DESCRIPCIÓN MÉTODO PARA AISLAR UNA PROTEÍNA INTESTINAL QUE SE UNE AL
COLESTEROL. La invención se refiere a un método para aislar una proteína intestinal implicada en la absorción intestinal del colesterol y que tiene la capacidad de unirse a los inhibidores de la absorción del colesterol. En los seres humanos, por término medio aproximadamente 50 % del colesterol está presente en la luz intestinal. El colesterol intraluminal procede principalmente de la dieta y las bilis. Aproximadamente 2 g de coles-terol por día es descargado de las bilis. La absorción intestinal del colesterol depende grandemente de la presencia de sales biliares. Así el efecto de los inhibidores de la recaptación de las sales biliares o de los secuestrantes de las sales biliares es inhibir la absorción intestinal del colesterol. La inhibición de la absorción intestinal del colesterol es un im-portante objetivo del tratamiento de los trastornos de los lípidos, la arteriesclerosis y los trastornos cardiovasculares. La opinión prevalente entre los expertos es que la absorción intestinal del colesterol tiene lugar por difusión fisicoquímica. Se conocen cierto número de observaciones relacionadas con el transporte del colesterol que indican que está implicada una proteína. La absorción intestinal del colesterol está sometida a una gran variabilidad individual. Datos bioquímicos de experimentos in vitro indican que están implicadas proteínas en el intercambio de colesterol entre pequeñas vesículas unilamina-
res y las vesículas de borde de cepillo del intestino. Fue posible observar grandes diferencias en la absorción intestinal de esteróles de plantas, tales como ß-sitosterol y campesterol, que solamente difieren en un grupo metilo (ß-sitosterol) y un grupo etilo (campesterol). En los seres humanos, el ß-sitosterol mostró entre otras cosas una inhibición de la absorción del colesterol. Hay dos clases de compuestos altamente activos que inhiben la absorción intestinal del colesterol por administración luminal. Los compuestos son, por un lado, compuestos derivados de saponina, tales como tiqueside y pamaqueside, y por otro lado ciertos derivados de 2-azetidinonas. Los derivados de 2-azetidinonas como inhibidores de la absorción del colesterol se describen en Clader et al., J. Med, C em. 39, 3684-3693, 1996. Para los fines de esta invención, el término absorción pretende significar la unión de una sustancia a una proteína y el transporte de esta sustancia con la ayuda de esta proteína. La absorción intestinal del colesterol contribuye significativa-mente a la homeostasis del colesterol en suero. Inhibidores de la absorción intestinal del colesterol como Ezetimibe o Pamaqueside han probado sus eficacias como nuevos agentes que disminuyen el colesterol en ensayos clínicos. Su modo de acción molecular, así como los mecanismos de la absorción intestinal del colesterol, a pesar de enormes esfuerzos científicos son todavía desconocidos y están sometidos a controversia. En general, se supone una difusión pasiva del colesterol a través de las membranas plasmáticas y la membrana intestinal de células de borde de cepillo, pero hay una evidencia creciente de que la absorción intestinal del colesterol es un proceso mediado
por proteínas: La absorción del colesterol muestra una fuerte diferencia entre especies y esteróles de plantas estructuralmente relacionados, como ß-sitosterol o campesterol con características físico-químicas comparables están en contraste con el colesterol que se absorbe sólo malamente lo que hace improbable un simple proceso de difusión. La existencia de inhibidores de transporte específicos para el colesterol, las 2-azetidinonas y los glicósidos de esterol, con intensa relaciones estructura-actividad sugieren que la absorción intestinal del colesterol es fundamentadamente un proceso mediado por proteínas. El colesterol es un compuesto versátil que es vital (en pequeñas cantidades) para el funcionamiento del cuerpo humano. Solamente lo producen los animales; ningún producto de planta contiene colesterol a no ser que a un producto de origen animal, tal como la manteca de cerdo, le haya sido añadido durante su procesamiento. En seres humanos, el colesterol cumple tres funciones principales. Es usado por ciertas glándulas para fabricar hormonas esteroides o similares a la cortisona, incluyendo las hormonas sexuales. Ayuda al hígado a producir ácidos biliares, que son esenciales para la digestión de las grasas. Y finalmente, pero no la de menor importancia, es un componente esencial de las membranas y estructuras celulares, una clase de bloque de construcción para los tejidos del cuerpo. Sin colesterol, no existiría la vida de los mamíferos. El problema con el colesterol surge cuando el cuerpo lo contiene en demasiada cantidad, o tiene depósitos de él en sitios erróneos. La
enfermedad cardiaca coronaria se produce cuando el colesterol se deposita dentro de las paredes de las arterias coronarias del corazón, que son las principales suministradoras de oxígeno al tejido muscular propio del corazón. Allí contribuye a la formación de obstrucciones grasas tenaces denominadas pla-ca. Esta acumulación de placa se denomina arteriesclerosis o endurecimiento de las arterias. El colesterol también puede depositarse dentro de las arterias en cualquier parte del cuerpo, donde puede contribuir a que se produzca un ictus (por haberse obstruido las arterias del cerebro) y a la enfermedad vascular periférica (por la obstrucción de las arterias en las piernas). Para desplazarse a través del cuerpo, el colesterol debe estar empaquetado en moléculas especiales denominadas lipoproteínas. Los lípi-dos, o componentes grasos del colesterol, están envueltos dentro de una capa de proteína soluble en agua. Diferentes tipos de lipoproteínas contienen lipoproteínas que varían desde una economía dinámica dentro del cuerpo, trans-portando el colesterol a algunos tejidos y retirándolo de otros. El principal compuesto transportador de colesterol en el cuerpo es la lipoproteína de baja densidad, o LDL-colesterol. (La abreviatura LDL corresponde a las iniciales en inglés de la expresión low-density lipoprotein). La LDL es denominada frecuentemente "el colesterol malo" porque parece desempeñar un papel clave en depositar de colesterol dentro de las arterias. Se denomina de baja densidad porque tiene muy poca proteína, que es el contenido más denso de la molécula, y está compuesto principalmente de grasas. Elevados niveles de LDL están asociados a un riesgo creciente de enfermedad cardiaca coronaria.
