CN108414305A - 一种用于结核感染t细胞测定的样本处理方法和处理剂 - Google Patents
一种用于结核感染t细胞测定的样本处理方法和处理剂 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108414305A CN108414305A CN201810071446.1A CN201810071446A CN108414305A CN 108414305 A CN108414305 A CN 108414305A CN 201810071446 A CN201810071446 A CN 201810071446A CN 108414305 A CN108414305 A CN 108414305A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- inorganic agent
- cell
- magnetic bead
- sample
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/38—Diluting, dispersing or mixing samples
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
- G01N33/5695—Mycobacteria
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于结核感染T细胞测定的处理剂及样本处理方法，所述处理剂包括偶联γ‑干扰素抗体的磁珠，所述磁珠与γ‑干扰素抗体的质量比为1：0.02～0.5。本发明处理剂以磁珠作为载体，磁珠偶联γ‑干扰素抗体，抗体可以结合血样中的γ‑干扰素，形成γ‑干扰素‑抗体‑磁珠微粒复合物，在磁力分离的作用下，复合物随磁珠微粒与血液分离，实现去除血液γ‑干扰素的目的。本发明的处理方法可批量处理样本，简单、快速，采用均相免疫反应和磁力分离技术，能彻底消除样本γ‑干扰素的干扰。
Description
技术领域
本发明涉及生化试剂技术领域，具体涉及一种用于结核感染T细胞测定的样本处理方法和处理剂。
背景技术
γ-干扰素体外释放试验(interferon-gamma release assays，IGRAs)是检测结核分枝杆菌感染，巨细胞病毒(Cytomegaoviyns，CMV)感染以及贝氏柯克氏体感染的有效方法，现临床上主要应用于结核分枝杆菌的辅助诊断。
结核病严重危害公共安全，全世界每年有200万人死于结核病。在中国，每年有100万的新增结核病人。结核分枝杆菌侵入人体时，首先面对的是第一道防线天然免疫。大多数情况下，天然免疫可将结核分枝杆菌清除。在结核分枝杆菌菌体数量过多、毒力较强或者天然免疫免疫系统状态较差时，部分结核分枝杆菌会突破第一道防线，面对免疫系统的第二道防线，即获得性免疫。此时抗原呈递细胞会识别入侵的病原体，将信息传递给T淋巴细胞和B淋巴细胞，从而启动免疫反应，清除菌体。初始T淋巴细胞会活化成为效应T淋巴细胞，释放γ-干扰素以及其他细胞因子，参与菌体清除过程。TB-IGRAs试验中，将来自结核分枝杆菌的抗原与外周血共培养，如果外周血中存在结核感染效应T淋巴细胞，则这些细胞会被激活并释放γ-干扰素，否则不会释放γ-干扰素。结核感染T细胞(TB-IGRAs)检测使用的ESAT-6和CFP-10抗原来自结核分枝杆菌基因组RD1区。根据全基因组研究的结果，RD1区在卡介苗和绝大多数非结核分枝杆菌中不存在。因此TB-IGRAs可以排除卡介苗和绝大多数非结核分枝杆菌的干扰，为医生提供结核分枝杆菌感染的证据。
结核分枝杆菌的镜检是最常用的诊断结核病的方法，但是该方法的阳性率低。结核分枝杆菌的培养是确定结核病的金标准，但是由于结核分枝杆菌的生长速度慢，试验周期长(2～3周)，不能满足临床的要求。另外，结核病还可以通过胸透、核酸检测和体格检查等方法确认。潜伏性结核菌感染是宿主感染结核分枝杆菌后的一种特殊状态，感染者体内的结核分枝杆菌处于持留状态，不能诊断为活动性结核病，但具有发展为活动性结核病的风险。对潜伏性结核菌感染的高危人群进行早期诊断和适当干预，在结核病控制中具有积极意义。结核菌素试验是唯一可以诊断潜伏性结核菌感染的方法，在结核杆菌感染后2～10周内结核菌素试验转为阳性。然而，有些感染者对结核菌素是没有反应的，这些人群中既包括那些各种原因导致免疫抑制者，也包括一些没有免疫抑制的人。此外，接种卡介苗，感染非致病性分枝杆菌，以及其他因素，会导致非结核菌感染者结核菌素试验呈阳性。PCR是近些年技术发展更新最快的方法，在美国已经纳入到结核病诊断依据中，对于涂阴培阳患者灵敏度特异性都比较高，但存在的问题是，肺结核患者中有一半以上的菌阴肺结核，标本中不含有菌体，而对于肺外结核则更为困难，导致PCR类方法会出现假阴性。同时分子生物学方法操作相对繁琐，可能会存在污染而导致的假阳性。而TB-IGRAs采用的是外周血，不需要找到结核菌的DNA或RNA，因此可不受患者是否排菌以及病变部位的限制。同时TB-IGRAs仅需24小时即可出结果，也是目前针对结核感染灵敏度最高的检测手段。因此TB-IGRAs已在呼吸科、感染科、风湿免疫科、消化科和儿科普遍应用，用于潜伏性结核感染、菌阴结核病和肺外结核的诊断。
