JPS62258397A - ペプチド、およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明１ハ、システィンＶＣｔみ、γ−グルタミン酸−
およびβ−アラニン単位を有するペプチドおよびその製
造法に関する。

従来の技術 すでに、動物起源のシスティン蛋白質（メタロチオネイ
ン）が公知である。この蛋白質のアミノ酸が、α−ペプ
チド結合によシ相互に結合されている。このメタロチオ
ネインは、著量の重金属を結合することができ、従って
恐らく相応に汚染された生体中で除毒に使用されること
ができる〔ケーギー（Ｋａｅｇｉ　）　、　　Ｊ。ビオ
ケム（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　ｊＪ　８９巻、１８６９頁（
１９８１年〕〕。

さらにまた”アブリフ・ビオル・ケム”（Ａｇｒｉｃ、
　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、第４９巻、７１頁（１９８５
年）によれば、分解酵母から得られた、式： ％式％ のペプチドがすでに公知であシ、並びに、高等植物およ
び真菌類から得られることのできるフィトケラチンが、
以下のアミノ酸シーケンス：（ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ）ｎ
−Ｇｌｙ　（式中ｎが４〜７の整数である〕によシ表わ
される〔”サイエンス”（５ｃｉｅｎｃｅ　）　’Ｍ　
２３０巻、６７４頁（１９８４年）、および”フエープ
ス・レターズ（ＦＦＪ３ＳＬｅｔｔｅｒｓ　）　Ｋ　１
９７巻、１１５頁（１９８６年）による〕。

問厘点を解決するための手段 本発明は、以下にホモフィトケラチンとも呼称されるペ
プチドに関し、このものは以下のアミノ酸シーケンス： （ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ）　ｎβ−Ａｌａ〔式中ｎが２〜
１１の整数である〕を特徴とする。

７−Ｇｌｕがｒ−グルタミン酸であり、Ｃｙｓがシステ
ィンであり、β−Ａｌａがβ−アラニンである。

本発明によるペプチドは以下の構造式により表わされる
ことができる： ｎ　：２７’−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−
β−Ａｌａ。

ｎ　＝　３　ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−７−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ
−ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−β−Ａｌａ。

ｎ　＝　４７−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−
ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−β−Ａｌａ
　。

ｎ　＝　５　ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−７−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ
−ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−４−Ｇｌ
ｕ−Ｃｙｓ−β−Ａｈａ。

ｎ、＝　６ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−
ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−７−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−ｒ−Ｇｌｕ
−Ｃｙｓ−７−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−β−Ａｌａ。

ｎ　＝　７　ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−ｒ−Ｇｙｌｕ−Ｃｙ
ｓ−ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−ｒ−Ｇ
ｌｕ−Ｃｙｓ−ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−７”−Ｇｌｕ−Ｃ
ｙｓ−β−Ａｌａ。

ｎ　＝　８７−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ、−ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ
−７”−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−ｒ−Ｇ
ｌｕ−Ｃｙｓ−ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙ
ｅ−ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−β−Ａｌａ　。

ｎ　＝　９　　ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙ
ｓ−ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−ｒ−Ｇ
ｌｕ−Ｃｙｓ−γ−Ｇｌｕ−ｃ７８−ｒ−Ｇｌｕ−ｃ７
Ｂ−ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−β−Ａ
ｌａ　　。

ｎ　：　１Ｑ　ｒ−Ｇｌｕ−Ｃ７Ｂ−ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙ
ｓ−ｒ−Ｇｌｕ−Ｃ７Ｂ−７’−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−γ〜
Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−ｒ−Ｇｌｕ−Ｃ
ｙｓ−７”−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−４
−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−β−Ａｌａ。

ｎ　＝１１　７−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−７”−Ｇｌｕ−Ｃｙ
ｓ−ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−ｒ−Ｇ
ｌｕ−Ｃｙｓ−ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙ
ｓ−γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−γ−Ｃ
１ｕ−Ｃｙｓ−ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−β−Ａｌａ。