La lipoproteína de alta densidad, o HDL (por sus iniciales en inglés hig -density lipoprotein), se denomina frecuentemente "el colesterol bueno" porque parece ayudar a retirar el colesterol de las paredes arteriales y transportarlo al hígado para su excreción. En contraste con el LDL colesterol, los bajos niveles de HDL están asociados con un riesgo aumentado de enfermedad cardiaca coronaria, mientras que niveles más elevados de HDL parecen proteger contra la enfermedad. Otros subtipos de partículas de colesterol incluyen quilomicro-nes, que son producidos por las células intestinales cuando se digiere la gra-sa, y lipoproteína de muy baja densidad (abreviadamente VLDL por sus iniciales en inglés very low-density lipoprotein), fabricada por el hígado como un importante precursor de la producción de LDL-colesterol. La VLDL es la principal lipoproteína que transporta los triglicéridos producidos por el hígado. Para determinar el riesgo de enfermedad cardiaca son claves la LDL y la HDL. Dada toda la evidencia de que las dietas de alto contenido en colesterol y alto contenido en grasas contribuyen a los elevados niveles de colesterol en la sangre, y que el alto contenido de colesterol es factor de riesgo definitivo para la enfermedad cardiaca, parecería natural suponer que dis-minuir el colesterol en la sangre, por la dieta u otros medios reducirá ese riesgo. Es un objetivo de la invención proporcionar un método de aislar una proteína que está implicada en la absorción intestinal del colesterol y
es la diana proteínica molecular para los inhibidores de la absorción del coles-terol. Dicho método se considera que proporciona un gran beneficio para los esfuerzos terapéuticos para controlar los elevados niveles de colesterol. La invención se refiere a un método para aislar una proteína, en donde a] se proporciona un material biólogico, b] el material biológico de a] se incuba con un compuesto de 2-azetidinona foto-reactivo que está marcado radiactivamente y que puede unirse específicamente a dicha proteína, c] el material biológico se solubiliza y se retiran los residuos celulares, d] el líquido sobrenadante se añade a un dispositivo que aloja lectina-agarosa de germen de trigo, e] el eluato de la lectina-agarosa del germen de trigo de d] se aplica a una columna de hidroxilapatito, la cual se eluye por medio de un gradiente de tampón de fosfato, f] las fracciones marcadas radioactivamente de e] se cargan en una placa de SDS-PAGE preparativa, y g] las fracciones marcadas radioactivamente se recogen y posiblemente precipitan. El material biológico se toma preferiblemente del tejido intestinal o de células de un cultivo de células intestinales o de células de tipo borde de cepillo del íleon de un ser humano, una rata, un ratón o un conejo.
Los compuestos de 2-azet¡d¡nona foto-reactivos tienen preferiblemente la estructura siguiente (Kramer, W. et al. (2000) FEBS Letters 487, 293-297) Fórmula I
en donde R se selecciona de uno de los grupos a) a e) si-guientes: sí — CH2NH — CO — CH3
La síntesis de los compuestos de la fórmula I a, b y c ha sido descrita en DE 10042447 A1 que se publicó el 28 de Marzo de 2002. Las síntesis de los compuestos de las fórmulas I d y e se describe en los ejemplos que se dan más adelante. Un grupo fotolábil de una molécula puede emplearse para producir enlaces covalentes a una molécula, preferiblemente una proteína, localizada en vecindad inmediata. Para este fin, el compuesto con el grupo fotolábil se lleva inicialmente a la vecindad inmediata de la molécula a la cual ha de producirse la conexión covalente. Esta tiene lugar, por ejemplo, a través de otra parte del compuesto que actúa como un inhibidor especifico de la pro-teína, preferiblemente un inhibidor de la absorción del colesterol. La puesta en contacto del compuesto con la molécula va seguida por irradiación con luz UV. La irradiación con luz UV activa el grupo fotolábil e inicia la producción de una conexión covalente a la molécula que interactúa, en particular a una proteína. Son adecuados como grupos fotolábiles, por ejemplo, grupos funcionales dia-zirina, azido o carbonilo. Es posible emplear para la irradiación una lámpara convencional de UV que se usa, por ejemplo, para visualizar polinucleótidos con bromuro de etidio intercalado o para esterilizar superficies de laboratorios, o
un reactor fotoquímico obtenible entre otros de "The Southern Ultraviolet Company, Hamden, CT". La ruptura de las células después de la irradiación con luz UV se lleva a cabo usando métodos convencionales. Ejemplos de ellos son congelación y descongelación repetidas, tratamiento de las células con ultrasonidos, el uso de una prensa francesa o la adición de un detergente y enzimas. El fraccionamiento del lisado de las proteínas de las células puede efectuarse, por ejemplo, por precipitación con sulfato de amonio, por centrifugación diferencial o aplicación de técnicas cromatográficas. Las técnicas cro-matográficas adecuadas para este fin son, por ejemplo, electroforesis desna-turalizante o no desnaturalizante en gel de poliacrilamida en una o dos dimensiones, cromatografía de líquidos alta presión, cromatografía de intercambio iónico o cromatografía de afinidad. Estas técnicas son familiares para los operarios expertos y se tratan con detalle en, por ejemplo, "Current Protocols in Protein Science"; John E. Caligan; Ben M. Dunn; Hidde L. Ploegh; David W. Speicher; Paul T. Wingfield; Wiley and Sons; ISBN 0-471-11184-8. Preferiblemente, la detección de una proteína después de un fraccionamiento tiene lugar por medio del radiomarcado del compuesto que contiene un inhibidor de la absorción intestinal del colesterol y un grupo foto-lábil. Un isótopo radioactivo que puede usarse para este fin es, por ejemplo, 3H ó 14C. Un método de detección adecuado es, por ejemplo, detección de la proteína que contiene un compuesto unido covalentemente por medio de un material de película usado para fotografía por rayos X después de que la proteína haya sido introducida en el gel de poliacrilamida con la ayuda de electro-
foresis en gel de poliacrilamida. Otros métodos de detección adecuados son recuento por centelleo de líquidos o escaneo en lecho plano. El materia biológico consiste preferiblemente en células intestinales. Las células intestinales pueden ser proporcionadas, por ejemplo, por disección del intestino de animales y subsiguiente purificación, rotura enzimá-tica del tejido conjuntivo y suspensión de células individuales en soluciones tampón isotónicas. Tejidos intestinales adecuados para la provisión de células intestinales son, entre otros, las partes correspondientes de animales que quedan después del sacrificio. Las células intestinales también pueden proce-der de partes de tejidos intestinales humanos que se han obtenido en una operación. Las células intestinales también pueden consistir en cultivos de células intestinales proporcionados para el fin de la invención por aplicación de técnicas de cultivo de células. Partes de células intestinales pueden ser orgánulos de células intestinales. Los orgánulos son, preferiblemente, mem-branas de las células intestinales. Las membranas de las células intestinales pueden obtenerse por centrifugación diferencial después de la rotura de estas células. Partes de células intestinales también son, preferiblemente, fracciones de proteínas. El suministro de células intestinales o partes de células intestinales son células intestinales que consisten preferiblemente en células del tipo borde de cepillo del tejido intestinal de organismos de mamíferos. Organismos mamíferos a partir de los cuales se obtienen preferiblemente estas células intestinales, incluyen, pero sen limitación: seres humanos, monos, ganado, cerdos, ratas, ratones, conejos, hámsteres u otras
