JP2001170501A - 乳清からのラクトフェリンアイソフォームの分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ラクトフェリンアイソフォームを高い効率に
て分離精製することができる工業的に有利な分離方法を
提供する。 【解決手段】 イオン交換体に乳清を接触させて、該乳
清に含有されるラクトフェリンアイソフォームをイオン
交換体に吸着させた後、溶離液により溶離する方法にお
いて、該イオン交換体が、粒子表面に親水性高分子層を
有し、且つ実質的に該親水性高分子層のみにイオン交換
基を有する多孔質粒子からなるものである乳清からのラ
クトフェリンアイソフォームの分離方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、乳清からのラクト
フェリンアイソフォームの分離方法に関するものであ
る。

【０００２】

【従来の技術】乳清とはスキムミルクおよび甘性ホエ
ー，酸性ホエー等のホエーを指し、特に牛乳由来の乳清
は乳製品の製造における副生成物として大量に提供され
る。乳清中には０．５〜２％程度の割合で蛋白質が含ま
れているが、その中に含有される主な成分は、β−ラク
トグロブリン，α−ラクトアルブミン及び血清アルブミ
ンであることから、これまでの乳清の利用方法は食品添
加物や家畜飼料等に限られていた。しかしながら、乳清
中には免疫グロブリン，ラクトペルオキシダーゼ，ラク
トフェリン，リゾチーム等、含有量は微量であるが、各
種生理活性を有する蛋白質が存在することから、これら
を分離精製し有効利用することが試みられている。

【０００３】特にラクトフェリンは鉄結合性の蛋白質で
あり、乳児や子牛の授乳において鉄を運搬する蛋白質と
して栄養学的に重要な働きを担っていること、及びその
鉄結合性の特性ゆえに鉄要求性の高い病原性細菌に対し
て強い抗菌作用を有することから栄養学的見地のみなら
ず感染予防の見地からも重要な乳蛋白質として知られて
いたが、近年の研究において、ラクトフェリンが抗菌作
用のみならず、過酸化脂質生成抑制作用、鉄吸収の調節
作用、免疫機能調節作用、細胞増殖作用、及び細菌感染
防御作用等などの有用な生理作用を有することが報告さ
れていることから、その分離精製に対する要求が高まっ
ている。

【０００４】更に、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．，７４
巻，ｐ１４３９−１４４４（１９９１）や、Ｎｅｔｈ．
Ｍｉｌｋ Ｄａｉｒｙ Ｊ．，４５巻，ｐ２７３−２８
０（１９９１）、Ｔｈｅ ４ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ
ｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｌａｃｔｏｆ
ｅｒｒｉｎ，Ｐｒｏｇｒａｍ ａｎｄ Ａｂｓｔｒａｃ
ｔｓ，ｐ６１（１９９９）等において牛ラクトフェリン
には糖鎖結合数の異なるａ，ｂのアイソフォームが存在
すること、またａ体とｂ体では抗菌活性に差があり、ａ
体が抗菌活性に優れることが明らかとなっている。しか
し、ラクトフェリンは初乳には比較的多く含まれている
ものの、常乳中の含量は少なく、例えば牛乳１Ｌ中のラ
クトフェリン含量は１００ｍｇ程度と微量であることか
ら、その分離精製には高度な技術が必要であり、更にラ
クトフェリンアイソフォームの分離精製には特に高度な
技術が必要となる。

【０００５】例えば、特開昭６２−１９５２３号公報に
はホエ−の濃縮液を陽イオン交換体に通液し、リン酸緩
衝液で洗浄後、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液
でラクトフェリンを溶出させる方法、また特開昭６３−
１５２４００号公報には脱脂乳を陽イオン交換体と混
合、攪拌後、樹脂をカラムに充填し、水洗後、１．５〜
１２％塩類溶液にて脱離する方法が開示されている。ま
た、ラクトフェリンと親和性の強い物質をカラムに固定
化し、アフィニティクロマトグラフィーにより分離する
方法も試みられている。例えば、ヘパリン（特開昭６３
−２５５２９９号公報）、ラクトフェリンに対するモノ
クロナール抗体（特開昭６１−１４５２００号公報）お
よび硫酸エステル化物（特開昭６３−２５５３００号公
報）などをクロマトグラフィー用の支持体に固定化し、
ラクトフェリンを含む乳原料と接触させ、吸着したラク
トフェリンを０．５〜１．０Ｍの塩化ナトリウムで溶出
させる方法等である。しかしながらこれらの方法によっ
ては、ラクトフェリンとしての分離は可能となるもの
の、そのアイソフォームの分離については未検討であっ
た。