さらに本発明は、金属陽イオンを含有するホモフィトケ
ラチンに関する。原則として、相応するホモフィトケラ
チンと配位結合することのできる全ての金属陽イオンが
挙げられる。とくてその例が、金属二鉛、錫、ビスマス
、チタニウム、バナジウム、モリブデン、マンがン、コ
バルト、ニッケル、鉄、銅、銀、金、白金、パラジウム
、亜鉛、カドミウム、水銀、ウラニウム、砒素、セレニ
ウム、テクネチウム、ガリウムの陽イオンである。

明白に金属含有率が、チオレート基に配位結合された陽
イオンの原子価に依存する。この金属含有率は、ホモフ
ィトケラチン１モル当り１〜４モル、２１ｉＩＩｌｉ陽
イオンの場合一般に２モルである。

本発明によるホモフィトケラチンは、植物性原料の抽出
により得られる。植物性原料として挙げられるのが、ホ
モグルタチオンを含有スる種類、とくに高等植物の豆科
（ＵｅｂｅｒｏｒｄｎｕｎｇＦａｂａｌｅｓ　）の種類
である。

例として挙げられるのが、豆科からの植物原料、とくに
以下のものである： こ ファゼオループルがリス（Ｐｈａｓａｅｏｌｕｓ　ｖｕ
ｌｇ−ａｌｉ日）およびその培養組織。

ファゼオルス・コツシネウス（ＰｈａｓａｅｏｌｕｓＣ
ＯＣＣｉｎｅｕ８　）　。

ファゼオルス・アウレウス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓａｕｒ
ｅｕｓ　）　。

ファゼオルス・ルｆ　）　ウス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓｌ
ｕｎａｔｕｓ　）　。

ファゼオルス・ムルチフロルス（Ｐｈａｓθｏ’ｌｕｓ
ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｓ　）　。

グリシン−マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ　）　（
大豆）。

エリトリナ・クリスターガリ（Ｅｒｙｔｈｒｉｎａｃｒ
ｉｓｔａ−ｇａｌｌｉ　）　。

並びに オノニス・アトリクス（０ｎｏｎｉθａｔｒｉｘ　）　
。

ロートウス・オルニトボデイオデス（Ｌｏｔｕｓｏｒｎ
ｉｔｈｏｐｏｄｉｏｄｅｓ　）　。

トリゴネラ・コエルレア（Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａｃｏｅ
ｒｕｘｅａ　）　ｓ メデイカゴ・サテイバ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ　５ａｔｉｖ
ａ　）。

メリロトウス・アルパ（Ｍｅｌｉｌｏｔｕｓ　ａｌｂａ
　）　。

トリホリウム・プラテンセ（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍｐｒａ
ｔｅｎｓｅ　　）。

ラテイルス・オクルス（Ｌａｔｈｙｒｕｓ　ｏｃｈｒｕ
ｓ　）　。

シセル・アヴイエテイヌム（ＣｉｃｅｒａＶｉｅｔｉｎ
ｕｍ　）　＋ レンズ・クリナリス（Ｌｅｎｓ　ｃｕｌｉｎａｒｉｓ　
）　。

アストラガルス・ルシタニクス（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ
１ｕｓｉｔａｎｉｃｕｆ３）　。

ガレが・オフィシナリス（Ｇａｌｅｇａｏｆｆｉｃｉｎ
ａｌｉｓ　）。

有利に植物性原料として、前記植物の細胞培養物が使用
される。しかしながら、異なる植物または植物部分も、
本発明によるペプチドを得るために使用されることがで
きる。

植物中のホモフィトケラチンの形成は、植物を金属ない
しは金属塩で処理することにより誘導される。この処理
は、植物が金属ないしは金属陽イオンを吸収することの
できるそれぞれ適当な方法で行なわれることができる。

有利に、ホモフィトケラチンの誘導は、細胞培養物を水
性混合物中の金属塩溶液で処理することにょう行なわれ
る。この場合一般に、細胞原、料が金属塩溶液中で培養
され、その場合急性の植物毒性を下廻る濃度が維持され
るように実施される。