especies de vertebrados. Estas células pueden proporcionarse para preparar suspensiones celulares del tejido del borde de cepillo del intestino de dichos organismos. El material intestinal adecuado se obtiene, por ejemplo, por métodos quirúrgicos. Otras fuentes pueden proceder de partes de animales que quedan después del sacrificio. Igualmente son adecuadas células de una línea celular intestinal. Para preparar preparaciones celulares adecuadas, el tejido intestinal debe someterse a un tratamiento enzimático para liberar células individuales y luego someterlas a centrifugación diferencial. Las células u orgá-nulos resultantes se recogen subsiguientemente en un medio acuoso adecúado. Estos medios acuosos pueden contener sustancias tampones, sales, proteínas y, además, excipientes. La invención se refiere también a un método para aislar una proteína que se une a los inhibidores de la absorción del colesterol, que están implicados en la absorción intestinal del colesterol, en donde a] se proporciona un material biológico, b] el material biológico de a] se incuba con un compues to de 2-azetidinona foto-reactivo que está marcado radiactivamente o que está marcado con un resto de biotina, c] el material biológico de b] se solubiliza y se retiran los residuos celulares, d] el líquido sobrenadante se somete a métodoss croma tográficos o se añade sobre estretavidina-agarosa, e] el eluato se añade sobre una placa de SDS-PAGE, y
f] las proteínas que se desplazan en un intervalo de tamaños de 140 a 150 kDa, se escinden, se eluyen y posiblemente se replie gan. El material biológico se toma preferiblemente de tejido intesti-nal o células de un cultivo de células intestinales o de células del tipo borde cepillo de íleon de un ser humano, una rata, un ratón o un conejo. El inhibidor de la captación del colesterol que está marcado con un resto de biotina tiene preferiblemente la estructura:
La invención también se refiere a una proteína, con capacidad para unirse específicamente a los inhibidores de la absorción del colesterol, que se ha aislado por un método de la invención como se ha mencionado antes. La proteína tiene preferiblemente un tamaño de 140 a 150 kDa y más preferiblemente un tamaño de 145 kDa. La proteína posiblemente está glicosila-da. Los pesos moleculares de las proteínas están sometidos a cierto margen de imprecisión que es causado por el método de electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida usado, pero también se determinan por otros
métodos correspondientes. Las variaciones en los pesos moleculares están en la región de hasta +/- 10 %. Los valores establecidos representan los valores medios de una pluralidad de experimentos. En el caso de una protefna con el peso molecular establecido de 145 kDa, las determinaciones del peso mo-lecular en 10 experimentos realizados independientemente unos de los otros por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida dieron como resultado un valor medio de 145,3 kDa con una desviación típica de +/- 7,55 kDa. Detalles de métodos adecuados para comprobar la glicosila-ción pueden encontrarse por los expertos en "Carbohydrate Biotechnology Protocols, Methods ¡n Biotechnology, 10 (1999) Humana Press, ISBN 0-89603-563-8, Editor C. Bucke". La invención se refiere además a un complejo formado por una proteína de la invención y un compuesto que tiene la estructura siguiente:
La invención se refiere además a una composición farmacéutica que comprende una proteína de la invención y compuestos farmacéuticamente aceptables y/o excipientes para la formulación de un medicamento. Dichas sustancias son conocidas comúnmente y descritas, por ejemplo, en
Remington's Pharmaceutical Sciences, fifth edition, publicado por Mack Pu-blishing Company. La invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende un complejo de una proteína de la invención y un com-puesto como se ha mencionado anteriormente, así como compuestos farmacéuticamente aceptables para la formulación de un medicamento. La invención también incluye el uso de una proteína de la invención para fabricar una composición farmacéutica para tratamiento de una enfermedad que esta asociada a elevados niveles de colesterol. Dichas en-fermedades son, por ejemplo, obesidad, arteriosclerosis, presión arterial alta (hipertensión), insuficiencia cardiaca y otras. Un nivel de colesterol de 199 mg/dL se considera elevado. La invención incluye también el uso de un complejo de una proteína de la invención y un compuesto como se ha mencionado antes para fabricar una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad que está asociada a elevados niveles de colesterol. La invención también se refiere al uso de una protema de la invención para identificar un compuesto que inhibe la recaptación del colesterol, en donde: a] se proporciona un material biológico que contiene la proteína de la invención, b] se proporciona un compuesto c] se ponen en contacto el material biológico y el com-
puesto, d] se determina la cantidad de colesterol absorbida por el material biológico de c], e] el resultado de d] se compara con los resultados de un experimento de control en donde se determina la captación de colesterol del material biológico que tiene la misma especificidad de especie y/o tejido de a], pero que no se puso en contacto con un compuesto de b], f] los resultados de e] son indicadores de un compuesto que inhibe la recaptación del colesterol cuando se determina la captación dis minuida de colesterol de las células que han sido puestas en contacto con un compuesto de b]. La invención también se refiere a un medicamento que comprende un compuesto que se identifica por dicho método, así como excipientes farmacéuticamente aceptables, para tratamiento de una enfermedad que esta asociada a elevados niveles de colesterol. El peso molecular de dicho compuesto está preferiblemente un intervalo de 100 a 50000 Da y más preferiblemente entre 100 y 5000 Da. Este compuesto podría ser un análogo del colesterol, una proteína, un péptido o un compuesto que contiene un ácido graso. La creación de un compuesto tiene lugar, por ejemplo, por síntesis química. El compuesto puede ser parte de una colección de compuestos como las que resultan del almacenamiento y catalogación de compuestos de químicos de programas de síntesis completados ("quimiotecas"). El com-
puesto, en otros casos, puede haber sido producido por un microorganismo, en particular una bacteria, un hongo o una especie de animal o planta (sustancias naturales). En el caso de sustancias naturales, la creación puede tener lugar por aislamiento de los organismos apropiados. La puesta en contacto de una proteina con un compuesto tiene lugar, en la mayoría de los casos, en soluciones acuosas con las cuales ha de mezclarse una cierta proporción de un disolvente, tal como, por ejemplo, dimetilsulfóxido o etanol. Las soluciones acuosas también pueden contener sustancias tampones, iones o aditivos estabilizantes, tales como proteínas, glicerol u otros. Pueden ser ventajosas para la puesta en contacto condiciones constantes particulares, por ejemplo para la temperatura, el pH, las condiciones iónicas, la concentración de la proteína o del compuesto, o del volumen. Así, por ejemplo, puede ser preferible mantener la temperatura constante a 37°C durante la puesta en contacto. La determinación de la unión del compuesto a la proteína después de efectuar la puesta en contacto tiene lugar, por ejemplo, por interacción con colesterol o inhibidores absorción de colesterol que están radiomarcados de otro modo, empleando el desplazamiento del colesterol o los inhibidores de absorción del colesterol como medida de la afinidad del compuesto para la proteína. EJEMPLOS Síntesis de [2-(4-Azido-fenil)-1-í4-(4-f3-f3-hidroxi-3-fenil-propil)-2-(4-metoxi-fenil)-4-oxo-azetidin-1 -in-fenilcarbamoil}-butilcarbamoin-etillamida del ácido 5-(2-oxo-hexahidro-tienof3.4-d]imidazol-6-il)-Dentanoico.