IGRAs试验中有一个最为重要的试验步骤为γ-干扰素的体外释放的过程，目前上市产品均为采用含肝素钠或肝素锂的抗凝管直接采血，将全血分装到空白对照管、测试管和阳性对照管中进行培养，进行体外释放γ-干扰素，然后采用离心分离血浆进行检测。γ-干扰素是一种炎症相关的细胞因子，在血液中的浓度范围为0～1000pg/mL。健康人的血中γ-干扰素的浓度比较低，但是受检者可能在严重感染性疾病(细菌、病毒)、急性排斥反应、器官特异性自身免疫疾病、某些肿瘤或因某些疾病接受过γ-干扰素治疗，会导致非体外释放γ-干扰素升高，高γ-干扰素可能会导致测试管和阳性对照管超过IGRAs试剂盒的线性范围上限，空白对照管本底过高，直接影响结果的判读和准确性。当血液中γ-干扰素的浓度为30～400pg/mL时，会增加IGRAs假阳性和假阴性的比例；当浓度＞400pg/mL时，则会造成IGRAs试验失效。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供了一种用于结核感染T细胞测定的样本处理方法和处理剂，解决以往γ-干扰素体外释放试验因受检者非体外释放γ-干扰素过高，而影响结果的判读和准确性的难题。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种用于结核感染T细胞测定的处理剂，所述处理剂包括偶联γ-干扰素抗体的磁珠，所述磁珠与γ-干扰素抗体的质量比为1：0.02～0.5。
上述技术方案中以磁珠作为载体，磁珠微粒上偶联着γ-干扰素抗体，抗体可以结合血液样本中的γ-干扰素，形成γ-干扰素-抗体-磁珠微粒复合物，在磁力分离的作用下，复合物随磁珠与血液分离，实现去除血液γ-干扰素的目的，从而提高γ-干扰素体外释放试验结果的准确性。
本发明偶联γ-干扰素抗体的磁珠具有以下特点：1)磁珠高度分散、不粘连、粒径均一；2)磁球表面涂覆保护层，稳定性好；3)磁珠表面涂覆亲水惰性聚合物，快速分离，减少非特异性吸附；4)磁珠表面功能基团含量高，修饰后联接γ-干扰素抗体量大，特异吸附γ-干扰素强；5)磁珠磁响应强度高，用普通磁铁即可轻松实现对磁球的富集与转移；6)官能团磁球进行修饰后，联接具有特异性的γ-干扰素抗体，处理样本针对性强；7)磁珠-γ-干扰素抗体偶合物加入到样本中，与样本中的γ-干扰素是均相免疫反应，反应迅速充分。
作为本发明所述的用于结核感染T细胞测定的处理剂的优选实施方式，所述处理剂包括处理剂稀释液，所述稀释液为0.85％的生理盐水。
作为本发明所述的用于结核感染T细胞测定的处理剂的优选实施方式，所述磁珠与γ-干扰素抗体的质量比为1：0.1。
作为本发明所述的用于结核感染T细胞测定的处理剂的优选实施方式，所述磁珠为羧基磁珠，磁珠的粒径为500～5000nm。
作为本发明所述的用于结核感染T细胞测定的处理剂的优选实施方式，所述磁珠的粒径为1500nm。
本发明还提供了上述用于结核感染T细胞测定的处理剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)配制处理剂稀释液；
(2)活化磁珠微粒；
(3)磁珠微粒与抗体偶联。
作为本发明所述的用于结核感染T细胞测定的处理剂的制备方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，取10mg磁珠，用MES缓冲液洗涤3次，洗涤后用MES缓冲液重悬，加入1-乙基-3-3-二甲基氨丙基碳化二亚胺活化磁珠，1-乙基-3-3-二甲基氨丙基碳化二亚胺与磁珠的质量比为1～10:1，活化反应30min后，磁分离，吸去上清液，用MES缓冲液清洗4次，得到活化磁珠，所述MES缓冲液的浓度为0.01～0.1M，pH为4.5～7.2。
作为本发明所述的用于结核感染T细胞测定的处理剂的制备方法的优选实施方式，所述MES缓冲液的浓度为0.05M，pH为5.2。
作为本发明所述的用于结核感染T细胞测定的处理剂的制备方法的优选实施方式，所述步骤(3)中，将γ-干扰素抗体加至MES缓冲液中配制成为抗体液，将抗体液与步骤(2)得到的活化磁珠混合，偶联反应16～24h后，磁分离，吸去上清液，用MES缓冲液清洗2次后，加5mL浓度为1M，pH 8.0的甘氨酸淬灭液，混匀30min后，磁分离，吸去上清液，用MES缓冲液洗涤3次后，用MES缓冲液重悬后，置于2～8℃保存，得到偶联γ-干扰素抗体的磁珠。
上述技术方案中可添加载体蛋白如BSA，以第5组分的BSA最佳，以增加反应体系中的总蛋白量，从而可以起到一定的封闭作用，保证抗体偶联的正确方向。
上述技术方案不能使用有氨基(如Tris)或是羧基的(如acetate,citrate)缓冲液。
本发明还提供了一种用于结核感染T细胞测定的样本处理方法，包括以下步骤:
1)采集2～5mL外周血样本，并在样本中加入抗凝剂；
2)将20～100μL权利要求1～5任一项所述的样本处理剂加入到步骤1)采集的样本中，混合均匀；
3)样本室温静置15～80min后，混合均匀，置于磁力分离架上静置70～200s，取样本上部的全血进行培养分析。
本发明的处理方法可批量处理样本，简单、快速，采用均相免疫反应和磁力分离技术，能彻底消除样本γ-干扰素的干扰。本发明解决了以往γ-干扰素体外释放试验因受检者可能在严重感染性疾病(细菌、病毒)、急性排斥反应、器官特异性自身免疫疾病、某些肿瘤或因某些疾病接受过γ-干扰素治疗，导致非体外释放γ-干扰素升高，高γ-干扰素可能会导致测试管和阳性对照管超过TB-IGRAs试剂盒的线性范围上限，空白对照管本底过高，直接影响结果的判读和准确性的难题，也解决了当血液中γ-干扰素的浓度为30～400pg/mL时，会增加IGRAs假阳性和假阴性的比例；当浓度＞400pg/mL时，则会造成IGRAs试验失效的难题。
作为本发明所述用于结核感染T细胞测定的样本处理方法的优选实施方式，所述步骤2)中，样本处理剂的加入量为50μL。
上述技术方案中，样本处理剂的加入量为50μL，有利于提高加样的准确性、保证处理剂足量和防止稀释样本造成误差。
