WO2006094467A1

WO2006094467A1 - Procede et systeme de purification du sang bases sur une absorption par affinite

Info

Publication number: WO2006094467A1
Application number: PCT/CN2006/000371
Authority: WO
Inventors: Heliang Fu; Yongmin Hou
Original assignee: Guangzhou Bopu Biotechnology Inc.; Guangdong Techpool Bio-Pharma Co., Ltd.
Priority date: 2005-03-11
Filing date: 2006-03-13
Publication date: 2006-09-14
Also published as: CN1830495B; CN1830495A

Description

基于亲和吸附的血液净化方法及系统

技术领域

本发明涉及新的血液净化方法，净化患者血液来治疗疾病的方法以及所述方法专用的血液净化系统。更具体地，本发明涉及改进的、基于亲和吸附的血液净化方法和系统，所述的血液净化方法是在常规的吸附净化后增加另一吸附步骤，用以吸附脱落的配体，以减少常规血液净化方法的副作用。背景技术

血液净化治疗是指患者血液在体外通过某种处理后再回输到患者体内，这种处理包括血液透析、血液过滤、血液渗透、血浆置换或免疫吸附，可以从患者血液中移除致病因子。

血浆置换被广泛应用于移除血浆中的各类病原体包括抗体、免疫复合物、异常的免疫球蛋白、冷沉 (淀)蛋白、异常的凝结因子和其他毒性因子。然而，血浆置换在选择性与特异性方面有一定局限性。它在移除病原体的同时还会移除某些人体血液中必需的蛋白。此外，血浆置换过程还需要使用替代液（如人体白蛋白溶液），此替代液的价格昂贵，并且增加了此种治疗方法引入污染物的可能，因此大大限制了血浆置换方法的应用。

为了克服这些问题，基于免疫吸附方法的亲和选择开始被应用于血液净化，并且其作用日益明显。免疫吸附能够有选择的移除血液中的致病因子。在免疫吸附方法中， Protein A应用最为广泛， protein A来源于金黄色葡萄球菌，能够与 IgG的 Fc片段特异性结合。 Protein A吸附方法已经成功地应用于治疗各种免疫疾病， M Gaubitz and KM Schneider就描述了用 protein A 吸附 IgG和免疫复合物来治疗某种自身免疫性疾病例如系统性红斑狼疮 (M Gaubitz and KM Schneider, "Immunoadsorption in systemic lupus erythematosus: different techniques and their current role in medical therapy", Therapeutic Apheresis and Dialysis, 7(2): 183- 188(2003》。

低密度脂蛋白（LDL) 和 LDL胆固醇（LDL-C) 是导致动脉硬化症的主要因素之一。传统治疗方法是通过控制饮食和药物来降低患者 LDL 与 LDL-C 水平，然而口服降脂药如洛伐他汀（Lovastatin) 很可能导致对肝的损害，而且降脂效果较低。通过亲和吸附在体外移除 LDL 和 LDL-C来降低患血液中胆固醇与 LDL的浓度能够表现出更好的效果，所使用的亲和吸附剂包括抗 LDL 抗体和其他化学吸附剂如右旋糖苷硫酸盐或苷磷脂。 Strahilevitz的美国专利 6,676,622设计了一种亲和吸附系统，但是没有提供实验数据；也有关于某种治疗动脉硬化症的吸附剂的报道，由螯和因子移除能够导致 LDL氧化的重金属； protein A也能吸附导致血液中 LDL氧化的自身抗体。

然而，在免疫治疗中，存在着吸附剂配体从载体脱落的问题。据报道，有 41%的高血脂患者在接受 LDL抗体免疫治疗后会出现低血压症状（伍强等人， "免疫吸附法治疗高血脂症疗效观察" ， Journal of Modern Clinical Medical Bioengineering, 9:110-112, 2003 ) 。目前所使用的大多数抗体是鼠源或羊源，这些非人源性抗体如果脱落进入人体内就会作为抗原引发人体内难以预测的免疫反应。在透析和血浆灌注过程中，血浆会多次经过免疫亲和吸附柱，因此配体很有可能脱落进入血液中，从而导致严重的副作用。目前已有许多关于 protein A从载体上脱落问题的研究，如果脱落数量达到一定值将会引起严重的副作用。已有报道从血浆中发现了脱落的 protein A并且导致各种副作用（JP Balint, FR Jones and HW Snyder, "The PROSORBA Column Clinical Trial Group: Selective extracorporeal removal of immunoglobulin G and circulating immune complexes: A review", Plasma Therapy and Transfusion Technology, 7:333-349 (1986)) 。

