CN104195207A - 一种罗非鱼抗氧化锌元素结合肽的制备方法 - Google Patents

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胡晓
李来好
杨贤庆
陈胜军
吴燕燕
郝淑贤
林婉玲
马海霞
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Abstract

本发明公开了一种罗非鱼抗氧化锌元素结合肽的制备方法，包括以下步骤：（1）以罗非鱼为原料，粉碎，加水，水温调节至50-60℃，加入木瓜蛋白酶和Alcalase中的一种或两种，酶解至水解度为15-22%，灭酶，离心后，取上清液，得酶解液；（2）将酶解液过截留分子量为1-10kDa超滤膜，取滤过液；（3）将滤过液通过已预先固载好锌离子的IMAC分离柱，然后用pH值为7.0-7.5的纯净水冲洗2-3个柱体积，再用pH值为4.0-4.5的纯净水进行洗脱，收集洗脱液；（4）将洗脱液经真空干燥和冷冻浓缩，得抗氧化锌元素结合肽。该方法较为简便，产品安全，可应用于实际生产。

Description

一种罗非鱼抗氧化锌元素结合肽的制备方法
技术领域
本发明属于功能性肽技术领域，具体涉及一种罗非鱼抗氧化锌元素结合肽的制备方法。
背景技术
功能性肽是指对生物机体的生命活动有益或具有特定生理作用的肽类化合物，其对保健食品及生化药物的开发具有极其重要的作用。其中，矿物元素结合肽即促矿物元素吸收肽，是一种具有螯合矿物离子能力的功能性肽，其可在pH值呈中性至微碱性的动物小肠下端，能与矿物离子，如锌离子等结合，阻止矿物离子与磷酸根产生沉淀，使小肠内可溶性的矿物离子浓度增加，并借助小肽的转运吸收特点和机制以螯合物整体的形式通过小肠被主动吸收，从而促进这些必需矿物离子的吸收和利用，可预防因矿物质缺乏而引起的各种疾病。此外，由于矿物元素结合肽可与金属离子螯合，能抑制以金属离子为辅酶或辅基的脂质过氧化反应，并减少由金属离子产生的活性氧，因此其可能具有一定的抗氧化活性。
近年来，以食源性蛋白为原料采用酶解法制备抗氧化肽已取得了很大的进展，获得了较多具有高抗氧化活性的肽段。但目前关于制备兼具抗氧化与促矿物元素吸收的双效功能性肽的方法尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种罗非鱼抗氧化锌元素结合肽的制备方法，该制备方法制备获得的罗非鱼抗氧化锌元素结合肽具有促进锌离子吸收的生物活性，是一种兼具抗氧化与促锌离子吸收的双效功能性肽。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：一种罗非鱼抗氧化锌元素结合肽的制备方法，包括以下步骤：
（1）控制酶解：以罗非鱼为原料，粉碎，加水，水温调节至50-60℃，加入木瓜蛋白酶和Alcalase中的一种或两种，酶解至水解度为15-22%，灭酶，离心后，取上清液，得酶解液；
（2）超滤分离：将酶解液采用截留分子量为1-10 kDa的超滤膜过滤，取滤过液；
（3）固定化金属离子亲和层析：将滤过液通过已预先固载好锌离子的IMAC分离柱，然后用pH值为7.0-7.5的纯净水冲洗2-3个柱体积，再用pH值为4.0-4.5的纯净水进行洗脱，收集洗脱液；
（4）真空浓缩、冷冻干燥：将洗脱液经真空干燥和冷冻浓缩，得抗氧化锌元素结合肽。
本发明的原理是：本发明先将罗非鱼酶解再经超滤后得具有抗氧化活性的酶解产物，然后采用IMAC分离柱从酶解产物中把具有锌离子结合能力的组分分离出来，即为抗氧化锌元素结合肽。经过鉴定，罗非鱼抗氧化锌元素结合肽的主成分结构为二肽结构，具体结构为Lys-Leu或Lys-IIe。
其中固定化金属离子亲和层析，即IMAC，是利用蛋白质、肽等表面暴露的一些氨基酸残基和载体之上的金属离子的亲和力的不同来进行分离纯化的技术，具有配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强等特点，适用于某些蛋白质、肽、氨基酸与酶的分离纯化。
在上述罗非鱼抗氧化锌元素结合肽的制备方法中：
步骤（1）中水的用量为罗非鱼原料总重量的2-3倍。