作为本发明所述用于结核感染T细胞测定的样本处理方法的优选实施方式，所述步骤3)中，样本室温静置30min后，混合均匀，置于磁力分离架上静置120s，取样本上部的全血进行培养分析。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的处理剂以磁珠作为载体，磁珠微粒上偶联着γ-干扰素抗体，抗体可以结合血样中的γ-干扰素，形成γ-干扰素-抗体-磁珠微粒复合物，在磁力分离的作用下，复合物随磁珠与血液分离，实现去除血液γ-干扰素的目的。
本发明的处理方法可批量处理样本，简单、快速，采用均相免疫反应和磁力分离技术，能彻底消除样本γ-干扰素的干扰。
本发明解决了以往γ-干扰素体外释放试验因受检者可能在严重感染性疾病(细菌、病毒)、急性排斥反应、器官特异性自身免疫疾病、某些肿瘤或因某些疾病接受过γ-干扰素治疗，导致非体外释放γ-干扰素升高，高γ-干扰素可能会导致测试管和阳性对照管超过TB-IGRAs试剂盒的线性范围上限，空白对照管本底过高，直接影响结果的判读和准确性的难题。也解决了当血液中γ-干扰素的浓度为30～400pg/mL时，会增加IGRAs假阳性和假阴性的比例；当浓度＞400pg/mL时，则会造成IGRAs试验失效的难题。
附图说明
图1为实施例4的样本处理方法的流程图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
作为本发明所述用于结核感染T细胞测定的处理剂的一种实施例，本实施例所述用于结核感染T细胞测定的处理剂包括偶联γ-干扰素抗体的磁珠和处理剂稀释液。所述稀释液为0.85％的生理盐水。所述磁珠与γ-干扰素抗体的质量比为1：0.1；所述磁珠的粒径为1500nm。
本实施例所述用于结核感染T细胞测定的处理剂的制备方法为：
材料：粒径1.5μm的BioMagPlus羧基磁珠；EDAC(1-乙基-3-3-二甲基氨丙基碳化二亚胺)试剂；15mL尖头离心管；BioMag磁分离器；0.05M，pH 5.2的2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液；淬灭液；洗涤缓冲液均由Bangs公司提供。第5组分的BSA由罗氏公司提供。γ-干扰素抗体由上海莱兹生物科技有限公司提供。
1、配制处理剂稀释液
称取0.85g氯化钠，用纯化水定容至100mL，即成0.85％的生理盐水。
2、磁珠微粒的活化
1)移取10mg的粒径为1.5μm的BioMagPlus羧基磁珠至15mL尖头离心管内，并放置在磁分离架上直到上清液变完全透彻后，用吸管小心移弃上清；
2)加5mL MES缓冲液(0.05M，pH 5.2)充分混匀洗涤，将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后，用吸管小心移弃上清；
3)重复步骤2)三次，最后一次洗涤后，重悬磁珠于5mL的MES缓冲液(0.05M，pH5.2)中；
4)将EDAC从冷藏处取出置于室温30分钟，准确称取所需的EDAC(1.6mg EDAC/mgBioMagPlus磁珠)加入装有磁珠的离心管内；
5)剧烈振荡摇匀；
6)室温下，将离心管置于旋转混匀仪上活化反应30分钟；
7)将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后，用吸管小心移弃上清；
8)重复步骤2)四次，得到活化磁珠。
3、磁珠微粒与抗体偶联
1)将1mg的γ-干扰素抗体加至5mL MES缓冲液(0.05M，pH 5.2)中，添加第5组分的BSA作为封闭剂；
2)吸取50μL抗体液于950μL的MES缓冲液(0.05M，pH 5.2)中，配成1：20的稀释液，标记为偶联反应前蛋白液。置于一旁用于后面的偶联率计算；
3)将剩下的抗体液加到装有10mg活化磁珠的离心管内，剧烈振荡混匀，室温下，将离心管置于旋转混匀仪上偶联反应18小时；
4)将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后，用吸管小心收集上清。标记为偶联后抗体液，用于计算偶联率；
5)重悬磁珠于5mL MES缓冲液(0.05M，pH 5.2)中，振荡摇匀，将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后，用吸管小心移弃上清；
6)重复步骤5)一次；
7)加5mL的淬灭液，振荡摇匀，室温下，将离心管置于旋转混匀仪上30分钟；
8)将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后，用吸管小心移弃上清；
9)洗涤和贮存偶联后的磁珠；
10)加5mL洗涤缓冲液并剧烈振荡摇匀，将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后，用吸管小心移弃上清；
11)重复步骤10)三次，最后一次洗涤后，重悬磁珠于2mL洗涤缓冲液内，此时磁珠的浓度为5mg/mL；
12)置于2～8℃保存，得到偶联γ-干扰素抗体的磁珠。
本实施例所述处理剂包括处理剂稀释液和偶联γ-干扰素抗体的磁珠。
实施例2
作为本发明所述用于结核感染T细胞测定的处理剂的一种实施例，本实施例所述用于结核感染T细胞测定的处理剂包括偶联γ-干扰素抗体的羧基磁珠和处理剂稀释液。所述磁珠与γ-干扰素抗体的质量比为1：0.02。所述处理剂包括处理剂稀释液，所述稀释液为0.85％的生理盐水。磁珠的粒径为5000nm。
本实施例所述用于结核感染T细胞测定的处理剂的制备方法为：
材料：粒径5.0μm的BioMagPlus羧基磁珠；EDAC(1-乙基-3-3-二甲基氨丙基碳化二亚胺)试剂；15mL尖头离心管；BioMag磁分离器；2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液；淬灭液；洗涤缓冲液均由Bangs公司提供。第5组分的BSA由罗氏公司提供。γ-干扰素抗体由上海莱兹生物科技有限公司提供。