金属濃度の下限が、１リットル当シ１μモルである。上
限が、すでに前記せるように、相応する金属陽イオンの
植物毒性に著るしく依存する。

これは１リットル当り１００ｍモルにまでであると（！
−ができる。有利なのが、１リットル轟シ１０μモル〜
１ｍモルの範囲である。

従って有利に、このような植物性原料は、前記せるよう
に金属ないしは金属陽イオンおよび金属陰イオンの存在
において培養されたものがホモフィトケラチンを得るた
めに使用される。

植物性原料の抽出は、すでに従来よジペプチドが植物か
ら油出されることのできた方法にょシ行なわれる。一般
に、植物の、細胞培養物が破壊されるように実施される
。このため植物性物質が、有利に例えば液体窒素で凍結
され、場合によシ粉砕され、かつ最後に弱アルカリ性の
水性調剤中に採られる。有利に、この水性調剤のｐＨ価
が７．５〜９．５である。しかしながら、ｐＨ１〜３の
酸性調剤も使用されることができる。しばしば、前記−
範囲の水性調剤として適当な緩衝液が使用される。場合
によシ溶解せざる植物原料を分離した後に、抽出物の処
理が行なわれる。

有利に、抽出物が差当り＠縮される。例えば、このこと
が凍結乾燥、またはペプチドのイオン交換体への収着お
よび引続く溶離によシ実施される。その後に、−緒に抽
出された蛋白質が電解質（例えば・硫酸アンモニウム溶
液）を添加することにより沈殿される。この場合、本発
明によるペプチドが溶液中（で残存する。最後に、例え
ば限外濾過、デル濾過または、硫酸銅溶液を使用するホ
モフィトケラチンの沈殿のような引続く精製工程が行な
われることができる。それぞれ溶離剤の選択が、Ｕｖ測
測定つき、金属−チオレート結合の代表的吸収バンドの
割合により、並びに場合によシＳＨ官能基の定量的検出
〔例えばエルマン試薬（Ｋｌ１ｍａｎ’ｓ　Ｒｅａｇｅ
ｎｚ　）を使用する〕によシ行なわれることができる。

フィトケラチンが相応する金属イオン含分とともに生じ
る。例えば遊離のベゾチ゛ドが、金属陽イオンを鐵性化
しかつ沈殿（例えばＨ２Ｓ沈殿）させることによシ得ら
れることができる。選択的に、金属陽イオンの負荷され
たペプチドが例えば錯形成剤（例えばエチレンジアミン
テトラアセテート）を使用しても金属含分と分離される
ことができる。

植物原料が酸性の調剤中に採られた場合、金属陽イオン
含分なしのペプチドが生じる。

一般に、式： ％式％ の本発明によるペプチドが混合物として生じ、その場合
式： ％式％ のペプチドが本発明によるペプチドのなかでも一般に主
成分である。その分量は、高級連鎖ペプチドの少くとも
２〜８倍である。

ペプチド混合物中の本発明によるペプチドの、本発明に
よるペプチドの総量に対する代表的度数分布が以下の記
載から明白である： （ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ）　２β−Ａｌａ　４０〜６０モ
ルチ。

（ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ）３β−Ａｈａ　　２０〜４０　
％ルチ。

（ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙａ）　４β−Ａｌａ　　１Ｑ　〜２
Ｑ２Ｑ％。

（ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ）５β−Ａｌａ　　　２〜１０モ
ルチ。

ｎ　＝　６〜１１を有する成分は、一般に１〜０．００
１モルチであるにすぎない。

所望の場合には、これらペプチドが自体公知のペプチド
分離法によシ分離されることができる。その例が、ＨＰ
Ｌクロマトグラフィー、デル濾過、イオン交換体による
クロマトグラフィー等でｂる。

