JPH11240899A - 乳およびその副生物からラクトフェリンを分離、 精製する方法 - Google Patents

乳およびその副生物からラクトフェリンを分離、 精製する方法

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Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 αs−カゼイン固定化カラムを用いて、
乳中に含まれるラクトフェリンを、安全、簡便、高純度
に分離する方法に関する。 【効果】 乳中に含まれるラクトフェリンを安全、簡
便、しかも高純度に分離することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、以下に述べるよう
に、種々の生理作用を示すラクトフェリンを、簡便、高
純度、しかも安全に分離・精製する方法に関する。
【0002】
【従来の技術】ラクトフェリンは乳、涙、唾液等の外分
泌液中に含まれる、分子量が約8万の鉄結合性糖蛋白質
である。その含量は初乳中に多く、ヒト初乳中で約5〜
10mg/ml含まれるが、ウシ常乳中では約0.1〜0.
5mg/mlと少ない。特に初乳中に多く含まれることか
ら、乳児の健全な発育を維持する上で、重要な働きを担
っていると考えられている。これを裏付けるように、近
年、in vitro、及びin vivoにおける多くの研究で、ラ
クトフェリンが抗菌作用、過酸化脂質生成抑制作用、鉄
吸収の調節作用、免疫機能調節作用、細胞増殖作用、及
び細菌感染防御作用などの有用な生理作用を有すること
が報告されている。
【0003】このようにラクトフェリンには多岐にわた
る生理活性が期待されることから、栄養生理学的、並び
に薬理学的に重要な物質である。ラクトフェリンを分離
するための原料としては、牛乳およびチーズ製造時に副
生されるチーズホエイが使用されている。ラクトフェリ
ンは栄養学的に優れ、しかも安全な牛乳原料から分離さ
れているため、安全な天然物由来の原料である。また、
最近では遺伝子組み換えラクトフェリンの利用も研究さ
れている。
【0004】従来、乳からラクトフェリンを分離、精製
する方法としては、陽イオン交換体を用いる方法(特開
昭62−19523、特開昭63−152400)が一
般的である。また、ラクトフェリンと親和性の強い物質
をカラムに固定化し、アフィニティクロマトグラフィー
により分離する方法がある。例えば、ヘパリン(特開昭
63−255299)、ラクトフェリンに対するモノク
ロナール抗体(特開昭61−145200)、硫酸エス
テル化物(特開昭63−255300)、DNA(T. W
illiam Hutchens ら、Biochimica et Biophysica Acta,
999(1989)323-329、及び色素(Mariano Grasselli ら、
Netherlands Milk & Dairy J., 50(1996)551-561)など
をクロマトグラフィー用の支持体に固定化し、ラクトフ
ェリンを含む乳原料と接触させ、吸着したラクトフェリ
ンを0.5〜1.0Mの塩化ナトリウムで溶出させる方
法などがある。
【0005】アフィニティクロマトグラフィーによる方
法は、ラクトフェリンとの特異的吸着反応を用いるた
め、イオン交換クロマトグラフィー法に比べ、煩雑な工
程を経ずに簡便に高純度のものが得られるという利点が
ある。しかし、従来アフィニティカラムに使用されてい
るリガンドとして、ヘパリン、ラクトフェリンに対する
モノクローナル抗体、硫酸エステル化物、DNAなどが
あるが、何れも大量に入手するのが困難である。また、
固定化した上記物質が脱落してラクトフェリンに混入す
る恐れもあり、食品用途としては、安全性に問題があ
り、更にもう一段の改良が待たれるところであった。
【0006】このような状況に鑑み、本発明者らは、先
に、牛乳中に含まれるκ−カゼインが、ラクトフェリン
に対して強い親和性を有するという事実を見出し、この
原理を応用して、κ−カゼインをリガンドとしてアフィ
ニティカラムを作製し、乳等に含まれるラクトフェリン
を特異的に分離する方法を開発するのに成功し、既に特
許出願を完了した(特願平9−202651)。
【0007】更に本発明者らは、ラクトフェリンと牛乳
中に含まれる個々の蛋白質成分との相互作用の強さを詳
細に調べたところ、全く予期せざることに、ラクトフェ