1、配制处理剂稀释液
称取0.85g氯化钠，用纯化水定容至100mL，即成浓度为0.85％的生理盐水。
2、磁珠微粒的活化
1)移取10mg的粒径为5.0μm的BioMagPlus羧基磁珠至15mL尖头离心管内，并放置在磁分离架上直到上清液变完全透彻后，用吸管小心移弃上清；
2)加5mL MES缓冲液(0.01M，pH 7.2)充分混匀洗涤。将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后，用吸管小心移弃上清；
3)重复步骤2)三次，最后一次洗涤后，重悬磁珠于5mL的MES缓冲液(0.01M，pH7.2)中；
4)将EDAC从冷藏处取出置于室温30分钟，准确称取所需的EDAC(10mg EDAC/mgBioMagPlus磁珠)加入装有磁珠的离心管内；
5)剧烈振荡摇匀；
6)室温下，将离心管置于旋转混匀仪上活化反应30分钟；
7)将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后，用吸管小心移弃上清。；
8)重复步骤2)四次，得到活化磁珠。
3、磁珠微粒与抗体偶联
1)将0.2mg的γ-干扰素抗体加至5mL MES缓冲液(0.01M，pH 7.2)中；
2)吸取50μL抗体液于950μL的MES缓冲液(0.01M，pH 7.2)中，配成1：20的稀释液。标记为偶联反应前蛋白液，置于一旁用于后面的偶联率计算；
3)将剩下的抗体液加到装有10mg活化磁珠的离心管内，剧烈振荡混匀，室温下，将离心管置于旋转混匀仪上偶联反应16小时；
4)将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后，用吸管小心收集上清，标记为偶联后抗体液，用于计算偶联率；
5)重悬磁珠于5mL MES缓冲液(0.01M，pH 7.2)中，振荡摇匀，将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后，用吸管小心移弃上清；
6)重复步骤5)一次；
7)加5mL的淬灭液，振荡摇匀，室温下，将离心管置于旋转混匀仪上30分钟；
8)将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后，用吸管小心移弃上清；
9)洗涤和贮存偶联后的磁珠；
10)加5mL洗涤缓冲液并剧烈振荡摇匀。将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后，用吸管小心移弃上清；
11)重复步骤10)三次，最后一次洗涤后，重悬磁珠于2mL洗涤缓冲液内，此时磁珠的浓度为5mg/mL；
12)置于2～8℃保存，得到偶联γ-干扰素抗体的磁珠。
本实施例所述处理剂包括处理剂稀释液和偶联γ-干扰素抗体的磁珠。
实施例3
作为本发明所述用于结核感染T细胞测定的处理剂的一种实施例，本实施例所述用于结核感染T细胞测定的处理剂包括偶联γ-干扰素抗体的羧基磁珠和处理剂稀释液。所述磁珠与γ-干扰素抗体的质量比为1：0.5。所述稀释液为0.85％的生理盐水，磁珠的粒径为500nm。
本实施例所述用于结核感染T细胞测定的处理剂的制备方法为：
材料：粒径0.5μm的BioMagPlus羧基磁珠；EDAC(1-乙基-3-3-二甲基氨丙基碳化二亚胺)试剂；15mL尖头离心管；BioMag磁分离器；2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液；淬灭液；洗涤缓冲液均由Bangs公司提供。第5组分的BSA由罗氏公司提供。γ-干扰素抗体由上海莱兹生物科技有限公司提供。
1、配制处理剂稀释液
称取0.85g氯化钠，用双蒸水定容至100mL，即成浓度为0.85％的生理盐水。
2、磁珠微粒的活化
1)移取10mg的粒径为0.5μm的BioMagPlus羧基磁珠至15mL尖头离心管内，并放置在磁分离架上直到上清液变完全透彻后，用吸管小心移弃上清；
2)加5mL MES缓冲液(0.1M，pH 4.5)充分混匀洗涤。将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后，用吸管小心移弃上清；
3)重复步骤2)三次，最后一次洗涤后，重悬磁珠于5mL的MES缓冲液(0.1M，pH 4.5)中；
4)将EDAC从冷藏处取出置于室温30分钟，准确称取所需的EDAC(1.0mg EDAC/mgBioMagPlus磁珠)加入装有磁珠的离心管内；
5)剧烈振荡摇匀；
6)室温下，将离心管置于旋转混匀仪上活化反应30分钟；
7)将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后，用吸管小心移弃上清；
8)重复步骤2)四次，得到活化磁珠。
3、磁珠微粒与抗体偶联
1)将5mg的γ-干扰素抗体加至5mL MES缓冲液(0.1M，pH 4.5)中；
2)吸取50μL抗体液于950μL的MES缓冲液(0.1M，pH 4.5)中，配成1：20的稀释液。标记为偶联反应前蛋白液，置于一旁用于后面的偶联率计算；
3)将剩下的抗体液加到装有10mg活化磁珠的离心管内，剧烈振荡混匀，室温下，将离心管置于旋转混匀仪上偶联反应24小时；
4)将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后，用吸管小心收集上清，标记为偶联后抗体液，用于计算偶联率；
5)重悬磁珠于5mL MES缓冲液(0.1M，pH 4.5)中，振荡摇匀，将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后，用吸管小心移弃上清；
