CN1830495A - 基于亲和吸附的血液净化方法及系统 - Google Patents

基于亲和吸附的血液净化方法及系统 Download PDF

Info

Publication number
CN1830495A
CN1830495A CNA2005100114145A CN200510011414A CN1830495A CN 1830495 A CN1830495 A CN 1830495A CN A2005100114145 A CNA2005100114145 A CN A2005100114145A CN 200510011414 A CN200510011414 A CN 200510011414A CN 1830495 A CN1830495 A CN 1830495A
Authority
CN
China
Prior art keywords
blood
post
blood purification
albumen
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA2005100114145A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1830495B (zh
Inventor
傅和亮
侯永敏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangdong Tianpu Biochemical Medicine Co., Ltd.
Original Assignee
Bopu Biological Tech Co Ltd Guangzhou City
GUANGDONG TIANPU BIOCHEMICAL MEDICINE CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bopu Biological Tech Co Ltd Guangzhou City, GUANGDONG TIANPU BIOCHEMICAL MEDICINE CO Ltd filed Critical Bopu Biological Tech Co Ltd Guangzhou City
Priority to CN2005100114145A priority Critical patent/CN1830495B/zh
Priority to PCT/CN2006/000371 priority patent/WO2006094467A1/zh
Publication of CN1830495A publication Critical patent/CN1830495A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1830495B publication Critical patent/CN1830495B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/34—Filtering material out of the blood by passing it through a membrane, i.e. hemofiltration or diafiltration
    • A61M1/3472—Filtering material out of the blood by passing it through a membrane, i.e. hemofiltration or diafiltration with treatment of the filtrate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/34—Filtering material out of the blood by passing it through a membrane, i.e. hemofiltration or diafiltration
    • A61M1/3472—Filtering material out of the blood by passing it through a membrane, i.e. hemofiltration or diafiltration with treatment of the filtrate
    • A61M1/3486—Biological, chemical treatment, e.g. chemical precipitation; treatment by absorbents
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3244—Non-macromolecular compounds
    • B01J20/3265—Non-macromolecular compounds with an organic functional group containing a metal, e.g. a metal affinity ligand
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3268—Macromolecular compounds
    • B01J20/3272—Polymers obtained by reactions otherwise than involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B01J20/3274—Proteins, nucleic acids, polysaccharides, antibodies or antigens
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J45/00—Ion-exchange in which a complex or a chelate is formed; Use of material as complex or chelate forming ion-exchangers; Treatment of material for improving the complex or chelate forming ion-exchange properties
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • B01D15/3809—Affinity chromatography of the antigen-antibody type, e.g. protein A, G, L chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • B01D15/3828—Ligand exchange chromatography, e.g. complexation, chelation or metal interaction chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
    • B01J2220/50—Aspects relating to the use of sorbent or filter aid materials
    • B01J2220/60—Use in several different columns
    • B01J2220/603—Use in several different columns serially disposed columns

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Anesthesiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • External Artificial Organs (AREA)

Abstract

本发明公开了一种血液净化的方法及其专用系统，以及应用该方法和系统净化患者血液以治疗疾病的方法，该方法可用于治疗多种与血液净化有关的疾病，包括高血脂症、动脉硬化症及免疫性疾病。本发明的血液净化方法包括将血液或血浆进行两步亲和吸附柱吸附，第一亲和吸附柱用于移除患者血液中的致病因子如非正常水平的蛋白；第二亲和吸附柱用于吸附从第一柱上脱落的配体，因此可减少血液净化中因配体脱落带来的副作用。