本発明によるペプチドは、またすでにこれまでにペプチ
ド組成物の配合に使用されえたように、個々にまたは混
合物で、塊状でまた＃″！：Ａ＃剤の形で使用されるこ
とができる。例えば、本発明によるペプチドは自体公知
の方法でキャリヤ物質に物理的に吸収または化学的に吸
着されることができる。キャリヤ物質の例は、アルヤネ
ート、官能基（例えばオキシラン基）を有するアガロー
ス、セルロース、アクリル樹脂、ガラス、シリケート等
である。

本発明によるペプチドは、医薬調剤の形で急性および慢
性の重金属被毒の処置に使用される。

他方で、金属イオンの負荷された本発明によるペプチド
も、金属欠乏症の処置ないしは相応する金Ｒ（例えば鉄
、亜鉛、鋼）のホメオスタシスの維持に使用されること
ができる。他の用途は、環境保護の部門、例えば重金属
汚染された溌水の浄化でるる。

さらに、本発明によるペプチドは、有用な金属を水溶液
から精製するために使用されることもできる。

さらに、重金属負荷された本発明によるペプチドは相応
する抗体を取得するために使用されることができ、この
抗体自体が植物における重金属負荷率の診断薬として使
用される。

さらに、放射性金属の負荷されたホモフィトケラチンが
抗体に結合され、診断薬として使用されることができる
（例えば腫瘍診［）。

実施例 以下に、本発明を実施例につき詳説する。

例　　１　ニ ゲリシン・マックス（Ｇ：１ｙｃｉｎｅ　ｗａｘ　）の
細胞培養物１ｏｏ　ａｙ　ｃ乾燥重量５４．Ｆに相応）
を、１０μモルの硫酸カドミウム水溶液４１中で３日間
不断の振とり下に培養した。その後に、この細胞培養物
を採シ、蒸溜水で洗浄しかつ液体窒素で凍結した。引続
き、このように砕解した細胞培養物を−＝８．６の緩衝
液（トリヒドロキシメチルアミノメタン／　ＨＣＬ　／
　２−メルカプトエタノールの１０ｍモル水’ｆ８Ｋ　
）　５００ｍｊｐＶＣ懸濁した。この懸濁液を遠心分離
した。残渣を再びｐｉ−１８，６となし、伝導率（１ｋ
Ｂとなるまで希釈した。その後に残渣を、陰イオン交換
カラム〔ジエチルアミノエチルーアがロースカラム、米
国リッチモンド在バイオラド社’Ａ　（Ｂｉｏ−Ｒａｄ
。

Ｒｌｃｈｍｏｎｄ、　Ｕ８Ａ　）　）上へ装入した。

引続き、水溶液（１（ａｃｔ　Ｏ−５モル／１１　トリ
ヒドロキシメチルアミノメタン／ＨＣ６１０ｍ％ル／ｉ
ｐ’＝８−６）で溶離した。この溶離物に、蛋白質沈殿
のため飽和度８５％になるまで固体の硫酸アンモニウム
を混合した。その後に遠心分離し、かつ残渣を限外濾過
〔英国性アミコン・ディパース社（Ｆｉｒｍａ　Ａｍ１
ｃｏｎ　Ｄａｖｅｒｓ、　ＧＢ　）の薄膜ＹＭ−２）す
ることによシ硫酸アンモニウムと分離しかつ１５ｍＪに
蒸発濃縮した。

最後に、この蒸発濃縮せる溶液に、デル濾過〔セファデ
ックス（５ｅｐｈａｄｅｘ　）　Ｇ　−５Ｑ　、スエー
デン・ウプサラ在ファーマシア社（ＦｉｒｍａＰｈａｒ
ｍａｃｉａ、σｐｐｓａｌａ、　１９ｃｈｗｅｄｅｎ　
）　〕をｐＨ＝７で施こした。この−価は酢酸アンモニ
ウムで相応に調節した。５ｍモル酢酸アンモニウム溶液
で溶離することにより、差当りわずかな分量の高分子蛋
白質および引続き所望のペプチドが得られた。溶離物を
凍結乾燥することによシ、ペプチド混合物１８０Ｉｖが
得られた。カドミウム含有率が１６．８重量％であった
。