6)重复步骤5)一次；
7)加5mL的淬灭液，振荡摇匀，室温下，将离心管置于旋转混匀仪上30分钟；
8)将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后，用吸管小心移弃上清；
9)洗涤和贮存偶联后的磁珠；
10)加5mL洗涤缓冲液并剧烈振荡摇匀，将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后，用吸管小心移弃上清；
11)重复步骤10)三次。最后一次洗涤后，重悬磁珠于2mL洗涤缓冲液内，此时磁珠的浓度为5mg/mL；
12)置于2～8℃保存，得到偶联γ-干扰素抗体的磁珠。
本实施例所述处理剂包括处理剂稀释液和偶联γ-干扰素抗体的磁珠。
实施例4
作为用于结核感染T细胞测定的样本处理方法的一种实施例，本实施例用于结核感染T细胞测定的样本处理方法包括以下步骤：
1)用含有肝素钠或肝素锂的抗凝管采取5mL外周血；
2)轻轻摇匀样本处理剂；
3)取50μL的样本处理剂加入到上述外周血中，轻轻颠倒混匀5次，使抗凝剂、处理剂与血液充分混匀；
4)室温下采血管垂直放置30min；
5)再将采血管上下颠倒5次，将采血管置于磁力分离架上静置120s；
6)小心吸取采血管上部3/5处的全血，各取1mL分别加至空白对照管、测试管、阳性对照管中进行培养，一定要注意不要分散或吸取磁珠-γ-干扰素抗体偶合物。
实施例5
本发明加入到外周血中的样本处理剂最适量的选择：
用肝素钠抗凝管采集外周全血，经γ-干扰素定量检测为12.50pg/mL，在其中加入γ-干扰素纯品，使其浓度达到1000pg/mL。然后分成10等份，每份5mL，标记成1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，分别对应加入10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μL实施例1制备的处理剂，轻轻颠倒混匀5次，使处理剂与血液充分混匀；室温下垂直放置30min；再将采血管上下颠倒5次，将采血管置于磁力分离架上静置120s；将各管以3000～5000r/min的转速离心10min，取血浆检测各管中γ-干扰素的浓度，结果如表1所示。一般IGRAs空白管的检测值＜400pg/mL，则判实验有效。
由表1结果可以得出，选择样本处理剂的加入量为50μL。
表1
实施例6
本发明外周血中的样本处理剂最适处理时间的选择：
用肝素钠抗凝管采集外周全血，经γ-干扰素定量检测为12.50pg/mL，在其中加入γ-干扰素纯品，使其浓度达到10 00pg/mL。然后分成10等份，每份5mL，标记成1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，分别加入50μL本实施例1制备的处理剂，轻轻颠倒混匀5次，使处理剂与血液充分混匀；室温下垂直放置10、15、20、25、30、35、40、50、60、80min；再将采血管上下颠倒5次，将采血管置于磁力分离架上静置120s；将各管以3000～5000r/min的转速离心10min，取血浆检测各管中γ-干扰素的浓度，结果如表2所示。一般IGRAs空白管的检测值＜400pg/mL，则判实验有效。
由表2结果可以得出，为了保证足够时间，选择30min。
表2
实施例7
本发明外周血中的加样本处理剂处理后，采用磁力吸附时间的选择：
用肝素钠抗凝管采集外周全血，然后分成11等份，标记成1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11，每份5mL，1-10号管分别加入50μL本实施例1制备的处理剂，轻轻颠倒混匀5次，使处理剂与血液充分混匀；室温下垂直放置30min；再将采血管上下颠倒5次，将采血管置于磁力分离架上静置50、55、60、70、80、100、120、140、160、200s；然后从1-11号管分别取1mL加至阳性对照管，放入37±1℃恒温培养箱中培养16～24小时。将各管以3000～5000r/min的转速离心10min，取血浆检测各管中γ-干扰素的浓度，结果如表3所示。一般检测结果与理论值偏倚不超过20％，认为两者之间差异较小，否则判为有差异。
由表3结果可以得出，磁力吸附时间低于70s，影响阳性刺激检测结果，未吸附完全的磁珠-γ-干扰素抗体偶合物能与刺激产生的γ-干扰素继续结合，使测定结果偏低，为了使磁珠-γ-干扰素抗体偶合物被磁力吸附完全，选择吸附时间为120s。
表3
实施例8
本发明γ-干扰素体外释放试验的样本处理方法的效果：
1)γ-干扰素体外释放试验的样本处理后培养法和结核感染T细胞检测试剂盒(体外释放荧光免疫法)直接培养法的结果比较。
结核感染T细胞检测试剂盒(体外释放荧光免疫法)由广州市丰华生物工程有限公司提供，γ-干扰素体外释放试验的样本处理方法按照实施例4的方法，其他操作和结果判读按照试剂盒说明书进行。其判读方法如表4所示：
表4
注：表中N为空白对照管N中γ-干扰素的浓度，P为阳性对照管P中γ-干扰素的浓度，T为测试管T中γ-干扰素的浓度。
表5为γ-干扰素体外释放试验的测试结果。γ-干扰素体外释放试验的样本处理后培养法本底测试结果(均值0.84pg/mL)明显低于直接培养法本底测试结果(均值6.05pg/mL)，直接培养法有一例样本因本底偏高，导致漏检(灰区)。样本处理后培养法测试管检测结果(均值104.79pg/mL)与直接培养法测试管检测结果(均值102.49pg/mL)相差不大。样本处理后培养法阳性对照管检测结果(均值667.22pg/mL)与直接培养法阳性对照管检测结果(均值643.84pg/mL)相差不明显。