Description

基于亲和吸附的血液净化方法及系统
技术领域
本发明涉及新的血液净化方法，净化患者血液来治疗疾病的方法以及所述方法专用的血液净化系统。更具体地，本发明涉及改进的、基于亲和吸附的血液净化方法和系统，所述的血液净化方法是在常规的吸附净化后增加另一吸附步骤，用以吸附脱落的配体，以减少常规血液净化方法的副作用。
背景技术
血液净化治疗是指患者血液在体外通过某种处理后再回输到患者体内，这种处理包括血液透析、血液过滤、血液渗透、血浆置换或免疫吸附，可以从患者血液中移除致病因子。
血浆置换被广泛应用于移除血浆中的各类病原体包括抗体、免疫复合物、异常的免疫球蛋白、冷沉(淀)蛋白、异常的凝结因子和其他毒性因子。然而，血浆置换在选择性与特异性方面有一定局限性。它在移除病原体的同时还会移除某些人体血液中必需的蛋白。此外，血浆置换过程还需要使用替代液(如人体白蛋白溶液)，此替代液的价格昂贵，并且增加了此种治疗方法引入污染物的可能，因此大大限制了血浆置换方法的应用。
为了克服这些问题，基于免疫吸附方法的亲和选择开始被应用于血液净化，并且其作用日益明显。免疫吸附能够有选择的移除血液中的致病因子。在免疫吸附方法中，Protein A应用最为广泛，protein A来源于金黄色葡萄球菌，能够与IgG的Fc片段特异性结合。Protein A吸附方法已经成功地应用于治疗各种免疫疾病，M Gaubitzand KM Schneider就描述了用protein A吸附IgG和免疫复合物来治疗某种自身免疫性疾病例如系统性红斑狼疮(M Gaubitz and KMSchneider，“Immunoadsorption in systemic lupus erythematosus：different techniques and their current role in medical therapy”，Therapeutic Apheresis and Dialysis，7(2)：183-188(2003))。
低密度脂蛋白(LDL)和LDL胆固醇(LDL-C)是导致动脉硬化症的主要因素之一。传统治疗方法是通过控制饮食和药物来降低患者LDL与LDL-C水平，然而口服降脂药如洛伐他汀(Lovastatin)很可能导致对肝的损害，而且降脂效果较低。通过亲和吸附在体外移除LDL和LDL-C来降低患血液中胆固醇与LDL的浓度能够表现出更好的效果，所使用的亲和吸附剂包括抗LDL抗体和其他化学吸附剂如右旋糖苷硫酸盐或苷磷脂。Strahilevitz的美国专利6,676,622设计了一种亲和吸附系统，但是没有提供实验数据；也有关于某种治疗动脉硬化症的吸附剂的报道，由螯和因子移除能够导致LDL氧化的重金属；protein A也能吸附导致血液中LDL氧化的自身抗体。
然而，在免疫治疗中，存在着吸附剂配体从载体脱落的问题。据报道，有41％的高血脂患者在接受LDL抗体免疫治疗后会出现低血压症状(伍强等人，“免疫吸附法治疗高血脂症疗效观察”，Journalof Modern Clinical Medical Bioengineering，9：110-112，2003)。目前所使用的大多数抗体是鼠源或羊源，这些非人源性抗体如果脱落进入人体内就会作为抗原引发人体内难以预测的免疫反应。在透析和血浆灌注过程中，血浆会多次经过免疫亲和吸附柱，因此配体很有可能脱落进入血液中，从而导致严重的副作用。目前已有许多关于protein A从载体上脱落问题的研究，如果脱落数量达到一定值将会引起严重的副作用。已有报道从血浆中发现了脱落的protein A并且导致各种副作用(JP Balint，FR Jones and HW Snyder，“ThePROSORBA Column Clinical Trial Group：Selective extracorporealremoval of immunoglobulin G and circulating immune complexes：Areview”，Plasma Therapy and Transfusion Technology，7：333-349(1986))。
美国专利6,441,146和5,962,641中描述了His(6)标记蛋白的纯化方法，然而没有涉及血液净化及解决配体脱落问题的方法。
至今为止，在血液净化领域，关于配体脱落问题还没有好的解决方案。本领域技术人员仍在不断寻找更有效的血液净化方法。
发明内容
本发明在现有技术的基础上研究了一种新的血液净化方法和应用于该方法的血液净化系统，所述的净化方法其特征在于包括两步亲和吸附，即第一步吸附用于移除患者血液中的致病因子，第二步吸附用于去除第一步吸附后脱落的配体。相应的，用于该方法的血液净化系统包括串联连接的两种吸附柱，即用于移除患者血液中致病因子的第一吸附柱，和用于去除由第一吸附柱脱落的配体的第二吸附柱。本发明的方法及系统解决了血液净化中配体脱落的难题，大大减少了血液净化可能出现的副作用。并且，将本发明的血液净化方法和系统用于治疗时无需替代液参与。