Los números 1 a 14 que se encuentran en el siguiente pasaje se refieren al esquema de reacción general de la Fig. 1 Síntesis del inhibidor del colesterol foto-reactivo marcado con biotina, [2-(4-Azido-fenil)-1-(4-{4-[3-(3-hidroxi-3-fenil-propil)-2-(4-metoxi-fenil)-4-oxo-azetidin-1-il]-fenilcarbamoil}-butilcarbamoil)-etil]-amida) del ácido (5-(2-oxo-hexahidro-tieno[3,4-d]imidazol-6-il)-pentanoico. Los números 1 a 14 que se encuentran en del siguiente pasaje de dicho inhibidor de colesterol foto-reactivo marcado con biotina se refieren a los esquemas de reacción de las Figuras 1 y 2. 3-[5-(terc-Butil-dimetil-silaniloxi)-5-fenil-pentanoill-4-fenil-oxazolidin-2-ona (1)
30 g de 3-(5-Hidroxi-5-fen¡l-pentanoil)-4-fenil-oxazolidin-2-ona se disuelven en 50 mi de DMF. Después de añadir 14,3 g de imidazol y 19 g de cloruro de terc.butil-dimetilsililo en 25 mi de DMF la mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente hasta que se disuelven todos los componentes
(2-4 horas). La solución de reacción se evapora, y después de que añade agua se extrae con éster etílico del ácido acético. Después del secado de la fase orgánica sobre sulfato de magnesio y evaporación se obtiene el compuesto 1 : C26H35 O4SÍ (453,6) MS (ESI+) 476, (M + Na+). (4-Metoxi-bencilidenH4-nitro-fenil)-amina (2) A 50 g (370 mmol) de anisaldehído en 160 mi de isopropanol se añaden 51 g (370 mmol) de para-nitroanilina. Después de 2 horas a 80°C precipita el producto. La mezcla de reacción se enfría a temperatura ambiente y se filtra. El residuo se lava con isopropanol. Después del secado se obtienen 62,9 g del producto 2 (rendimiento de 66 %) en forma de cristales amarillos: C14Hi3N203 (257,27). 3-{5-(terc-Butil-dimetil-silaniloxi)-2-r(4-metoxi-fenil)-(4-nitro- fenilamino)-metil]-5-fenil-Dentanoil -4-fenil-oxazolidin-2-ona f3)
A 5,4 g (12,0 mmol) del producto i y 6,2 g (24 mrnol) del producto 2 en 135 mi de cloruro de metileno, y 8 mi de diisopropiletilamina se
añaden, gota a gota a 10°C, 4,8 mi de cloruro de trimetilsililo. Después de 1 hora se añaden, a -10°C, gota a gota 14 mi de una solución 1 molar de tetra-cloruro de titanio en cloruro de metileno. Se agita durante 3 horas a -10°C y luego se mantiene 12 horas a -30°C sin agitación. Después de que se añaden 8 mi de ácido acético y 140 mi de una solución acuosa al 7% de ácido tartárico se agita durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de la adición de 50 mi de una solución acuosa al 20% de hidrogenosulfito de sodio se agita durante otra hora y se extrae con cloruro de metileno. La fase orgánica se seca sobre sulfato de magnesio, se evapora y se purifica por cromatografía sobre gel de sílice/acetato de etilo/heptano = 1/3 -> 1/1 . Se obtienen 6,3 g (74 %) de producto 3 en forma de un compuesto sólido ligeramente amarillo: C40H47N3O7SÍ (709,92) S (ESI+) 710 (M + H+). 3-r3-(terc-Butil-dimetil-silaniloxi 3-fenil-propill-4-(3-metoxi-fenih-1 -(4-nitrofenil)-azetidin-2-ona (4)
Una mezcla que comprende 6,1 g (8,6 mmol) de producto 3, 7,3 mi de bistrimetilsililacetamida, 0,5 g de fluoruro de tetrabutilamonio y 100 mi de terc.butil-metil-éter se agita bajo una atmósfera de argón durante 10 horas a temperatura ambiente. Después de terminar la reacción se añaden lentamente 5 mi de ácido acético con enfriamiento por hielo y se evapora. El residuo se separa por cromatografía sobre gel de sílice (acetato de eti-lo/heptano = 1/2). Se obtienen 3,3 g (70 %) de producto 4 en forma de un compuesto amarillo claro en forma sólida: (546,74) S (ESI+) 547,3 (M + 1-f). 1-(4-Amino-fenin-3-['3-(terc.butil-dimetil-silaniloxi)-3-fenil-propill-4-(3-metoxifenin-azetidin-2-ona (5)
Se realiza la reacción con 3,0 g (5,5 mmol) de producto 4 en 50 mi acetato de etilo y 1 ,0 g de paladio sobre carbono al 10 % durante 2 horas a 5 bares de una a mósfera de hidrógeno empleando un autoclave. La solución reacción se filtra, se evapora y se separa por cromatografía sobre gel de sílice (cloruro de metileno/metanol = 10/1). Se obtienen 2,4 g (86 %) de
producto 5 T? forma de un compuesto incoloro en forma sólida: C31H40N2O3S1 (516,76) MS (ESI+) 517,4 (M + H+). 1-(4-Amino-fen¡n-3-(3-hidroxi-3-fenil-propil)-4-(3-metoxi-fenin-azetidin-2-ona ^
15 mi de ácido clorhídrico acuoso 2N se añaden a 2,3 g de producto 5 en 20 mi de tetrahidrofurano y se agita durante 2 horas. Se añade a la mezcla de reacción una solución acuosa de hidrógeno-carbonato de so-dio y se extrae con acetato de etilo. La fase orgánica se seca sobre sulfato de magnesio, se evapora y se purifica por cromatografía sobre gel de sílice (acetato de etilo/heptano = 1/1 -> 1/0). Se obtienen 1 ,1 g de producto 6 en forma de un compuesto incoloro en forma sólida C25H26N2O3 (402,50) MS (ESI+) 403,2 (M + H+). Éster 9H-fluoren-9-ilmetílico del ácido (4-{4-í3-(3-hidroxi-3-fenil-prQpil)-2-(4-metoxi-fenil)-4-oxo-azet¡din-1 -il]-fenilcarbamoil}-butil')-carbamoico (8)
0,8 g (2,0 mmol) de producto 6 y 1 ,35 g (4,0 mmol) de ácido 5-(Fmoc-amino)-valeriánico 7 (Fluka) se disuelven en 15 mi de DMF (dimetilfor-mamida). En porciones se añade lo siguiente: 4,8 g de TOTU (Fluka), 1 ,6 g de Oxime (éster etílico del ácido hidroxiimino-cianoacético; Fluka) y 5,5 mi de NE (4-etil-morfolina). Después de 1 hora a temperatura ambiente la mezcla reacción se diluye con 100 mi de acetato de etilo y se lava tres veces con agua. La fase orgánica se seca sobre MgSO-i, se filtra y se evapora. El residuo se purifica por cromatografía de desarrollo rápido (acetato de etilo/n-heptano 2:1). Se obtienen 0,58 g (41 %) de producto 8 en forma de un compuesto sólido amorfo: C45H45 3O6 (723,8) MS (ESI+) 724,4 (M + H+). {4-f3-(3-Hidroxi-3-fenil-propih-2-(4-metoxi-fenil)-4-oxo-azetidin-1-il1-fenil}-amida de ácido 5-amino-pentanoico (9)