表5
2)γ-干扰素体外释放试验的样本处理方法的阳性参考品符合率：使用10份结核分枝杆菌涂片和(或)培养阳性的结核病患者(菌阳)的新鲜外周抗凝血样本和10份结核分枝杆菌涂片和(或)培养阴性的临床确诊结核病患者(菌阴)的新鲜外周抗凝血样本，其阳性参考品符合率应不低于75％。加样本处理剂处理后三批试剂盒的阳性参考品符合率：20/20。结果详见表6。
表6 TB-IGRAs阳性符检测结果(pg/mL)
3)γ-干扰素体外释放试验的样本处理方法的阴性参考品符合率：使用15份无结核病临床症状的健康志愿者的新鲜外周抗凝血样本，其阴性参考品符合率应不低于75％。具体而言：无结核病临床症状的健康志愿者应包含不同等级的PPD皮试人群，即应包含PPD皮试强阳性者(72h硬结或红晕直径≥15mm或伴有水泡)、PPD皮试阳性者(72h硬结或红晕直径≥5mm)和PPD皮试阴性者(72h硬结或红晕直径<5mm)这3种类型。加样本处理剂处理后三批试剂盒的阴性参考品符合率为20/20。结果详见表7。
表7 TB-IGRAs阴性符检测结果(pg/mL)
4)γ-干扰素体外释放试验的样本处理方法的抗干扰性结果如表8所示：阴性干扰性样本检测未见假阳性结果出现。
表8阴性干扰性样本检测结果(单位：pg/mL)
综上所述，本发明的样本处理剂以磁珠作为载体，磁珠微粒上偶联γ-干扰素抗体，抗体可以结合血液样本中的γ-干扰素，形成γ-干扰素-抗体-磁珠微粒复合物，在磁力分离的作用下，γ-干扰素随磁珠与血液分离，实现去除血液γ-干扰素的目的，从而提高结果的准确性。
本发明的处理方法可批量处理样本，简单、快速，采用均相免疫反应和磁力分离技术，能彻底消除样本γ-干扰素的干扰。本发明的样本处理剂和样本处理方法解决了以往γ-干扰素体外释放试验因受检者可能在严重感染性疾病(细菌、病毒)、急性排斥反应、器官特异性自身免疫疾病、某些肿瘤或因某些疾病接受过γ-干扰素治疗，导致非体外释放γ-干扰素升高，高γ-干扰素可能会导致测试管和阳性对照管超过TB-IGRAs试剂盒的线性范围上限，空白对照管本底过高，直接影响结果的判读和准确性的难题，也解决了当血液中γ-干扰素的浓度为30～400pg/mL时，会增加IGRAs假阳性和假阴性的比例；当浓度＞400pg/mL时，则会造成IGRAs试验失效的难题。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种用于结核感染T细胞测定的处理剂，其特征在于，所述处理剂包括偶联γ-干扰素抗体的磁珠，所述磁珠与γ-干扰素抗体的质量比为1：0.02～0.5。
2.根据权利要求1所述的用于结核感染T细胞测定的处理剂，其特征在于，所述处理剂包括处理剂稀释液，所述稀释液为0.85％的生理盐水。
3.根据权利要求1所述的用于结核感染T细胞测定的处理剂，其特征在于，所述磁珠与γ-干扰素抗体的质量比为1：0.1。
4.根据权利要求1所述的用于结核感染T细胞测定的处理剂，其特征在于，所述磁珠为羧基磁珠，磁珠的粒径为500～5000nm。
5.根据权利要求1所述的用于结核感染T细胞测定的处理剂，其特征在于，所述磁珠的粒径为1500nm。
6.根据权利要求1～5任一项所述的用于结核感染T细胞测定的处理剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)配制处理剂稀释液；
(2)活化磁珠微粒；
(3)磁珠微粒与抗体偶联。
7.根据权利要求6所述的用于结核感染T细胞测定的处理剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，取10mg磁珠，用MES缓冲液洗涤3次，洗涤后用MES缓冲液重悬，加入1-乙基-3-3-二甲基氨丙基碳化二亚胺活化磁珠，1-乙基-3-3-二甲基氨丙基碳化二亚胺与磁珠的质量比为1～10:1，活化反应30min后，磁分离，吸去上清液，用MES缓冲液清洗4次，得到活化磁珠，所述MES缓冲液的浓度为0.01～0.1M，pH为4.5～7.2。
8.根据权利要求6所述的用于结核感染T细胞测定的处理剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，将γ-干扰素抗体加至MES缓冲液中配制成为抗体液，将抗体液与步骤(2)得到的活化磁珠混合，偶联反应16～24h后，磁分离，吸去上清液，用MES缓冲液清洗2次后，加5mL浓度为1M，pH 8.0的甘氨酸淬灭液，混匀30min后，磁分离，吸去上清液，用MES缓冲液洗涤3次后，用MES缓冲液重悬，置于2～8℃保存，得到所述偶联γ-干扰素抗体的磁珠。
9.一种用于结核感染T细胞测定的样本处理方法，其特征在于，包括以下步骤:
1)采集2～5mL外周血样本，并在样本中加入抗凝剂；
2)将20～100μL权利要求1～5任一项所述的样本处理剂加入到步骤1)采集的样本中，混合均匀；
3)样本室温静置15～80min后，混合均匀，置于磁力分离架上静置70～200s，取样本上部的全血进行培养分析。
10.根据权利要求9所述的用于结核感染T细胞测定的样本处理方法，其特征在于，所述步骤3)中，样本室温静置30min后，混合均匀，置于磁力分离架上静置120s，取样本上部的全血进行培养分析。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810071446.1A CN108414305B (zh) | 2018-01-24 | 2018-01-24 | 一种用于结核感染t细胞测定的样本处理方法和处理剂 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810071446.1A CN108414305B (zh) | 2018-01-24 | 2018-01-24 | 一种用于结核感染t细胞测定的样本处理方法和处理剂 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108414305A true CN108414305A (zh) | 2018-08-17 |
| CN108414305B CN108414305B (zh) | 2020-08-04 |
Family
ID=63126462
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810071446.1A Active CN108414305B (zh) | 2018-01-24 | 2018-01-24 | 一种用于结核感染t细胞测定的样本处理方法和处理剂 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108414305B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110907639A (zh) * | 2019-12-05 | 2020-03-24 | 四川新健康成生物股份有限公司 | 血清淀粉样蛋白a检测试剂盒及其制备方法 |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1297380A (zh) * | 1998-02-20 | 2001-05-30 | 佛罗里达卅立大学 | 混合物成分的连续磁性分离 |
| CN1524878A (zh) * | 2003-09-15 | 2004-09-01 | 南开大学 | 纯化基因工程重组干扰素的免疫磁性分离技术 |
| CN103344630A (zh) * | 2013-08-09 | 2013-10-09 | 郑州安图生物工程股份有限公司 | 一种定量检测结核分枝杆菌γ干扰素的试剂盒 |
| CN103364545A (zh) * | 2013-05-21 | 2013-10-23 | 佛山迪安医学检验所有限公司 | 利用酶联免疫斑点法的结核效应t淋巴细胞检测方法 |
| CN103760345A (zh) * | 2014-01-17 | 2014-04-30 | 北京旷博生物技术有限公司 | 一种利用外周血检测结核分枝杆菌感染的试剂盒及其应用 |
| US20140323333A1 (en) * | 2013-04-29 | 2014-10-30 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Flow cytometry assay methods |
| CN104198693A (zh) * | 2014-07-31 | 2014-12-10 | 温州市中心医院 | 一种t淋巴细胞的酶联免疫斑点试验方法 |
| CN104569390A (zh) * | 2015-01-26 | 2015-04-29 | 河北省胸科医院 | 一种γ-干扰素定量检测方法及试剂盒 |
-
2018
- 2018-01-24 CN CN201810071446.1A patent/CN108414305B/zh active Active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1297380A (zh) * | 1998-02-20 | 2001-05-30 | 佛罗里达卅立大学 | 混合物成分的连续磁性分离 |
| CN1524878A (zh) * | 2003-09-15 | 2004-09-01 | 南开大学 | 纯化基因工程重组干扰素的免疫磁性分离技术 |
| US20140323333A1 (en) * | 2013-04-29 | 2014-10-30 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Flow cytometry assay methods |
| CN103364545A (zh) * | 2013-05-21 | 2013-10-23 | 佛山迪安医学检验所有限公司 | 利用酶联免疫斑点法的结核效应t淋巴细胞检测方法 |
| CN103344630A (zh) * | 2013-08-09 | 2013-10-09 | 郑州安图生物工程股份有限公司 | 一种定量检测结核分枝杆菌γ干扰素的试剂盒 |
| CN103760345A (zh) * | 2014-01-17 | 2014-04-30 | 北京旷博生物技术有限公司 | 一种利用外周血检测结核分枝杆菌感染的试剂盒及其应用 |
| CN104198693A (zh) * | 2014-07-31 | 2014-12-10 | 温州市中心医院 | 一种t淋巴细胞的酶联免疫斑点试验方法 |
| CN104569390A (zh) * | 2015-01-26 | 2015-04-29 | 河北省胸科医院 | 一种γ-干扰素定量检测方法及试剂盒 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| HILARY S. WHITWORTH ET AL.: "IGRAs–the gateway to T cell based TB diagnosis", 《METHODS》 * |
| 刘先桥等: "磁性微球的制备及在细胞分离中的应用", 《化学通报》 * |
| 崔希等: "免疫磁分离结合胶体金免疫层析法快速检测大肠杆菌O157：H7", 《分析化学 研究报告》 * |