リンはκ−カゼインよりもαs−カゼインとの間に、よ
り一層強い相互作用があるという興味深い事実を発見す
るに至った。この様な経緯から、先に出願したκ−カゼ
インに比べαs−カゼインをリガンドとして用いるアフ
ィニティクロマトグラフィーの方がラクトフェリンを分
離する方法として好ましいとの着想を得た。以上から、
今回αs−カゼインを固定化したアフィニティクロマト
グラフィーを考案し、ラクトフェリンを分離精製する方
法を発明した。
【0008】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した技
術の現状に鑑み、数多くの生理作用を有するラクトフェ
リンを安全にしかも簡便、効率的に分離及び/又は精製
する方法を開発する目的でなされたものである。
【0009】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するためになされたものであって、各方面から検討の
結果、αs−カゼインを固定化したアフィニティクロマ
トグラフィーによる方法は、本発明者らが先に出願した
κ−カゼインを固定化したアフィニティクロマトグラフ
ィーによる方法よりも、ラクトフェリンとの吸着が強い
ことが明らかとなった。
【0010】次にこの事実を詳細に説明する。乳中の主
要タンパク質として、αs−カゼイン(αs−CN)、
β−カゼイン(β−CN)、κ−カゼイン(κ−C
N)、β−ラクトグロブリン(β−Lg)、及びα−ラ
クトアルブミン(α−La)があるが、これらをそれぞ
れ固定化したカラムを作製し、ラクトフェリンとの相互
作用の強さを調べた。その結果、何れの固定化カラムに
対してもラクトフェリンは吸着した。それぞれの固定化
カラムに吸着したラクトフェリンを溶出するのに必要な
塩濃度は、αs−CN>κ−CN、β−CN、β−Lg
>α−Laの順に高いことが分かった。このことから、
αs−カゼインは、他の乳蛋白質に比べて、ラクトフェ
リンとの相互作用が強いことが明らかになった。実験の
詳細は後記する実施例において述べる。
【0011】αs−カゼインはκ−カゼイン同様に、牛
乳中に存在する成分であり、従来使用されてきたヘパリ
ン、モノクロナール抗体などに比べ、極めて安全で、価
格的にも安いという利点がある。αs−カゼインは単一
成分ではなく、構成するポリペプチド鎖に基づいて、α
1−カゼインとαs2−カゼインとに区別される。この
内、αs1−カゼインは牛乳1000ml中に12〜15
g、カゼインの約45%を占める主要成分である。一
方、αs2−カゼインは牛乳1000ml中に3〜4g、
カゼインの約10%を占める。本発明でいうαs−カゼ
インは、αs1−カゼインとαs2−カゼインのどちらか
一方、又は双方を含む成分を示すが、いずれも固定化に
用いるリガンドとして有効である。
【0012】上記した有用新知見に基づき、更に研究の
結果完成されたものであって、本発明は、αs−カゼイ
ンを用いることにより、乳、液、唾液などの外分泌液、
微生物や細胞の培養物、遺伝子組み換え培養液、こ(れ
ら)の濃縮液、抽出液、等に含まれる生理学的に重要な
ラクトフェリンを高純度に、しかも簡便に分離/精製す
る方法に関するものである。以下、本発明について詳述
する。
【0013】
【発明の実施の形態】本発明は、αs−カゼインに対し
てラクトフェリンが特異的、選択的に親和性を有すると
いう本発明者らがはじめて発見した新しい原理に基づく
ものであって、ラクトフェリン含有原料をαs−カゼイ
ンで処理し、両者を特異的に結合せしめた後、ラクトフ
ェリンを分離するものである。
【0014】したがって、本発明を実施するには、αs
−カゼインを担体に固定化しておき、これにラクトフェ
リン含有原料を接触せしめてラクトフェリンを特異的に
αs−カゼインに吸着させた後、次いで吸着させたラク
トフェリンを溶出せしめるいわば工業的な方法、あるい
は、αs−カゼインを担体に固定化することなく遊離状
態にしておき、これにラクトフェリン含有原料を接触せ
しめてラクトフェリンとの結合体ないし複合体を形成せ
しめ、これを取り出した後に両者を分離するいわば化学
的ないし生物学的方法のいずれもが利用可能である。
【0015】αs−カゼインの固定化は、従来より行わ
れている酵素、各種蛋白質、微生物の担体への固定化技
術が適宜利用可能である。すなわち、無機又は有機、天