美国专利 6,441,146和 5,962,641 中描述了 His ( 6) 标记蛋白的纯化方法，然而没有涉及血液净化及解决配体脱落问题的方法。

至今为止，在血液净化领域，关于配体脱落问题还没有好的解决方案。本领域技术人员仍在不断寻找更有效的血液净化方法。发明内容

本发明在现有技术的基础上研究了一种新的血液净化方法和应用于该方法的血液净化系统，所述的净化方法其特征在于包括两步亲和吸附，即第一步吸附用于移除患者血液中的致病因子，第二步吸附用于去除第一步吸附后脱落的配体。相应的，用于该方法的血液净化系统包括串联连接的两种吸附柱，即用于移除患者血液中致病因子的第一吸附柱，和用于去除由第一吸附柱脱落的配体的第二吸附柱。本发明的方法及系统解决了血液净化中配体脱落的难题，大大减少了血液净化可能出现的副作用。并且，将本发明的血液净化方法和系统用于治疗时无需替代液参与。

本发明的血液净化方法和系统可用于治疗诸如动脉硬化症、自身免疫性疾病和其他与血液有关的疾病。

本发明的目的是提供一种通过亲和吸附进行血液净化的新方法。该方法是一种基于亲和作用的血液净化方法，该方法没有或只有很少配体脱落问题，因此大大减少了血液净化中可能出现的副作用。

具体的，本发明提供了一种新的血液净化方法，该方法包括在常规的净化吸附步骤之后加入吸附第一步吸附后由载体上脱落的蛋白的步骤，从而克服了配体脱落的问题。

更具体地，本发明通过亲和吸附进行血液净化的方法包括以下步骤：

(1)将血液或经过分离的血浆通过第一亲和吸附柱 A，该柱中的吸附剂以蛋白作为配体，用于去除致病因子；

(2)使经过柱 A净化的血液或血浆通过第二亲和吸附柱 B，该柱以固定的金属离子为配体，能够吸附从柱 A脱落的配体蛋白。

本发明的方法可用于处理血浆或血液，用于处理血浆时，所述的血浆可以是用血桨分离器将血液分离为血浆与血细胞后所获得的血浆。

采用上述方法净化后的血液可输回患者体内；用上述方法净化后的血浆在与患者的血细胞混合后也可被输回患者体内。所以此净化过程无需替代液参与。

本发明的血液净化方法可用于治疗诸如动脉硬化症、自身免疫性疾病和其他与血液净化有关的疾病。

本发明的另一目的是提供一种通过净化患者血液来治疗疾病的方法，该方法包括以下步骤：

(1)将从病人体内输出的血液分离得到的血浆通过第一亲和吸附柱 A，或将从病人体内输出的血液直接通过第一亲和吸附柱 A，该柱中的吸附剂以蛋白作为配体，用于去除致病因子；

(2)使经过柱 A净化的血液或血浆通过第二亲和吸附柱 B，该柱以固定的金属离子为配体，能够吸附从柱 A脱落的配体蛋白； (3)将净化后的血液输送至患者体内；或将净化后的血桨与患者的血细胞混合后输送至患者体内。

本发明的另一目的是提供一种用于上述血液净化方法和治疗方法的专用血液净化系统，它是一种新颖的亲和吸附净化系统。

具体的说，本发明的血液净化系统包括二种吸附柱，即用于去除致病因子的第一亲和吸附柱 A，和用于吸附由柱 A脱落的蛋白的第二亲和吸附柱8。

本发明的血液净化系统还可包括血浆分离器，用于将血液分离为血浆和血细胞。在此情况下，本发明的血液净化系统包括三部分，即血浆分离器、第一亲和吸附柱 A和第二亲和吸附柱 B。