本发明的血液净化方法和系统可用于治疗诸如动脉硬化症、自身免疫性疾病和其他与血液有关的疾病。
本发明的目的是提供一种通过亲和吸附进行血液净化的新方法。该方法是一种基于亲和作用的血液净化方法，该方法没有或只有很少配体脱落问题，因此大大减少了血液净化中可能出现的副作用。
具体的，本发明提供了一种新的血液净化方法，该方法包括在常规的净化吸附步骤之后加入吸附第一步吸附后由载体上脱落的蛋白的步骤，从而克服了配体脱落的问题。
更具体地，本发明通过亲和吸附进行血液净化的方法包括以下步骤：
(1)将血液或经过分离的血浆通过第一亲和吸附柱A，该柱中的吸附剂以蛋白作为配体，用于去除致病因子；
(2)使经过柱A净化的血液或血浆通过第二亲和吸附柱B，该柱以固定的金属离子为配体，能够吸附从柱A脱落的配体蛋白。
本发明的方法可用于处理血浆或血液，用于处理血浆时，所述的血浆可以是用血浆分离器将血液分离为血浆与血细胞后所获得的血浆。
采用上述方法净化后的血液可输回患者体内；用上述方法净化后的血浆在与患者的血细胞混合后也可被输回患者体内。所以此净化过程无需替代液参与。
本发明的血液净化方法可用于治疗诸如动脉硬化症、自身免疫性疾病和其他与血液净化有关的疾病。
本发明的另一目的是提供一种通过净化患者血液来治疗疾病的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将从病人体内输出的血液分离得到的血浆通过第一亲和吸附柱A，或将从病人体内输出的血液直接通过第一亲和吸附柱A，该柱中的吸附剂以蛋白作为配体，用于去除致病因子；
(2)使经过柱A净化的血液或血浆通过第二亲和吸附柱B，该柱以固定的金属离子为配体，能够吸附从柱A脱落的配体蛋白；
(3)将净化后的血液输送至患者体内；或将净化后的血浆与患者的血细胞混合后输送至患者体内。
本发明的另一目的是提供一种用于上述血液净化方法和治疗方法的专用血液净化系统，它是一种新颖的亲和吸附净化系统。
具体的说，本发明的血液净化系统包括二种吸附柱，即用于去除致病因子的第一亲和吸附柱A，和用于吸附由柱A脱落的蛋白的第二亲和吸附柱B。
本发明的血液净化系统还可包括血浆分离器，用于将血液分离为血浆和血细胞。在此情况下，本发明的血液净化系统包括三部分，即血浆分离器、第一亲和吸附柱A和第二亲和吸附柱B。
更具体地，本发明的血液净化系统包括以蛋白为配体的第一亲和柱A和以固定的金属离子为配体的第二亲和柱B，且柱A与柱B串联连接。所述的血液净化系统还可包括血浆分离器。
在将本发明的系统和方法用于治疗疾病时，可按照下述方法进行：将患者的血液经血浆分离器分离为血浆与血细胞，再将所述的血浆在该系统中按照上述血液净化方法经过两步处理；或者将患者的血液在该系统中按照上述血液净化方法直接进行两步处理。第一步处理是用亲和吸附柱A，柱A以蛋白为配体，用于移除血液或血浆中的致病因子；第二步处理用亲和吸附柱B，柱B以固定的金属离子为配体，用于吸附从柱A脱落的配体；净化后的血液再输回到患者体内，或将净化后的血浆与细胞混合后再输回到患者体内。因此，此净化过程无需替代液参与。
在本发明的方法和系统中，第一亲和吸附柱A是一种蛋白吸附柱，其配体是一种蛋白，连接到某种载体上。本文所用的术语“蛋白”是指广义的蛋白，也包括抗体。所述蛋白可以是蛋白的整体或是一部分，即多肽，具有能与血液中的致病分子结合的能力。可用于柱A的配体蛋白的实例例如protein A、protein G或相关变体等；所述蛋白或多肽包括体外合成的，或是通过重组DNA技术细胞或动物合成的。所述的蛋白是抗体时，该抗体包括完整抗体、抗体片段、或单链Fv等，如IgG或Ig A，能够结合血液中的致病抗原或分子，这些抗体可以是体外合成的，也可以是通过基因重组技术获得的。
本发明的方法和系统中所述柱A吸附剂的配体蛋白优选是His(n)标记的，即组氨酸标记的蛋白。由于组氨酸残基具有易于和金属离子结合的特性，在配体上引入此标记使脱落的配体更易于被第二亲和吸附柱吸附。术语“His(n)”是指至少4个连续的组氨酸残基，优选6-10个连续的组氨酸残基，最优选为6个连续的组氨酸残基，因此n为大于4的整数，优选n为6-10的整数，最优选n为6。His(n)标记与配体蛋白的连接位置可以在配体蛋白的N-端，C-端或其他不影响蛋白性质功能的位置。所述的His(n)标记必须暴露在柱A配体蛋白表面，以便配体蛋白脱落后能与金属亲和柱B结合。