然又は合成、高分子又は低分子、生物系又は非生物系等
各種担体を用い、共有結合法、イオン結合法、物理的吸
着法等による従来既知の固定化技術が適宜利用可能であ
る。
【0016】例えば担体としては、アガロース、セルロ
ース、デキストラン、セファロース、セファデックス等
の多糖類(誘導体)、ポリアクリルアミドゲル、ポリス
チレン等の合成高分子物質、(多孔質)ガラス、(多孔
質)セラミックス、活性炭、シリカゲル、アルミナ、粘
土鉱物等の無機ないしセラミックス系物質が適宜利用さ
れる。
【0017】これらの担体は、そのまま、あるいは臭化
シアン、水素化シアノホウ素等で処理したり、架橋剤や
縮合試薬で処理したりして、常法にしたがってαs−カ
ゼインとの固定化を更に推進せしめてもよい。
【0018】本発明を実施するには、先ず、このように
して固定化したαs−カゼインとラクトフェリン含有原
料とを接触せしめるのであるが、ラクトフェリン含有原
料としては、乳、脱脂乳のほか、ホエイ等の乳副生物等
ヒトを含む哺乳類の乳類;涙、唾液等の各種外分泌液;
細胞や微生物の培養液、遺伝子組み換え培養液;これら
の抽出液や濃縮液等、ラクトフェリンを含有する物質が
すべて包含される。
【0019】αs−カゼインとラクトフェリンの接触時
において、pHは2.5〜8.5、好ましくは3.0〜
8.0とするのがよく、イオン強度は0.3以下、好ま
しくは0.2以下とするのがよい。
【0020】次いで吸着されたラクトフェリンを塩類溶
液で溶出するが、その際塩類溶液としては、イオン強度
が0.3〜1.6、好ましくは0.4〜1.5とするの
がよい。溶出した後、電気透析等の常法にしたがって脱
塩を行い、ラクトフェリンを得る。
【0021】吸着ラクトフェリンの溶出に用いられる塩
類溶液としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化
カルシウム、塩化マグネシウム、及びこれらの1種又は
それ以上の混合物から選ばれた塩類の溶液が使用され
る。以下、本発明の実施例について述べる。
【0022】
【実施例1】αs−カゼインの固定化:市販のアクチゲ
ル10ml(アガロースゲル、ステロジェン・バイオセパ
レーション社製)を脱イオン交換水で十分洗浄し、濾過
した後、αs−カゼイン20mgを10mMリン酸緩衝液
(pH7.0)3mlに溶かし、この混合物に水素化シア
ノホウ素ナトリウム(NaCNBH3)130mgを添加
し、αs−カゼイン固定化アクチゲルを得た。
【0023】ウシラクトフェリンの分離、精製:上記の
手順で調製したαs−カゼイン固定化アガロースゲルを
直径1cm、長さ10cmのカラムに充填し、10mMリン酸
緩衝液(pH7.0)で平衡化した。このカラムに、ウ
シラクトフェリン(シグマ社)(1mg/ml)1mlを通液
し、10mMリン酸緩衝液(pH7.0)でカラムを洗浄
した。次いで0.5M NaCl 20mlを通液してカ
ラムに吸着しているウシラクトフェリンを溶出した。
【0024】
【実施例2】実施例1で調製したαs−カゼイン固定化
アガロースカラム(直径1cm×長さ10cm)に、ヒトラ
クトフェリン(シグマ社)(1mg/ml)1mlを通液し、
10mMリン酸緩衝液(pH7.0)でカラムを洗浄し
た。次いで0.5M NaCl20mlを通液してカラム
に吸着しているウシラクトフェリンを溶出した。
【0025】
【実施例3】実施例1と同様に、αs−カゼイン(αs
−CN)、β−カゼイン(β−CN)、κ−カゼイン
(κ−CN)、β−ラクトグロブリン(β−Lg)、及
びα−ラクトアルブミン(α−La)を、それぞれ20
mg固定化したカラムを作製した。これらのカラムにウシ
ラクトフェリン(シグマ社)(1mg/ml)1mlを通液し
た。10mMリン酸緩衝液(pH7.0)でカラムを洗浄
した。次いでNaCl濃度を0Mから2.0Mまで直線
的に上昇させ、カラムに吸着しているラクトフェリンを
溶出した。最初にα−La固定化カラムに吸着したラク
トフェリンが溶出し、次にκ−CN、β−CN、及びβ
−Lg固定化カラムに吸着したラクトフェリンが溶出し
た。最後に、αs−CN固定化カラムに吸着したラクト
フェリンが溶出した。この結果から、溶出に必要な塩濃
度は、αs−CN>κ−CN、β−CN、β−Lg>α
−Laの順に高いことが分かった。すなわち、αs−カ
ゼインはκ−カゼインよりも、ラクトフェリンとの相互
作用が強いことが明らかになった。
【0026】図面は、上述の各種乳蛋白質固定化アフィ
ニティクロマトグラフィーによるウシラクトフェリンの
分離クロマトグラムを示し、図1は、溶出したカラムナ
ンバーと吸光度(A280)、NaCl濃度との関係を示
す。
【0027】
【実施例4】αs−カゼイン固定化カラム(直径1cm×
長さ10cm)は、実施例1と同様な手順で調製した。乳
タンパク質共存下において、αs−カゼイン固定化カラ
ムに対するラクトフェリンの特異的吸着性を確認するた
めに、ホエイ中の主要タンパク質である牛血清アルブミ
ン(BSA)(0.7mg)、免疫グロブリン(1.4m
g)、α−ラクトアルブミン(2.8mg)、及びβ−ラ
クトグロブリン(7.0mg)をホエイ中の濃度と同レベ
ルに溶解し、この中にウシラクトフェリン1.0mgを添
加した。
【0028】このようにして調製したホエイのモデル溶
液の全量(2ml)を、上記のαs−カゼイン固定化カラ
ムに通液し、10mMリン酸緩衝液(pH7.0)でカラ
ムを洗浄した。次いで1.0M NaCl 20mlを通
液してカラムに吸着しているウシラクトフェリンを溶出
した。溶出したウシラクトフェリン量をELISAで分
析したところ、約0.95mgのウシラクトフェリンが回
収されたことから、ウシラクトフェリンの回収率は96
%であることを確認した。回収したウシラクトフェリン
の純度は、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
(PAGE)図より、95%以上と測定された。
【0029】図面は、αs−カゼイン固定化アフィニテ
ィクロマトグラフィーによるウシラクトフェリンの分離
を示し、図2は溶出したカラムナンバーと吸光度(A
280)との関係を示し、図3は上記SDS−ポリアクリ
ルアミド電気泳動(PAGE)図を示す。
【0030】
【実施例5】各種乳白質の固定化;αs−カゼイン(α
s−CN)、β−カゼイン(β−CN)、κ−カゼイン
(κ−CN)、β−ラクトグロブリン(β−Lg)、及
び、α−ラクトアルブミン(α−La)を固定化したカ
ラムは、実施例3と同様な手順で調製した。
【0031】未加熱酸ホエイの調製:生乳1000mlを
40℃に加温後、10,000g、20分間遠心分離を
行った。クリーム部を除去後、脱脂乳を調製した。脱脂
乳をpH4.6に調製してカゼインを沈殿させ、10,
000g、20分間遠心分離後、沈殿した酸カゼインを
除去した。得られた酸ホエイのpHを1N NaOHで
pH7.0に調整した。
【0032】上述で調製した酸ホエイを10mlずつ採取
し、αs−CN、κ−CN、β−CN、β−Lg、及び
α−Laの固定化カラムに通液した。実施例3と同様な
手順で、10mMリン酸緩衝液(pH7.0)でカラムを
洗浄後、NaCl濃度を0Mから2.0Mまで直線的に
上昇させ、カラムに吸着しているラクトフェリンを溶出
した。各固定化カラムから溶出したラクトフェリンの含
量をELISA法で定量した。表1(上記各蛋白質を固
定化したアフィニティクロマトグラフィーを用いて、酸
ホエイから回収したウシラクトフェリンの吸着量及び回
収率を示す)に示したように、カラムから溶出して回収
したラクトフェリン含量は、αs−カゼインが最も多
く、次に、κ−カゼインとβ−ラクトグロブリンは同程
度、その次はβ−カゼインであった。α−ラクトアルブ
ミン固定化カラムでは、ラクトフェリンの回収性は極め
て低かった。
【0033】
【表1】
【0034】
【実施例6】αs−カゼイン固定化カラム(直径1cm×
長さ10cm)は、実施例1と同様な手順で調製した。ヒ
ト初乳から脂肪を分離した脱脂乳において、塩酸でpH
4.6に調整することにより、カゼインを等電点沈殿さ
せて、ホエイ画分を得た。上清液のpHを水酸化ナトリ
ウムでpH7.0に調整した。このようにして調製した
ヒト初乳ホエイ5mlをαs−カゼイン固定化カラムに通
液した。10mMリン酸緩衝液(pH7.0)でカラムを
洗浄後、1.0M NaCl 20mlを通液してカラム
に吸着している成分を溶出した。この成分をSDS−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)で分析した
ところ、ヒトラクトフェリンであることが確認できた。
回収されたヒトラクトフェリンの純度は、95%以上で
あった。
【0035】
