150rpm摇床中反应8小时，去离子水洗涤，得到以5-氨基苯并咪唑为配基的层析介质，配基密度为40μmol/ml。
实施例6
取抽干琼脂糖凝胶10g，加入10g20%（v/v）二甲基亚砜、10g烯丙基溴和5g氢氧化钠，25℃下150rpm摇床中活化8小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化基质；然后将活化基质、5gN-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应1小时，抽滤，用去离子水洗涤；接着将溴代基质和3g5-氨基苯并咪唑以及0.5M碳酸钠缓冲（pH10）混合，25℃下150rpm摇床中反应8小时；最后将介质抽滤，用去离子水洗涤，加入到50g乙醇胺中，25℃下150rpm摇床中反应2小时，去离子水洗涤，得到以5-氨基苯并咪唑为配基的层析介质，配基密度为150μmol/ml。
实施例7
取抽干琼脂糖凝胶10g，加入5g20%（v/v）二甲基亚砜、5g烯丙基溴和2.5g氢氧化钠，25℃下150rpm摇床中活化24小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化基质；然后将活化基质、2gN-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应4小时，抽滤，用去离子水洗涤；接着将溴代基质和2g5-氨基苯并咪唑以及1M碳酸钠缓冲（pH10）混合，25℃下150rpm摇床中反应4小时；最后将介质抽滤，用去离子水洗涤，加入到25g乙醇胺中，25℃下150rpm摇床中反应4小时，去离子水洗涤，得到以5-氨基苯并咪唑为配基的层析介质，配基密度为80μmol/ml。
实施例8
取抽干琼脂糖凝胶10g，加入1g20%（v/v）二甲基亚砜、10g烯丙基溴和1g氢氧化钠，25℃下150rpm摇床中活化10小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化基质；然后将活化基质、5gN-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应2小时，抽滤，用去离子水洗涤；接着将溴代基质和1g2-氨基苯并咪唑以及0.5M碳酸钠缓冲（pH10）混合，25℃下150rpm摇床中反应16小时；最后将介质抽滤，用去离子水洗涤，加入到25g乙醇胺中，25℃下150rpm摇床中反应5小时，去离子水洗涤，得到以2-氨基苯并咪唑为配基的层析介质，配基密度为85μmol/ml。
实施例9
取抽干纤维素微球10g，加入8g20%（v/v）二甲基亚砜、5g烯丙基溴和5g氢氧化钠，25℃下150rpm摇床中活化24小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化基质；然后将活化基质、3gN-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应1小时，抽滤，用去离子水洗涤；接着将溴代基质和2g4-氨基苯并咪唑以及1M碳酸钠缓冲（pH11）混合，25℃下150rpm摇床中反应24小时；最后将介质抽滤，用去离子水洗涤，加入到10g乙醇胺中，25℃下150rpm摇床中反应2小时，去离子水洗涤，得到以4-氨基苯并咪唑为配基的层析介质，配基密度为100μmol/ml。
实施例10
取抽干纤维素微球10g，加入10g20%（v/v）二甲基亚砜、10g烯丙基溴和4g氢氧化钠，25℃下150rpm摇床中活化10小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化基质；然后将活化基质、5gN-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应1小时，抽滤，用去离子水洗涤；接着将溴代基质和3g5-氨基苯并咪唑以及0.5M碳酸钠缓冲（pH12）混合，25℃下150rpm摇床中反应16小时；最后将介质抽滤，用去离子水洗涤，加入到5g乙醇胺中，25℃下150rpm摇床中反应4小时，去离子水洗涤，得到以5-氨基苯并咪唑为配基的层析介质，配基密度为95μmol/ml。
Claims (4)
1.一种以氨基苯并咪唑为功能配基的层析介质，其特征在于包括层析基质和配基，所述的层析基质为带有羟基的亲水性多孔微球，配基为经烯丙基溴活化后偶联的氨基苯并咪唑，所述的氨基苯并咪唑为4-氨基苯并咪唑或5-氨基苯并咪唑，
当氨基苯并咪唑为4-氨基苯并咪唑时，层析介质的结构组成为：
当氨基苯并咪唑为5-氨基苯并咪唑时，层析介质的结构组成为：
2.根据权利要求1所述的以氨基苯并咪唑为功能配基的层析介质，其特征在于所述的层析基质为琼脂糖凝胶或纤维素微球。
3.根据权利要求1所述的以氨基苯并咪唑为功能配基的层析介质，其特征在于所述的层析介质的配基密度为40-150μmol/ml。
4.一种如权利要求1所述的以氨基苯并咪唑为功能配基的层析介质的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1)将层析基质抽干后，加入0.2-1倍层析基质质量的20％(v/v)二甲基亚砜、0.1-1倍层析基质质量的烯丙基溴和0.1-0.5倍层析基质质量的氢氧化钠，25℃下150rpm摇床中活化8-48小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化层析基质；
2)将活化层析基质和0.1-0.5倍层析基质质量的N-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应1-5小时，抽滤，用去离子水洗涤，得到溴代醇化的基质；
3)将溴代醇化的基质和0.1-0.3倍层析基质质量的氨基苯并咪唑以及0.5-1M碳酸钠缓冲液混合，碳酸钠缓冲液的pH为10-12，25℃下150rpm摇床中反应8-24小时，得到氨基苯并咪唑偶联后的介质；
4)将氨基苯并咪唑偶联后的介质抽滤，去离子水洗涤，加入到含有1-5倍层析基质质量的乙醇胺中，25℃下150rpm摇床中反应2-8小时，去离子水洗涤，得到以氨基苯并咪唑为功能配基的疏水性电荷诱导层析介质。
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