本发明的方法和系统中所述的His(n)标记相对较短，通常情况下不会影响蛋白活性。组氨酸标记的免疫原性低，最近有许多实例证明蛋白增加了该标记后并不影响治疗效果。Poon和Hunt在大肠杆菌中表达了His6标记protein A，并且通过固定金属亲和色谱(immorbilized-metal affinity chromatography，IMAC)纯化(R.Poon和T.Hunt，“Reversible Immunoprecipitation Using Histidine-orGlutaththione-S-Transferase-Tagged Staphylococcal Protein A”，Analytical Biochemistry 218：26-33(1994))。该His6protein A连接到琼脂糖凝胶上，其结合IgG的能力与通常的protein A-琼脂糖凝胶相似，也就是说His6标记并不影响protein A的蛋白活性。
本发明所使用的His(n)标记蛋白是在通常所用的吸附剂蛋白上引入His(n)标记。引入His(n)标记的方法可参见上述Poon和Hunt的文献。在本发明的方法和系统中，第二步的亲和吸附柱B用来吸附由第一柱A脱落的配体。该柱B可以是生化领域中常用的固定金属亲和柱，其采用了固定金属亲和色谱(IMAC)方法。IMAC是近年来出现的应用很广的一种分离技术，它的作用原理是柱填料中的固相载体通过共价键螯合金属离子，某些金属离子作为配体能够结合具有组氨酸残基标记的蛋白质。IMAC具有配体稳定、高蛋白吸附能力、洗脱条件温和、再生简单、成本低廉的特点，因此在蛋白纯化中应用广泛。
本发明的方法和系统中，第二亲和吸附柱B所使用的配体固定金属包括但不仅限于以下几种：Ni(II)，Co(II)，Cu(II)，Fe(II)和Zn(II)。关于固定金属亲和柱现有技术中已有报道，固定金属亲和柱非常稳定，痕量的此类金属如果脱落也不会对人体造成伤害。
在本发明中，亲和吸附柱A和B中的载体可以是颗粒、纤维、大孔基质、膜或中空纤维，其中的颗粒优选是球形颗粒，例如琼脂糖、纤维素颗粒。
本发明的方法和系统中所述的第一亲和吸附柱A和第二亲和吸附柱B是串联连接。柱A和柱B各自可以是单柱，也可以是一组柱，例如二个或二个以上的柱并联。优选使用单柱或平行双柱。
本发明的血液净化方法和系统可用于治疗与血液有关的疾病，这些疾病包括但不限于由于自身抗体异常导致的疾病，例如系统性红斑狼疮、风湿性关节炎、血管球性肾炎和脉管炎、先天性血小板减少性紫癜、IgG引起的自身免疫溶血性贫血、多发性硬化症、天疱疮、韦格内肉芽肿病、血小板无力症、肺出血肾炎综合征、系统性脉管炎、慢性脱髓鞘性神经炎、急性感染性多发性神经炎、重症肌无力扩张型心肌症、化疗引起的溶血性尿毒症、血友病、肾脏移植引起的白细胞抗原机能亢进、免疫球蛋白E过高症候群等，以及由于血液中某些蛋白异常可能导致的疾病，例如高脂血症、动脉硬化症、透析相关性淀粉样变性、末期肾脏疾病、慢性肾衰竭、败血症、内毒素休克和艾滋病等等。特别是用于治疗高脂血症、动脉硬化症和自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、风湿性关节炎、天疱疮等。
试验结果表明，用本发明的方法进行治疗的患者其血液中的异常蛋白或抗体明显减少，由柱A上脱落的配体His(n)标记蛋白可被金属亲和柱B吸附。因此可减少由此而产生的副作用。很显然，患者血液中异常蛋白的减少可使他们的临床症状得到明显改善。
附图说明
下面参照附图进一步描述本发明的实施方案。
图1是本发明的两步法亲和吸附血液净化系统简图。该系统包括血浆分离器、吸附柱A和吸附柱B，以及吸附剂的再生系统。图1具体说明了使用两步亲和吸附法对患者的血浆进行血液净化的过程：患者血液通过导管流入血池101，肝素102或其他稳定的抗凝剂加入血池中，关于抗凝剂的加入可参考美国专利4,614,513。血液通过导管104流入血浆分离器105，血浆与血细胞分离，所述血浆流入柱A(113)，柱A中的吸附剂以蛋白为配体，优选以His(n)标记的蛋白为配体。在柱A中，发生亲和吸附反应，如抗原与抗体之间，通过亲和吸附移除血液中异常的致病分子。经过柱A净化的血浆流入柱B(121)，柱B中的吸附剂是金属亲和树脂，能够吸附从柱A中脱落的配体蛋白，特别是吸附脱落的His(n)标记蛋白。当关闭阀门108，打开阀门109时，柱A就进入再生状态，冲洗缓冲液由111流入柱A，打开阀门114，废液就流到废液池115中，该池中液体可直接丢弃或进行分析。当关闭阀门109，打开阀门110时，缓冲液从112中进入柱A中平衡。阀门114打开，缓冲液进入115。柱B的再生与此类似，用118中的冲洗缓冲液清洗，119中的缓冲液进行平衡，最终废液流到废液池123中，泵103与125控制血浆流速。通过两个柱子净化后的血浆进入混合小血池(127)中与血细胞重新混合，最后输回到患者体内，控制器128可以控制阀门108，109，110，114，116，117，120，122和124，如果不使用在线再生，也可以直接更换吸附剂。