570 mg (0,78 mmol) de producto 8 y 0,8 mi de dietilamina se disuelven en 5 mi de DMF (dimetilformamida). Se evapora después de 1 hora a temperatura ambiente. El residuo se purifica por cromatografía de desarrollo rápido (cloruro de metileno/metanol/amoníaco concentrado 30:10:3). Se obtienen 220 mg (56%) de producto 9 en forma de un compuesto sólido amorfo: C30H35N3O4 (501 ,63) MS (ESI+) 502,3 (M + H+). Ester 9H-fluoren-9-ilmetílico del ácido [2-(4-azido-fenil)-1-(4-{4-[3-(3-hidroxi-3-fenil-propih-2-(4-metoxi-fenil)-4-oxo-azetidin-1-il1-fenilcarbamoil -butilcarbamoil)-et¡l1-carbamoico (1 )
200 mg (0,40 mmol) de producto 9 y 340 mg (0,79 mmol) de Fmoc-p-azido-Phe-OH 10 (Bachem) se disuelven en 4 mi DMF (dimetilformamida) y se hacen reaccionar de acuerdo con la obtención del producto 8. Se obtienen 300 mg (82%) de producto 11 en forma de un compuesto sólido amorfo: C54H53N7O7 (912,07) MS (ESI+) 912,5 (M + H+).
{4-[3-(3-Hidroxi-3-fenil-propilV2-(4-metoxi-fenil)-4-oxo-azetidin-l-ill-fenilVamida -aminn-Í 4-a7ÍHn-feni -nrnnion¡lamino1-pentanoico (12)
300 mg (0,33 mmol) de producto 11 y 0,8 mi de dietilamina se disuelven en 4 mi de DMF (dimetilformamida) y se hacen reaccionar de acuerdo con la obtención del compuesto 9. Se obtienen 42 mg (19%) de compuesto 12 en forma de un compuesto sólido amorfo: C39H43N7O5 (689,82) MS (ESI+) 690,3 (M + H+). [2-(4-azido-fenil)-1-(4 4-[3-(3-hidroxi-3-fenil-propil)-2-(4-metoxi-feniB-4-oxo-a2etidin-1-ill-fenilcarbamoil}-butilcarbamoil)-et¡l]-amida del
40 mg (0,058 mmol) de compuesto 12 y 60 mg de D-biotinil-N-hidroxisuccinimida 13 (Bachem) se disuelven en 0,5 mi DMF (dimetilformami-da). Se evapora después de 1 hora a temperatura ambiente. El residuo se purifica por cromatografía de desarrollo rápido (cloruro de metileno/metanol/ amoníaco concentrado 30:5:1). Se obtienen 29 mg (55%) de compuesto 14 en forma de un compuesto sólido amorfo: C49H57N9O7S (912,12) MS (ESI+) 916,6 (M + H+). ESTUDIOS DE UNIÓN Y DE MARCADO POR FOTOAFINIDAD: Se aislaron por métodos conocidos por los expertos en la téc-nica vesículas de tejido de borde de cepillo del intestino delgado de conejos (Kramer et al. J. Biol. Chem. 268, 18035-18046 (1993)). El marcado por fotoa-finidad que empleaba un compuesto radiomarcado de la Fórmula I a), ó Fórmula I b) ó, Fórmula I c), ó Fórmula I d), ó Fórmula I e) de esta invención se llevó a cabo en un reactor fotoquímico del tipo Rayonet RPR-100 (obtenible de "The Southern Ultraviolet Company, Hamden, CT"). Las vesículas de membrana de borde de cepillo (100 a 200 g de proteína) se incubaron con uno de los compuestos en un volumen de 200 µ? en tampón Tris/Hepes10 mM (pH 7,4), NaC1 100 mM, manitol 100 mM a 20°C en la oscuridad durante 5 minutos En lugar de las vesículas de borde de cepillo también es posible usar orgánu-los, en particular sus membranas. Las consideraciones que siguen se aplican correspondientemente a estas membranas. La incubación en la oscuridad fue seguida por irradiación con luz UV de 254 nm durante 20 segundos o 60 segundos. Las vesículas de borde de cepillo se lavaron luego dos veces con el
tampón mencionado. Las proteínas se precipitaron por técnicas convencionales, tales como, por ejemplo, adición de etanol, adición de una sal o detergente, calentamiento, congelación y descongelación repetidas u otro método adecuado conocido por los expertos en la técnica, y se fraccionaron por electrofo-resis en gel de SDS-poliacrilamida. Las proteínas radiomarcadas eran detec-tables por LSC o fluorografía. La afinidad de las proteínas marcadas procedente de tejido de borde de cepillo para los compuestos estaba en el Intervalo de 1 a 100 n . PREPARACIONES DE ANIMALES Y MEMBRANAS: Conejos blancos machos de la raza New Zealand que pesaban 4-5 kg (Hariem Winkelmann, Borchem, Alemania) se mantuvieron con un dieta Altronin® estándar C 2023 (Altronin®, Lage, Alemania) que ingerían ad libitum. Se prepararon vesículas de membranas de borde de cepillo del estómago, duodeno, yeyuno, ileon, ciego, colon, recto y riñon por el método de precipitación con Mg2+. De acuerdo con técnicas estándares se prepararon membranas de microsomas de hígado de ratas y adipocitos de rata. INHIBICIÓN DE LA ABSORCIÓN DEL COLESTEROL: La absorción intestinal del colesterol se determinó por una modificación del método de Zilversmit/Hughes. Ratones machos NMRI (Char-les River Deutschland GmbH, Salzfeld, Alemania) mantenidos con comida (Altronin®, Lage, Alemania) se dejaron sin comida 12 horas. 0,5 mi de una solución de metilcelulosa al 0,5%/Solutol al 5 % (BASF, Ludwigshafen, Alemania) como vehículo con o sin 3 mg del respectivo inhibidor de la absorción
del colesterol se aplicaron como alimentación por sonda a cada animal seguido por 0,25 mi de solución de Intralipid® (Pharmacia & Upjohn, Erlangen, Alemania) que contenía 0,24 \¡C'\ de [1 C]colesterol y 0,25 µ?? de [3H]sitosterol. Los animales (cinco ratones por grupo) se mantuvieron en jau-las de metabolismo y se recogieron las heces. Después de 24 horas los animales se sacrificaron y se determinó la radiactividad en las heces y el hígado por análisis de combustión. SOLUBILIZACIÓN DE LA PROTEÍNA DE 145 KDA QUE SE UNE A INHIBIDORES DE LA ABSORCIÓN DEL COLESTEROL: Vesículas de membrana de borde de cepillo del intestino delgado de conejos se lavaron varias veces con tampón Tris/Hepes 10 mM (pH 7,4)/ manitol 300 mM después de marcado por fotoafinidad. El pelet resultante se solubilizó a una concentración de proteína de 1 mg/ml durante 60 minutos a 4°C en tampón Tris/Hepes 10 mM (pH 7,4)/KCI 75 mM/MgCI2 5 mM/EGTA 1 mM/DTT 1 mM/n-octilglucósido al 1 % (p/v)/Triton X-100 al 1 %/ ("tampón de solubilización") al 1 % (p/v). Alternativamente, las proteínas pudieron solubili-zarse a una concentración de proteína de 10 mg/ml con SDS al 1 % en tampón Tris/Hepes 10 mM (pH 7,4) a 4°C durante 10 minutos seguido por una dilución 1 :10 con tampón Tris/Hepes 10 mM (pH 7,4)/ n-octilglucósido al 1 %. Después de centrifugación, los líquidos sobrenadantes que contenían las proteínas de membrana se mezclaron y diluyeron con los tampones apropiados para cromatografía, que contenían n-octilglucósido al 1 % como detergente.
Purificación de la proteína de unión de 145 kDa radiomarcada para los inhibidores de la absorción del colesterol después de marcado por fotoafinidad con 2-azetidinona C-1 foto-reactiva: MARCADO POR FOTOAFINIDAD: 8 muestras de vesículas de membranas de borde de cepillo de íleon de conejo (250 g de proteína) se incubaron con 66 nM (0,3 pCi) de [3H]C-1 en tampón Tris/Hepes 10 mM (pH 7,4)/NaCI100 mM/manitol 100 mM durante 30 minutos a 20°C en la oscuridad. Después de irradiación durante 30 segundos a 254 nm en un reactor fotoquímico de Rayonat RPR 100 equipado con 4 lámparas RPR 2537 A (The Southern Ultraviolet Company, Hamden, CT, EE.UU.) se recogieron las muestras y después de centrifugación las vesículas de membrana se volvieron a suspender en 2 mi de tampón Tris/Hepes 10 mM (pH 7, 4)/manitol 300 mM y se centrifugaron durante 20 minutos a 20°C. Este método se repitió tres veces. El sedimento resultante se solubilízó con 2 mi de "tampón de solubilización". Después de centrifugación, se retiró una parte alícuota de 40 µ? del líquido sobrenadante y se analizó por SDS-PAGE y recorte subsiguiente del gel para incorporación de la radioactividad en las proteínas de membrans. CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD SOBRE LECTINA DE GERMEN DE
TRIGO El líquido sobrenadante que contenía las proteínas de membrana solubilizadas se añadieron a 0,5 mi de un gel de agarosa con lectina de germen de trigo. Después de 30 men a 20°C las perlas se recogieron por cen-
trifugación y se lavaron 3 veces con 2 mi de tampón Tris/Hepes 10 mM (pH 7,4)/NaC1 100 mM/ manitol 100 mM/n-octilglucósido al 1 % (p/v). Las proteínas absorbidas se eluyeron con 4 porciones de 2 mi de tampón Tris/Hepes 10 mM (pH 7,4)/NaCI 100 mM/manitol 100 mM/N-acet¡l-D-glucosamina 300 mM; en todos los eluatos se midieron la actividades de aminopeptidasa N y sacarasa y de 100 µ? alícuotas de cada fracción de proteína se precipitó y analizó por SDS-PAGE. CROMATOGRAFIA SOBRE HIDROXILAPATITO Los eluatos de N-acetilglucosamina de la cromatografía sobre lectina de germen de trigo se diluyeron diez veces con tampón de fosfato de sodio 10 mM (pH 7,4)/noctilglucósido al 1 % (p/v) y se aplicaron a una columna de hídroxiapatito (10 cm de altura, 1 cm de diámetro) equilibrada con tampón de fosfato de sodio 10 mM (pH 7,4)/ n-octilglucósido al 1 % (p/v) a un caudal constante de 0,25 ml/minutos y recogida de fracciones de 1 mi. Las proteínas subsiguientes se eluyeron como sigue: 10 mi de tampón fosfato de sodio 10 mM (pH 7,4)/n-octilglucósido al 1 % (p/v) seguido por los siguientes gradientes de fosfato: 15 mi con fosfato 10 a 250 mM, 15 mi con 250 a 700 mM y 10 mi con 700 a 1000 mM. En cada fracción se determinó la actividad y radiactividad de aminopeptidasa N y sacarasa. De cada fracción se retiraron 100 µ? y la proteína se precipitó seguido por SDS-PAGE con determinación subsiguiente de la distribución de las proteínas marcadas radiactivamente por recorte de los geles en trozos de 2 mm.
ELECTROFORESIS EN GEL DE SDS PREPARATIVA Se recogieron las fracciones que contienen la proteína de 145 KDa marcada radiactivamente y la proteína se precipitó con clorofor-mo/metanol. Después de disolución en un tampón de SDS-muestra (Tris/HCI 62,5 mM (pH 6,8) SDS al 2%/2-mercaptoetanol al 5%/glicerol al 10 %/azul de bromofenol al 0,001 % la muestra se centrigugó y el líquido sobrenadante transparente se aplicó al gel de separación de una gel de SDS al 7,5 % preparativo (diámetro 28 mm; longitud del gel de separación: 5 cm). La electrofore-sis se realizó a 500 V (40 mM, 6 W) y el eluato se dividió en fracciones de 1 ,5 mi. Para el análisis de composición de proteína por SDS-PAGE se usaron partes alícuotas de 150 µ? de cada fracción. Purificación de la proteína de 145 kDa que se une a los inhibidores de la absorción del colesterol por cromatografía de afinidad sobre es-treptavidina-biotina: 10 muestras de vesículas de membrane de borde de cepillo de íleon de conejo (200 pg de proteína) se incubaron con 200 µ? del inhibidor de colesterol C-4 marcado con biotina en tampón Tris/Hepes 10 mM (pH 7,4)/ NaCI 00 mM/manitol 100 mM durante 30 minutos en la oscuridad a 20°C seguido por irradiación a 254 nm durante 30 segundos en un reactor fotoquímico Rayonat RPR-100 equipado con 4 lámparas RPR 2537 A. Después de la recogida, las vesículas se lavaron 3 veces con 2 mi tampón Tris/Hepes (pH 7,4)/ manitol 300 mM. El pelet final se suspendió en 2 mi de " tampón de solubiliza-ción" durante 1 hora a 4°C. Después de centrifugación, el líquido sobrenadan-
te transparente se mezcló con 0,5 mi de perlas de estreptavidina-agarosa y se mantuvo bajo agitación a 4°C durante 2 horas. Después de centrifugación, las perlas se incubaron con 2 mi de tampón Tris/Hepes 10 mM (pH 7,4)/manitol 300 mM /n-octilglucósido al 1%/PMSF 4 ml yodacetamida 4 mM/EDTA4 mM /durante 10 minutos a 4°C seguido por centrifugación. Después de repetir este método dos veces, las proteínas se eluyeron de las perlas de estreptavidina-agarosa con 3 porciones de 2 mi del tampón anterior que contenía biotina 5 mM. De todos los eluatos se tomaron partes alícuotas para la determinación de la actividad enzimática de aminopeptidasa N y sacarasa y para análisis por SDS-PAGE. Para la purificación final se consiguieron, por electroforesis en gel de SDS preparativa como se ha descrito anteriormente, los eluatos de biotina que contenían la proteína de 145 kDa, modificada covalentemente, que se une los inhibidores de la absorción del colesterol. FRAGMENTACIÓN ENZIMÁTICA: La proteína de 145 kDa aislada por ambos métodos se precipitó con cloroformo/metanol y se redisolvió en 3 µ? de tampón Tris/HCI (pH 6,8)/ SDS al 6,2 %/2-mercaptoetanol al 0,5 %/azul de bromofenol al 0,0005%. La fragmentación enzimática se realizó añadiendo 5 µ? de una solución recientemente preparada de quimotripsina (35 ng/ml) en el tampón anterior e incubación a 30°C durante 1 hora. La reacción se detuvo por adición de tampón de SDS-muestra que contenía EDTA 4 mM / PMSF 4 mM/yodoacetamida 4 mM y calentamiento durante 5 minutos a 95°C seguido por subsiguiente sobre SDS-PAGE en geles de Trís/Tricina.
ELECTROFORESIS EN GEL DE SDS La electroforesis en SDS-PAGE se llevó a cabo en geles de planchas verticales (20 x 17 x 0,15 cm) empleando un sistema de electroforesis LE 2/4 (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania) con concentra-ciones de gel de 7-10,5 % a una relación de 97,2 % de acrilamida y 2,8 % de ?,?-metilen-bisacrilamida o para fines analíticos en geles de NOVEX (4-12 %, 12 % o 15 %, Invitrogen (Groningen, Países Bajos) usando un sistema de electroforesis Xcell II de Novex. La separación electroforética de los fragmentos peptídicos se realizó en geles de Tris/Tricina (16,5 %) de acuerdo con Schaggre & Jagow. Después de la electroforesis los geles se fijaron en ácido tricloroacético al 12,5% seguido por tinción con azul Serva R 250. Para la determinación de la distribución de las radiactividad, las pistas de gel individuales se cortaron en trozos de 2 mm, la proteína hidrolizó con 250 µ? del solubi-lizador de tejidos Biolute S y recuento con centelleo de líquidos usando 4 mi de agente de centelleo Quickszint 501. SOLUBILIZACIÓN DE LA PROTEÍNA DE 145 KDA QUE SE UNE LOS INHIBIDORES DE LA ABSORCIÓN DEL COLESTEROL: Un requisito previo para la purificación de la proteína de 145 kDa que se une los inhibidores de la absorción del colesterol es una solubili-zación satisfactoria de esta proteína de membrana integral en un estado no desnaturalizado. Los experimentos de solubilizacíón con una variedad de detergentes revelaron que con aproximadamente 80-90 % de SDS y con el detergente de ion híbrido 9-13 podía solubilizarse aproximadamente 60 % de
proteína fotomarcada, mientras que con CHAPS, NP-40, digitonina y Triton-X-114 no se pudo conseguir una solubilización significativa. Las soluciones al 1 % de detergentes no iónicos como Triton-X-100, n-octilglucósido, decilmalto-sida, dodecilmaltosida o hemisuccinato de colesterol/dodecilmaltosida en tam-pón Tris/Hepes 10 mM (pH 7,4)/ manitol 300 mM sólo condujeron a una solubilización parcial de la proteína de 145 kDa con lo cual se impedía su purificación. Finalmente se encontraron dos protocolos que daban un rendimiento de 60-80 % de solubilización de la proteína de 145 kDa que permitían un método de purificación: a) solubilización con SDS al 1% con dilución subsiguiente con n-octilglucósido al 1% como concentración de partida de SDS al 0,1 %/n-octilglucósido al 1%. b) solubilización con tampón Tris/Hepes 10 mM (pH 7,4)/ CI 75 mM/MgCI2 5 mM/EGTA 1 mM/DTT 1 mM/Triton X-100 al 1 %/ n-octilglucósido al 1 % ("tampón de solubilización "). El método de solubilización permitió obtener proteínas de membrana de borde de cepillo satisfactoriamen-te purificadas por un método cromatografico. DISEÑO DE SONDA DE FOTOAFINIDAD DE 2-AZETIDINONA MARCADA CON BIOTINA: Para una purificación en una sola etapa de la proteína diana para los inhibidores de la absorción del colesterol hemos acoplado el grupo fotolábil que contiene biotina, N-(biotinil)-4-azidofenil-alanina, mediante un espaciador, a la posición para del anillo de N-fen¡lo o bencilamino de inhibidores la absorción del colesterol a base de 2-azetidinona. Las relaciones de estructura-actividad han demostrado que esta posición permite una modificación
química considerable manteniendo la potencia in vivo para la inhibición de la absorción intestinal del colesterol. Después de la aplicación del C-4 fotolabil de marcado de biotina, a ratones NMRI la absorción intestinal del colesterol era inhibida dependiendo de la dosis lo que indicaba una eficacia biológica del inhibidor de la absorción del colesterol fotolábil marcado con biotina, un requisito previo para la identificación de la(s) proteína(s) que están implicadas en la absorción intestinal del colesterol por esta sonda. El marcado por fotoafinidad de vesículas de membrana de borde de cepillo (abreviadamente VMBC) del intestino delgado de conejos con el derivado de azidobenzoilo [3HJC-1 en pre-sencia de concentraciones crecientes del inhibidor de la absorción del colesterol C-4 marcado con biotina dió como resultado una disminución dependiente de la concentración en la extensión del marcado de la proteína de 145 kDa lo que indicaba una interacción específica de C-4 con la proteína de 145 kDa que se une a los inhibidores de la absorción del colesterol en la membrana de cepillo de borde de los enterocitos del intestino delgado. PURIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA DE 145 KDA FOTOMARCADA QUE SE UNE AL INHIBIDOR DE LA ABSORCIÓN DEL COLESTEROL C-1 DE 2- AZETIDINONA MARCADO CON TRITIO: La proteína de unión fotomarcada de 145 kDa está localizada en un intervalo de peso molecular en el que proteínas de membrana muy abundantes de membranas de borde de cepillo como el complejo sacara-sa/isomaltasa o aminopeptidasa N migran en geles de SDS haciendo por tanto obligatoria una separación completa de estas proteínas para la determina-
ción de la secuencia. La investigación bioquímica identificó la proteína de 145 kDa como una proteina de membrana glicosilada e integrada, con un desplazamiento de la masa molecular de 145 kDa a 110 kDa por desglicosilación con N-glicanasa. Por tanto investigamos diversas lectinas como supuestos ligandos por cromatografía de afinidad. Con lectina-agarosa de germen de trigo se consiguió una retardación completa de la proteína fotomarcada de 145 kDa, mientras que fueron eluidas 70-80% de la actividad enzimática de la sacarasa y aminopeptidasa N. Con N-acetilglucosamina la cantidad total de la proteína de 145 kDa pudo ser eluida junto con 30-50 % de la actividad de aminopeptidasa N y sacarasa. Globalmente se consiguió, un enriquecimiento de 4-5 veces de la proteína de 145 kDa que se unía a los inhibidores de la absorción del coiesterol. Para más purificación se evaluaron cierto número de diferentes métodos. La cromatografía en columnas Mono Q o Mono S condujo a una separación completa de sacarasa/isomaltasa, pero solo parcialmente de aminopeptidasa N, mientras que con cromatografía de afinidad con quela-ción de metales no pudo conseguirse una separación clara. Con cromatografía sobre hidroxilapatito pudo conseguirse un fuerte enriquecimiento de la proteína de 145 kDa y la separación de sacarasa y aminopeptidasa N. Un perfil de gradiente de fosfato optimizado condujo a una separación casi completa de la proteína 145 de kDa de otras proteínas de membrana; la proteína de 145 kDa se eluyó a altas concentraciones de fosfato y estaba exenta de actividades enzimáticas significativas de sacarasa o aminopeptidasa N. La purificación final se consiguió por SDS-PAGE preparativa de los eluatos de la croma-
tografía de hidroxilapatito. La cantidad estimada de la proteína pura de 145 kDa fue 1-3% del material aplicado a la columna de hidroxilapatito lo que indicaba que se consiguió un factor de enriquecimiento de > 150 < 500 veces con respecto a las membranas de borde de cepillo y 2500-10000 veces con res-pecto a la proteína total de enterocitos. PURIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA DE 145 KDA, QUE SE UNE A INHIBIDORES DE LA ABSORCIÓN DEL COLESTEROL, POR CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD SOBRE ESTREPTAVIDINA-BIOTINA DESPUÉS DE MARCADO POR FOTOAFINIDAD CON UN INHIBIDOR DE LA ABSORCIÓN DEL CO- LESTEROL MARCADO CON BIOTINA Vesículas de membrana de borde de cepillo (VMBC) de intestino delgado de conejos se incubaron con 200 µ? de C-4 y se consiguió la reticulación por irradiación ultravioleta a 254 nm. Después de solubilización las proteínas modificadas covalentemente que contenían los inhibidores de la absorción del colesterol de 2-azetidinona marcados con biotina se extrajeron con perlas de estreptavidina. Después de lavado intensivo proteínas unidas se eluyeron con una solution 10 mM de biotina y se analizaron por SDS-PAGE. Predominantemente se retuvo una proteína de Mr 145 kDa por las perlas de estreptavidina, mientras que no había proteínas detectables si se omitía la irradiación ultravioleta lo que indicaba que una proteína de 145 kDa es la pro-teína principal que se une al inhibidor de la absorción del colesterol fotolábil marcado con biotina denominado C-4 . Los extractos biotina de las perlas de estreptavidina no contenían actividades enzimáticas detectables de sacara-
sa/isomaltasa o aminopeptidasa N lo que indicaba que la proteína de 145 kDa eluida representa probablemente un solo resto de proteína modifcado por unión covalente del inhibidor de la absorción del colesterol marcado con bioti-na. La presencia de 200 µ de otros inhibidores de la absorción del colesterol como ezetimibe durante el fotomarcado con C-4 redujo la cantidad de proteína extraible 145 kDa con perlas de estreptavidina lo que indicaba una competición directa de inhibidores de la absorción del colesterol con C-4 para sitios de unión idénticos; en contraste, sustratos para otros transportadores de nutrientes intestinales para ácidos biliares, ácidos grasos, glucosa, oligopéptidos o aminoácidos no tenían influencia sobre la cantidad de proteína de 145 kDa extraible. Al realizar estos experimentos de marcado con membranas de células de diferentes órganos se reveló que solamente por marcado de VMBC del intestino delgado de conejo o - duodeno, yeyuno e íleon - podía extraerse una proteína de 145 kDa, mientras que después de marcado de VMBC de estómago, ciego, colon, recto, riñon, hígado o adipocitos ninguna proteína de 145 kDa fue retardada por perlas de estreptavidina. Por tanto, la proteína de unión de 145 kDa sólo pudo purificarse de estos sitios anatómicos en donde ocurre la absorción intestinal del colesterol, el duodeno, yeyuno e íleon. Las proteínas de 145 kDa purificada por cromatografía sobre lectina de germen de trigo e hidroxilapatito y por cromatografía de afinidad sobre estreptavidina-biotina son indistinguibles en geles de SDS. Después de fragmentación enzi-mática con quimotripsina se obtuvieron modelos casi idénticos de péptídos con un número de péptidos en el intervalo de pesos moleculares de 4-35 kDa
lo que indicaba que las proteínas de 145 kDa purificadas por ambos métodos eran idénticas y contenían predominantemente, cuando no exclusivamente, sólo un resto de proteína. Fig. 1 : Parte 1 del esquema de reacción para la síntesis de [2-(4-Azido-fenil)-1-(4-{4-[3-(3-hidroxi-3-fenil-propil)-2-(4-metoxi-fen¡l)-4-oxo-azetidin-1-il]-fen¡lcarbamoil}butilcarbamoil)-etil]amida del ácido 5-(2-oxo-hexahidrotieno[3,4-d]imidazol-6-il)-pentanoico (14). Fig. 2: Parte 2 del esquema de reacción para la síntesis de
[2-(4-Azido-fenil)-1-(4-{4-[3-(3-hidroxi-3-fenil-propil)-2-(4-metoxi-fenil)-4-oxo-azetidin-1-il]-fenilcarbamoil}-butilcarbamoil)-etil]amida del ácido 5-(2-oxo-hexahidrotieno[3,4-d]¡midazol-6-il)-pentanoico (14).