更具体地，本发明的血液净化系统包括以蛋白为配体的第一亲和柱 A 和以固定的金属离子为配体的第二亲和柱 B，且柱 A与柱 B 串联连接。所述的血液净化系统还可包括血浆分离器。

在将本发明的系统和方法用于治疗疾病时，可按照下述方法进行：将患者的血液经血浆分离器分离为血浆与血细胞，再将所述的血浆在该系统中按照上述血液净化方法经过两步处理；或者将患者的血液在该系统中按照上述血液净化方法直接进行两步处理。第一步处理是用亲和吸附柱 A，柱 A 以蛋白为配体，用于移除血液或血浆中的致病因子；第二步处理用亲和吸附柱 B，柱 B以固定的金属离子为配体，用于吸附从柱 A脱落的配体；净化后的血液再输回到患者体内，或将净化后的血浆与细胞混合后再输回到患者体内。因此，此净化过程无需替代液参与。

在本发明的方法和系统中，第一亲和吸附柱 A 是一种蛋白吸附柱，其配体是一种蛋白，连接到某种载体上。本文所用的术语 "蛋白"是指广义的蛋白，也包括抗体。所述蛋白可以是蛋白的整体或是一部分，即多肽，具有能与血液中的致病分子结合的能力。可用于柱 A 的配体蛋白的实例例如 protein A、 protein G或相关变体等；所述蛋白或多肽包括体外合成的，或是通过重组 DNA技术细胞或动物合成的。所述的蛋白是抗体时，该抗体包括完整抗体、抗体片段、或单链 Fv等，如 IgG或 Ig A，能够结合血液中的致病抗原或分子，这些抗体可以是体外合成的，也可以是通过基因重组技术获得的。

本发明的方法和系统中所述柱 A 吸附剂的配体蛋白优选是 His(n)标记的，即组氨酸标记的蛋白。由于组氨酸残基具有易于和金属离子结合的特性，在配体上引入此标记使脱落的配体更易于被第二亲和吸附柱吸附。术语

"His(n)"是指至少 4个连续的组氨酸残基，优选 6-10个连续的组氨酸残基，最优选为 6个连续的组氨酸残基，因此 n为大于 4的整数，优选 n为 6-10 的整数，最优选 n为 6。 His (n) 标记与配体蛋白的连接位置可以在配体蛋白的 N-端， C-端或其他不影响蛋白性质功能的位置。所述的 His(n)标记必须暴露在柱 A配体蛋白表面，以便配体蛋白脱落后能与金属亲和柱 B结合。

本发明的方法和系统中所述的 His(n)标记相对较短，通常情况下不会影响蛋白活性。组氨酸标记的免疫原性低，最近有许多实例证明蛋白增加了该标记后并不影响治疗效果。 Poon 和 Hunt 在大肠杆菌中表达了 His6 标记 protein A，并且通过固定金属亲和色谱 (immorbilized-metal affinity chromatography ， IMAC) 纯化 ( R. Poon 和 T. Hunt, "Reversible Immunoprecipitation Using Histidine- or Glutaththione-S-Transferase-Tagged Staphylococcal Protein A", Analytical Biochemistry 218:26-33 (1994))。该 His6 protein A 连接到琼脂糖凝胶上，其结合 IgG的能力与通常的 protein A-琼脂糖凝胶相似，也就是说 His6标记并不影响 protein A的蛋白活性。

本发明所使用的 His(n)标记蛋白是在通常所用的吸附剂蛋白上引入 His(n)标记。引入 His(n)标记的方法可参见上述 Poon 和 Hunt的文献。在本发明的方法和系统中，第二步的亲和吸附柱 B用来吸附由第一柱 A脱落的配体。该柱 B 可以是生化领域中常用的固定金属亲和柱，其采用了固定金属亲和色谱 (IMAC)方法。 IMAC是近年来出现的应用很广的一种分离技术，它的作用原理是填料中的固相载体通过共价键螯合金属离子，某些金属离子作为配体能够结合具有组氨酸残基标记的蛋白质。 IMAC具有配体稳定、高蛋白吸附能力、洗脱条件温和、再生简单、成本低廉的特点，因此在蛋白纯化中应用广泛。