| 庄俊玲: "免疫磁性分离法在医学中的应用", 《临床血液学杂志》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110907639A (zh) * | 2019-12-05 | 2020-03-24 | 四川新健康成生物股份有限公司 | 血清淀粉样蛋白a检测试剂盒及其制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108414305B (zh) | 2020-08-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0280559B1 (en) | Agglutination immunoassay and kit for determination of a multivalent immune species using a buffered salt wash solution | |
| CN104628833B (zh) | 一种结核感染细胞免疫检测抗原组合物及其应用 | |
| JPH08506421A (ja) | 細胞関連分子を検出し、その量を測定するための方法および器具 | |
| CN105259354B (zh) | 结核T细胞释放γ‑干扰素检测试剂盒及其使用方法 | |
| CA1045031A (en) | Serological test for gonorrheal antibodies | |
| CN105842464B (zh) | 基于上转换发光技术的联合定量检测uNGAL和uCr的装置及其制备方法 | |
| US5773232A (en) | Methods for measurement of lymphocyte function | |
| CN107144694A (zh) | 用于检测结核感染t细胞的抗原、试剂盒及应用 | |
| CN113717258B (zh) | 一种SARS-CoV-2感染细胞免疫检测的抗原多肽组合物及其应用、试剂盒 | |
| US20080145876A1 (en) | Poly(ethylene glycol) anti-body detection assays and kits for performing thereof | |
| CN109991417A (zh) | 一种结核病的免疫标志物及应用 | |
| CN107219362A (zh) | 用于检测结核感染t细胞的抗原、试剂盒及应用 | |
| CN106053783A (zh) | 一种适用于结核感染t细胞检测的快速时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其检测方法 | |
| CN108414305A (zh) | 一种用于结核感染t细胞测定的样本处理方法和处理剂 | |
| Affronti et al. | Serodiagnostic test for tuberculosis | |
| US20240044891A1 (en) | Antibody detection test strip of integrating primary screening and diagnosis of sheep brucellosis | |
| US20240044890A1 (en) | Antibody detection test strip of integrating primary screening and diagnosis of bovine brucellosis | |
| CN102520176A (zh) | 一种定量检测白介素8的试剂盒 | |
| CN104569390A (zh) | 一种γ-干扰素定量检测方法及试剂盒 | |
| EP0215099A1 (en) | Method for the early diagnosis of bordetella diseases and kit therefor | |
| Cernyseva et al. | Study of the plate agglutination test with rose bengal antigen for the diagnosis of human brucellosis. | |
| CN1570638A (zh) | Sars病毒抗体检测方法及快速诊断试剂盒和制备方法 | |
| CN107219363A (zh) | 用于检测结核感染t细胞的抗原、试剂盒及应用 | |
| CN111504886A (zh) | 一组分子在制备新冠肺炎辅助诊断试剂或试剂盒中的应用 | |
| JP7081861B1 (ja) | ＬＩＰに基づいてＵＭＯＤを修飾した尿中のＮｅｕ５Ｇｃを識別する尿路上皮癌の検査用キット、およびその製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 510000 No. 6, Yinyi street, economic and Technological Development Zone, Guangzhou, Guangdong Patentee after: Guangzhou Fenghua Biological Co.,Ltd. Address before: 510000 No. 6, Yinyi street, economic and Technological Development Zone, Guangzhou, Guangdong Patentee before: GUANGZHOU FENGHUA BIOENGINEERING Co.,Ltd. |