【実施例7】αs−カゼイン固定化カラム(直径1cm×
長さ10cm)は、実施例1と同様な手順で調製した。ゴ
ーダチーズ製造過程で得られるチーズホエイ10mlをα
s−カゼイン固定化カラムに通液した。10mMリン酸緩
衝液(pH7.0)でカラムを洗浄後、1.0M Na
Cl 30mlを通液してカラムに吸着している成分を溶
出した。この成分をSDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動(PAGE)で分析したところ、ウシラクトフェ
リンであることが確認できた。回収されたウシラクトフ
ェリンの純度は95%以上であった。
【0036】
【発明の効果】乳等ラクトフェリン含有原料中に含まれ
るラクトフェリンを安全、簡便、しかも高純度に分離及
び/又は抽出することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】カラムナンバーと溶出したウシラクトフェリン
の吸光度(A280)、及び溶出液中のNaCl濃度との
関係を示す。
【図2】カラムナンバーと溶出したウシラクトフェリン
の吸光度(A280)の関係を示す。
【図3】回収したウシラクトフェリンの純度を示す電気
泳動図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成11年5月31日
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 兼次 智子 東京都東村山市栄町1−21−3 明治乳業 株式会社栄養科学研究所内

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 αs−カゼインに、ラクトフェリン含有
    原料を接触させてラクトフェリンを吸着させ、次いで吸
    着させたラクトフェリンを溶出すること、を特徴とする
    ラクトフェリン含有原料からラクトフェリンを分離、精
    製する方法。
  2. 【請求項2】 αs−カゼインを固定化した担体を用
    い、アフィニティクロマトグラフィーによりラクトフェ
    リン分離、精製すること、を特徴とする請求項1に記載
    の方法。
  3. 【請求項3】 ラクトフェリン含有原料が、乳、脱脂
    乳、ホエイ、涙、唾液、細胞培養物、微生物培養物、濃
    縮液、抽出液から選ばれる少なくともひとつであるこ
    と、を特徴とする請求項1又は2に記載の方法。
  4. 【請求項4】 αs−カゼインとラクトフェリンとの接
    触時のpHが、3.0〜8.0であること、を特徴とす
    る請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
  5. 【請求項5】 αs−カゼインとラクトフェリンとの接
    触時のイオン強度が、0.3以下であること、を特徴と
    する請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
  6. 【請求項6】 吸着ラクトフェリンをイオン強度が0.
    4〜1.5の塩類溶液で溶出した後、電気透析等で脱塩
    すること、を特徴とする請求項1〜5のいずれか1項に
    記載の方法。
  7. 【請求項7】 上記溶出に用いる塩類溶液が、塩化ナト
    リウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシ
    ウム、及びこれらの混合物から選ばれた塩類の溶液であ
    ること、を特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に
    記載の方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005068502A1 (ja) * 2004-01-20 2005-07-28 Kurume University ラクトフェリンの分離精製方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2005068502A1 (ja) * 2004-01-20 2005-07-28 Kurume University ラクトフェリンの分離精製方法

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