步骤（1）中灭酶时的温度为85-95℃，灭酶时间为10-20min。
步骤（1）中离心时离心机转速为4000-8000r/min，离心时间为15-30min。
其中步骤（1）中水解度的测定方法：水解度(%)=酶解液中游离氨基态氮含量/原料总氮含量×100，式中：酶解液中游离氨基态氮含量采用甲醛电位滴定法测定；原料总氮含量采用半微量凯氏定氮法测定。
步骤（2）中将酶解液先过截留分子量为3-10 kDa的超滤膜，再采用截留分子量为1kDa的超滤膜过滤，取滤过液；或将酶解液直接采用截留分子量为1kDa的超滤膜过滤，除去未酶解的蛋白，获得所需的小分子肽类。
步骤（3）中预先固载好锌离子的IMAC分离柱的制备过程如下：选取层析柱，先用0.05-0.2mol·L-1的ZnCl2或ZnSO4溶液冲洗0.5-2个柱体积，以实现锌离子在柱子上的固载，再用纯净水冲洗5-10个柱体积，去除未结合的锌离子，即制备获得预先固载好锌离子的IMAC分离柱。
本发明所述的层析柱优选为GE公司生产的HiPrep IMAC FF 16/10预装柱。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
（1）本发明方法制备的罗非鱼抗氧化锌元素结合肽具有与天然抗氧化剂谷胱甘肽相似的抗氧化性，安全无毒，在抗氧化保健方面具有优越性；
（2） 本发明方法制备的罗非鱼抗氧化锌元素结合肽具有促进锌离子吸收的生物活性，是一种兼具抗氧化与促锌离子吸收的新型双效功能性肽；
（3）本发明方法制备的罗非鱼抗氧化锌元素结合肽的制备工艺较为简便，产品安全，可应用于实际生产。
附图说明
图1为实施例1-4中获得的罗非鱼抗氧化锌元素结合肽的IMAC分离纯化图；
图2为实施例1-4中获得的罗非鱼抗氧化锌元素结合肽的总离子流图；
图3实施例1-4中获得的罗非鱼抗氧化锌元素结合肽的一级质谱图；
图4实施例1-4中获得的罗非鱼抗氧化锌元素结合肽的二级质谱图；
图5为实施例1中罗非鱼抗氧化锌元素结合肽的DPPH自由基清除率；
图6为实施例1中罗非鱼抗氧化锌元素结合肽的OH自由基清除率。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
第一部分罗非鱼抗氧化锌元素结合肽的制备方法
实施例1
本实施例提供的罗非鱼抗氧化锌元素结合肽的制备方法，包括以下步骤：
（1）以罗非鱼为原料，取肉绞碎，按照1:2的料水重量比加水，水温调节至50℃，加入木瓜蛋白酶，酶解至水解度为15%，85℃灭酶20min，再以转速为4000r/min离心30min，取上清液，得酶解液；
（2）将酶解液过截留分子量为1 kDa的超滤膜，取滤过液； 
（3） 将超滤液通过已预先固载好锌离子的IMAC分离柱，然后用pH值调节为7.2的纯净水冲洗2个柱体积，再用pH值调节为4.0的纯净水进行洗脱，收集洗脱液，其中预先固载好锌离子的IMAC分离柱的制备过程如下：选取层析柱，先用0.05-0.2mol·L-1的ZnCl2或ZnSO4溶液冲洗0.5-2个柱体积，以实现锌离子在柱子上的固载，再用纯净水冲洗5-10个柱体积，去除未结合的锌离子，即制备获得预先固载好锌离子的IMAC分离柱，采用的层析柱为GE公司生产的HiPrep IMAC FF 16/10预装柱；
（4） 真空浓缩经IMAC分离后的洗脱液，冷冻干燥得抗氧化锌元素结合肽，获得的罗非鱼抗氧化锌元素结合肽的IMAC分离纯化图如图1中所示，从图1中可以看出，图中第1个高峰是用pH值为7.0-7.5的纯净水冲洗2-3个柱体积后出现的峰，这个峰代表的组分是不能与锌离子结合的肽，因此被洗脱下来，这部分是不要的，能结合锌离子的肽此时被吸附在柱子上，其在酸性条件下可以被洗脱下来，因此用pH值为4.0-4.5的纯净水进行洗脱，收集到的洗脱液则为锌元素结合肽，为图中第2峰。
罗非鱼抗氧化锌元素结合肽的肽序结构测定采用电喷雾电离串联质谱分析(ESI-MS/MS, Bruker Daltonics Inc., Billerica, MA)。样品以流动注射方式注入电喷雾（ESI）质谱，采用正离子扫描模式，雾化气和干燥气为高纯氮气，气体流速为6L/min，气体压力为1.5Bar，扫描范围为质/核比50-1000 (m/z)，喷雾电压3.5kV。MS/MS肽序列分析借助BioTools (Version3.0，Bruker Daltonics Data Analysis 3.3)软件并结合手动计算。具体结果如图2-4中所示。经过鉴定，罗非鱼抗氧化锌元素结合肽的主成分结构为二肽结构，具体结构为Lys-Leu或Lys-IIe。
实施例2
本实施例提供的罗非鱼抗氧化锌元素结合肽的制备方法，包括以下步骤：
（1）以罗非鱼为原料，取肉绞碎，按照1:3的料水重量比加水，水温调节至55℃，加入Alcalase，酶解至水解度为17%，90℃灭酶15min，再以转速为6000r/min离心25min，取上清液，得酶解液；
（2）将酶解液先过截留分子量为5 kDa的超滤膜，以除去未酶解的蛋白，再过截留分子量为1kDa的超滤膜，获得小分子肽，取滤过液；
（3）将超滤液通过已预先固载好锌离子的IMAC分离柱，然后用pH值调节为7.3的纯净水冲洗2个柱体积，再用pH值调节为4.2的纯净水进行洗脱，收集洗脱液，预先固载好锌离子的IMAC分离柱的制备过程等同实施例1；
（4）真空浓缩经IMAC分离后的洗脱液吧，冷冻干燥得抗氧化锌元素结合肽，该抗氧化锌元素结合肽的IMAC分离纯化图如图1中所示。罗非鱼抗氧化锌元素结合肽的肽序结构同实施例1。
实施例3
本实施例提供的罗非鱼抗氧化锌元素结合肽的制备方法，包括以下步骤：
（1）以罗非鱼为原料，取肉绞碎，按照1:2的料水重量比加水，水温调节至52℃，加入木瓜蛋白酶与Alcalase（1:1，w/w），酶解至水解度为18%，95℃灭酶10min，再以转速为7000r/min离心20min，取上清液，得酶解液；
（2）将酶解液过截留分子量为3 kDa的超滤膜，以除去未酶解的蛋白，再过截留分子量为1kDa的超滤膜，获得小分子肽，取滤过液；
（3）将超滤液通过已预先固载好锌离子的IMAC分离柱，然后用pH值调节为7.5的纯净水冲洗2个柱体积，再用pH值调节为4.0的纯净水进行洗脱，收集洗脱液，预先固载好锌离子的IMAC分离柱的制备过程等同实施例1；
（4）真空浓缩经IMAC分离后的洗脱液，冷冻干燥得抗氧化锌元素结合肽，该抗氧化锌元素结合肽的IMAC分离纯化图如图1中所示。罗非鱼抗氧化锌元素结合肽的肽序结构同实施例1。
实施例4
本实施例提供的罗非鱼抗氧化锌元素结合肽的制备方法，包括以下步骤：
（1）以罗非鱼为原料，取肉绞碎，按照1:3的料水重量比加水，水温调节至53℃，加入木瓜蛋白酶与Alcalase（1:2，w/w），酶解至水解度为20%，90℃灭酶15min，再以转速为8000r/min离心15min，取上清液，得酶解液；
（2）将酶解液过截留分子量为10kDa的超滤膜，以除去未酶解的蛋白，再过截留分子量为1kDa的超滤膜，获得小分子肽，取滤过液；
（3）将超滤液通过已预先固载好锌离子的IMAC分离柱，然后用pH值调节为7.4的纯净水冲洗2个柱体积，再用pH值调节为4.1的纯净水进行洗脱，收集洗脱液，预先固载好锌离子的IMAC分离柱的制备过程等同实施例1；
（4）真空浓缩经IMAC分离后的超滤液洗脱液，冷冻干燥得抗氧化锌元素结合肽，该抗氧化锌元素结合肽的IMAC分离纯化图如图1中所示。罗非鱼抗氧化锌元素结合肽的肽序结构同实施例1。
第二部分罗非鱼抗氧化锌元素结合肽的抗氧化性测试
抗氧化性的测定方法：
2.1 DPPH自由基清除率的测定方法：取2mL样液（实施例1中获得的抗氧化锌元素结合肽，样品用纯净水溶解，下同）加入0.15mM DPPH (95%乙醇溶解)，混匀后于室温下避光反应30 min，在517 nm处测得其吸光值Ai，空白为2 mL 95%乙醇溶液代替DPPH溶液，加入2 mL样液混匀，在517nm处测得其吸光值Aj，对照组为2 mL DPPH溶液加入2 mL 95%乙醇，在517 nm处测得其吸光值A0。对样品溶液做梯度稀释，测定不同浓度下的自由基清除率，经线性回归后计算出自由基清除率为50%时的浓度，即IC50值。清除率按以下公式进行计算：清除率(%）=[1-(Aj-Ai) / A0]×100%，式中：A0为对照组吸光值；Ai为样品组吸光值；Aj为空白组吸光值，罗非鱼抗氧化锌元素结合肽的DPPH自由基清除率结果见图5，用公认的抗氧化剂谷胱甘肽做对照，DPPH自由基半清除率IC50值越低表明其抗氧化性越好，从图5中可以看出，本发明中的抗氧化锌元素结合肽的抗氧化性与抗氧化剂谷胱甘肽的抗氧化性两者没有显著性差异，具有相似的活性。
2.2 OH自由基清除率的测定方法：取0.6 mL 5mmol/L邻二氮菲的无水乙醇溶液，先加入0.4mL 0.15 mol/L的磷酸盐缓冲液(pH 7.40)和0.6mL 0.75 mmol/L的FeSO4，再加入2mL样品液混匀后，最后加入0.4mL 0.1% (V/V)的H2O2摇匀, 37℃下水浴60 min后在536 nm处测定得吸光值为A样品；以去离子水代替样品和H2O2溶液重复上述操作，在536 nm处测得其吸光值为A未损伤；以去离子水代替样品液来重复以上操作，在536 nm处测得吸光度A损伤。对样品溶液做梯度稀释，测定不同浓度下的自由基清除率，经线性回归后计算出自由基清除率为50%时的蛋白浓度，即IC50值。清除率按如下公式进行计算： 清除率（%）= (A样品–A损伤)/( A未损伤–A损伤) ×100%，式中：A样品为样品组的吸光值；A损伤为损伤管的吸光值；A未损伤为未损伤管的吸光值。罗非鱼抗氧化锌元素结合肽的OH自由基清除率结果见图6，用公认的抗氧化剂谷胱甘肽做对照，OH自由基半清除率IC50值越低表明其抗氧化性越好，从图6中可以看出，本发明中的抗氧化锌元素结合肽的抗氧化性与抗氧化剂谷胱甘肽的抗氧化性两者没有显著性差异，具有相似的活性。
本发明的实施方式不限于此，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更，均落在本发明权利保护范围之内。

Claims (7)

1.一种罗非鱼抗氧化锌元素结合肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）控制酶解：以罗非鱼为原料，粉碎，加水，水温调节至50-60℃，加入木瓜蛋白酶和Alcalase中的一种或两种，酶解至水解度为15-22%，灭酶，离心后，取上清液，得酶解液；
（2）超滤分离：将酶解液采用截留分子量为1-10 kDa的超滤膜过滤，取滤过液；
（3）固定化金属离子亲和层析：将滤过液通过已预先固载好锌离子的IMAC分离柱，然后用pH值为7.0-7.5的纯净水冲洗2-3个柱体积，再用pH值为4.0-4.5的纯净水进行洗脱，收集洗脱液；
（4）真空浓缩、冷冻干燥：将洗脱液经真空干燥和冷冻浓缩，得抗氧化锌元素结合肽。
2.根据权利要求1所述的罗非鱼抗氧化锌元素结合肽的制备方法，其特征在于：步骤（1）中水的用量为罗非鱼原料总重量的2-3倍。
3.根据权利要求1所述的罗非鱼抗氧化锌元素结合肽的制备方法，其特征在于：步骤（1）中灭酶时的温度为85-95℃，灭酶时间为10-20min。
4.根据权利要求1所述的罗非鱼抗氧化锌元素结合肽的制备方法，其特征在于：步骤（1）中离心时离心机转速为4000-8000r/min，离心时间为15-30min。
5.根据权利要求1所述的罗非鱼抗氧化锌元素结合肽的制备方法，其特征在于：步骤（2）中将酶解液先过截留分子量为3-10 kDa的超滤膜，再采用截留分子量为1kDa的超滤膜过滤，取滤过液；或将酶解液直接采用截留分子量为1kDa的超滤膜过滤。
6.根据权利要求1所述的罗非鱼抗氧化锌元素结合肽的制备方法，其特征在于：步骤（3）中预先固载好锌离子的IMAC分离柱的制备过程如下：选取层析柱，先用0.05-0.2mol·L-1的ZnCl2或ZnSO4溶液冲洗0.5-2个柱体积，以实现锌离子在柱子上的固载，再用纯净水冲洗5-10个柱体积，去除未结合的锌离子，即制备获得预先固载好锌离子的IMAC分离柱。
7.根据权利要求6所述的罗非鱼抗氧化锌元素结合肽的制备方法，其特征在于：所述的层析柱为GE公司生产的HiPrep IMAC FF 16/10预装柱。
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