图2是本发明另一血液净化系统简图，其中两种亲和吸附柱各自采用两个平行柱，即并联双柱。当柱A1(204)净化时，柱A2(227)再生；类似地，当柱B1(206)净化时，柱B2(229)再生，因此可提高净化效率。
图2具体描述了一个改进的血液净化系统用于治疗的过程。与图1不同的是，此系统每一步吸附采用的都是平行柱，这可以大大增加血液净化效率。当柱A1和柱B1在进行净化操作时，柱A2和柱B2可以进行再生；反之，当柱A2和柱B2在进行净化操作时，柱A1和柱B1可以再生。因此，此双柱系统可比单柱系统更快的完成血液净化过程。
如图所示，患者的血液经过血浆分离器后，血浆通过导管106进入柱A1(204)，在柱A1中发生亲和反应，移除致病因子；从柱A1流出的血浆流经柱B1，净化后的血浆进入混合小血池(未显示)与血细胞混合后输回患者体内，泵201和203可控制压力保证血浆的流动，在柱A1和柱B1行使净化功能时，柱A2和柱B2可进行再生，再生过程与图1中说明类似。
应用此系统对患者的血液进行净化时，可比图1所描述的单柱系统更快的完成血液净化过程。
图3是His6标记protein A与非标记protein A结合IgG水平的比较。试验所用的商购protein A和对照protein(HSA-人血清白蛋白)是由Sigma公司.购买，Protein A和His6标记protein A按照实施例1所述方法制备。
具体实施方案
以下用实例举例说明本发明的方法、系统和治疗方法，但本发明并不限于以下应用。
实施例1柱A配体His6标记protein A的制备
本例旨在说明柱A所用His(n)标记配体蛋白的制备。并通过IgG的结合力之功能测定对所制备的柱A配体和无标记的天然protein A(常规使用的配体)进行比较。为了符合柱A所用配体蛋白的要求，所制备的标记protein A中His6不能影响该蛋白的活性并且可被柱B的固定金属配体结合。试验表明，His6-protein A与IgG的结合力和protein A类似。
Protein A和His6protein A均可通过基因重组技术获得(Sambrook J.Fritsch BF and Maniatis T.，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，2nd.Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。根据报道已知位于protein A C-端的His6不会影响protein A活性(Poon and Hunt，“Reversible Immunoprecipitation UsingHistidine-or Glutaththione-S-Transferase-Tagged StaphylococcalProtein A”，Analytical Biochemistry 218：26-331994)。
His6标记protein A，按照上述文献公开的方法制备。
通过PCR方法构建编码protein A和C-端His6标记的cDNA，克隆到载体pET21b(Novagen公司)，并且在Escherichia coliBL21菌株(DE3)中表达，异丙硫基-(β)-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside，IPTG)诱导表达，通过Ni-NTA树脂(Qiagen公司)纯化His6-protein A后连接到琼脂糖凝胶上。重组protein A的获得及连接到载体上的过程与前者类似。
测定IgG结合能力采用如下方法。10ml protein A或10ml His6protein A与50ml医学实验用的狗血清于4℃孵育1小时，缓冲液为20mM Tris-HCl(pH7.5)和50mM NaCl。用缓冲液冲洗，结合的IgG洗脱后用抗狗IgG抗体通过ELISA方法定量(测定方法参见H.Sato，T.Kidaka and M.Hori，“Leakage of Immobilized IgG from TherapeuticImmunoadsorpents”，Applied  Biochemistry  and  Biotechnology，15：145-158(1987))。如图三所示His6protein A具有与protein A相似的IgG结合能力，也就是说加入的组氨酸标记不会阻挡proteinA与IgG的结合区域。
结果说明His6标记不影响protein A功能。
实施例2
此例旨在比较用常规的单柱层析法进行体外血液净化和用本发明的双柱串联层析法进行体外血液净化后，系统性红斑狼疮(SLE)患者血浆中IgG水平与His6-protein A的脱落情况。