例　　２　： 例１により得られたホモフィトケラチン混合物１００ｍ
９を０．０１　Ｎ塩酸１０ｍ１中に溶解した。

この溶液中へ、ガス状の硫化水素を硫化カドミウムの沈
殿下に導入した。その後に遠心分離し、かつ残渣を凍結
乾燥した。金属不含のペプチド混合物８２ｍ２が得られ
た。

このペプチド混合物を、。逆相カラム”（ｒｅｖｅｒｓ
ｅｄ　ｐｈａｓｅ−８ａｅｕｌｅ　）　［ヌクレオシル
（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ　）　Ｃ−１８、西ドイツ国デュ
ーレン在マツケリー・ラント・ナーデル社（Ｆｉｒｍａ
Ｍａｃｈｅｒｅｙ　ｕｎｄ　Ｎａｇｅｌ、　Ｄｕｅｒｅ
ｎ、　ＢＲＤ　）　：］でＥ（ＰＬクロマトグラフィー
することにより分割した。

このものは以下の組成を有した： （ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙ　ｓ　）　２β−Ａｌａ　　　４６
−６モル価。

（ｒ−Ｇ’１ｕ−Ｃｙｓ）３β−Ａ１ａ３７．８モル価
。

（ｒ−Ｇ’ｌｕ−Ｃｙｓ）　、β−Ａ１ａ　　　１１．
７モに％。

（ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ　）　ｓβ−Ａｈａ　　　　３．
６モル価。

（ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ）６β−Ａｌａｏ、６モル価。

（７−Ｇ’１ｕ−Ｃｙｓ）７−１１β−Ａｌａ　　　０
．３モル価。

例　　３　： 金屑不含のペプチド混合物（例２による）ｙｒ／ψ７ｉ
ｉ’７５ＣＪｍ９を、水素化硼素ナトリウムで１元した
後０．０１　Ｎ塩酸１０１ｍ中に採シかつ１モル溶液の
形の硫酸鉄２５０μモルと混合した。窒素雰囲気下に作
業した。その後に０．０１Ｎ苛性ソーダ溶液で中和した
（、　ｐＨ＝　７．５　）。最後に、こうして得られた
溶液をアがロースカラム〔セファデックス（５ｅｐｈａ
ｄｅｘ　）　Ｇ　−２５、スエーデン国つプサラ在ファ
ーマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｕｐｐｓａｌａ、
　Ｓｃｈｗｅｄｅｎ　）　〕に装入した。水で溶離しか
つ溶離物を凍結乾燥することにより、鉄の負荷されたペ
プチド混合物が収量５１ｍ９で得られた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、以下のアミノ酸シーケンス： （γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ）＿ｎβ−Ａｌａ 〔式中ｎが２〜１１の整数である〕を特徴とするペプチ
   ド。 ２、ペプチド１モル当り金属陽イオン１〜４モルを含有
   することを特徴とする、特許請求の範囲第１項記載のペ
   プチド。 ３、以下のアミノ酸シーケンス： （γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ）＿ｎβ−Ａｌａ 〔式中ｎが２〜１１の整数である〕より成り、その１モ
   ル当り金属陽イオン１〜４モルを含有するペプチドを製
   造するに当り、 ａ）豆科からの植物原料を金属塩の作用下に培養し、 ｂ）ａ）により得られた植物原料を抽出することを特徴
   とするペプチドの製造法。 ４、以下のアミノ酸シーケンス： （γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ）＿ｎβ−Ａｌａ 〔式中ｎが２〜１１の整数である〕のペプチドを製造す
   るに当り、 ａ）豆科からの植物原料を金属塩の作用下に培養し、 ｂ）ａ）により得られた植物原料を抽出し、ｃ）ｂ）に
   よる抽出物を沈殿−および／または錯形成反応によりそ
   の金属含分と分離することを特徴とするペプチドの製造
   法。