【０００６】また、前述のＪ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．，
７４巻，ｐ１４３９−１４４４（１９９１）や、Ｎｅｔ
ｈ．Ｍｉｌｋ Ｄａｉｒｙ Ｊ．，４５巻，ｐ２７３−
２８０（１９９１）、Ｔｈｅ ４ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｌａｃｔ
ｏｆｅｒｒｉｎ，Ｐｒｏｇｒａｍ ａｎｄ Ａｂｓｔｒ
ａｃｔｓ，ｐ６１（１９９９）等においては用いられた
充填剤の分離性能が不充分であり、高い効率でラクトフ
ェリンアイソフォームを分離精製することができなかっ
た。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ラクトフェ
リンアイソフォーム（ａ体及びｂ体）を高い効率にて分
離精製する方法を提供することを目的とするものであ
る。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、液体クロ
マトグラフィー法による分離方法につき種々検討した結
果、特定構造のイオン交換体を使用することにより、ラ
クトフェリンアイソフォームを非常に効率良く分離精製
することが可能となることを見い出し、本発明に到達し
た。即ち本発明は、イオン交換体に乳清を接触させて、
該乳清に含有されるラクトフェリンアイソフォームをイ
オン交換体に吸着させた後、溶離液により溶離する方法
において、該イオン交換体が、粒子表面に親水性高分子
層を有し、且つ実質的に該親水性高分子層のみにイオン
交換基を有する多孔質粒子からなるものであることを特
徴とする乳清からのラクトフェリンアイソフォームの分
離方法に存する。

【０００９】

【発明の実施の形態】以下、本発明につき詳細に説明す
る。本発明に用いられるイオン交換体は、粒子表面に親
水性高分子層を有し、且つ実質的に該親水性高分子層の
みにイオン交換基を有する多孔質粒子からなるものであ
る。該イオン交換体を構成する多孔質粒子の多孔質構造
とは、水銀ポロシメーターにより測定した最頻度細孔径
が、通常２〜１０００ｎｍの範囲にあるものを指す。該
多孔質粒子は親水性、疎水性の何れも用いうる。但し、
ラクトフェリンアイソフォームのａ体およびｂ体はその
構造差において糖鎖結合数が１つ異なるのみであり、こ
の構造差に起因する僅かの等電点差によってａ体および
ｂ体を分離する必要がある。このような場合、多孔質粒
子表面を被覆する親水性高分子層の種類および層の厚み
によっては該多孔質粒子の疎水性によりラクトフェリン
との望ましくない相互作用を及ぼし、純粋なイオン交換
相互作用を妨害する可能性があることから多孔質粒子自
体が親水性であることが好ましい。

【００１０】親水性の多孔質粒子としては、具体的に
は、デキストラン、セルロース、キトサン、グルコマン
ナン等の天然高分子系多孔質粒子や（メタ）アクリル酸
エステル、（メタ）アクリルアミド等の親水性多孔質架
橋共重合体粒子等が挙げられるが、特に工業的に高い効
率にてラクトフェリンアイソフォームの分離精製を行う
場合には高流速での通液が必要なことから、機械的強度
に優れた（メタ）アクリル酸エステル親水性多孔質架橋
共重合体粒子が好適に用いられる。疎水性の多孔質粒子
としては、例えば、ポリ（スチレン−ジビニルベンゼ
ン）多孔質粒子が挙げられる。本発明において、イオン
交換体を構成する多孔質粒子は、その表面に親水性高分
子層を有し、実質的に該親水性高分子層のみにイオン交
換基を有するものである。

【００１１】親水性高分子層を構成する親水性高分子と
は、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基、水酸
基、アミノ基、アミド基等の親水性基を有するものであ
り、例えば、デキストラン及びそのカルボキシル化物、
スルホン化物、リン酸化物、アミノ化物、アミド化物等
の誘導体、アガロース及びそのカルボキシル化物、スル
ホン化物、リン酸化物、アミノ化物、アミド化物等の誘
導体、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチル
セルロース等のセルロース誘導体、コンドロイチン硫
酸、ヒアルロン酸、ヘパリン等のムコ多糖類、等の天然
高分子及びその誘導体、また、（メタ）アクリル酸ヒド
ロキシエチル、（メタ）アクリル酸２，３−ジヒドロキ
シプロピル、（メタ）アクリル酸グリコシルエチル、ビ
ニルアルコール、（メタ）アクリルアミド、ビニルピロ
リドン、（メタ）アクリル酸、イタコン酸、２−アクリ
ルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、ｐ−スチレ
ンスルホン酸、ビニルスルホン酸、（メタ）アクリル酸
ジメチルアミノエチル、（メタ）アクリル酸ジエチルア
ミノエチル、ビニルアミン、ビニルピリジン、ジアリル
ジメチルアンモニウムクロリド、塩酸アリルアミン、等
を単量体単位とする（共）重合体及びそれらのカルボキ
シル化物、スルホン化物、リン酸化物、アミノ化物、ア
ミド化物等の誘導体が挙げられ、更に該親水性高分子に
イオン交換基が存在しない場合には後反応によりイオン
交換基が導入される。

【００１２】上述のイオン交換体の具体例としては例え
ば、特開平１−３１０７４４号公報に開示される分離材
料のうち、イオン交換基を有するポリマーを用いたも
の、特開平３−１７９２５８号公報に開示される疎水性
架橋重合体粒子の表面がカルボキシル基を持つ重合体で
被覆された液体クロマトグラフィー充填剤、特開平３−
１７９２５９号公報に開示される疎水性架橋重合体粒子
の表面が水酸基を持つ重合体で被覆された液体クロマト
グラフィー充填剤に対し、公知の方法でイオン交換基を
導入したもの、特開平７−８８３６６号公報に開示され
る分離剤のうち、重合性ビニル単量体（Ｃ）として水酸
基等の親水基を有する重合性ビニル単量体や、イオン交
換基を有する重合性ビニル単量体を共重合させ、該多孔
質粒子の表面に親水性高分子層を導入したもの、および
重合性ビニル単量体（Ｃ）としてイオン交換基を後反応
により導入可能である重合性ビニル単量体を共重合さ
せ、公知の方法でイオン交換基を導入することにより該
多孔質粒子の表面に親水性高分子層を導入したもの、お
よび特開平７−１７１３８９号公報に開示される分離剤
のうち、重合性ビニル単量体（Ｃ）として水酸基等の親
水基を有する重合性ビニル単量体や、イオン交換基を有
する重合性ビニル単量体を共重合させ、該多孔質粒子の
表面に親水性高分子層を導入したもの、および重合性ビ
ニル単量体（Ｃ）としてイオン交換基を後反応により導
入可能である重合性ビニル単量体を共重合させ、公知の
方法でイオン交換基を導入することにより該多孔質粒子
の表面に親水性高分子層を導入したもの等が挙げられ
る。

【００１３】上記した中でも好ましい例としては、特開
平７−８８３６６号公報に開示される分離剤のうち、重
合性ビニル単量体（Ｃ）として水酸基等の親水基を有す
る重合性ビニル単量体や、イオン交換基を有する重合性
ビニル単量体を共重合させ、該多孔質粒子の表面に親水
性高分子層を導入したもの、および重合性ビニル単量体
（Ｃ）としてイオン交換基を後反応により導入可能であ
る重合性ビニル単量体を共重合させ、公知の方法でイオ
ン交換基を導入することにより該多孔質粒子の表面に親
水性高分子層を導入したもの、および特開平７−１７１
３８９号公報に開示される分離剤のうち、重合性ビニル
単量体（Ｃ）として水酸基等の親水基を有する重合性ビ
ニル単量体や、イオン交換基を有する重合性ビニル単量
体を共重合させ、該多孔質粒子の表面に親水性高分子層
を導入したもの、および重合性ビニル単量体（Ｃ）とし
てイオン交換基を後反応により導入可能である重合性ビ
ニル単量体を共重合させ、公知の方法でイオン交換基を
導入することにより該多孔質粒子の表面に親水性高分子
層を導入したものが挙げられる。

【００１４】また、本発明に用いられるイオン交換体は
陰イオン交換体、陽イオン交換体の何れも用いうるが、
ラクトフェリンの等電点が９〜１０であることからカル
ボキシル基、リン酸基およびスルホン酸基等を有する陽
イオン交換体が好ましく用いられる。さらに、工業的に
高い効率にてラクトフェリンを分離精製するためには高
い吸着量が得られることから、特に好ましくはスルホン
酸基を有する陽イオン交換体が用いられる。導入される
陽イオン交換基の量としては、乾燥樹脂重量１ｇあたり
通常、０．０５〜１．５ミリ当量、好ましくは０．２〜
１．２ミリ当量である。なお、イオン交換基を後反応に
より導入した場合、多孔質粒子の組成及びイオン交換基
導入反応条件によっては該多孔質粒子の表面を被覆する
親水性高分子層のみならず多孔質粒子の一部にもイオン
交換基が導入される場合があるが、本発明はこの場合を
も含むものであり、実質的に該親水性高分子層のみにイ
オン交換基を有することが本発明の構成要素として重要
である。

【００１５】本発明において用いられるイオン交換体の
平均粒子径については、ラクトフェリンアイソフォーム
を高い効率にて分離する必要を勘案すると小さい方が好
ましい。一方、工業的な実用性を勘案すると通液に伴う
圧力上昇等の問題から大きいことが好ましく、総合的に
判断すると平均粒子径は、３〜１５０μｍが好適に用い
られ、好ましくは５μｍ以上９０μｍ未満、特に好まし
くは１０μｍ以上４０μｍ未満が好適に用いられる。ま
た、更にはその粒径分布は狭いことが好ましい。これら
上述の要素を満たすイオン交換体の具体例としては、
Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，７６３巻，ｐ５７（１
９９７）に記載される細孔径１００ｎｍのポリメタクリ
レート系親水性多孔質粒子の表面に親水性高分子層を有
し、実質的に該高分子層のみに官能基として陽イオン交
換基であるスルホプロピル基（スルホン酸基）を乾燥樹
脂重量１ｇあたり０．３ミリ当量有する「ＭＣＩ ＧＥ
ＬＰｒｏｔＥｘ−ＳＰ（三菱化学株式会社製）」や、Ｔ
ｈｅ ５０ｔｈ Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ Ｃｏｎｆｅｒ
ｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｘｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｎＡｎａ
ｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ａｐｐ
ｌｉｅｄ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ａｂｓｔｒａｃ
ｔｓ，１７００Ｐ（１９９９）に記載されるスルホプロ
ピル基（スルホン酸基）を有するするイオン交換体が挙
げられる。

【００１６】本発明は、上記イオン交換体に乳清を接触
させて、該乳清に含有されるラクトフェリンアイソフォ
ームをイオン交換体に吸着させた後、溶離液により溶離
する。乳清中に含まれるラクトフェリンアイソフォーム
の含有量は、通常、１リットルあたり１０〜１００ｍｇ
程度である。乳清をイオン交換体に接触させる方法とし
ては、バッチ法及びカラム通液法の何れも可能である
が、工業的有用性を考慮するとカラム通液法が好まし
い。また、カラム通液法を用いて該イオン交換体に吸着
されたラクトフェリンアイソフォームを溶離液により溶
離する際の通液速度は、通常、単位時間当たり該イオン
交換体体積の０．１〜１００倍程度である。

【００１７】本発明において用いられる溶離液のｐＨに
ついては、乳清蛋白質中の含有率において主なものであ
るβ−ラクトグロブリンの等電点が５．２、α−ラクト
アルブミンの等電点が４．４、血清アルブミンの等電点
が４．９であること、これらの蛋白質が陽イオン交換体
に吸着しないｐＨであること、ラクトフェリンアイソフ
ォームの等電点が９〜１０であること、陽イオン交換体
に充分に吸着するためには用いられる溶離液は等電点よ
り１以上低いｐＨであることが好ましいことから、５．
２〜８．０であることが好ましい。

【００１８】更に、本発明において用いられる溶離液に
おいては、乳清中に微量に含まれる免疫グロブリンがイ
オン交換体に吸着する場合があることから、溶離液通液
中の免疫グロブリンの安定性を保つために塩類を含むこ
とが好ましい。塩類としては、塩化ナトリウム、塩化カ
リウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム等、酢酸ナ
トリウム、酢酸アンモニウム等、クエン酸ナトリウム、
クエン酸アンモニウム等、リン酸ナトリウム、リン酸ア
ンモニウム等、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム等、
が挙げられる。また、ラクトフェリンを分離精製するた
めには溶離液中の塩濃度を変化させることが必要とな
り、その塩濃度が０．００１〜２ｍｏｌ／Ｌであること
が好ましい。なお、溶離液中の塩濃度を変化させる方法
としてはステップワイズグラジエント法およびリニアグ
ラジエント法の何れも用いることができる。

【００１９】

【実施例】次に、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明するが、本発明はその要旨を越えない限り以下の実
施例によって限定されるものではない。

【００２０】実施例１ 親水性多孔質粒子としてメタアクリル酸エステル架橋共
重合体粒子を用い、その表面を被覆する親水性高分子層
を有し、実質的に該高分子層のみに官能基として陽イオ
ン交換基であるスルホン酸基を有するイオン交換体とし
て「ＰｒｏｔＥｘ−ＳＰ」（平均粒子径３０μｍ、最頻
度細孔径１００ｎｍ、交換容量０．３ｍｅｑ／ｇ、三菱
化学株式会社製）を用い、内径１．５ｃｍのオープンク
ロマト用ガラスカラムに充填した。長さは１１ｃｍであ
った。牛ホエーについてはホルスタイン種の常乳を脱脂
し、塩酸にてｐＨを４．７に調整しカゼインを除去した
酸性ホエーを水酸化ナトリウムにてｐＨを６．８に再調
整し、沈殿物を除去したものを用いた。得られた牛ホエ
ー５００ｍｌを該陽イオン交換体の充填されたカラムに
流速０．４ｍｌ／ｍｉｎで、負荷し、次に０．２ＭのＮ
ａＣｌを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）を通
液し、ＵＶモニターＩＩ型（アトー社製）にて波長２８
０ｎｍでの吸光度が０．０１ＡＵ以下になるまで該陽イ
オン交換体に吸着しない成分を洗浄した。

【００２１】続いて該陽イオン交換体に吸着したラクト
フェリンアイソフォームの分離精製を実施した。０．２
ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
７）と０．６ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．７）各２５０ｍｌを用いて合計５００ｍｌの
溶離液を、流速０．４ｍｌ／ｍｉｎにて、ＮａＣｌ濃度
０．２Ｍから０．６Ｍへのリニアグラジエント通液を行
い、カラムからの溶離液を１０ｍｌ毎に分取した。分取
された溶離液の溶離容量２００ｍｌから４００ｍｌまで
の波長２８０ｎｍでの吸光度を図１に示す。溶離容量２
７０ｍｌ（ＮａＣｌ濃度約０．３８Ｍ）をピークトップ
とするラクトフェリンａ体および溶離容量３２０ｍｌ
（ＮａＣｌ濃度約０．４２Ｍ）をピークトップとするラ
クトフェリンｂ体が分離されていることが分かる。牛ホ
エー５００ｍｌからの総ラクトフェリン回収量は３７．
９ｍｇであった。

【００２２】比較例１ 陽イオン交換基としてカルボキシメチル基を有する親水
性ビニルポリマー系イオン交換体として、市販品である
ＣＭ−トヨパール６５０Ｍ（粒子径４０〜９０μｍ、東
ソー株式会社製）を用い、内径１．５ｃｍのオープンク
ロマト用ガラスカラムに充填した。長さは１８ｃｍであ
った。なお、このイオン交換体はＪ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃ
ｉ．，７４巻，ｐ１４３９−１４４４（１９９１）や、
Ｎｅｔｈ．Ｍｉｌｋ Ｄａｉｒｙ Ｊ．，４５巻，ｐ２
７３−２８０（１９９１）、Ｔｈｅ ４ｔｈ Ｉｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｌ
ａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ，Ｐｒｏｇｒａｍ ａｎｄ Ａｂ
ｓｔｒａｃｔｓ，ｐ６１（１９９９）にて用いられたも
のである。

【００２３】牛ホエーからのラクトフェリンアイソフォ
ーム分離精製については実施例１と同様に行い、カラム
からの溶離液を７ｍｌ毎に分取した。分取された溶離液
の溶離容量２００ｍｌから４００ｍｌまでの波長２８０
ｎｍでの吸光度を図１に示す。溶離容量２５６ｍｌ（Ｎ
ａＣｌ濃度約０．３７Ｍ）にラクトフェリンａ体に由来
するショルダーピークが認められるが、溶離容量２８４
〜２９１ｍｌ（ＮａＣｌ濃度約０．４０Ｍ）をピークト
ップとするラクトフェリンｂ体との分離は不充分である
ことが分かる。牛ホエー５００ｍｌからの総ラクトフェ
リン回収量は３６．７ｍｇであった。

【００２４】実施例２ 親水性多孔質粒子としてメタアクリル酸エステル架橋共
重合体粒子を用い、その表面を被覆する親水性高分子層
を有し、実質的に該高分子層のみに官能基として陽イオ
ン交換基であるスルホン酸基を有するイオン交換体とし
て「ＰｒｏｔＥｘ−ＳＰ」（平均粒子径３０μｍ、最頻
度細孔径１００ｎｍ、交換容量０．３ｍｅｑ／ｇ、三菱
化学株式会社製）を用い、内径１．６ｃｍのＨＰＬＣ用
ガラスカラムに充填した。長さは１２ｃｍであった。牛
ホエーについてはホルスタイン種の常乳を脱脂し、塩酸
にてｐＨを４．７に調整しカゼインを除去した酸性ホエ
ーを孔径０．４５μｍのメンブレンフィルタにて濾過し
たものを用いた。

【００２５】得られた牛ホエー２４０ｍｌをＨＰＬＣポ
ンプＬＣ−６Ａ（島津製作所製）にて流速２．０ｍｌ／
ｍｉｎにて該陽イオン交換体の充填されたカラムに負荷
し、次に２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を流速
２．０ｍｌ／ｍｉｎにて１２０ｍｌ通液し、該陽イオン
交換体に吸着しない成分を洗浄した。続いて該陽イオン
交換体に吸着したラクトフェリンアイソフォームの分離
精製を実施した。２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
と１．０ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）を用い、ＨＰＬＣポンプＬＣ−６Ａ（島津製
作所製）２台による高圧グラジエント装置にて流速２．
０ｍｌ／ｍｉｎにて２４０分間でＮａＣｌ濃度０〜１．
０Ｍのリニアグラジエント通液を行い、カラムからの溶
離液をフラクションコレクターにて６ｍｌ毎に分取し
た。分取された各フラクションに含まれるラクトフェリ
ン含有量は以下のようにして求めた。ＨＰＬＣポンプＬ
Ｃ−１０ＡＳ（島津製作所製）２台による高圧グラジエ
ント装置および紫外検出器ＳＰＤ−１０Ａ（島津製作所
製）によるＨＰＬＣシステムを用い、分析用ＨＰＬＣカ
ラムとして「ＭＣＩ ＧＥＬ ＰｒｏｔＥｘ−ＳＰ（平
均粒子径５μｍ、内径４．６ｍｍ、長さ５０ｍｍ、三菱
化学株式会社製）」、溶離液は２０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）と１．０ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて流速０．５ｍｌ／ｍ
ｉｎにて３０分間でＮａＣｌ濃度０〜１．０Ｍのリニア
グラジエント通液を行い、ラクトフェリン含有量分析を
行った。

【００２６】シグマ社製牛ラクトフェリン（品番Ｌ−４
７６５）を標品として各種濃度のラクトフェリン溶液を
注入量１０μｌにて分析し、吸光度２８０ｎｍでのラク
トフェリンピークの面積値から検量線を作成した。次い
で各フラクションを注入量１０μｌにて分析し、ラクト
フェリンピークの面積値と検量線との比較により各フラ
クションの濃度を求め、更にラクトフェリン含有量を求
めた。フラクション番号５１番から６５番までのラクト
フェリン含有量を図２に示す。フラクション番号５５番
（ＮａＣｌ濃度約０．６９Ｍ）をピークトップとするラ
クトフェリンａ体およびフラクション番号６０番（Ｎａ
Ｃｌ濃度約０．７５Ｍ）をピークトップとするラクトフ
ェリンｂ体が分離されていることが分かる。牛ホエー２
４０ｍｌからの総ラクトフェリン回収量は１１．７ｍｇ
であった。

【００２７】実施例３ 親水性多孔質粒子としてメタアクリル酸エステル架橋共
重合体粒子を用い、その表面を被覆する親水性高分子層
を有し、実質的に該高分子層のみに官能基として陽イオ
ン交換基であるスルホン酸基を有するイオン交換体とし
て「ＰｒｏｔＥｘ−ＳＰ」（平均粒子径３０μｍ、最頻
度細孔径１００ｎｍ、交換容量０．３ｍｅｑ／ｇ、三菱
化学株式会社製）を用い、内径１．６ｃｍのＨＰＬＣ用
ガラスカラムに充填した。長さは１２ｃｍであった。牛
ホエーについてはホルスタイン種の常乳を脱脂し、塩酸
にてｐＨを４．７に調整しカゼインを除去した酸性ホエ
ーを孔径０．４５μｍのメンブレンフィルタにて濾過し
たものを用いた。

【００２８】得られた牛ホエー３６０ｍｌをＨＰＬＣポ
ンプＬＣ−６Ａ（島津製作所製）にて流速３．０ｍｌ／
ｍｉｎにて該陽イオン交換体の充填されたカラムに負荷
し、次に２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を流速
３．０ｍｌ／ｍｉｎにて１８０ｍｌ通液し、該陽イオン
交換体に吸着しない成分を洗浄した。続いて該陽イオン
交換体に吸着したラクトフェリンアイソフォームの分離
精製を実施した。２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）
と１．０ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．５）を用い、ＨＰＬＣポンプＬＣ−６Ａ（島津製
作所製）２台による高圧グラジエント装置にて流速２．
０ｍｌ／ｍｉｎにて２４０分間でＮａＣｌ濃度０〜１．
０Ｍのリニアグラジエント通液を行い、カラムからの溶
離液をフラクションコレクターにて６ｍｌ毎に分取し
た。分取された各フラクションに含まれるラクトフェリ
ン含有量は実施例２と同様に求めた。フラクション番号
４０番から７０番までのラクトフェリン含有量を図３に
示す。 フラクション番号５４番（ＮａＣｌ濃度約０．
６８Ｍ）をピークトップとするラクトフェリンａ体およ
びフラクション番号５９番（ＮａＣｌ濃度約０．７４
Ｍ）をピークトップとするラクトフェリンｂ体が分離さ
れていることが分かる。牛ホエー３６０ｍｌからの総ラ
クトフェリン回収量は２０．０ｍｇであった。

【００２９】

【発明の効果】本発明方法により、特定の構造を有する
イオン交換体を用いることにより、ラクトフェリンアイ
ソフォームを高い効率にて分離精製することができ、工
業的に極めて有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１及び比較例１において分取された溶離
液のラクトフェリンに由来する波長２８０ｎｍの吸光度
を示すグラフ。

【図２】実施例２における分取された各フラクション中
のラクトフェリン含有量を示すグラフ。

【図３】実施例３における分取された各フラクション中
のラクトフェリン含有量を示すグラフ。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 イオン交換体に乳清を接触させて、該乳
   清に含有されるラクトフェリンアイソフォームをイオン
   交換体に吸着させた後、溶離液により溶離する方法にお
   いて、該イオン交換体が、粒子表面に親水性高分子層を
   有し、且つ実質的に該親水性高分子層のみにイオン交換
   基を有する多孔質粒子からなるものであることを特徴と
   する乳清からのラクトフェリンアイソフォームの分離方
   法。
2. 【請求項２】 多孔質粒子が親水性多孔質粒子である請
   求項１記載のラクトフェリンアイソフォームの分離方
   法。
3. 【請求項３】 親水性多孔質粒子が（メタ）アクリル酸
   エステル架橋共重合体からなるものである請求項２に記
   載のラクトフェリンアイソフォームの分離方法。
4. 【請求項４】 多孔質粒子の平均粒子径が３〜１５０μ
   ｍである請求項１〜３に記載のラクトフェリンアイソフ
   ォームの分離方法。
5. 【請求項５】 イオン交換基が陽イオン交換基である請
   求項１〜４のいずれかに記載のラクトフェリンアイソフ
   ォームの分離方法。
6. 【請求項６】 溶離液のｐＨが５．２〜８．０である請
   求項１〜５に記載のラクトフェリンアイソフォームの分
   離方法。
7. 【請求項７】 溶離液が塩類を含む溶離液であり、その
   塩濃度が０．００１〜２ｍｏｌ／Ｌであるラクトフェリ
   ンアイソフォームの分離方法。