SLE患者为一位40岁的妇女，从患者体内取血200ml，离心分离血浆与血细胞。各取100ml血浆通过常规的单柱层析和本发明的双柱串联层析系统。单柱层析系统包括一个以实施例1制备的His6-protein A为吸附剂的的75ml柱；本发明的双柱串联层析系统包括一个与此相同的柱，以及一个20ml金属亲和树脂Ni-NTA柱(Qiagen公司)(该柱的吸附剂是金属Ni)。血浆过柱后用酸性洗脱液和中性平衡缓冲液再生、重平衡柱子。根据净化需要，可对血浆进行多次净化。完成净化后，测定纯化血浆中IgG和His6-proteinA的量。IgG通过色谱法和免疫电泳方法测定，脱落的His6-proteinA用抗protein A抗体和抗His6抗体按照ELISA方法测定(测定方法参见H.Sato，T.Kidaka and M.Hori，“Leakage of Immobilized IgG fromTherapeutic Immunoadsorpents”，Applied  Biochemistry andBiotechnology，15：145-158(1987))。结果列于表一。
表一经过常规的单柱处理系统和本发明的双柱处理系统净化后SLE患者血浆中抗体和His6-Protein A的含量
  抗体含量(g/L)   处理前   处理后   移除量   移除率％
IgG   单柱层析   19.72   7.99   11.73   59.5
  双柱层析   20.50   6.50   14.0   68.3
  IgA   单柱层析   2.51   1.82   0.69   27.6
双柱层析 2.39 1.67 0.72 30.2
  IgM   单柱层析   1.92   1.11   0.81   42.3
双柱层析 1.65 0.88 0.77 46.5
  His6-Protein A含量(ug/L)   单柱层析   0.68   156.03
  双柱层析   0.82   3.21
如表一所示，单柱层析和双柱串联层析在体外结合IgG的能力相近，然而单柱层析系统处理后的血浆中His6-protein A明显高于双柱串联层析系统。
实施例3
本例旨在比较用常规的单柱系统和本发明的双柱亲和吸附血液净化系统净化后，狗血清中IgG水平与His6-protein A的脱落情况。
本实施例应用了图2所示的双柱亲和吸附血液净化系统，其中柱A和柱B使用的吸附剂各自与实施例2相同，柱A体积为150ml，柱B为40ml。而常规的单柱血液净化系统只包括柱A。
实验动物为雄性、供医学实验用的狗，体重为10-13公斤。狗全身麻醉后，血液从狗的后腿股动脉引出，进入血浆膜分离器。膜分离器将血液分成血球、血浆两部分，血浆以30mL/min的速度流过柱1系统(A1-B1双柱串联)，柱2系统(A2-B2双柱串联)关闭，运行10分钟以后，关闭柱1系统入口和出口，开启柱2系统。柱1系统进入洗脱、平衡过程，再生过程为先用酸性洗脱液洗去吸附的蛋白，再用平衡缓冲液平衡柱子。再生过程完毕后，开启柱1系统入口，同时关闭柱2系统入口。重复以上操作，每柱各切换5次，经图2所示装置处理后，纯化的血浆与血球混合后一同输回狗的后腿静脉。
系统运行10分钟后开始取样测量。IgG通过色谱法和免疫电泳方法测定，脱落的His6-protein A用ELISA方法测定，用于测量His6-protein A抗体包括抗protein A抗体和抗His6抗体，测定方法如实施例2所述。结果列于表二。
表二  单柱和双柱系统处理后狗血浆中IgG抗体和His6-Protein A的含量变化
狗 IgG含量(g/L) IgG移除率   His6-ProteinA含量(ug/L)
  编号   体重   处理前   处理后   移除   处理前   处理后
  单柱血液净化系统   A1   12.6   11.25   5.57   5.68   50.5   0.48   123.05
A2 11.8 12.93 6.61 6.32 48.9 0.63 136.01
  A3   10.8   10.4   4.83   5.58   53.6   0.59   133.06
  双柱血液净化系统   B1   11.4   11.62   5.10   6.52   56.1   0.67   1.56
B2 10.7 13.18 4.06 9.04 69 0.53 1.73
  B3   12.8   12.53   4.38   8.13   65   0.56   2.31
如表二所示，与常规的单柱吸附血液净化系统相比，通过双柱亲和吸附血液净化系统后的His6-protein A配体脱落的数量大大地降低。
试验结果表明本发明的血液净化方法和系统使净化的血液中脱落配体的数量大大减少，因此可相应的减少由配体脱落引起的副作用，解决了血液净化治疗方法中所存在的难题。
以上已经详细描述了本发明的实施方案，对本领域技术人员来说很明显可以做很多改进和变化而不会背离本发明的基本精神。所有这些变化和改进都在本发明的范围之内，其特征由上述说明书确定。