本发明的方法和系统中，第二亲和吸附柱 B 所使用的配体固定金属包括但不仅限于以下几种： Ni(II), Co(II), Cu(II), Fe(II) 和 Ζη(Π)。关于固定金属亲和柱现有技术中已有报道，固定金属亲和柱非常稳定，痕量的此类金属如果脱落也不会对人体造成伤害。

在本发明中，亲和吸附柱 Α和 Β中的载体可以是颗粒、纤维、大孔基质、膜或中空纤维，其中的颗粒优选是球形颗粒，例如琼脂糖、纤维素颗粒。本发明的方法和系统中所述的第一亲和吸附柱 A和第二亲和吸附柱 B 是串联连接。柱 A和柱 B各自可以是单柱，也可以是一组柱，例如二个或二个以上的柱并联。优选使用单柱或平行双柱。

本发明的血液净化方法和系统可用于治疗与血液有关的疾病，这些疾病包括但不限于由于自身抗体异常导致的疾病，例如系统性红斑狼疮、风湿性关节炎、血管球性肾炎和脉管炎、先天性血小板减少性紫癜、 IgG引起的自身免疫溶血性贫血、多发性硬化症、天疱疮、韦格内肉芽肿病、血小板无力症、肺出血肾炎综合征、系统性脉管炎、慢性脱髓鞘性神经炎、急性感染性多发性神经炎、重症肌无力扩张型心肌症、化疗引起的溶血性尿毒症、血友病、肾脏移植引起的白细胞抗原机能亢进、免疫球蛋白 E过高症候群等，以及由于血液中某些蛋白异常可能导致的疾病，例如高脂血症、动脉硬化症、透析相关性锭粉样变性、末期肾脏疾病、慢性肾衰竭、败血症、内毒素休克和艾滋病等等。特别是用于治疗高脂血症、动脉硬化症和自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、风湿性关节炎、天疱疮等。

试验结果表明，用本发明的方法进行治疗的患者其血液中的异常蛋白或抗体明显减少，由柱 A上脱落的配体 His(n)标记蛋白可被金属亲和柱 B吸附。因此可减少由此而产生的副作用。很显然，患者血液中异常蛋白的减少可使他们的临床症状得到明显改善。附图说明

下面参照附图进一步描述本发明的实施方案。

图 1是本发明的两步法亲和吸附血液净化系统简图。该系统包括血桨分离器、吸附柱 A和吸附柱 B，以及吸附剂的再生系统。图 1具体说明了使用两步亲和吸附法对患者的血浆进行血液净化的过程：患者血液通过导管流入血池 101，肝素 102或其他稳定的抗凝剂加入血池中，关于抗凝剂的加入可参考美国专利 4,614,513。血液通过导管 104流入血桨分离器 105，血浆与血细胞分离，所述血浆流入柱 A ( 113 ) ，柱 A中的吸附剂以蛋白为配体，优选以 His(n)标记的蛋白为配体。在柱 A中，发生亲和吸附反应，如抗原与抗体之间，通过亲和吸附移除血液中异常的致病分子。经过柱 A 净化的血浆流入柱 B ( 121 ) ，柱 B中的吸附剂是金属亲和树脂，能够吸附从柱 A中脱落的配体蛋白，特别是吸附脱落的 Hi_S(n)标记蛋白。当关闭阀门 108，打开阀门 109时，柱 A就进入再生状态，冲洗缓冲液由 111流入柱 A，打开阀门 114, 废液就流到废液池 115中，该池中液体可直接丢弃或进行分析。当关闭阀门 109，打开阀门 110时，缓冲液从 112中进入柱 A中平衡。阀门 1 14打开，缓冲液进入 115。柱 B的再生与此类似，用 118中的冲洗缓冲液清洗， 119中的缓冲液进行平衡，最终废液流到废液池 123中，泵 103与 125 控制血浆流速。通过两个柱子净化后的血浆进入混合小血池（127) 中与血细胞重新混合，最后输回到患者体内，控制器 128可以控制阀门 108, 109, 110, 114, 116， 117, 120, 122 和 124，如果不使用在线再生，也可以直接更换吸附剂。

