KR101095288B1

KR101095288B1 - 장내 콜레스테롤 결합 단백질의 분리방법

Info

Publication number: KR101095288B1
Application number: KR1020057002084A
Authority: KR
Inventors: 베르너 크라머; 벤델린 프리크
Original assignee: 사노피-아벤티스 도이칠란트 게엠베하
Priority date: 2002-08-06
Filing date: 2003-07-28
Publication date: 2011-12-16
Also published as: JP2006512054A; US7786103B2; CA2493487A1; CA2493487C; NO20051169L; IL199409A; RU2345089C2; BR0313217A; ATE386053T1; RU2005106238A; WO2004014947A1; EP1529061A1; KR20060015443A; NO333437B1; US20040126812A1; US20080167451A1; CN1668642A; IL166492A0; AU2003253341C1; US7435727B2

Abstract

본 발명은 콜레스테를 및/또는 콜레스테를 흡수 억제제와 결합할 수 있는 장 단백질을 분리하는 방법에 관한 것이다.

장내 콜레스테롤 결합 단백질, 콜레스테를 흡수 억제제, 단백질 분리.

Description

장내 콜레스테롤 결합 단백질의 분리방법 {Method for isolating an intestinal cholesterol binding protein}

본 발명은 장내 콜레스테롤 흡수에 관여하며 콜레스테롤 흡수 억제제에 결합할 수 있는 장 단백질을 분리하는 방법에 관한 것이다.

사람의 경우, 콜레스테롤의 평균 약 50%는 장 내강에 존재한다. 관내 콜레스테롤은 주로 식이 및 담즙으로부터 생긴다. 1일 약 2g의 콜레스테롤이 담즙으로부터 배출된다. 장내 콜레스테롤 흡수는 담즙염의 존재에 크게 좌우된다. 따라서, 담즙염 또는 담즙염 봉쇄제의 재흡수 억제제의 투여 효과는 장 콜레스테롤의 흡수를 억제하는 것이다.

장내 콜레스테롤 흡수를 억제하는 것은 지질 장애, 동맥경화증 및 심혈관 장애 치료의 중요한 목표이다. 전문가들 사이에서 우세한 의견은 장내 콜레스테롤 흡수가 물리화학적 확산에 의해 일어난다는 것이다.

단백질이 관련되는 것으로 나타난 콜레스테롤 운반에 대한 여러 소견들이 공지되어 있다. 장내 콜레스테롤 흡수는 개인차가 크다. 시험관내 실험으로부터의 생화학 데이타에서는 단백질이 작은 단층 소포와 장의 솔가장자리 소포(brush border vesicle) 간의 콜레스테롤 교환에 관여하는 것으로 나타났다. β-시토스테롤 및 캄페스테롤과 같은 식물 스테롤의 장 흡수에는 상당한 차이가 있음을 관찰할 수 있으며, 이들은 메틸 그룹(β-시토스테롤) 및 에틸 그룹(캄페스테롤)에서만 차이가 있다. 사람의 경우, β-시토스테롤은 특히 콜레스테롤 흡수 억제를 나타낸다. 내강 투여시 장내 콜레스테롤 흡수를 억제하는 화합물에는 두 가지 종류의 고활성 화합물이 있다. 화합물은, 한편으로는 티퀘사이드 및 파마퀘사이드와 같은 사포닌으로부터 유도된 화합물이고, 다른 한편으로는 2-아제티디논의 특정 유도체이다. 콜레스테롤 흡수 억제제로서의 2-아제티디논의 유도체가 문헌[참조; Clader et al., J. Med. Chem. 39, 3684-3693, 1996]에 기재되어 있다. 본 발명의 목적을 위해, 흡수란 성분이 단백질에 부착되고 이러한 성분이 단백질의 도움으로 운반되는 것을 의미한다.

콜레스테롤의 장내 흡수는 혈청 콜레스테롤 항상성에 상당히 기여한다. 이제티미브(ezetimibe) 또는 파마퀘사이드와 같은 장내 콜레스테롤 흡수 억제제는 임상 시험에서 신규한 콜레스테롤 강하제로서의 이의 효능이 입증되었다. 수많은 과학적 노력에도 불구하고, 이들의 작용 분자 모드 뿐만 아니라 장내 콜레스테롤 흡수 기전은 여전히 불분명하며 논쟁적으로 논의되고 있다. 일반적으로, 혈장 막 및 장 솔가장자리 세포 막을 통해 콜레스테롤이 수동 확산되는 것으로 여겨지지만, 장내 콜레스테롤 흡수를 위한 단백질 매개된 과정에 대한 증거들이 증가하고 있다: 콜레스테롤 흡수는 종에 따라 큰 차이를 나타내며, 필적하는 물리화학적 특성을 갖는 β-시토스테롤 또는 캄페스테롤과 같은 구조적으로 밀접하게 관련된 식물 스테롤은 콜레스테롤과는 다르게 흡수가 불량하므로 단순 확산 공정을 거치게 된다. 깊은 구조-활성 관련성을 갖는 콜레스테롤용 특정 운반 억제제인 2-아제티디논 및 스테롤 글리코사이드의 존재는 장내 콜레스테롤 흡수를 위한 단백질 매개된 과정을 강력하게 제안한다.