Claims (10)

1.通过亲和吸附进行血液净化的方法，该方法包括在常规的净化吸附步骤之后加入另一吸附步骤，该吸附步骤用于吸附上一步骤吸附后又由载体上脱落的配体蛋白。
2.按照权利要求1的血液净化方法，该方法包括以下步骤：
(1)将血液或经过分离的血浆通过第一亲和吸附柱A，该柱的吸附剂以蛋白为配体，连接到载体上；
(2)使经柱A净化的血液或血浆通过第二亲和吸附柱B，该柱以固定的金属离子为配体，能够吸附从柱A中脱落的蛋白。
3.按照权利要求1或2的血液净化方法，其中所述经过分离的血浆是使用血浆分离器分离的。
4.按照权利要求2的血液净化方法，其中所述柱A的配体蛋白是完整蛋白或多肽，优选为His(n)标记的蛋白，并且可以是体外合成的，也可以是通过重组DNA技术获得的；其中所述His(n)标记的位置可以位于蛋白的N-端、C-端或其他不影响蛋白功能活性的任何位置。
5.按照权利要求4的血液净化方法，其中所述蛋白中的组氨酸残基数量至少为4，优选为6-10。
6.按照权利要求2的血液净化方法，其中所述柱B中的金属离子选自Ni(II)、Cu(II)、Co(II)、Fe(II)和Zn(II)。
7.一种血液净化系统，该系统包括以蛋白为配体的第一亲和吸附柱A，和以固定的金属离子为配体的第二亲和吸附柱B，所述的柱A与柱B串联连接，可各自独立地是单柱或并联多柱；该系统还可选择性包括血浆分离器。
8.按照权利要求7的血液净化系统，其中所述柱A的配体蛋白是完整蛋白或多肽，优选为His(n)标记的蛋白，并且可以是体外合成的，也可以是通过重组DNA技术获得的，其中所述His(n)的位置可以位于蛋白的N-端、C-端或其他不影响蛋白功能活性的任何位置。
9.按照权利要求8的血液净化系统，其中所述蛋白中的组氨酸残基数量至少为4，优选为6-10。
10.按照权利要求7的血液净化系统，其中所述柱B中的金属离子选自Ni(II)、Cu(II)、Co(II)、Fe(II)和Zn(II)。
CN2005100114145A 2005-03-11 2005-03-11 基于亲和吸附的血液净化方法及系统 Active CN1830495B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2005100114145A CN1830495B (zh) 2005-03-11 2005-03-11 基于亲和吸附的血液净化方法及系统
PCT/CN2006/000371 WO2006094467A1 (fr) 2005-03-11 2006-03-13 Procede et systeme de purification du sang bases sur une absorption par affinite