图 2 是本发明另一血液净化系统简图，其中两种亲和吸附柱各自采用两个平行柱，即并联双柱。当柱 A1 ( 204) 净化时，柱 A2 ( 227 ) 再生；类似地，当柱 B1 ( 206) 净化时，柱 B2 ( 229 ) 再生，因此可提高净化效率。

图 2 具体描述了一个改进的血液净化系统用于治疗的过程。与图 1不同的是，此系统每一步吸附采用的都是平行柱，这可以大大增加血液净化效率。当柱 A1和柱 B1在进行净化操作时，柱 A2和柱 B2可以进行再生；反之，当柱 A2和柱 B2在进行净化操作时，柱 A1和柱 B 1可以再生。因此，此双柱系统可比单柱系统更快的完成血液净化过程。

如图所示，患者的血液经过血桨分离器后，血浆通过导管 106 进入柱 A1 (204), 在柱 A1中发生亲和反应，移除致病因子；从柱 A1流出的血桨流经柱 B1 , 净化后的血浆进入混合小血池（未显示）与血细胞混合后输回患者体内，泵 201和 203可控制压力保证血浆的流动，在柱 A1和柱 B1行使净化功能时，柱 A2和柱 B2可进行再生，再生过程与图 1中说明类似。

应用此系统对患者的血液进行净化时，可比图 1所描述的单柱系统更快的完成血液净化过程。

图 3 是 His6标记 protein A与非标记 protein A结合 IgG水平的比较。试验所用的商购 protein A 和对照 protein (HSA-人血清白蛋白）是由 Sigma 公司.购买， Protein A和 His6标记 protein A 按照实施例 1所述方法制备。具体实施方案

以下用实例举例说明本发明的方法、系统和治疗方法，但本发明并不限于以下应用。

实施例 1 柱 A配体 His6 标记 protein A的制备

本例旨在说明柱 A所用 His(n)标记配体蛋白的制备。并通过 IgG的结合力之功能测定对所制备的柱 A配体和无标记的天然 protein A (常规使用的配体）进行比较。为了符合柱 A所用配体蛋白的要求，所制备的标记 protein A中 His6不能影响该蛋白的活性并且可被柱 B的固定金属配体结合。试验表明， His6-protein A与 IgG的结合力和 protein A类似。

Protein A和 His6 protein A均可通过基因重组技术获得 (Sambrook J. Fritsch BF and Maniatis Τ·, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^nd. Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)。根据报道已知位于 protein A C-端的 His6 不会影响 protein A活性 (Poon and Hunt, "Reversible Immunoprecipitation Using Histidine- or Glutaththione-S-Transferase-Tagged Staphylococcal Protein A", Analytical Biochemistry 218 :26-331994)。

His6 标记 protein A，按照上述文献公开的方法制备。

通过 PCR方法构建编码 protein A 和 C-端 His6标记的 cDNA，克隆到载体 pET21b (Novagen公司），并且在 Escherichia coli BL21菌株 (DE3)中表达，异丙硫基- ( β ) -D-半乳糖苷 ( isopropylthio- β -D- galactoside, IPTG) 诱导表达，通过 Ni-NTA 树脂 (Qiagen公司）纯化 His6-protein A后连接到琼脂糖凝胶上。重组 protein A 的获得及连接到载体上的过程与前者类似。

测定 IgG结合能力采用如下方法。 10 ml protein A或 10 ml His6 protein A 与 50 ml 医学实验用的狗血清于 4 °C孵育 1 小时，缓冲液为 20 raM Tris-HCl(pH7.5)和 50 raM NaCl。用缓冲液冲洗，结合的 IgG洗脱后用抗狗 IgG抗体通过 ELISA方法定量（测定方法参见 H. Sato, T. Kidaka and M. Hori, "Leakage of Immobilized IgG from Therapeutic Immunoadsorpents", Applied Biochemistry and Biotechnology, 15 : 145-158 (1987))。如图三所示 His6 protein A具有与 protein A 相似的 IgG 结合能力，也就是说加入的组氨酸标记不会阻挡 protein A 与 IgG 的结合区域。

结果说明 His6 标记不影响 protein A 功能。实施例 2

此例旨在比较用常规的单柱层析法进行体外血液净化和用本发明的双柱串联层析法进行体外血液净化后 '系统性红斑狼疮（SLE)患者血浆中 IgG 水平与 His6-protein A的脱落情况。

SLE患者为一位 40岁的妇女，从患者体内取血 200ml，离心分离血浆与血细胞。各取 100ml血桨通过常规的单柱层析和本发明的双柱串联层析系统。单柱层析系统包括一个以实施例 1制备的 His6-pr₀tein A为吸附剂的的 75ml 柱；本发明的双柱串联层析系统包括一个与此相同的柱，以及一个 20ml金属亲和树脂 Ni-NTA柱 (Qiagen公司）（该柱的吸附剂是金属 Ni) 。血浆过柱后用酸性洗脱液和中性平衡缓冲液再生、重平衡柱子。根据净化需要，可对血浆进行多次净化。完成净化后，测定纯化血桨中 IgG和 His6-protein A的量。 IgG通过色谱法和免疫电泳方法测定，脱落的 His6-protein A用抗 protein A抗体和抗 His6抗体按照 ELISA方法测定（测定方法参见 H. Sato, T. Kidaka and M. Hori, "Leakage of Immobilized IgG from Therapeutic Immunoadsorpents", Applied Biochemistry and Biotechnology, 15 : 145-158 (1987) ) 。结果列于表一。

表一经过常规的单柱处理系统和本发明的双柱处理系统净化后 SLE患者血浆中抗体和 His6-Protein A 的含量

如表一所示，单柱层析和双柱串联层析在体外结合 IgG的能力相近，然而单柱层析系统处理后的血桨中 His6-protein A 明显高于双柱串联层析系统。实施例 3

本例旨在比较用常规的单柱系统和本发明的双柱亲和吸附血液净化系统净化后，狗血清中 IgG水平与 His6-protein A的脱落情况。

本实施例应用了图 2所示的双柱亲和吸附血液净化系统，其中柱 A和柱 B使用的吸附剂各自与实施例 2相同，柱 A体积为 150ml，柱 B为 40ml。而常规的单柱血液净化系统只包括柱 A。

实验动物为雄性、供医学实验用的狗，体重为 10-13公斤。狗全身麻醉后，血液从狗的后腿股动脉引出，进入血浆膜分离器。膜分离器将血液分成血球、血浆两部分，血桨以 30mL/min的速度流过柱 1系统（A1-B1双柱串联），柱 2系统（A2-B2双柱串联）关闭，运行 10分钟以后，关闭柱 1系统入口和出口，开启柱 2系统。 z柱 1系统进入洗脱、平衡过程，再生过程为先用酸性洗脱液洗去吸附的蛋白，再用平衡缓冲液平衡柱子。再生过程完毕后，开启柱 1系统入口，同时关闭柱 2系统入口。重复以上操作，每柱各切换 5次，经图 2所示装置处理后，纯化的血浆与血球混合后一同输回狗的后腿静脉。

系统运行 10分钟后开始取样测量。 IgG通过色谱法和免疫电泳方法测定，脱落的 His6-protein A用 ELISA方法测定，用于测量 His6-protein A抗体包括抗 protein A抗体和抗 His6抗体，测定方法如实施例 2所述。结果列于表二。

表二单柱和双柱系统处理后狗血浆中 IgG抗体和 His6-Protein A 的含量变化

如表二所示，与常的单柱吸附血液净化系统相比，通过双柱亲和吸附血液净化系统后的 His6-protein A配体脱落的数量大大地降低。

试验结果表明本发明的血液净化方法和系统使净化的血液中脱落配体的数量大大减少，因此可相应的减少由配体脱落引起的副作用，解决了血液净化治疗方法中所存在的难题。

以上已经详细描述了本发明的实施方案，对本领域技术人员来说很明显可以做很多改进和变化而不会背离本发明的基本精神。所有这些变化和改进都在本发明的范围之内，其特征由上述说明书确定。

Claims

权利要求

1. 通过亲和选择吸附进行血液净化的方法，该方法包括在净化吸附步骤之后加入吸附上一步骤吸附后又脱落的配体蛋白的步骤。

2. 按照权利要求 1的血液净化方法，该方法包括以下步骤：

(1)将血液或经过分离的血浆通过第一吸附 ¾ A，该柱的吸附剂以蛋白为配体，连接到某种载体上； .

(2)使柱 A净化的血液或血浆通过第二吸附柱 B，该柱以固定的金属离子为配体，能够吸附从柱 A脱落的蛋白。

3. 按照权利要求 2的血液净化方法，其中所述经过分离的血浆是使用血浆分离器分离的。

4. 按照权利要求 1或 2的血液净化方法，其中经过净化的血液可输回患者体内，净化后的血浆在与患者的血细胞混合后可输回患者体内。

5. 按照权利要求 2-4 任意一项的血液净化方法，其中所述柱 A 的配体蛋白是 His(n)标记的蛋白。 ^r

6. 按照权利要求 ' 1或 5的血液净化方法，其中所述的蛋白包括完整蛋白或多肽_;

7. 按照权利要求 6的血液净化方法，其中所述的蛋白可以是 protein A, protein C 或相关变体。

8. 按照权利要求 7的血液净化方法，其中所述的相关变体包括能与抗体结合任何蛋白抗原。

9. 按照权利要求 5的血液净化方法，其中所述的 His(n) 标记蛋白是体外合成的: 或是通过重组 DNA技术获得的。

10. 按照权利要求 5 的血液净化方法，其中所述 His(n)标记的位置位于蛋白 N-端、 C-端或其他不影响蛋白功能活性的任何位置。

11. 按照权利要求 1或 5的血液净化方法，其中所述的配体蛋白是抗体，所述白抗体可选自完整抗体、抗体片段、单链 Fv、 IgG 或 Ig A。

12. 按照权利要求 5或 11的血液净化方法，其中所述蛋白或抗体中的组氨酸歹

14. 按照权利要求 2的血液净化方法，其中所述柱 B中的金属离子选自 Ni⁺⁺ 、 Cu⁺⁺、 Co⁺⁺ 和 Zn⁺⁺。

15. 按照权利要求 2的血液净化方法，其中所述的每一步亲和吸附可各自独立 i! 使用单柱或平行双柱。

16. 一种血液净化系统，该系统包括以蛋白为配体的第一吸附柱 A，和以固定白金属离子为配体的第二吸附柱 B，且柱 A与柱 B串联连接。

17. 按照权利要求 16的血液净化系统，其中所述的血液净化系统还包括血浆离器。

18. 按照权利要求 16的血液净化系统，其中所述柱 A的配体蛋白是 His(n)标 ΐ 的蛋白。

19. 按照权利要求 16-18任意一项的血液净化系统，其中所述的蛋白包括完整 § 白或多肽。

20. 按照按照权利要求 19 的血液净化系统，其中所述的蛋白包括 protein A、 protein G或相关变体。

21. 按照按照权利要求 20的血液净化系统，其中所述的相关变体包括能与抗结合的任何蛋白抗原。

22. 按照按照权利要求 18的血液净化系统，其中所述的 His(n) 标记蛋白是体夕 I 合成的，或是通过重组 DNA技术获得的。

23. 按照权利要求 18的血液净化系统，其中所述 His (n) 的位置可以位于蛋 έ 的 Ν-端、 C-端或其他不影响蛋白功能活性的任何位置。

24. 按照权利要求 18 的血液净化系统，其中所述蛋白中的组氨酸残基数量至为 4。

25. 按照权利要求 24的血液净化系统，其中所述组氨酸残基数量为 6-10。

26. 按照权利要求 16-18任意一项的血液净化系统，其中所述的蛋白是抗体，戶) 述抗体选自完整抗体、抗体片段、单链 Fv、 IgG 或 Ig A。

27. 按照权利要求 16的血液净化系统，其中所述柱 B的金属离子选自 Ni⁺⁺ 、 Cu⁺⁺、 Co⁺⁺ 和 Zn⁺⁺。

28. 按照权利要求 16的血液净化系统，其中所述的吸附柱 A和 B可各自独立: ti 使用单柱或平行双柱。

29. 按照权利要求 1- 15任意一项的血液净化方法在血液净化中的应用。

30. 按照权利要求 16-28任意一项的血液净化系统在血液净化中的应用。