JPS63255299A - 乳からラクトフエリンを分離、精製する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産栗上坐剋■立！ 本発明は、種々の生理的活性を有し、薬理学的にも重要
な乳蛋白質であるラクトフェリンを、それを含有する乳
から有効に分離、精製する方法に関する。

′とその−占 ラクトフェリンは、乳等の外分泌液中に存在する鉄結合
性の糖蛋白質であって、病原性細菌に対する静菌作用、
白血球の分化調節作用及び殺菌力増強作用、リンパ球の
増殖作用及び鉄吸収調節作用等の種々の生理的活性を有
するため、栄養学的のみならず薬理学的にも重要な乳蛋
白質であるといえる。

したがって、従来からも乳からラクトフェリンを分離、
精製する方法が検討されてきたが、ラクトフェリンは非
常に反応性に冨んだ分子構造を有する蛋白質であり、か
つ他の乳蛋白質とも相互作用を示すため、高純度のラク
トフェリンを、簡易な操作により高収率で分離、精製す
るのが困難とされていた。

従来、乳からラクトフェリンを分離、精製する方法とし
て、例えば、脱脂した乳に塩酸を加えｐＨを調整するこ
とによりカゼインを等電沈澱させて除去し、得られたホ
エーを限外濾過、または塩析により？１ｍしてそのｐＨ
を７．０に調整し、かつイオン強度を塩化ナトリウムで
０．１５Ｍに調整した後、イオン交換樹脂に通してラク
トフェリンを分離、精製する方法（特開昭６２−１９５
２３号）、同様にしてカゼインを除去して得られたホエ
ーを限外濾過などにより処理して、シリカ粒子のような
固体担体に通してラクトフェリンを分離、精製する方法
（特開昭５８−２８２３３号）及び上記イオン交換樹脂
に通した後、更に金属キレートアフィニティークロマト
グラフィーにより処理する方法〔河方則裕「日医大誌Ｊ
　５１，４２６（１９８４））等が提案されている。

しかし、これらの方法はいずれも操作が煩雑であるため
、ラクトフェリンの回収率も著しく低下することが避け
られず、加うるに、分離、精製に長時間を要するという
問題がある。更に、これらの方法では、ラクトフェリン
を分離、精製した後に得られる残留分に含まれるラクト
フェリン以外の乳蛋白質やその他の乳成分を回収して再
利用することが実際上不可能であるため、実用性に乏し
いといえる。

一方、最近に、前述したようにして原料乳からカゼイン
を除去したホエーを、０．０５Ｍ食塩を含む５１のベロ
ナール緩衝液（ｐＨ７，４）に透析した後、ラクトフェ
リンと生物学的親和性をもつヘパリンをセファロース（
ファルマシア社製）に固定化したアフィニティーカラム
に通液してラクトフェリンを分離、精製する方法ＣＢ１
ａｃｋｂｅｒｇ、　Ｌ、ｅｔ、ａｌ［エフイービーニス
　レターズＪ　　（ＦＥＢＳＬＩＩＪＴＴ、＞　１０９
，１８０　（１９８０）］が報告された。しかし、この
方法のようにアガロース系のクロマトグラフィー用担体
を用いて、工業規模で大容量の乳を通液する場合、自重
と通液の高流速のために担体の圧密化が起って通液が不
可能となり、加うるに操作後の洗浄性が悪いため製造ラ
インの保守衛生管理も不十分になるという問題がみられ
る。また、市販のヘパリンセファロースは高価な担体で
あるため、ラクトフェリンの製造コストにも大きく影響
する。

日が解゛　しようとする諜 本発明は、畝上の状況に鑑みなされたものであって、工
業的規模でも通液可能な硬質担体から成るカラムを利用
して、簡易な操作により、乳からラクトフェリンを高純
度且つ高収率で効果的に分離、精製するための方法を提
供することを課題とする。

以下本発明の詳細な説明する。

光ユ旦遺底 本発明の特徴は、ヘパリンを、架橋型セルロースもしく
は架橋型キトサンからなる硬質担体に固定化して成るア
フィニティーカラムに、ラクトフェリン含有原料乳を通
してラクトフェリンを吸着させ、次いで吸着ラクトフェ
リンを分離して精製することにある。

ｉ　を　°するための 本発明は、上述のように、ラクトフェリンと生物学的親
和性を有する、強酸性のムコ多糖であるヘパリンを特定
な硬質担体に固定化して成るアフィニティーカラムを用
いることにより、原料乳の該カラムへの１回の通液で乳
からラクトフェリンを高純度、高収率で分離、精製し得
るものである。

ここで硬質担体として用いる架橋型セルロースはアミノ
基を有する硬いセルロースゲルであって、“アミノーセ
ルロファイン”の商品名で市販されており、また、架橋
型キトサンはアミノ基を有する架橋タイプのキトサンビ
ーズであって、′キトパール°の商品名で市販されてい
る。これらはいずれも多孔性である。

本発明では、上記の硬質担体にヘパリンを下記に示す方
法で固定化したものをアフィニティーカラムとして用い
る。

ヘパリンの上記硬質担体への固定化： ヘパリンの還元末端を利用して固定化する方法と、ヘパ
リンのカルボキシル基を利用して固定化する方法がある
。

（イ）ヘパリンの還元末端を利用する方法としては、硬
質担体を水洗し濾過した後に、担体と同量乃至２倍量の
０．０５Ｍ〜０．２Ｍ食塩を含む０．０１６〜０．２Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ５〜９）に溶カルたヘパリンを混合
し、さらに還元剤として水素化シアノホウ酸ナトリウム
、ジメチルアミンポラン或は水素化ホウ素ナトリウムを
ヘパリンの１７５０〜１７２量添加して３０℃以上、好
ましくは６０℃で１〜３日間振とうして固定化する。次
いで、十分に水洗してヘパリン固定化担体が得られる。

ヘパリンの固定化量は１〜５０ｍｇ／ａ＋　ｌ担体であ
る。

（ロ）ヘパリンのカルボキシル基を利用する方法として
は、蒸留水で５〜１００＋＋＋ｇ／ｍ　ｌの濃度になる
ように溶かしたヘパリン溶液を、ＩＮ塩酸でｐＨｓ、ｓ
以下、好ましくはｐｉ　５以下に調整したものに、水洗
し濾過した担体をヘパリン溶液に対して１／１０乃至同
量前え、さらにＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）−カルボジイミドヒドロクロライド
）のような縮合剤をヘパリンの１／１００〜１７１０量
加えて、４℃で１時間以上、好ましくは一夜振とうを行
う。次いで、水洗して未固定化のヘパリンや縮合剤を除
いてヘパリン固定化担体が得られる。ヘパリンの固定化
量は１〜５０ａ＋ｇ／ｎ　ｌ担体である。

ただし１．上記カルボキシル基を利用する固定化では、
ヘパリンはｐ）１５以下もしくはｐ）ｌ　１０以上で加
水分解されるので、ヘパリンの生理活性を維持する観点
からは、前記の還元末端を利用する固定化が好ましい。

このようにして得られるヘパリン固定化担体が高流速の
通液においても圧密化が起らないことは下記実験結果か
ら認めることができる。

実験方法： 耐圧性カラム（直径８ｍｍ、長さ５０＋＊ｍ）に、市販
のアミノーセルロファイン並びにキトバールの各２ｔａ
ｌｌと、比較として市販のセファロース（Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ）ＣＬ−６８２ａｌｔをそれぞれ充填し、この各
カラムに脱脂乳を通液して圧力の上昇を測定した。

その結果、セファロースでは流量３麟ｊ！　／ｓｉｎ、
以上で急激な圧力上昇がみられ圧密化したのに対し、ア
ミノーセルロファイン並びにキトバールでは流量２０ｔ
ａ　Ｉｔ　／ａｋｉｎ、以上でも圧密化は起らなかった
。

次に、上述のようにしてヘパリンを不溶性の硬質担体に
固定化して成るアフィニティーカラムを用いて、乳から
ラクトフェリンを分離、精製するには、該アフィニティ
ーカラムに、ラクトフェリンを含有する原料乳を６０℃
以下の温度、好ましくは室温で適当量通液して、カラム
に対する非吸着画分を溶出させた後、カラムを０．３Ｍ
食塩水もしくは０．３Ｍ食塩を含む０．０１〜０．２Ｍ
のリン酸ナトリウム或はトリス−ＨＣｌ又はアムモニア
ーＨＣＩ或はベロナール等の緩衝液（ｐＨ５〜９）で洗
浄し、次いで０．４Ｍ〜１．５Ｍ食塩水、好ましくは０
．５Ｍ食塩水又は０．５Ｍ食塩を含む上記緩衝液を通液
してカラムに吸着しているラクトフェリン画分を溶出す
る。なお、カラムはラクトフェリン画分の溶出後、１．
５Ｍ食塩水で洗浄し、さらに０．１５Ｍ食塩水を通液す
ることにより再生できる。

上述のようにして溶出させたラクトフェリン画分は、電
気透析（ＥＤ）装置により脱塩した後、凍結乾燥して４
０℃以下、好ましくは４℃の温度で保存する。このよう
にして得られたラクトフェリンは純度が９８％以上であ
ることが確認し得る。

本発明ではラクトフェリンを分離するための原料乳とし
て、ヒト及び牛、山羊等の哺乳動物の初乳、移行孔、常
乳、末期孔等のいずれも使用可能であり、さらに低温殺
菌した乳、脱脂乳及びホエー等も用い得る。

１３廊と１限 以上述べたとおり、本発明に従って乳からラクトフェリ
ンを分離、精製すると、カラムに原料乳を高流速で大量
に通液することができるので、短時間に大量のラクトフ
ェリンを、一度のカラム通液操作で、しかも高純度で分
離、精製できる。

また、本発明によると、原料乳について従来法のように
カゼインの酸による分離、ホエー画分の濃縮、及び脱塩
やイオン強度の調整等の前処理を・行う必要がなく、脱
脂のみを行った乳を直接カラムに通液できる。

さらに、本発明によると、カラムに吸着させたラクトフ
ェリンの溶出は食塩水のみでも可能であるため、ラクト
フェリン分離後の脱塩操作が簡単であり、加うるに、食
品や医薬品に適さないような添加物が分離過程に混入し
ないという利点もある。

なお、本発明によって得られるラクトフェリンの鉄結合
能を−ｏｏｄｗｏｒｔｈ等の方法〔（プロタイドスバイ
オロジカルフリューズプロシーデイングコロキューム（
Ｐｒｏｔｉｄｅｓ、Ｂｉｏｌ、Ｆｌｕｉｄｓ　Ｐｒｏｃ
、Ｃｏ１）ｏｑ。

１４．３７　（１９６６）　）に準じて測定した結果に
よると、１ｇ当り１．３〜２．１ｍｇの鉄結合能を示す
ことから、本発明によって得られるラクトフェリンは、
鉄要求性病原菌に由来する乳児の感染防御のための予防
薬及び上記病原菌によりもたらされる各症状の治療薬と
して利用できる。

また、本発明によると前記アフィニティーカラムにより
分離、精製したラクトフェリン溶液に直接塩化第二鉄を
混合し、よく攪拌した後そのまま電気透析（ＥＤ）装置
に通すことにより鉄飽和型ラクトフェリンを簡単に得る
ことができる利点もある。因に、鉄飽和型ラクトフェリ
ンは腸管における鉄の吸収効果を高めるのに役立つもの
である。

以下実施例を示して本発明を具体的に説明する。

実施例１ ヘパリンの固定化： 市販のアミノーセルロファイン５０ｓ＋　１　（架橋化
セルロール、チッソ株式会社製）を脱イオン水で十分洗
浄し、濾過した後、ヘパリンＬｏｇを０．１Ｍ食塩を含
む０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）１０
０ｍ　ｌに溶かしたヘパリン溶液と混合し、この混合物
にさらに１００請ｇのジメチルアミンボランを添加し１
，６０℃の振とう恒温槽中で２夜攪拌した後、ヘパリン
固定化セルロファインを得た。

ラクトフェリンの分離、精製： 上記により得られたヘパリンと固定セルロファイン２０
ｍ　ｌを直径２Ｃ１）％長さ１０ｃｍ＋のカラムに充填
し、このカラムに脱脂したヒト初乳２０ａｇ　１を１０
ｍ　ｌ　／■１）１゜で通液した後、０．３Ｍ食塩水Ｌ
ｏｏｍ　ｊｌでカラムを洗浄し、次いで０．５Ｍ食塩水
５０ｍ　ｌを通液してカラムに吸着しているヒトラクト
フェリンを溶出した。このヒトラクトフェリン溶液を十
分量の脱イオン水に対して透析した後、凍結乾燥してヒ
トラクトフェリン３５ｍｇを得た。

回収したヒトラクトフェリンの純度は、ＳＯＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動図より９８％と測定された。ま
た、このヒトラクトフェリンの鉄路合量は、血清鉄測定
キット（和光純薬社製）で測定したところ、０．１４ｍ
ｇ　Ｆｅ／ｇ蛋白質であった。また、鉄結合能は−ｏｏ
ｄｗｏｒｔｈの方法により９９％と算定され、鉄キレー
ト能も十分量する未変性のヒトラクトフェリンが得られ
ることが確認された。

実施例２ ヘパリンの固定化： 市販のキトパールＢＣＷ　（架橋キトサン、富士紡績社
製）５００＋ｗｌを脱イオン水で十分洗浄し、濾過した
後、ｔｏｇのヘパリンを０．０５Ｍ食塩を含む０．０５
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）５００＋ｍ　１
に溶かしたヘパリン溶液と混合し、この混合物に更に１
ｇの水素化シアンホウ素ナトリウムを添加し、６０’Ｃ
の恒温槽中で２夜緩徐に攪拌した後、ヘパリン固定化キ
トパールを得た。

ラクトフェリンの分離、精製： 上記で得たヘパリン固定化キトパール５００ｍ　ｊｌを
、直径６ｃ１ｍ、長さ２５ｃｍのカラムに充填し、この
カラムに脱脂した牛乳１０！を１０１２　／ｈｒで通液
した後、０．３Ｍ食塩水３１でカラムを洗浄し、次いで
０．５Ｍ食塩水を通液してカラムに吸着しているウシラ
クトフェリンを溶出して１．５１のウシラクトフェリン
溶液を回収した。

このウシラクトフェリン溶液に塩化第二鉄５０＋＊ｇを
添加し、１時間攪拌した後、小型ＥＤ装置（ＴＳ−２１
０、徳山ソーダ社製）に通して脱塩した後、凍結乾燥を
行った。

得られたウシラクトフェリンの純度は９８％と測定され
た。また、このウシラクトフェリンの鉄路合量を測定し
たところ、１．４ｍｇ　Ｆｅ／ｇ蛋白質であり、鉄の飽
和状態は１００％であった。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヘパリンを、架橋型セルロースもしくは架橋型キ
   トサンからなる硬質担体に固定化して成るアフイニテイ
   ーカラムに、ラクトフエリン含有原料乳を通してラクト
   フエリンを吸着させ、次いで吸着ラクトフエリンを溶出
   することを特徴とする乳からラクトフエリンを分離、精
   製する方法。
2. （２）ヘパリンを、還元剤を用いその還元末端によつて
   上記硬質担体に固定化する特許請求の範囲第（１）項記
   載の方法。
3. （３）ヘパリンを、縮合剤を用いそのカルボキシル基に
   よつて上記硬質担体に固定化する特許請求の範囲第（１
   ）項記載の方法。
4. （４）ラクトフエリンの溶出を食塩水のみで行う特許請
   求の範囲第（１）項記載の方法。