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2005100114145A CN1830495B (zh) 2005-03-11 2005-03-11 基于亲和吸附的血液净化方法及系统

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1830495A true CN1830495A (zh) 2006-09-13
CN1830495B CN1830495B (zh) 2010-12-15

Family

ID=36952960

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2005100114145A Active CN1830495B (zh) 2005-03-11 2005-03-11 基于亲和吸附的血液净化方法及系统

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN1830495B (zh)
WO (1) WO2006094467A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105214341A (zh) * 2015-09-17 2016-01-06 广州康盛生物科技有限公司 组合型吸附柱及其制备方法
CN105343953A (zh) * 2015-10-06 2016-02-24 浙江大学 一次性血浆免疫吸附管路
CN106166311A (zh) * 2016-08-30 2016-11-30 张小曦 一种新型血浆净化系统及其应用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2488228A4 (en) 2009-10-18 2018-03-21 Glycorex AB Method and product for blood treatment and purification
US9051355B2 (en) 2010-03-24 2015-06-09 Jsr Corporation Filler for affinity chromatography and method for isolating immunoglobulin

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4983722A (en) * 1988-06-08 1991-01-08 Miles Inc. Removal of protein A from antibody preparations
SE522921C2 (sv) * 1998-06-30 2004-03-16 Fresenius Hemocare Gmbh Förfarande och anordning för behandling av helblod
FR2785200B1 (fr) * 1998-10-30 2001-03-30 Centre Nat Rech Scient Utilisation d'un gel adsorbant pour eliminer et purifier les biomolecules
JP2004180703A (ja) * 2002-11-29 2004-07-02 Toray Ind Inc 脱離可能なリガンド親和性物質固定化基材、および該基材にリガンドを結合させた材料およびそれを用いたカラム
DE20300703U1 (de) * 2003-01-16 2003-03-13 Macherey, Nagel GmbH & Co. Handelsgesellschaft, 52355 Düren Trennmaterial zur Reinigung von Proteinen
DE10360450A1 (de) * 2003-02-27 2004-09-09 Robert Bosch Gmbh Brennstoffeinspritzventil
PT1601697E (pt) * 2003-02-28 2007-09-04 Lonza Biologics Plc Purificação de anticorpos através de proteína a e cromatografia de troca iónica.

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105214341A (zh) * 2015-09-17 2016-01-06 广州康盛生物科技有限公司 组合型吸附柱及其制备方法
CN105343953A (zh) * 2015-10-06 2016-02-24 浙江大学 一次性血浆免疫吸附管路
CN106166311A (zh) * 2016-08-30 2016-11-30 张小曦 一种新型血浆净化系统及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN1830495B (zh) 2010-12-15
WO2006094467A1 (fr) 2006-09-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sanchez et al. The selective therapeutic apheresis procedures
EP0236509B1 (en) B2-microglobulin-removing column
Stegmayr Apheresis as therapy for patients with severe sepsis and multiorgan dysfunction syndrome
CN1830495B (zh) 基于亲和吸附的血液净化方法及系统
Mitzner et al. Extracorporeal endotoxin removal by immobilized polyethylenimine
AU2014285971A1 (en) Affinity chromatography matrix
Serpa et al. Evaluation of immobilized metal membrane affinity chromatography for purification of an immunoglobulin G1 monoclonal antibody
EP3669888A1 (en) Extracorporeal devices for methods for treating diseases associated with anti-neutrophil cytoplasmic antibodies
JPH08509243A (ja) エンドトキシンの除去方法
Prasanna et al. Development of l‐histidine immobilized CIM® monolithic disks for purification of immunoglobulin G
CN112898387A (zh) 一种重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白的纯化方法
Teschner et al. ABO‐incompatible kidney transplantation using regenerative selective immunoglobulin adsorption
Vallar et al. Immunoadsorption procedure as a potential method for the specific β2-microglobulin removal from plasma of patients with chronic renal failure
CN115651081A (zh) 一种破伤风抗毒素的纯化方法、层析填料及破伤风抗毒素
Acconci et al. Depyrogenation of snake antivenom serum solutions by hollow fiber-based pseudobioaffinity filtration
Matic et al. Extracorporeal removal of circulating immune complexes: from non-selective to patient-specific
JP2001170501A (ja) 乳清からのラクトフェリンアイソフォームの分離方法
US11732004B2 (en) Compositions and methods for simplified high efficiency isolation of proteins
US20040198957A1 (en) Method for removing endotoxins from protein solutions
CN113069538B (zh) 一种制备重组金黄色葡萄球菌疫苗的方法
Srour et al. Histidine based adsorbents for selective removal of monoclonal immunoglobulin IgM antibodies from Waldenstrom's macroglobulinemia patient sera: A preliminary study
Kadar et al. Biocompatibility of extracorporeal immunoadsorption systems
Kunkel et al. Selective removal of circulating immune complexes from patient plasma
JP2584261B2 (ja) ヘモグロビンの吸着剤
RU2325172C2 (ru) Сорбент для удаления иммуноглобулинов

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: GUANGDONG TIANPU BIOCHEMICAL MEDICINE CO., LTD.

Free format text: FORMER OWNER: FU HELIANG

Effective date: 20101021

Free format text: FORMER OWNER: HOU YONGMIN BOPU BIOLOGICAL TECH. CO., LTD., GUANGZHOU CITY GUANGDONG TIANPU BIOCHEMICAL MEDICINE CO., LTD.

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20101021

Address after: 510520 Guangdong city of Guangzhou province Tianhe District Gaotang High Technology Industrial Park No. 89 Pu Lu

Applicant after: Guangdong Tianpu Biochemical Medicine Co., Ltd.

Address before: 510520 Guangdong city of Guangzhou province Tianhe District Gaotang High Technology Industrial Park No. 89 Pu Lu

Applicant before: Fu Heliang

Co-applicant before: Hou Yongmin

Co-applicant before: Bopu Biological Tech. Co., Ltd., Guangzhou City

Co-applicant before: Guangdong Tianpu Biochemical Medicine Co., Ltd.

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant