JPS5953449A - エラスタ−ゼ抑制剤、その製法、それらを含有する薬剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は下記のＢＩ−３−Ｅ及びＢＩ−Ｓ−Ｅ（エラス
ターゼに対するＭｒ８０００を有する牛型の抑制物質）
と呼ばれる膵臓及び白血球エラスターゼに対する牛血清
からの新規抑制物質及びその製造方法及びその抑制物質
を含む薬剤に関する。

本発明に従うエラスターゼ抑制物質ＢＩ−Ｓ−Ｅは下記
のＢＩ−Ｓ−Ｔ（トリプシンに対するＭｒ３０００を有
する牛型の抑制物質）と呼ばれる構造的に均一なトリプ
シンーチモトリプシン抑制物質と共に、牛（ｃａｌ．ｌ
．ｌｔ・）のＩＴ１と略称されるインターα一トリプシ
ン（ｉｕｌ．＋｝じα−Ｌｒｙ１円団）から１段または
それ以上の酵素反応により放出され、そしてクロマトグ
ラフ法により純粋な形で製造される，ＢＩ−Ｓ−Ｅは、
Ｎ−アセチルニュウラミン酸、Ｎ−アセチルグルコサミ
ン、ガラクトーズ及びマンノーズの残基から形成された
炭水化物部分がペプチド鎖の２４の位置にあるＡｓｎの
側鎖によりＮ−グルコシド状に結合している糖蛋白であ
る。文献から公知の方法によりグリコシド法を分解する
ことにより、ＢＩ−Ｓ−Ｅから下記においてＢＩ−Ｓ−
Ｅ”と呼ばれる本発明による変形抑制物質が得られる。

両抑制物質、ＢＩ−Ｓ−Ｅ及びＢＩ−Ｓ−Ｅ”は第１表
からわかるように同一の抑制スペクトルを有する。ＢＩ
−Ｓ−Ｅは下記の構造を有する。

この構造は、活性点位置１５またはシエヒター及びベル
ガ−（Ｓｃｌ＋ｔ・ｃｌ＋ｌ．ｔ・ｒａｎｄ１３＋・ｒ
６ｃｒ）（１，Ｓｃｈｃｃｌ＋ｌ．＋′ｒａｎｃｌＡ．
１３ＱｒＢｃｒ，１３ｉｏｃｌ旧１｝，１３ｉｏ１＋ｙ
ｓ．ｌ＜（ｒｓ．ＣＯＩＩＩＩＩＩＬＩＩ１．２％、＋
５’？−ｆ６２（１９Ｇ７））の命名法によるＰ１にリ
ジン残基を有する、牛の器官から得られるＢＰＴＩ（塩
基性膵臓トリプシン抑制物貿、クニツツ（ｋｕ旧Ｌｚ）
抑制物質〕の構造と極めて類似しており、従って本抑制
物質はクニッツ（１（Ｌｌｌｌ酉ｌ）型の抑制物質と呼
ばれる。

本発明によるクニツツ型抑制物質の特異性を決定する位
置１５またはＰのアミノ酸残基はロイシンである。詠抑
制物質は膵臓及び白血球エラスターゼ、チモトリプシン
及びカテプシン（ｃａＬｌｌ（！Ｉ＋！シ団）Ｇの有力
な抑制物質である。従って該抑制物質は、酵素源からの
増加した放出または細胞崩壊中の放出の結果としてこれ
ら蛋白分解酵素の過剰生成によるかまたは器官及び組織
液体中の酵素の入然内生抑制物質の不足または欠損によ
り生ずる病気の治療に本発明に従い用いることが出来る
。

この型の病因を有する病気は種々の形のショック症、外
傷後または手術後の併発症、血液凝固症、急性及び慢性
の炎症、及び特に結合組織に対する壊死的及び変質的損
傷を伴う慢性の炎傷、例えば膵炎、及び免疫性複合誘発
脈管炎、糸球体腎炎、リウマチ様関節炎及び他の膠原症
、並びに代謝がら生する沈清により起る関節炎（痛風）
、更にまた血管壁の弾性要素の変質的変化（アテローム
性動脈硬化症）または肺の弾性要素の変質的変化（肺気
腫）である。

クニツツ型抑制物質〔八・ｌ．Ｋ＋ｕ＋ｉ１．２ａｎｄ
Ｈ．Ｈ．Ｎｏｒｌ．ｌＩｒｏｌ＋，．Ｊ．（．；（・ｎ
．円ｌｙｓｉｏｌ．］９＋ＣＪ’：）］（］！ノ３６）
）とも呼ばれるＢＰＴＩ〔Ｈ．ＫｒａｕｌＫ．Ｍｒｅｙ
ａ＋ｕＪＩ’．，ＷＬ１＋１ｃ．’／．“Ｉ”ｌ＋ｙｓ
ｉｏｌ．Ｃｌｔｑｎ．−１．．８】，１ノ７（１！Ｊ．
’｛（１））は多数の生埋的に重要な酵素、例えばキニ
ノゲニン（キニノゲナーゼ）、プラスミン、チモトリプ
シン及びトリプシン〔Ｅ．Ｗｅ−ｒｌｃｉｎＷ．１３ｒ
ｐｎｃｂｉａｎｄｃｉ，ＩＩａｌ＋ｔ》ｒｌａｎｄ：Ｎ
ｃｕｃ八ＳＩＩ（１１山１ｄ（ゝ＋′Ｉ’ｒａ：ｙｙｌ
ｏ１−１”ｌ＋〈ｌｒｕｌ＋ｉ（（Ｎｔ１ｕ＋／＼ｂｌ
ｌ（’Ｃ−１．！；ｏｆＴｒａｓｙｌｏｌＴｌ＋ｅｒａ
＋＋ｙ）ｓ−１’Ｊ＋Ｉ’．Ｋ．Ｓｃｌ１ｕＬｌ．−ａ
ｕ（Ｉｒ−Ｖ（ＪｒｌａＨＳｌ．ｕＬＬ８ａｒＬ−Ｎｅ
＋ＩＩＹｏｒｋＩ５ノ７２；及びＩＩ．Ｆｒｉｚｚ、Ｉ
Ｉ．Ｔｓｃｌ＋ｃｓｃｌ＋ｅ＋１−，．Ｊ，（ｉｒｃｅ
ｎｅａｎｄＩＥ．１”ｒｕｓｃ１＋ｅｉＬ（Ｉ艶ｄｉＬ
ｏｒｓ）：レｒｏＬ（ｌｉｎａｓｃｌｎｌｒｉｂｉＬｏ
ｒｓ（ＤｕｙｅｒＳｙ＋ｎｌ＋ｏｓｉｕｍＶ），Ｐｒｏ
ｃ．２ｎｄＩｎ−１（ｌｒｎａｌ．ｉｏｎａｌＲｔ＋ｓ
ｅａｒｃｌ＋Ｃｏｎｌ’（Ｉｒｃｑ＋ｃｔ１＋Ｓ１＋ｒ
ｉｎＨｔｌｒ−ｖｅｒｌａＩ；Ｉ３（！ｒｌｉｎ−１１
（Ｉｉｄｅｌｌ＞ｃｒ）；−Ｎｅｕ＋Ｙｏｒｋ］！Ｊ７
・１〕、を抑制し、そしてアプロチニン（一般名）とし
て、ショック症状の治療及び予防及び手術後及び外傷後
の併発症の予防に用いられることがすでに発表されてい
る。

また、下記においてＢＩ−３０と呼ばれるＭｒ３０，０
００を有する酸安定性の生理的ｌＴｌが人間血清の脱蛋
白のための方法と同様の方法で過塩素酸を用いて牛血清
の脱蛋白により得られることが知られている。〔Ｅ．Ｗ
ａ＜：Ｉ山・ｒ，Ｋ．Ｉ）＋甲川１円、Ｋ，ＩＩｏＪｐ
＋ｌ．ｒａｓ（＋＋−ｒ，Ｋ，Ｌ（ｑ川＋ＩＩｒｌ．ｔ
ｉｌｌＣＩ１＜．（ｉｔ｝ｉＨ（》ｒ，１・゛１・：１
う８１、（・山・ｒｓ（１９ｉｉ′ｆ１）］Ｉ！ノ、５
ト６冫〕．然しながら、人間の系とは対照的に、この上
澄液過塩素酸はまた他の蛋白分解酵素を抑制するがエラ
スターゼを抑制せずそして同様にクニッツ型抑制物質の
種類に属する、Ｍｒ８，０００の更に一つのトリプシン
抑制物質を含む。それはＩＴＩから生ずるものではなく
、下記においてＢＩ−８と呼ばれる。

更にまた、人間の系におけると同様ＩＴＩから生ずるク
ニツッ型の他の抑制物質が、ホッホシュトラツサ−（ｌ
Ｉｏｃｌ１ｓＬｒａｓｓｔ・ｒ）及び共同研究者により
人間の系について記載されているように、過塩素酸沈澱
物からトリプシン、プラスミン、エラスターゼまたはカ
リクレインのごとき過剰の蛋白分解酵素を用いて弱塩基
性溶液中で部分的に酸素加水分解することにより放出さ
れることが知られている。ＣＫ．ＩＩｏｃｂｓｌ．ｒａ
ｓＳｃｒ＋Ｃ：．１３ｒｃＬノｔ１ｌ，ＩＩ．ｌ’Ｔｊ
ｌｌ−ｌ．ｌｌ，Ｗ．ＩＩｉｌｌａａｎＪＫ．Ｌ．ｃ・
ＩＩＩＩ＋ａｒＬＩＩ．Ｓ，；’．，ｌ’ｌ＋ｙｓｉ−
ｏｌ．ＣＩＩ（ｑｎ．：３ユ？？ξｉ−７ｉ５３暑（３
ン゜（．１！］’７ｆ’ｉ））．人間の系から知られて
いるようにＣＶ．，ＷａｃｈＬ＜・＝ｒ＋Ｋ．ｌＩｏｃ
ｌ＋ｓＬｒａｓｓ（ｌｒ＋Ｇ．１３ｒｅＬｚｅｌａ＋＋
ｄＳ，Ｉ−１ｅｉｎｄ−１．Ｈ．Ｓ．Ｚ．Ｐｌ＋ｙｓｉ
ｏｌ．ＣＩ＋ｃｑｎ．３１ｊ（．），ｌ２！Ｊ７−］：
｛（１：｛（１！Ｊ’７！Ｊ）、この限定的蛋白分解に
より、異なった特異性を有するクニツツ型の２つの抑制
物貿がノ＼ｒＨ；−’ｌ’ｌ＋ｒ・結合により共有結合
的に結合した１．３１−１．：４と呼ばれるＭｒ１４，
０００の多価抑制物質が得られる。

本発明において、両領域の完全な抑制作用が保たれるよ
うに、弱アルカリ性溶液中で蛋白分解酵素を用いてＢ１
−１４を長時間処理することによりこのＡｒ８−Ｔｈｙ
結合を選択的に開裂させ得ることが見出された。

本発明によれば、この蛋白分解に適した蛋白分解酵素は
尿または膵臓からのカリクレイン、プラスミン及び特に
トリプシン、更にまた植物、菌または細菌からの蛋白分
解酵素である。該蛋白分解醇素は固体、不活性担体に結
合させた固定化した形で有利に用いることが出来る。固
定化トリプシン、好ましくはトリプシンーセフアローズ
を用いる場合、可溶性酵素を加えることが有利である。

抗トリプシン作用を有するＢ−１４のトリプシンーセフ
アローズへの結合は希薄溶液からでも完全であり、そし
て過剰に結合したまたは添加された可溶性トリプンンに
よる蛋白分解は担体上で進行し、そしてトリプシンを抑
制しない抑制物質のみが上澄液中に移動する。

抑制物質を基準にしてモル過剰のの蛋白分解酵素、特に
ＢＩ−１４により抑制される蛋白分解酵素が分解に用い
られる。この過剰量は１０〜４００％とすることが出米
、それは好ましくはＩ５０乃至３００％である。この反
応は６．５〜１０、特定的には７．５〜８．５のｐＨ値
を有する緩衝溶液中で行われる。適当な緩衝材はトリス
−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、トリエタノー
ルアミン、アルカリ金属の硼酸塩もしくは燐酸塩または
アルカリ金属炭酸塩を用いて製造される。適当ならは、
緩衝剤はまたジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキ
シドまたはへキサメチル燐酸トリアミドのごとき有機溶
媒及び／または添加剤としての塩類を含むことが出来る
。反応混合物の温度は好ましくは蛋白分解中３７℃に保
たれる。然しなから、分解はそれより低いまたは高い温
度で行うことも出来る。反応時間は１〜２４時間、好ま
しくは１〜１０時間である。分解は完全に進行しない。

未反応のＢＩ−１４のほかに、反応混合物は２つの加水
分解生成物ＢＩ−Ｓ−Ｔ及びＢＩ−Ｓ−Ｅ及び更に一つ
のＭｒ１４，０００のエラスターゼーチモトリプシン抑
制物質を含み、該エラスターゼーチモトリプシン抑制物
質において抑トリプシン中心は明かに変形されておりそ
して下記において該抑制物質はＢＩ−１４’と呼ばれる
。

本発明によるエラスターゼ抑制物質を得るための好まし
い出発物質は牛ＩＴＩからの直列のクニツツ型抑制物質
ＢＩ−１４である。すでに述べたことく、この酸安定性
の多価抑制物質は脱蛋白中に得られる沈澱物の限定的蛋
白分解により得られる。すでに知られているように、更
に比較的少量のＢＩ−１４及びその中間ＢＩ−３０を過
塩素酸沈澱の上澄液から分離することができる〔ｌ−：
．〜’ａｃｌ］ｌＯｒ．Ｋ．ｌ）（ｉＨｕ＋ｃｒ，Ｋ．
ＩＩｏｃｌ１：山ｕｓ：；（’ｆ’ＨＫ．Ｌｃ＋Ｂａｒ
ｌ．ａｎｄＲ，Ｃ：（Ｉｉ）；ｔ−ｒ，ｌ’ｌ；Ｉ｛Ｓ
Ｌ．Ｃｌ．ｌ．ｐｒｓ（１１ノ冫ｉ０）ＩＩ！ノ＋５ｉ
ｉ−６２）。

本発明によれば、ＢＩ−Ｓ−ＥはまたＢＩ−３０から出
発し、すでに列記された酵素、特にトリプシンを用いて
完全に蛋白分解により得ることも出来る。またＢＩ−１
４とＢＩ−３０の混合物または牛血清それ自体を用いる
ことら出来る。後者の場合、勿論かなり多量の酵素が分
解に必要であり、その理由は酸に不安定な抑制物質を先
づ中和または複合化しなければならないからである。従
って、すべての場合、抑制作用を有しない混在物貿、及
びＢＩ−１４、ＢＩ−１４、ＢＩ−Ｓ−Ｔ及び、牛血清
または脱蛋白中に得られる抑制物質フラクションまたは
固定化トリプシンを含む支持本を用いて可逆的複合化に
より得られた組ＢＩ−１４を用いるには、更にＢＩ−１
４のごとき抑制作用を有する物質から所望のＢＩ−１４
−Ｅが分離されねばならない。第１図はセファデックス
（Ｓｅ１＋ｈａＪ（・Ｘ）（：−，７．■カラムを用い
たＢＩ−１４トリプシン分解バッチの溶離曲線を示し、
カラム寸法は３Ｘ２０（ｌｃｍ、溶離剤はｐＨ８．０の
０．０５Ｍ硼酸塩緩衝液、塩化ナトリウムに関して０．
２Ｍであり、２４ｍｌのフラクションか捕集された。フ
ラクションの数が横座標に示されており、そして縦座標
は左側に溶離液の抗トリプシン活性度を示しそして右側
に抗エラスターゼ活性度を示す。トリプシンまたはエラ
スターゼの抑制のデータは溶離液１ｍｌ当りのミリ抑制
物質単位（ｍＩＵ／ｍｌ）で表わされる。

トリプシンの抑制は２．ｄ．に記載された方法で測定さ
れ、そして豚膵臓エラスターセの抑制は２．ｄ．に記載
された方法で測定された。曲線１はエラスターゼの抑制
度を示し、他方曲線２はトリプシンの抑制度に相当する
。

固定化されたトリプシンを用いる複合化がトリプシンに
対する抑制作用を有する物質を分離するのに特に適して
いる。このためには、分解に用いられる酵素は先づ好ま
しくは過塩素酸を用いる沈澱及び遠心分離またはろ過に
より除去される。中和しそしてｐＨ値を７．５至１０に
調節した後、抑制物質を含む溶液はトリプシンを付加し
た担体と混合されるかまたはこの支持体上で濾過される
。

ＢＩ−Ｓ−Ｅはトリプシンと複合化ぜす、そしてＢＩ−
１４はトリプシンと僅かな親和性を有するに過ぎない。

両者は中性の流出液中にまたは洗浄中のろ液中に得られ
る。ＢＩ−１４及びＢＩ−Ｓ−Ｅは好ましくは該混合物
を分子節カラムによりろ過することにより分離される。

適当な分子篩はセフアデックス（ｅｌ＋ｈａｄｐ）Ｇ−
５０、セフアデックスＧ−７５＠またはセフアデックス
Ｇ＝１００バイオ−ゲル（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ）Ｐ−３０、
バイオ−ゲルＰ−６０またはバイオ−ゲルＰ−１００の
ごとき交差結合デキストランである。ゲルろ過のためほ
特に適当な溶媒は酢酸のごとき高揮発性希酸、または蟻
酸アンモニウム溶液、重炭酸アンモニウム溶液または酢
酸アンモニウム溶液のごとき揮発性緩衝剤または塩の溶
液である。ＢＩ−Ｓ−Ｅを更に精製するには、抑制物貿
は中性または弱アルカリ性溶液から固定化チモトリプシ
ンを有する担体、好ましくはα−チモトリプシン−セフ
アローズに吸着せしめられ、そこで複合化が起る。不純
物を洗い出した後、複合木はバッチまたはカラム中でそ
れ自体公知の方法により酸性緩衝剤を用いる親和性担体
の処理により解離せしめられ、抑制物質が放出される。

複合本の解離かカラム中で行われる場合、溶離は比較的
小量の容積で行うことが出来る。更に限外ろ過により濃
縮を行うことが出来、塩は同時に除去される。然しなが
ら、上記の方法により分子節カラムにより濃縮物のろ過
により塩を分離することも可能である。

別法として、Ｂｌ−Ｓ−Ｅはまたコンカナバリン−Ａ−
セフアローズ（Ｃｏｎｃａｎ？ｖｕｌｉｕ−Ａ−Ｓｚ，
１＋ｌ＋ａｒｏｓ−（・■）を用いる吸着法により精製
することも出来る。

α−メチルグリコシドまたはα−メチルマンアシドの溶
液を用いて脱着する前に、水及び／または緩衝溶液を用
いて不純物を洗い出す。アミコン（Ａｍ−ｉｃｏｎ）Ｕ
Ｍ−２膜を用いる限外ろ過または分子篩カラムを用いる
ろ過により塩を除去した後、得られたＢＩ−Ｓ−Ｅを凍
結乾燥により分離することが出来る。

ＢＩ−Ｓ−Ｅを分離するには、ＢＩ−１４＋及びＢＩ−
Ｓ−Ｅを含むトリプシンカラムからのろ液または中性溶
離液を固定化チモトリプシンを含む担体と共に保温し、
それ以上操作を加えないのが特に有利である。抑制物質
と固定化酵素との複合化はバッチ中でまたは親和性担体
を充填したカラムを用いるろ過により行うことが出来、
結合は中性または弱アルカリ性溶液により行われる。

不純物を洗い出した後、抑制物質は好ましくは塩を含む
希酸溶液を用いて酸性にすることにより複合体から遊離
せしめられる。特に適した酸は塩酸または蟻酸及び酎酸
である。塩として塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを
用いることか好ましいか、他の無機塩及び塩化ナトリウ
ム、塩化グアニジニウムまたは尿素のごとき変性剤も適
している。遊離はバッチまたはカラムのいづれかで行う
ことか出来る。最後に、中和及び濃縮後、Ｂ１−３−Ｅ
はすでに記載した適当な分子篩を用いるゲルろ過により
すでに記載した遊離剤を用いて分離される。この方法で
は、塩は同時に除去される。

数回述べたごとく、ＢＩ−Ｓ−Ｅは凍結乾燥により分離
することが出来る。第２図はセファデツクスＧ−７５カ
ラム３Ｘ２００ｃｍの溶離曲線である。

カラムは塩化ナトリウムに関して０．２ＭでありｐＨ３
．０の０．０５Ｍ硼酸塩緩衝液を用いて溶離され、そし
て溶離液は２４ｍｌのフラクションで補集された。溶離
液において、特定のトリプシン抑制度は２．ｄ．に記載
された方法で測定され、豚膵臓エラスターセの特定の制
度は２．ａに記載された方法で測定され、そして抑制物
質単位が確認された（Ｉ１１１（ｉｎＬｉｌｊ＋ｌ．ｏ
ｒ旧■ｌ．）は２酸素単位を５０％抑制する抑制物質の
量に相当する）。縦座標には、左側にトリプシン抑制度
（曲線ＩＩ）が、ぞして右側にエラスターセ抑制度（曲
線■）がｍｉｌｌ／ｍｌの単位で示されており、そして
フラクション数が横座標に示されている。

然しながら最初に粗分解混合物からすでに記載された方
法により炭水化合物含有抑制物質をコンカナバリン〜Ａ
カラムに吸着させ、そしてすでに記載された方法で、混
在物質を洗い出した後に、α−メチルグリコシド溶液を
用いてカラムから脱着させることも出来る。この脱着物
質中に含まれる抑制物質はすでに数回記載された方法で
分子篩カラムを用いるゲルろ過により分離することが出
米、同時にα−メチルグリコシドと及び関係ある塩が分
離除去される。

本発明に従えば、下記においてＢＩ−Ｓ−Ｅ＋と呼ばれ
る炭水化物を含まないＢＩ−Ｓ−Ｅは凍結乾燥物からま
たは必要ならば濃縮された溶液から出発して、それ自体
公知の方法により炭水化物を酸を用いて分離することに
より得ることが出来る。

６０〜９０％の蟻酸を４０〜７０℃、好ましくは５６℃
の温度にて用いることが特に有利である。

然しなから、ＩＭ硫酸またはＩＮ塩酸のごとき他の酸を
５０乃至１００℃，好ましくは９０℃の高い温度にて用
いることも可能である。中和後、加水分解生成物及び酸
は例えばアミコンＵＭ−２のごとき規定された孔径のフ
ィルターを用いる限界が過によりまたは溶液の濃縮後ゲ
ルろ過によるろ過によりＢＩ−Ｓ−Ｅ”から分離される
。

抗本を含む親和性担体、特定的にはモノクロナル（ｍｏ
ｎｏｃｌｏｎａｌ）抗体を用いて本発明による抑制物質
を分離することも出来る。

すでに述べたごとく、本発明によるエラスターゼ抑制物
質ＢＩ−Ｓ−Ｅ及びＢＩ−Ｓ−Ｅは抑制物質の特異性を
定めるペプチド鎖の位置Ｐ，のロイシン残基を有する。

合成基質及び抑制物質の白血球エラスターゼ、膵臓エラ
スターゼ、チモトリプシン及びカラプシンＧに対する親
和性に関する研究において得られたパワーズ（Ｐｏｗｅ
ｒｓ）及びチンマーマン（ｌｉ＋１）の研究グループの
結果によればＣＭ．×ｉｍｍｃｎｎａ＋＋ａｎｄＢＩ−
１４．Ｍ．ノ＼ｓｌ１（Ｉ＋Ｉ’３ｉｏｃｌ＋ｉ−ロ＋
．ＢＩ−１４ｉ＋月＋ｌｌｙｓ．ノ＼ｃＬａ．．ｊ．ｊ
：（．ＩＨ’ｔビ４１（．１（）’ｉ７）；．Ｊ，Ｃ．
Ｉ’４１１１１＋−１’８＋ｌ｛，１″，Ｌ：１１１１
１．０１１．Ａ，ｌ）．ｌＩａ＋ｉｔ１ｙ＋Ｎ．Ｎ−ｉ
ｓｌｌｉｏ＋＋１１１１（ＩＲ．Ｃ，Ｗｌ＋ｉＬｌｔＩ
ｙ，ＢＩ−１４ｉｏｃｌ目＋ｎ．ｌ｛ｉｏｌ＋ｌ＋ｙｓ
−Ａｒ山−：’ｌｊ！−５．ｌ］５６（］９７゜７）；
Ｍ．Ｃａ！＋ｌ．ｉｌｌｏ，Ｋ．Ｎａｋａ，ＢＩ−１４
＋ｎａ＋Ｉ’ｔ’ｌ．ｌｉ１ｌｕｎｔｌｎｎｕｎ＋１１
１（１．Ｊ．（ニ．ｌ’（ｌｕｆ’ｆ’ｓ＋Ａｎａｌｙ
ｌ．．ＩＪｉｏ（二ＢＩ−１４（・＋ｎ．！Ｊ−：），
５．’４（１９７！））ａｎｄＫ，Ｎ−ａｋＩｊｊｉ＋
ｎａ＋．Ｊ．Ｃ．Ｉ’０１１１ｉ’ｌ’Ｓ＋ＢＩ−１４
．Ｍ．ｔ＼：；ｌＩｅａｎｄＭ．７．ｉ＋１１１ｆｌｅ
ｒｍｌｌｌｌ＋．Ｊ．ＢＩ−１４ｉｏ１，（二ｌｌｆ’
ｌｌ＋．２’，＋−１＋４．０２７（１″）７ＱＬＬｅ
ｕＩ５抑制物質のすべてのこれらの酵素に対する良好な
抑制作用は驚くべきことである。

本発明による抑制物質はＢＰＴＩより優れた生物的特性
を有する。膵臓及び白血球からのエラスターゼ及びカテ
プンンＧに対する抑制作用は特に有利でありそして治療
的用途の新しい可能性を開くものである。膵臓エラスタ
ーゼは膵炎において重要な役割を演しＣＭ，Ｃ．Ｇｃｏ
ｋａｓ，ＢＩ−１４．Ｒｉｕｃｌｐｒｋｎ−ｅｃｌＩＬ
．Ｖ．８１１１１１１１８０１１１ＢＩ−１４．１’．
Ｖｉｌ．ｒｏｎａｎｃｌＢＩ−１４．ｊ．ｌ−１ａ−ｖ
ｅｒｂａｃｋ，ＣＢＩ−１４ｎ．Ｒｐｓ−ＩＧ，２０５
（＋！］６ＢＩ−１４）Ｇ血清エラスターゼはアテロー
ム性動脈硬化症において重要な役割を演じＣＬＪ，ＢＩ
−１４ｕＬｌ．ｕｒｉｎｉａｎｄＮｉ．１−ａｎ８ｅｎ
，ＫＢＩ−１４ｎ．ＷｏＪ＋ｅｎｓｃｌＩｒ．／Ｌｆｌ
＋４２７（１！ＪＧ２）〕、そして白血球エラスターゼ
は結合組織への損傷を伴う急性及び慢性炎症ＣＡ．．Ｊ
ａｎｏｒｒ＋Ａ＋ｎｃｒ．Ｊ．ｌａＬｌ＋ｏｌ．ＧｉＬ
！’ｉ７！Ｊ（＋！Ｊ７２）］、血管壁に対する損傷〔
ノ〜．Ｊａ＋＋ｏｒｒ１１１１４１．Ｊ．１つ．Ｚｅｌ
ｉｇｓ，ＳｃＩｐｎｃ＜・Ｉ−Ｇ↓−，７０２（］！ノ
６８）〕及び壊死症及び例えば肺組織の変性、気腫［Ｇ
．Ｍ．’ｌ’ｕｒｉｎｏ，ＲＪ４．Ｓｅｎｉｏｒ＋ＢＩ
−１４，１），Ｇａｒ）；，Ｓ．Ｋｃｌｌｅｒ，ＭＪ４
．１．ｅｖＢＩ−１４ＩｎｄＩ．Ｍａｎｄｌ，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅＩＧ５．７（Ｊ！ノ（１９（ｉ！Ｉ）；ＢＩ−１
４．Ｉ・，．１・：νｆｉｌ１・＋島］Ｊ４，ｌ．ｔ・
νｉａ＋１ｄｌＪ・ｌｌｌｌｌ−ｄｌ，ＡＩｌｌ（・＋
、Ｒｔ・ν．１く《・・＋１＋ｉｒ．ｌ）ｉ！，，Ｉｆ
ｌＩ．３．”）！＋（＋５ノ゜７（１）Ｉ１ｎｄｉ＼．
．ＪＩＪＩＤＢＩ−１４ｒｌ１＜．ｉ＼，３Ｈｌ（Ｉｈ
ａｕｓ，＼’，Ｉ）．１１ｏ：中＋・ｌｌ１ａｒｎ＋ｎ
＋ｄＲ．Ｒｏｓ＋ＪＪＬ′＋’ｂ＋Ｉ”ｒｏｅ，Ｓ（１
（：．ｌ゛．’Ｘ−１＋ｌ．ｌ．１１ｉｏ１．へ・ｌｐ
ｄ．ｊ，ｊＱ，．’＋１６（１！］’７２）：Ｉの場今
において重要な役割を演じる。免疫的起源の炎症反応（
Ｍ，ＫＢＩ−１４ＯＢＩ−１４Ｌ），Ｍ．Ｍｕｌ．ｏａ
ｎｄＢＩ−１４．Ｉｌａｙａ：；ｂｉ＋１’Ｏｉｌ＋Ｉ
ｋＬＩ．１．ｌハ１＋ｌｌ．ｈ１１ｅｄ．−！）．ｉ，
２：｛＋（１４ノ６；；）〕、例えばリウマチ様関節炎
Ｇ．〜’ｆ’！！ｉｓｌＩｌａｌｌｌｌａｎｄ，Ｊ．Ｓ
１＋ｉｌｂ（Ｉｒ）；，／＼１゛１１旧ｌ．ｉｓ旧ｌ（
１ｔｕｎａｌ．ｊｌ＋１６２（１！ノｒ’ｒ：；））に
おけるリソソマル（ｌｙｓｏ！−；ｏ＋ｎ−Ｉｌ１）酵
素及び特に白血球エラスターセの役割は同しく重要であ
る。

本発明による抑制物質の更に一つの利点はその低い抗原
性及び免疫性である。即ち、ＢＩ−１４は抗ＩＴＩ抗体
と反応するが、ＢＩ−Ｓ−Ｅ及びＢＩ−Ｓ−Ｅは反応し
ない。

従って、本発明による新規の抑制物質を提供することは
医薬の分野を強化することである。牛血清から得られる
本発明による抑制物質は新規である。該物質は化学的、
物理化学的、生化学的及び物理学的特性により特徴づけ
られそして公知の物質に関係づけて明示することが出来
る。下記の基準が用いられた。

１．アミノ酸配列の測定 ＢＩ−Ｓ−Ｅ”３００ｍｇを還元しそしてシスティン残
基のメルカプト基をクレストフィールド（Ｃｒ−ｅｓｌ
ｆｉｅｌｄ）及び共同研究者により記載された方法でカ
ルボキシメチル化した〔Ａ，Ｍ．ＣｒｅｓＬｒｉｅｌｃ
ｌ，Ｓ．ＭｏｏｒｅａｎｄＷ，ＩＩ．ＳＬｅｉｕ，Ｊ．
１３ｉｏ１．ＣＩＩ（’Ｉ１１．２−；｛−谷．Ｇ２２
−（；２゜７（１！〕６３））過剰の試薬をバイオーゲ
ル（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ）Ｐ−２を用いるゲルろ過により分
離した後、抑制物質の分割した部分をチモトリプシン及
びトリプシンを用いて酵素的に分解し、後者の場合もそ
れ自体公知の方法でシトラフニル化した後に行った［Ｋ
．Ｉ−］ｏｃｌ＋ｓｌ．ｒａＳｓＩ！ｒａｎｄ１：．Ｗ
ｄｃｌ＋Ｌｃ・ｒ＋Ｈ．Ｓ，χ．ＰＩ＋ｙｓｉｏｌ．Ｃ
Ｉ＋ｅ＋ｎ．３ＧＯ＋１冫ｉｊ７−１２０６（＋’．）
７９））この結果得られた物質の混合物は、上記の研究
のホツホシユトラツサー（ＩＩｏｃｌ＋！；ｌｒａ：；
：；＋・ｒ）及びワッヒター（ＷＩ１（：ｌ山・−『・
）により記述されたごとくイオン交換クロマトグラフ法
及びゲルクロマトグラフ法によりその成分に分離された
。個々の成分のアミノ酸配列はＲ．Ａ．ラウルセン（１
．ｄｕｒ！；（・ｕ）による固相シークエンシエーター
（ｓｅｕｕｅｎｌ．ｉａｔｏｒ）によりエドマン（１：
ｄｍｕ−＋＋）分解法により測定された［１＜．ノ＼．
ｌ．ａｕｒｓｐｎ＋ｌ：ｕ−ｒｏｌ＋．．Ｊ．１３ｉｏ
ｃｈｃｍ．．２−＋ｌｉｉ＋１−！ＪＩ（１！Ｊ７１）
。

相当する部分配列の相互の並び方により、ＢＩーＳ−Ｒ
の全体的配列が測定された： ２、蛋白分解酵素抑制スペクトル ａ）エラスターゼ抑制 ａ）膵臓エラスターゼ抑制 ニュートリショナル・バイオケミカルｌ（Ｍｃｓｓ−ｒ
ｓ．ＮｕｌｒｉＬｉｏｏａｌ１３ｉｏｃｌｎｑｎｉｃｕ
ｌＣ：ｏｒ＋＋．）からの糸占晶臓エラスターゼ（豚）
を本発明による抑制物貿による抑制実験に月１いた。基
質としてサクシニルーＬ−５−アラニルーＬ−アラニル
ーＬ−アラニンーｐ−ニトロアリニド〔．Ｊ．ｌＪｉｃ
Ｌｂ，ＩＪ．Ｓ１＋ｉｅｓｓａｎｄＣ．（ｉ．Ｗｃ−ｒ
ｍｕｌ．ｌ＋，１３ｉｏｃｌ１（・ｍ．Ｍ（Ｊ．ｌ１４
．’３５ｆｌ（１！Ｊ’７，・ｌ）］を用いた。加水分
解は遊離されたｐ一ニトロアニリンの４０５ｎｍにおけ
る吸光度を連続的に測定することにより観測された。最
高複合度を確認するために、酵素及び抑制物質は基質の
添加前に１５分間予備保温された。

この場合に関する抑制物質について酵素の抑制度に関す
る半定量的データを第１表に集録する。

第３図は本発明によるＢＩ−Ｓ−Ｅを用いる膵臓エラス
ターゼ（豚）の滴定曲線を示す。エラスターゼの総体活
性度が縦座標にプロットされておりそして抑制物質の量
（ｎモル単位）が横座標にプロットされている。

β）白血球エラスターゼ抑制 基質としてサクシニル−Ｌ−アラニルーＬ−アラニルー
Ｌ−アラニンーｐ−ニトロアニリド〔Ｊ．Ｂｉｅｔｈ，
１３．Ｓ１＋ｉ（−：；８１１１１＋ＩＣ．Ｇ，Ｗ＋｝
ｒ１ｎｕｌ．ｈ，ｌ（ｉｏｃｌｕｑｎ．ヘ’ｌｐｄ．ｊ
ｊ−．．’｛．”）ｆｌ（１！４７４）］を用いた。こ
の場合に関する抑制物質について白血球エラスターゼの
抑制度に関するデータを第１表に示す。

ｂ）チモトリプシン抑制 チモトリプリンの活性度を、サクシニルーＬ−フエニル
アラニン−ｐ−ニトロアニリドを基質として用い、Ｗ．
Ｎａ８（・ｌ計’．Ｗｉｌｌｉｇ，’ｖＶ．Ｉ’ｃ・：
；ｃｌ＋ｋｃａｎｄ１”．Ｈ，ＳｃｌｕｎｉｄＬ＋ＩＩ
．Ｓ．７．．円１ｙｓｉｏｌ，ＣＩｕ・ｍ．；｛４カー
，Ｉ（１！ＪＧ５），の方法により光度測定法により測
定しそして加水分解を遊離されたｐ−ニトロアニリンの
４０５ｎｍにおける吸光度の連続測定により測定した。

酵素及び抑制物質は基質の添加前に１５分間試験緩衝液
中に保温した。

シユナーベル（Ｓ（二１団ａｌノｃｌ）［１死．Ｓｃｌ
ｕ＋ａｌノ（ゝ１，ＩＩ．Ｓ．：／．．Ｉ’ｂｙ！ｉｉ
ｏｌ．（二二ｌＩｃｍ，；ｊ−６２，Ｇ５５−Ｇ（ｉ／
Ｌ（１！Ｊｉｊｌ）］により記述された連続試験におい
て更に一つの基質としてサクシニルーＬ−フエニルアラ
ニンーβ−ナフチルエステルが用いられた。酵素及び抑
制物質は基貿の添加前に１０〜１５分間室温にて試験緩
衝液中で予備保温された。

第１表に、この上易今に関する抑制物貿についてのチモ
トリプシン抑制度に関するデータか示されている。

ｃ）カテプシンＧ抑制 カテプンンＧの活性瓜もＥ．シュナーヘル（Ｓｃｈ−＋
＋ａｂ＋ｌ）ＣＩＩ，Ｓ．シー．円１ｙｓｉｏｌ．（二
ｈｅｍ，Ｉ３［ｉ２，Ｇ．’）５−＋５６−？１（１！
Ｊ８］）〕の方法によりサクシニル−Ｌ−フエニルアラ
ニン−β−ナフチルエステルを用いて測定された。

第１表に、この１易今に関する抑制物質についての抑制
度に関するデータが示されている。

ｄ）トリプシン抑制 トリプシン活性度は、基質としてベンゾイルーＬ−アル
キニンーｐ一ニトロアニリドを用いて、Ｈ．フリツツ１
・１・１１ノ〕、Ｌ．トラウトシヨルド（ｉ’ｒａ−ｕ
ｌｓｃｌ１ｏｌｄ）及びＥ．ベルレ（Ｗｃｒｌ（・）に
よる方法により測定された［：ｉｎＭｒ１．ｌｕ）（Ｉ
ｎ＋ｄｔ１ｒｃｑ＋ｚｙ＋ｎａｌ．ｉｓｃｌ旧ＩＡｎｕ
ｌｙｓ（値へｋｌ．ｌ１ｏｄｓｏｒ旨ｚｙ＋ｎａｌ．ｉ
ｃｔ旨ｕｌｙ！；：Ｓ）ｇＩＩ．’ｖＶ．ＩＪ（！ｆ’
ｌｉｌ１１ｆ’ｙｆ’ｌ’ｃｔｌ，，２ｎｕｌ：ｄｉｌ
．ｉｏｎ．ＶｏｌＬｌｌｌｌ（ｌＩ＋］（１１１（１！
ノ゜７（’ｌ，ｌ：ｌ遊離したｐ−ニトロアニリンは４
０５ｎｍの波長にて吸光度法により観測された。

酵素及び抑制物質は基質の添加前に１５分間予備保温さ
れた。この場合に関する抑制物質によるトリプシンの抑
制度に関するデータが第１表に示されている。

更に、本発明による抑制物質は急性炎症の場合の予防的
且つまた治療的作用を有することが見出された。炎症病
毒が固定した後数時間後に抑制物質を投与した場合、炎
症反応は若しく抑制される。

この抑制物質の治療作用は保持時間か長いことに原因が
あり、その結果実験動物体中の作用及び抑制スペクトル
かより長く有効となることによる。

ラットにおける抗炎症作用を例示するための実験方法 ａ）カオリン誘発性炎症反応 体重１３０〜１６０ｇのウィスタル（Ｗｉｓｌ．ａｒ）
ラットの後足に１０％カオリン懸濁液０．１ｍｌを足底
内注射することにより炎症反応を誘発させた。

炎症反応の処置に用いられた本発明による抑制物質は０
．９％塩化ナトリウム溶液に１０〜２０ｍｇ／ｍｌの濃
度にて溶された。実験動物は、予防的に、即ち炎症病毒
が固定する前に、または治療的に、即ち炎症病毒が固定
した後に、抑制物質の０．５〜１．０ｍｌ溶液を腹腔内
、筋肉内、皮下または静脈内注則することにより処置さ
れた。灸傷反応の重症度の尺度である炎症を起した足の
膨化なケムバー・アンチフログメーター（Ｋ（Ｉ＋叩（
ｌｒ１１１１１印旧ｏ６一＋ｎｃｌ．ｐｒ）により時間
の関数として観測した［：Ｆ．Ｋｅ−町＋ｃｒａｎｄ（
ｉ．Ａ＋１１ｅｌｎ，Ｚ．Ｂｅｓ，ｅｘｌ＋．Ｍｃｄ．
１３１−＋＝・ｌ（１７−４１１（］５）５！〕）］。

炎症病毒が固定した後４時間後に測定した値を用いて服
用量と効果の関係を測定した。

作用の比較は本新規抑制物質がＢＰＴＩより優れた抗炎
症作用な有することを示している。

ｂ）エーロシル（Ａｅｒｏｓｉｌ）誘発性炎症反応体重
１３０〜１６０ｇのウィスター・ラットの後足に２％エ
ーロシル懸濁液０．１ｍｌを足底内注射することにより
炎症反応を誘発させた。炎症反応の処置に用いられた本
発明による抑制物質は０．９％塩化ナトリウム溶液に１
０〜２０ｍｓ／ｍｌの濃度にて溶された。実験動物は、
炎症病毒が固定した後１５時間後に抑制物質の溶液０．
５〜１．０ｍｌを腹腔内、皮下または静脈注射すること
により処置された。炎症反応の重傷度の尺度である炎症
を起した足の膨化をケムバー・アンチフログメーターを
用いて時間に関して追跡した。炎症誘発後２１時間１１
の値（＝本発明による抑制物質の注射Ｇ時間後）を測定
して服用量と効果との関係を確かめた。

実施例による本新規抑制物質を用いる治療実験の結果は
この実験モデルにおいて用いられた抑制物質の作用を示
しており、同服用量のＢＰＴＩは炎症反応を抑制しない
。

生物的作用に基つき、牛ＩＴＩから製造された本発明の
新規抑制物質は特定的には下記の病気または症状の処置
に用いることか出来る：１．種々の形のショック症、特
定的にはショック肺及び内毒素ショック、及び外傷後及
び手術後の併発症、 ２．血液凝固症、 ３．急性及び慢性炎症反応、特定的には例えば膵臓のご
とき器官損傷、及び照射誘発性腸炎、免疫複合体により
発生する炎症反応、例えば免疫性脈管炎、糸球木賢災及
び関節炎、及び膠原症、特定的にはリウマチ様関節炎の
治療及び予防、４、代謝から生ずる沈積物により発生す
る関節炎（例えば痛風）、 ５．アテローム性動脈硬化症または肺気腫の場合のごと
き、器官の結合組織の弾性成分の変性、及び ６、照射誘発性関節炎。

本発明の新規活性化合物は（ＢＰＴＩと同様に）公知の
方法により通常の組成物に転化することが出来る。

好ましいものとして次の組成物をあげることが出来る： １．静脈内、筋肉内もしくは皮下注射壕たは関節内およ
び腫瘍内注射のための非経口的用途のための溶液、 ２連続静脈内注入用の溶液、 ３吸入用エーロゾルとして用いるだめの溶液、４外部局
所投薬用の溶液、乳濁液、軟膏、ペースト、クリーム、
ローションまたは粉末、及び５抑制スペクトルを互いに
補う他の抑制物質との組合せ。

本発明による組成物中の新規活性化合物の濃度は溶液１
ｍｌ当り０．０１乃至１００ｍｇ好ましくは溶液１ｍｌ
当り０．１乃至１０ｍｇの範囲で変化する。

新規活性化合物は通常の方法で用いることが出来、そし
て特に好ましいものとして下記の投与方法があげられる
： ａ）非経口投与：静脈内、筋肉内、皮下、関節内及び腫
瘍内、 ｂ）局所投与：例えば鼻孔内、及び Ｃ）経口投与。

本発明の新規活性化合物に関して次の投与量範囲を記す
ことができる： 体重１Ｋｇ当り活性化合物Ｏｌ〜２０ｍｇ，好ましくは
体重ｌＫｇ当り活性化合物１乃至１０ｍｇ、投与量はと
りわけ処置されるべき種類及び投与形態に依存する。

本発明による新規活性化合物は人間及び動物に用いるこ
とが出来る。

実施例ｌ ａ）生理的牛ＩＴＪの分離及びＢＩ−８’の分離７０％
過塩素酸（２５７ｍｌ）４２８．６５’を牛血清１０リ
ットル中に室温にて十分攪拌しながら加え、そして沈澱
した蛋白質を混合物を２時間放置した後に遠心分離した
（４０分、３０００ｇ）。

沈降物は天然及び関係ある場合には部分的に分解したＩ
ＴＩの大部分を含みそしてｂ）に記載されている方法で
Ｍｒ１４，０００を有する多価抑制物質を得るために用
いられた。

透明な遠心分離液を５Ｎ水酸化カリウム溶液（約６００
ｍｅ）を用いて中和しそして沈澱した過塩素酸カリウム
をろ過分離した。ろ過残渣を、２８０ｎｍの吸収をろ液
が示さなくなるまで水洗した。次に溶液のｐＨ値を２Ｎ
水酸化カリウム溶液を用いて７．８に調節し、そしてト
リプシンーセファローズ４Ｂを、すべての抗トリプシン
活性物（５６抑制物質即位）が結合するまで、ゆっくり
機械的に攪拌しながら添加した。トリプシン抑制物質と
複合化したトリプシンーセファローズをシンターガラス
ろ斗を用いて懸濁液を吸引涙過することにより分離した
。ろ過残渣をｐＨ７，８の０．２Ｍトリエタノールアミ
ン／塩酸緩衝液、０．２３Ｍ塩化ナトリウム５００ｍｌ
を用いて洗浄し、そして０．２Ｍ塩化カリウム／ｐＨ１
．５塩酸溶液２５０ｍｌ中に懸濁させた。該懸濁液を２
０℃にて２時間放置した後、それをカラム（５×３０ｃ
ｍ））を用いて、塩化カリウム／塩酸溶液で２８０ｎｍ
での吸収が最早見られなくなるまで溶離した後（全容積
約５００ｍｌ）、ろ過した。溶離液のｐＨ値を水酸化ナ
トリウム溶液を添加して７．８に調節しそしてアミコン
ＵＡ１−２膜を用いる限外沖過により容積を２５ｍｌに
減じた。残った物質をセファデックスＧ一７５、微粒子
（カラム３×２００ｃｍ）を用いて、溶離剤としてｐＨ
７．５の０．００５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液によりろ
過した。溶離液をたの抗トリプシン活性度に従って３つ
のフラクションに分割した： １．Ｊ１ｒ３０，０００を有する生理的ＩＴＩ（βＩ−
３０）（約５抑制物質単位；溶離容積４５０〜６００ｍ
ｌ） ２．Ｍｒ１４，０００を有する変性ＩＴＪ（Ｂ１〜１４
）（約２０抑制物質単位；溶離容積６００〜７９５ｍｌ
） ３．Ｍｒ８，０００を有する血清抑制物質（ＢＩ〜８＋
）（約２５抑制物質単位；溶離容積７９５〜９７５ｍｌ
） ｂ）多価直列型抑制物質ＢＩ−１４の分離α）に従って
分離された過堪素酸沈澱物を水７リットル中に懸濁させ
た。該懸濁液に５Ｎ水酸化カリウム溶液をｐＨが８，０
になるまで添加し、そして該混合物を２０℃にて１２時
間攪拌することにより均質化した。次にセファデツクス
Ｇ−７５クロマトグラフからのＩＴＩフラクション１を
懸濁液に加えそして該混合物のｐＨ値をＩＮ水酸化ナト
リウム溶液を用いてｐＨ８．０に再調整した。

反応混合物を３７℃に加温した後、牛トリプシン３ｇを
加えた。該混合物を３７℃にて１時間徐々に機械的に攪
拌した。次に該混合物に７０％過塩素酸３２５ｇ（ｌ９
３ｍｌ）を十分攪拌しながら添加し、そして該混合物を
室温にて２時間放置した後、生成した沈澱を遠心分離（
４０分、３０００ｇ）により分離した。遠心分離物を５
Ｎ水酸化カリウム溶液を添加して中和しそして沈殿した
過塩素酸カリウムをろ過により除去した。ろ液のｐＨ値
を次に水酸化カリウム溶液を用いて７．８に調節し、そ
して溶液の全抗トリプシン活性物（１０５抑制物質単位
）が親和性担体に結合するまで、トリプシンーセファロ
ーズをゆっくリ攪拌しつつ一部分づつ添加した。固定化
した酵素一抑制物質枚合体をシンターガラスろ斗を用い
て吸引ろ過によりａ）に記載された方法で分離した。ｐ
Ｈ１．５の０，２Ｍ塩化カリウム／塩酸溶液中にトリプ
シン−セファローズを加えた懸濁液をろ過することによ
りａ）に記載された方法で酸安定型トリプシン抑制物質
の溶液を得た。このトリプシン抑制物質溶液を５Ｎ水酸
化ナトリウム溶液で中和した後、該浴液を真空蒸発によ
り約５０ｍｌまで濃縮しそして該濃縮物をセファデツク
スＧ−７５カラム（３×２００ｃｍ）により溶離剤とし
て０．０１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液を用いてろ過した
。ＢＩ−１４を含む溶離液（溶離容積６００〜８００ｍ
ｌは１フラクション当り１５ｍｐの容積にてフラクショ
ン４０〜５４に相当する）をアミコンＶＡｆ−２膜を用
いる限外ろ過により２５ｍｌの容積まで濃縮し、そして
この溶液からバイオゲルＰ−２カラム（５×５０ｃｍ）
により溶離剤として水を用いてろ過することにより塩を
除去し、それぞれ２００〜４００ｍｌ及び４５０〜５６
０ｍｌの溶離容積を有する二つの蛋白ピークを浴離させ
、塩酸を用いてｐＨ１．５に調節した０．２Ｍ塩化カリ
ウム溶液を用いてカラムを溶離させて、セファデツクス
Ｇ７５を用いるクロマトグラフ法によりＢＩ−８”が前
以って除去されていなかった場合には、ａ）に記載され
た方法で更に一つのピークを洗い出した。ピーク１から
凍結乾燥によりＢＩ−１４１００〜１１０ｍｇを分離し
た（用いた抗トリプシン活性度の５０〜５５％）。ビー
クｌ及び塩化カリウム溶離液は各々トリプシンのみを抑
制する抑制物質３５ｍｇを含んだ（各々の場合用いた抗
トリプシン活性度の７％）。ＢＩ−１４の抑制作用の状
態は第１表から知ることが出来る。

ｃ）エラスターゼ抑制物質ＢＩ−８−Ｅの分離ｂ）に従
って得られたＢ１−１４２００ｍｇ（１４３μモル）を
ｐＨ７．８の０．２Ｍトリエタノールアミン／塩酸緩価
液７５ｍｌに溶解しそして該溶液を同じ緩価液に溶解し
たトリプシン８００ｍｇ（３０μモル）と共に３７℃に
て２時間保温した。

該溶液に次に７０％過塩素酸７．５ｍｌを添加しそして
混合物を６時間放置した後沈澱物を遠心分離（３０分、
５０００ｇ）により分離した。遠心分離物を５Ｎ水酸化
カリウム溶液（ｌｓｙ）を用いて中和しそして沈澱した
過塩素酸カリウムをろ過により分離した。ろ液をアミコ
ンＵＮ−２膜を用いる限外瀘過により２０ｍｌの容積ま
で濃縮した。

該濃縮物を３Ｘ２００ｗセファデツクスＧ−７５カラム
に入れそしてとのカラムを０．２Ｍ塩化ナトリウムを含
むｐＨ８．０の０．０５Ｍ硼酸ナトリウム緩衝液を用い
て溶離きせた。

溶離液中の抗トリズシン及びエラスターゼ活性度を測定
した。このクロマトグラフ分析の結果を第１図に示す。

Ｂ１−８−Ｅと共に溶離するＢ１−８−Ｔを、すでに数
回記載された方法で、３×１５ｃｍトリプシンーセファ
ローズカラムにより溶液を直接ろ過することにより分離
した。ＢＩ−８一Ｅを含む溶離液をアミコンＵＭ−２膜
を用いる限外ろ過により２０ｍｌの容積まで濃縮し、そ
して次に塩を、この溶液からＩＭ酢酸アンモニウム溶液
と平衡にしたパイオーゲルＰ−２カラム（１５Ｘ１５０
ｃｍ）によるろ過により除去した。抑制物質を含むフラ
クションを合しそしてＢＩ−８−Ｅを凍結乾燥により分
離した。それにより無色のＢＩ−８−Ｅｌ５ｍｇ（約１
５係）が得られた。この抑制物質の抑制挙動に関するデ
ータは第ｌ表に示されている。

ｄ）ＢＩ−８−Ｅ＋ ｃ）に従って得られたＢＩ−８−Ｅ１０ｍｇを８０％蟻
酸２ｍｌに溶解した。この溶液を５６℃にで１２時間保
った。次にこの溶液をバイオーゲルＰ−２カラム（１．
５Ｘ１００ｃｍ）により溶離剤として水を用いてろ過し
た。蛋白含有俗離液を合しそして凍結乾燥しだ。それに
より用いたエラスターゼ抑制活性度の５０〜８０％を有
する無色の物質４５〜６．５ｍｇが得られた。本発明に
従う炭水化物を含まないＢＩ−８−Ｅ＋の抑制スペクト
ルは第１表から知ることが出来る。

実施例２ 実施例１．αに記載された方法で牛血清１０リットルか
ら得られた過塩素酸沈澱物を水７リットルを用いてペー
ストにした。ｐＨが８２になるまで５Ｎ水酸化ナトリウ
ム溶液を加えた後、該混合物を２０℃にて１２時間攪拌
することにより均質化した。該懸濁液にトリプシン３．
５ｇを加えそしで該混合物をゆっくり攪拌しつつ３７℃
にて１８時間保った。次に７０％過塩素酸３２５ｇ（ｌ
９５ｍｌ）をこの混合物に加え、そして該混合物を２０
℃にて２時間放置した後、沈澱を遠心分離（４０分；３
０００ｇ）により分離した。遠心分離物のｐＨ値を５Ｍ
水酸化カリウム溶液を用いて７．８に調節した。沈澱し
た過塩素酸カリウムをろ過により分離した。ろ液中に存
在するトリプシン抑制物質をトリプシンーセファローズ
４Ｂを部分にわけて加えることにより複合化し、そして
不溶性の酵素一抑制物質複合体をろ過により分離した。

ろ液の容積を真空中で約７００ｍｌに下げ、そして該ろ
液を、コンカナパリン−Ａ−セファローズを充填しそし
てｐＨ８．０の０．０５Ｍトリスー塩酸緩衡液と平衡に
しだカラム（２．５×２０ｃｍ）により溶離剤としてそ
の平衡用緩衝液を用いてろ過した。本発明のエラスター
ゼ抑制物質ＢＩ−８及ひ変性ＢＩ−１４＋をｐＨ６．０
の０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、α−メチルマンノ
シドに関して００５Ｍを用いて溶離した。アミコンＵＭ
−２膜を用いる限外ろ過により抑制物質含有溶離物から
塩を除去した。

ＢＩ−１４＋及びＢＩ−８−Ｅは実施例１．Ｃ．に記載
された方法でセファデツクスＧ−７５を用いるゲルろ過
により分離された。バイオーゲルＰ一２により塩を除去
しそして凍結乾燥した後に、ＢＩ−８−Ｅｌ０ｍｇが得
られた。

実施例３ 実施例１．ｂ．に従って得られたＢＩ−１４２００ｍｇ
をｐＨ７，８の０．２Ｍトリエタノールアミン／塩酸緩
衝液７５ｍｌに溶解し、そしてトリプシン８００ｍｇを
用いる加水分解及び処理を実施例１．ｃ。に記載の方法
で行った。実施例１．ａ．に記載のごとく、過塩素酸カ
リウムを除去した後に得られた抑制物質の溶液にトリプ
シンーセファローズ４Ｂを、該溶液の全抗トリプシン活
性物質がトリプシンと結合するまで加えた。次にその複
合化したトリプシンーセファローズをシンターガラスろ
斗（Ｄ２）でろ過することにより分離除去しそしてｐＨ
７．８の０．２Ｍトリエタノールアミン／塩酸緩衝液、
塩化ナトリウムに関して０．２Ｍの全量２００ｍｌを用
いて十分溶離させた。ろ液及び洗浄水を合し、そしてチ
モトリプシンーセファローズ４Ｂを、エラスターゼ抑制
物質が上澄液中に最早検出されなくなるまで、添加した
。ＢＩ−１４”及びＢＩ−８−Ｅと複合化しだチモトリ
プシンーセファローズを２．５×３０ｃｍカラムに移し
そして上記のトリエタノールアミン／塩酸緩衝液を用い
て洗浄した。

エラスターゼ抑制物質ＢＩ−１４及びＢＩ−８−Ｅの脱
着のため、水で溶離させたあとｐＨ１．５の０．２Ｍ塩
化カリウム／塩酸溶液２５０ｍｌを用いて、溶離液が２
８０ｎｍにおいて吸収がなくなるまで、カラムを溶離さ
せた。エラスターゼに対する抑制活性作用を有する溶離
液を補集し、そしてｌＮ水酸化カリウム溶液で中和した
後、その結果得られた溶液の容積をアミコンＵＮ−２膜
を用いる限外ろ過により約１０ｍｌに下げた。

残留塩からＢＩ−１４”を分離するために、該濃縮液を
セフアデツクスＧ−７５を允填したカラム３×２００ｃ
ｍにより戸過しだ。

ｐＨ７．５の０．１Ｍ酢酸アンモニウム溶液を溶離剤と
して用いた。

溶離液を２４ｍｌのフラクションに捕集しそしてそのエ
ラスターゼに対する抑制度を測定した。カラムの溶離の
状況は第１図から知ることが出来る。

ＢＩ−８−Ｅを含む溶離液を集めそして凍結乾燥により
抑制物質を分離した。無色の凍結乾燥物１０〜２０ｍｇ
を得た。ＢＩ−８−Ｅ”は実施例１．ｄ．に記載の方法
でＢＩ−８−Ｅから得ることが出来る。

【図面の簡単な説明】

第１図はセファデツクスＧ−７５Ｃ”）カラムを用いた
ＢＩ−１４トリプシン分解パッチの溶離曲線を示す。 第２図はセファデツクスＧ−７５カラム３×２００ｃｍ
の溶離曲線を示す。 第３図は本発明によるＢ１−８−Ｅを用いる膵臓エラス
ターゼ（豚）の滴定曲線を示す。 特許出願人バイエル・アクチェンゲゼルシャフト

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 式中、×は水素またはグリコシド残基を表わす、なる一
   般式（１）のエラスターゼ抑制物質。 ２．Ｘかグリコシド残基を意味する、特許請求の範囲第
   １項記載の一般式（１）のエラスターゼ抑制物貿（１３
   トトＩら）。 ３、Ｘが水素を意味する、特許請求の範囲第１項記載の
   一般式（１）のエラスターゼ抑制物質（Ｂ１−Ｓ．＋）
   。 ４、牛からのインター−α−トリブシン抑制物質または
   この抑制物質から部分的加水分解により得られる抑制物
   質Ｂ１−３０もしくはＢ１−１４，またはそれらの混合
   物を、蛋白分解酵素を１０〜４００％、好ましくは１５
   ０〜３００％の過剰量にて用いて、６．５〜１０ｐＨに
   て１乃至２４時間、好ましくは１乃至１０時間、約３７
   ℃にて処理し、そしてそれにより生成した抑制物質を分
   離しそしてＢ−Ｓ−Ｅ”に転化することを特徴とする、
   特許請求の範囲第１項記載の一般式（１）のエラスター
   ゼ抑制物質の製造方法。 ５．蛋白分解酵素としてトリブシンを用いる、特許請求
   の範囲第４項記載の方法。 ６．酸として６０〜９０％蟻酸を４０〜７０℃、好まし
   くは５６℃の温度にて用いる、特許請求の範囲第４項記
   載の方法。 ７．特許請求の範囲第１項記載の一般式（１）のエラス
   ターゼ抑制物質を含む薬剤。 ８、特許請求の範囲第１項記載の一般式（１）のエラス
   ターゼ抑制物質を不活性、無毒性の医薬的に適した賦形
   剤と混合する、薬剤の製造方法。 ９．ショック症状に権った患者を特許請求の範囲第７項
   記載の薬剤を用いて処置する、ショック症状処置方法。 １０．リウマチ様関節炎に羅った患者を特許請求の範囲
   第７項記載の薬剤を用いて処置する、リウマチ様関節炎
   の処置方法。 １１，肺気腫に罹った患者を特許請求の範囲第７項記載
   の薬剤を用いて処置する、肺気腫処置方法。