콜레스테롤은 (소량에서) 인체의 작용에 필수적인 불안정한 화합물이다. 단지 동물만이 이를 생산한다: 가공시 라드(lard)와 같은 동물계 제품을 첨가하지 않으면 식품성 제품은 콜레스테롤을 함유하지 않는다. 사람에서, 콜레스테롤은 세 가지 주요 작용을 한다. 이는 특성 선(gland)에서 성 호르몬을 포함한 스테로이드 또는 코르티손-유사 호르몬을 제조하는 데 사용된다. 이는 간이 지방 소화에 필수적인 담즙산을 생성하는 것을 도와준다. 마지막으로 말하지만, 중요하게는 이는 세포 막 및 구조, 일종의 신체 조직의 구성 블럭의 주요 성분이다. 콜레스테롤이 없다면, 포유동물의 수명은 유지되지 않을 것이다.

몸에 콜레스테롤이 너무 많이 있거나 부적절한 장소에 쌓여있는 경우에 콜레스테롤과 관련하여 문제가 야기된다. 심장 자체 근육 조직으로의 산소의 주요 공급자인 심장 관상동맥벽 내부에 콜레스테롤이 쌓이면 관상심장 질환이 야기된다. 이는 플라크라고 불리는 지방질의 단단한 차단물(blockage)의 형성에 기여한다. 이러한 플라크의 축적을 동맥경화증이라고 한다. 또한, 콜레스테롤은 신체의 다른 동맥내에 쌓일 수도 있으며, 여기서 이는 (뇌에서의 동맥 폐쇄로 인한) 졸중 및 (다리에서의 동맥 폐쇄로 인한) 말초혈관 질환의 발생에 기여할 수 있다.

콜레스테롤을 신체 전반에 운반하기 위해서는, 콜레스테롤이 지단백질이라고 불리는 특수 분자로 포장되어야 한다. 지질 또는 지방 콜레스테롤 성분이 수용성 단백질 피막내에 감싸여져 있다. 상이한 유형의 지단백질은, 신체내의 역학적인 조직(economy)으로 인해, 콜레스테롤을 몇몇 조직에 운반하고 다른 조직으로부터 콜레스테롤을 제거하는 다양한 지단백질을 함유한다. 체내의 주요 콜레스테롤-운반 화합물은 저밀도 지단백질, 즉 LDL-콜레스테롤이다. LDL은 동맥내에 콜레스테롤을 축적시키는 데 주요한 역할을 하는 것으로 보이므로 종종 "나쁜 콜레스테롤(bad cholesterol)"이라고 한다. 이는 가장 조밀한 크기의 분자인 매우 작은 단백질을 갖기 때문에 저밀도라고 불리며, 주로 지방으로 구성된다. 높은 수준의 LDL은 관상심장 질환 위험성 증가와 관련된다. 고밀도 지단백질, 즉 HDL은 동맥벽으로부터 콜레스테롤을 제거하여 배설을 위해 이를 간으로 운반하는 것을 도와주는 것으로 보이므로 종종 "좋은 콜레스테롤(good cholesterol)"이라고 한다. LDL 콜레스테롤과는 달리, 낮은 수준의 HDL이 관상심장 질환 위험성 증가와 관련되며, 반면에 HDL의 수준이 보다 높으면 상기 질환으로부터 보호하는 것으로 보인다.

기타 하위유형의 콜레스테롤 입자로는, 지방 소화시 장 세포에 의해 생성되는 킬로마이크론(chylomicron) 및 LDL 콜레스테롤 제조의 중요한 전구체로서 간에 의해 제조되는 초저밀도 지단백질(VLDL)이 포함된다. VLDL은 간에 의해 생성되는 트리글리세라이드를 운반하는 주요 지단백질이다.

심장 질환 위험성을 측정하기 위해서는, LDL 및 HDL이 중요하다.

고지방 고콜레스테롤 식이가 혈중 콜레스테롤 수준 증가에 기여하며 높은 혈중 콜레스테롤이 심장 질환의 명확한 위험인자라는 증거에 의해, 식이 또는 기타 수단에 의해 혈중 콜레스테롤을 감소시키는 것이 위험성을 낮출 것이라고 생각하는 것은 당연해 보인다.

본 발명의 목적은 장내 콜레스테롤 흡수에 관여하고 콜레스테롤 흡수 억제제의 분자 단백질 표적인 단백질을 분리하는 방법을 제공하는 것이다. 당해 방법은 콜레스테롤 수준 증가를 조절하기 위한 치료학적 노력에 대해 상당한 이익을 제공할 것으로 생각된다.

본 발명은

생물학적 물질을 제공하는 단계(a),

단계(a)로부터의 생물학적 물질을, 방사능 표지되어 있고 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 광반응성 2-아제티디논 화합물과 함께 항온처리하는 단계(b),

생물학적 물질을 용해시키고 세포 파편을 제거하는 단계(c),

밀 배아 렉틴 아가로스를 포함하는 장치에 상청액을 첨가하는 단계(d),

단계(d)로부터의 밀 배아 렉틴 아가로스의 용출액을 하이드록실아파타이트 컬럼에 적용하여 포스페이트 완충액 구배에 의해 용출시키는 단계(e),

단계(e)로부터의 방사능 표지된 분획을 제조용 SDS-PAGE에 로딩하는 단계(f) 및

방사능 표지된 분획을 수거하고, 가능하게는, 침전시키는 단계(g)를 포함하는 단백질의 분리방법에 관한 것이다.

생물학적 물질은 사람, 랫트, 마우스 또는 래빗의 장 세포 배양액 또는 회장 솔가장자리 세포로부터의 장 조직 또는 세포로부터 채취하는 것이 바람직하다.

광반응성 2-아제티디논 화합물의 구조는 바람직하게는 다음과 같다[문헌 참조; Kramer, W. et al. (2000) FEBS Letters 487, 293-297].

위의 화학식 I에서,

R은

(a),

(b),

(c),

(d) 및

(e) 중의 하나의 그룹으로부터 선택된다.

화학식 I a, b 및 c의 화합물의 합성방법은 2002년 3월 28일자로 공개된 독일 공개특허공보 제10042447 A1호에 기재되어 있다. 화학식 I d 및 e의 화합물의 합성방법은 이하의 실시예에 기재되어 있다.

분자내의 광불안정 그룹을 사용하여 바로 인접하여 위치한 분자, 바람직하게는 단백질에 공유결합을 생성시킬 수 있다. 이러한 목적을 위해, 광불안정 그룹을 갖는 화합물을 초기에, 공유결합을 생성시키고자 하는 분자에 바로 인접시킨다. 이는, 예를 들면, 단백질의 특이 억제제, 바람직하게는 콜레스테롤 흡수 억제제로서 작용하는 화합물의 또 다른 부분을 통해 일어날 수 있다. 화합물을 분자와 접촉시킨 다음 UV광으로 조사한다. UV광을 조사하면 광불안정 그룹이 활성화되고 상호작용 분자, 특히 단백질에 대한 공유결합의 생성이 개시된다. 예를 들면, 디아지린, 아지도 또는 카보닐 관능 그룹이 광불안정 그룹으로서 적합하다.

조사를 위해서는, 예를 들면, 삽입(intercalation)된 에티듐 브로마이드를 사용하여 폴리뉴클레오타이드를 육안으로 보이도록 하거나 실험실 표면을 살균시키기 위해 사용되는 통상적인 UV 램프 또는 코네티컷주 햄던에 소재한 더 서든 울트라바이올렛 캄파니(the Southern Ultraviolet Company)로부터 입수 가능한 광화학 반응기를 사용할 수 있다. UV광을 조사한 후, 통상적인 방법을 사용하여 세포를 파열시킨다. 이의 예는 동결과 해동을 반복하는 것, 세포를 초음파로 처리하는 것, 프렌치 프레스(French press)를 사용하거나 세정제 및 효소를 첨가하는 것이다. 세포 용해질의 단백질 분별은, 예를 들면, 황산암모늄으로 침전시키거나 분별 원심분리시키거나 크로마토그래피 기법을 사용함으로써 수행할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 크로마토그래피 기법은, 예를 들면, 1차원 또는 2차원의 변성 또는 비변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 고압 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 또는 친화력 크로마토그래피이다. 이러한 기법은 숙련가들에게 친숙하며, 예를 들면, 문헌[참조; "Current Protocols in Protein Science" ; John E. Caligan ; Ben M. Dunn; Hidde L. Ploegh ; David W. Speicher; Paul T. Wingfield ; Wiley and Sons; ISBNO-471-11184-8]에 상세하게 다루어져 있다.

바람직하게는, 분별 후 단백질 검출은 장내 콜레스테롤 흡수 억제제 및 광불안정 그룹을 함유하는 화합물을 방사능 표지화함으로써 수행한다. 이러한 목적에사용될 수 있는 방사성 동위원소는, 예를 들면, ³H 또는 ¹⁴C이다. 적합한 검출방법은, 예를 들면, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용하여 단백질을 폴리아크릴아미드 겔에 도입한 후 X선 사진촬영술에 사용되는 필름 재료에 의해 공유결합된 화합물을 함유하는 단백질을 검출하는 것이다. 기타의 적합한 검출방법은 액체 신틸레이션 계수법 또는 평판 스캐닝(flat bed scanning)이다.

생물학적 물질은 바람직하게는 장 세포로 구성된다. 장 세포는, 예를 들면, 동물로부터 장을 절개한 다음 정제하고, 결합 조직을 효소에 의해 파열시키고 등장성 완충액에 단세포를 현탁시킴으로써 제공될 수 있다. 장 세포를 제공하는 데 적합한 장 조직은, 그중에서도, 도축 후 남은 동물의 상응 부분이다. 또한, 장 세포는 사람 장 조직으로부터 수술시 장의 일부를 수득한 후에 제공될 수도 있다. 장 세포는 세포 배양 기법을 사용하여 본 발명의 목적을 위해 제공된 장 세포 배양물로 이루어질 수도 있다. 장 세포의 일부는 장 세포의 소기관일 수 있다. 소기관은, 바람직하게는 장 세포의 막이다. 장세포의 막은, 장 세포를 파열한 후에 분별 원심분리하여 수득할 수 있다. 장 세포의 일부가 단백질 분획인 것도 바람직하다. 장 세포 또는 장세포의 일부의 제공은, 바람직하게는 포유동물 유기체의 장 조직의 솔가장자리로부터의 세포로 이루어진다.

이러한 장 세포가 수득되는 포유동물 유기체에는, 바람직하게는 사람, 원숭이, 소, 돼지, 랫트, 마우스, 래빗, 햄스터 또는 기타 척추 동물이 포함되지만 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 세포는, 상기 생물의 장의 솔가장자리 조직으로부터 세포 현탁액을 제조함으로써 제공될 수 있다. 적합한 장 물질은, 예를 들면, 수술 과정에 의해 수득된다. 기타의 공급원은 도축 후 남은 동물의 일부로부터 유도될 수 있다. 장 세포선의 세포도 적합하다. 적합한 세포 표본을 제조하기 위해, 장 조직을 효소 처리하여 단세포를 없앤 다음 분별 원심분리시킬 수 있다. 이어서, 이렇게 하여 수득한 세포 또는 소기관을 적당한 수성 매질에 용해시킨다. 이러한 수성 매질은 완충 성분, 염, 단백질 뿐만 아니라 부형제를 함유할 수 있다.

또한, 본 발명은

생물학적 물질을 제공하는 단계(a),

단계(a)로부터의 생물학적 물질을, 방사능 표지되어 있거나 비오틴-표지되어 있는 콜레스테롤 흡수의 광반응성 억제제와 함께 항온처리하는 단계(b),

단계(b)로부터의 생물학적 물질을 용해시키고 세포 파편을 제거하는 단계(c),

상청액을 크로마토그래피 처리하거나 스트렙트아비딘-아가로스에 첨가하는 단계(d),

용출액을 SDS-PAGE에 첨가하는 단계(e) 및

크기가 140 내지 150kDa인 단백질을 절제, 용출 및, 가능하게는, 리폴딩(refolding)시키는 단계(f)를 포함하는, 장내 콜레스테롤 흡수에 관여하는 콜레스테롤 흡수 억제제용 결합 단백질의 분리방법에 관한 것이기도 하다.

비오틴 표지된 콜레스테롤 흡수 억제제의 구조는 바람직하게는 다음과 같다:

또한, 본 발명은 상기한 바와 같은 본 발명의 방법에 의해 분리된 콜레스테롤 흡수 억제제에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 단백질에 관한 것이기도 하다. 단백질의 크기는 바람직하게는 140 내지 150kDa, 가장 바람직하게는 145kDa이다. 단백질은 글리코실화될 수 있다.

단백질의 분자량은 사용된 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에서는 불명 확하지만 기타의 상응하는 방법에서는 공지되어 있는 특정 범위를 나타낸다. 분자량 변화율은 +/- 10% 이하이다. 명시된 값은 다수회 실험의 평균을 나타낸다. 분자량이 145kDa인 단백질의 경우, SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 서로 독립적으로 수행된 10회 실험으로 분자량을 측정한 결과 평균은 145.3kDa이고 표준 편차는 +/- 7.55kDa이었다.

숙련가들은 글리코실화를 확인하기에 적합한 방법에 대한 상세한 설명을 문헌[참조; "Carbohydrate Biotechnology Protocols, Methods in Biotechnology, 10 (1999) Humana Press, ISBN 0-89603-563-8, Editor C. Bucke"]에서 찾아볼 수 있다.

추가로, 본 발명은 본 발명의 단백질 및 하기 화학식의 화합물에 의해 형성된 복합체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 본 발명의 단백질과 약제를 제형화하기 위한 약제학적으로 허용되는 화합물 및/또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 이러한 성분들은 널리 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌(참조; Remingtons Pharmaceutical Sciences, fifth edition, by Mack Publishing Company)에 기재되어 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 단백질과 상기 화합물과의 복합체 뿐만 아니라 약제를 제형화하기 위한 약제학적으로 허용되는 화합물을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 증가된 콜레스테롤 수준과 관련된 질환 치료용 약제학적 조성물을 제조하기 위한, 본 발명의 단백질의 용도를 포함한다. 이러한 질환은, 예를 들면, 비만, 동맥경화증, 고혈압, 심부전 등이다. 콜레스테롤 수준이 199mg/㎗이면 증가된 것으로 간주한다.

또한, 본 발명은 증가된 콜레스테롤 수준과 관련된 질환 치료용 약제학적 조성물을 제조하기 위한, 본 발명의 단백질과 상기 화합물과의 복합체의 용도를 포함한다.

또한, 본 발명은

본 발명의 단백질을 함유하는 생물학적 물질을 제공하는 단계(a),

화합물을 제공하는 단계(b),

생물학적 물질과 화합물을 접촉시키는 단계(c),

단계(c)에서 생물학적 물질에 의해 흡수된 콜레스테롤의 양을 측정하는 단계(d),

단계(d)로부터의 결과를, 단계(a)로부터의 생물학적 물질과 동일한 종 및/또는 조직 특이성을 갖지만 단계(b)의 화합물과 접촉시키지 않은 생물학적 물질로부 터 콜레스테롤 흡수를 측정한 대조 실험으로부터의 결과와 비교하는 단계(e) 및

단계(e)로부터의 결과에서, 단계(b)로부터의 화합물과 접촉시킨 세포로부터 콜레스테롤 흡수의 감소가 측정될 경우 화합물이 콜레스테롤 재흡수를 억제함을 나타내는 단계(f)를 포함하는, 콜레스테롤 재흡수를 억제하는 화합물을 동정하기 위한 본 발명의 화합물의 용도에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기한 방법으로 동정된 화합물 뿐만 아니라 증가된 콜레스테롤 수준과 관련된 질환 치료용 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제에 관한 것이다.

이러한 화합물의 분자량은 바람직하게는 100 내지 50,000Da, 보다 바람직하게는 100 내지 5,000Da이다. 이들 화합물은 콜레스테롤 유사체, 단백질, 펩타이드 또는 지방산 함유 화합물일 수 있다.

화합물은, 예를 들면, 화학적 합성에 의해 제공된다. 화합물은 완전한 합성 프로그램으로부터 화학적 화합물을 저장 및 카탈로그화하여 수득한 것과 같은 화학적 화합물의 수집물의 일부일 수 있다("화합물 라이브러리"). 다른 경우에, 화합물은 미생물, 특히 세균, 진균 또는 동물이나 식물 종에 의해 생성될 수 있다(천연 성분). 천연 성분의 경우, 화합물의 제공은 적절한 유기체로부터 분리함으로써 수행할 수 있다. 단백질과 화합물과의 접촉은, 대개의 경우, 예를 들면, 디메틸 설폭사이드 또는 에탄올과 같은 용매가 특정 비율로 혼합되어 있는 수용액에서 수행된다. 수용액은 또한 완충 성분, 이온 또는 안정화 첨가제, 예를 들면, 단백질, 글리세롤 등을 함유할 수 있다. 접촉을 위해서는, 예를 들면, 온도, pH, 이온 상태, 단백질 및 화합물의 농도 또는 용량에 대해 특히 일정한 상태인 것이 유리할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 접촉 동안 온도를 37℃로 일정하게 유지시키는 것이 바람직할 수 있다. 접촉을 수행한 후 단백질에 대한 화합물의 결합도의 측정은, 예를 들면, 단백질에 대한 화합물의 친화력의 척도로서 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 흡수 억제제의 변위를 사용하여, 다른 방식으로 방사능 표지된 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 흡수 억제제와의 상호작용에 의해 수행한다.

실시예

5-(2-옥소-헥사하이드로-티에노[3,4-d]이미다졸-6-일)-펜탄산[2-(4-아지도-페닐)-1-(4-{4-[3-(3-하이드록시-3-페닐-프로필)-2-(4-메톡시-페닐)-4-옥소-아제티딘-1-일]-페닐카바모일}-부틸카바모일)-에틸]아미드의 합성

하기 단락의 1 내지 14의 숫자는 도 1의 반응식을 참고한다.

비오틴-표지된 광반응성 콜레스테롤 억제제 (5-(2-옥소-헥사하이드로-티에노 [3,4-d]이미다졸-6-일)-펜탄산[2-(4-아지도-페닐)-1-(4-{4-[3-(3-하이드록시-3-페닐-프로필)-2-(4-메톡시-페닐)-4-옥소-아제티딘-1-일]-페닐카바모일}-부틸카바모일)-에틸]-아미드)의 합성

비오틴-표지된 광반응성 콜레스테롤 억제제의 합성에 관한 하기 단락의 1 내지 14의 숫자는 도 1 및 도 2의 반응식을 참고한다.

3-[5-(3급 부틸-디메틸-실라닐옥시)-5-페닐-펜타노일]-4-페닐-옥사졸리딘-2-온(1)

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3-(5-하이드록시-5-페닐-펜타노일)-4-페닐-옥사졸리딘-2-온 30g을 DMF 50㎖에 용해시킨다. DMF 25㎖ 중의 이미다졸 14.3g과 3급 부틸-디메틸실릴클로라이드 19g을 첨가한 후, 모든 성분이 용해될 때까지(2 내지 4시간) 반응물을 실온에서 교반한다. 반응 용액을 증발시키고, 물을 가한 후, 아세트산 에틸 에스테르로 추출한다. 유기 상을 황산마그네슘으로 건조시키고 증발시킨 후, 화합물(1)이 수득된다: C₂₆H₃₅NO₄Si (453.6) MS (ESI⁺) 476 (M + Na⁺).

(4-메톡시-벤질리덴)-(4-니트로-페닐)-아민(2)

이소프로판올 160㎖ 중의 아니스알데히드 50g(370mmol)에 파라-니트로아닐린 51g(370mmol)을 가한다. 80℃에서 2시간 후, 생성물이 침전된다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시켜 여과한다. 잔류물을 이소프로판올로 세척한다. 건조시킨 후, 생성물(2) 62.9g이 황색 결정의 형태로 수득된다(수율 66%): C₁₄H₁₃N₂0 ₃ (257.27).

3-{5-(3급 부틸-디메틸-실라닐옥시)-2-[(4-메톡시-페닐)-(4-니트로-페닐아미노)-메틸]-5-페닐-펜타노일}-4-페닐-옥사졸리딘-2-온(3)

3

메틸렌 클로라이드 135㎖ 중의 생성물(1) 5.4g(12.Ommol)과 생성물(2) 6.2g(24mmol)에 디이소프로필에틸아민 8㎖를 10℃에서 첨가하고, 트리메틸실릴 클로라이드 4.8㎖를 적가한다. 1시간 후, 메틸렌 클로라이드 중의 사염화티탄의 1M 용액 14㎖를 -10℃에서 적가한다. 이를 -10℃에서 3시간 동안 교반한 다음 교반하지 않은 채로 -30℃에서 추가로 12시간 동안 저장한다. 그후, 아세트산 8㎖와 타르타르산의 7% 수용액 140㎖를 첨가하고 실온에서 추가로 2시간 동안 교반한다. 아황산수소나트륨의 20% 수용액 50㎖를 첨가한 후, 1시간 동안 교반하여 메틸렌 클로라이드로 추출한다. 유기 상을 황산마그네슘으로 건조시키고 증발시키고 실리카겔 상에서 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헵탄(1/3 내지 1/1))하여 정제한다. 생성물(3) 6.3g(74%)이 담황색 고체 화합물의 형태로 수득된다: C_4OH₄₇N₃0₇Si(709.92) MS (ESI⁺) 710 (M+H⁺).

3-[3-(3급 부틸-디메틸-실라닐옥시)-3-페닐-프로필]-4-(3-메톡시-페닐)-1-(4-니트로-페닐)-아제티딘-2-온(4)

4

생성물(3) 6.1g(8.6mmol), 비스트리메틸실릴 아세트아미드 7.3㎖, 테트라부틸암모늄 플루오라이드 0.5g 및 3급 부틸메틸에테르 100㎖를 포함하는 혼합물을 아르곤 대기하에 실온에서 10시간 동안 교반한다. 반응을 완료한 후, 빙냉시켜 아세트산 5㎖를 서서히 첨가하고 증발시킨다. 잔류물을 실리카겔 상에서 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헵탄 =1/2)에 의해 분리한다. 생성물(4) 3.3g(70%)이 고체 형태의 담황색 화합물 형태로 수득된다: C₃₁H₃₈N₂0₅Si(546.74) MS (ESI⁺) 547.3 (M+H⁺).

1-(4-아미노-페닐)-3-[3-(3급 부틸-디메틸-실라닐옥시)-3-페닐-프로필]-4-(3-메톡시-페닐)-아제티딘-2-온(5)

5

오토클레이브를 사용하여 수소 대기 5bar에서 2시간 동안 에틸 아세테이트 50㎖ 중의 생성물(4) 3.0g(5.5mmol)과 팔라듐 목탄 10% 1.0g을 사용하여 반응을 수행한다. 반응 용액을 여과하고 증발시킨 다음 실리카겔 상에서 크로마토그래피(메틸렌 클로라이드/메탄올 = 10/1)에 의해 분리한다. 생성물(5) 2.4g(86%)이 고체 형태의 무색 화합물 형태로 수득된다: C₃₁H₄₀N₂0₃Si(516.76) MS (ESI⁺) 517.4 (M+H⁺).

1-(4-아미노-페닐)-3-(3-하이드록시-3-페닐-프로필)-4-(3-메톡시-페닐)-아제티딘-2-온(6)

6

2N 수성 염산 15㎖를 테트라하이드로푸란 20㎖ 중의 생성물(5) 2.3g에 첨가하여 2시간 동안 교반한다. 탄산수소나트륨의 수용액을 반응물에 첨가하고 에틸 아세테이트로 추출한다. 유기 상을 황산마그네슘으로 건조시키고 증발시킨 다음 실리카겔 상에서 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헵탄 = 1/1 내지 1/0)하여 정제한다. 생성물(6) 1.1g이 고체 형태의 무색 화합물 형태로 수득된다: C₂₅H₂₆N₂0₃(402.50) MS (ESI⁺) 403.2 (M+H⁺).

(4-{4-[3-(3-하이드록시-3-페닐-프로필)-2-(4-메톡시-페닐)-4-옥소-아제티딘-1-일]-페닐카바모일}-부틸)-카밤산-9H-플루오렌-9-일메틸 에스테르(8)

8

생성물(6) 0.8g(2.0mmol)과 5-(Fmoc-아미노)-발레리안산(7)(제조원; Fluka) 1.35g(4.0mmol)을 DMF(디메틸포름아미드) 15㎖에 용해시킨다. 다음의 물질을 단계적으로 가한다: TOTU(제조원; Fluka) 4.8g, 옥심(하이드록시이미노-시아노아세트산 에틸 에스테르; 제조원 Fluka) 1.6g 및 NEM(4-에틸-모르폴린) 5.5㎖. 실온에서 1시간 후, 반응물을 에틸 아세테이트 100㎖로 희석시키고 물로 3회 세척한다. 유기 상을 MgSO₄로 건조시키고 여과하여 증발시킨다. 잔류물을 섬광 크로마토그래피(에틸 아세테이트/n-헵탄 2:1)하여 정제한다. 생성물(8) 0.58g(41%)이 무정형 고체 화합물 형태로 수득된다: C₄₅H₄₅N₃0₆(723.8) MS (ESI⁺) 724.4 (M+H⁺).

5-아미노-펜탄산-{4-[3-(3-하이드록시-3-페닐-프로필)-2-(4-메톡시-페닐)-4-옥소-아제티딘-1-일]-페닐}-아미드(9)

9

생성물(8) 570mg(0.78mmol)과 디에틸아민 0.8㎖를 DMF(디메틸포름아미드) 5㎖에 용해시킨다. 실온에서 1시간 후 이를 증발시킨다. 잔류물을 섬광 크로마토그래피(메틸렌 클로라이드/메탄올/진한 암모니아 30:10:3)하여 정제한다. 생성물(9) 220mg(56%)이 무정형 고체 화합물 형태로 수득된다: C_3OH₃₅N₃0₄(501.63) MS (ESI⁺) 502.3 (M+H⁺).

[2-(4-아지도-페닐)-1-(4-{4-[3-(3-하이드록시-3-페닐-프로필)-2-(4-메톡시-페닐)-4-옥소-아제티딘-1-일]-페닐카바모일}-부틸카바모일)-에틸]-카밤산-9H-플루오렌-9-일메틸 에스테르(11)

11

생성물(9) 200mg(0.40mmol)과 Fmoc-p-아지도-Phe-OH(10)(제조원; Bachem) 340mg(0.79mmol)을 DMF(디메틸포름아미드) 4㎖에 용해시키고, 생성물(8)의 제조방법에 따라 반응시킨다. 생성물(11) 300mg(82%)이 무정형 고체 화합물 형태로 수득된다: C₅₄H₅₃N₇0₇(912.07) MS (ESI⁺) 912.5 (M+H ⁺).

5-[2-아미노-3-(4-아지도-페닐)-프로피오닐아미노]-펜탄산{4-[3-(3-하이드록시-3-페닐-프로필)-2-(4-메톡시-페닐)-4-옥소-아제티딘-1-일]-페닐}-아미드(12)

12

생성물(11) 300mg(0.33mmol)과 디에틸아민 0.8㎖를 DMF(디메틸포름아미드) 4㎖에 용해시키고, 화합물(9)의 제조방법에 따라 반응시킨다. 화합물(12) 42mg(19%)이 무정형 고체 화합물 형태로 수득된다: C₃₉H₄₃N₇0₅(689.82) MS (ESI⁺) 690.3 (M+H⁺).

5-(2-옥소-헥사하이드로-티에노[3,4-d]이미다졸-6-일)-펜탄산-[2-(4-아지도-페닐)-1-(4-{4-[3-(3-하이드록시-3-페닐-프로필)-2-(4-메톡시-페닐)-4-옥소-아제티딘-1-일]-페닐카바모일}-부틸카바모일)-에틸]-아미드(14)

14

화합물(12) 40mg(0.058mmol)과 D-비오티닐-N-하이드록시숙신이미드(13)(제조원; Bachem) 60mg을 DMF(디메틸포름아미드) 0.5㎖에 용해시킨다. 실온에서 1시간후, 이를 증발시킨다. 잔류물을 섬광 크로마토그래피(메틸렌 클로라이드/메탄올/진한 암모니아 30:5:1)로 정제한다. 화합물(14) 29mg(55%)이 무정형 고체 화합물 형태로 수득된다: C₄₉H₅₇N₉0₇S(912.12) MS (ESI⁺) 916.6 (M+H⁺).

광친화력 표지화 및 결합 연구 :

래빗 소장의 솔가장자리 조직으로부터의 소포를 숙련가들에게 공지되어 있는 방법[문헌 참조; Kramer et al. J. Biol. Chem. 268, 18035-18046 (1993)]으로 분리하였다. 본 발명의 방사 표지된 화학식 Ia, 화학식 Ib, 화학식 Ic, 화학식 Id 또는 화학식 Ie의 화합물을 사용한 광친화력 표지화를 Rayonet RPR-100 유형의 광화학 반응기(코네티컷주 햄던에 소재한 더 서든 울트라바이올렛 캄파니로부터 입수 가능함) 속에서 수행하였다. 이의 솔가장자리 막 소포를 암흑에서 20℃에서 5분 동안 10mM 트리스/헤페스 완충액(pH 7.4), 100mM NaCl, 100mM 만니톨 속에서 200㎕ 용량의 화합물 중의 하나와 함께 항온처리하였다. 솔가장자리 소포 대신에, 소기관, 특히 이의 막을 사용할 수도 있다. 하기의 설명도 이에 상응하게 적용된다. 암흑에서 항온처리한 다음 254nm의 UV광으로 20 내지 60초 동안 조사하였다. 이어서, 솔가장자리 소포를 상기한 완충액으로 2회 세척하였다. 단백질을, 예를 들면, 에탄올을 첨가하거나 염 또는 세정제를 첨가하거나 가열하거나 동결 및 건조를 반복하는 종래의 기법 또는 숙련가들에게 공지되어 있는 그외의 적합한 방법에 의해 침전시키고, SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분별하였다. 방사능 표지된 단백질을 LSC 또는 플루오로그래피로 검출하였다. 솔가장자리 조직으로부터의 표지된 단백질의 화합물에 대한 친화력 범위는 1 내지 100nM이다.

동물 및 막 준비 :

체중이 4 내지 5kg인 수컷 뉴질랜드 화이트 래빗(Harlem Winkelmann, Borchem, Germany)을 자유롭게 알트로닌(Altronin®) 표준 식이 C 2023(Altronin®, Lage, Germany)을 섭취하도록 유지시켰다. 위장, 십이지장, 공장, 회장, 맹장, 결장, 직장 및 신장으로부터의 솔가장자리 막 소포는 Mg²⁺-침전법으로 준비하였다. 랫트 간 마이크로솜 및 랫트 지방세포 막은 표준 기법에 따라 준비하였다.

콜레스테롤 흡수의 억제 :

질버스미트/휴거스법(Zilversmit/Hughes method)을 변형시켜 장내 콜레스테롤 흡수를 측정하였다. 표준 식이(Altronin®, Lage, Germany)에서 유지시키던 수컷 NMRI 마우스(구입처; Charles River Deutschland GmbH, Salzfeld, Germany)를 12시간 동안 공복시켰다. 각각의 콜레스테롤 흡수 억제제 3mg의 존재 또는 부재하에 비히클로서 0.5% 메틸 셀룰로즈/5% 솔루톨(Solutol)(제조원; BASF, Ludwigshafen, Germany)의 용액 0.5㎖를 각각의 동물에게 식사로 적용한 다음 0.24μCi [¹⁴C]콜레스테롤 및 0.25μCi [³H]시토스테롤을 함유하는 인트라리피드(Intralipid®)(제조원; Pharmacia & Upjohn, Erlangen, Germany) 0.25㎖를 적용하였다. 동물(그룹당 5마리 마우스)을 대사 케이지에 두고 대변을 수집하였다. 24시간 후, 동물을 치사시키고, 대변과 간 중의 방사능을 연소 분석에 의해 측정하였다.

콜레스테롤 흡수 억제제에 대한 145kDa 결합 단백질의 용해 :

래빗 소장 솔가장자리 막 소포를 광친화력 표지화시킨 후 10mM 트리스/헤페스 완충액(pH 7.4)/300mM 만니톨로 수회 세척하였다. 수득한 펠렛을 10mM 트리스/헤페스 완충액(pH 7.4)/75mM KCl/5mM MgCl₂/1mM EGTA/1mM DTT/1%(w/v) n-옥틸글리코사이드/1% 트리톤 X-100/1% (w/v)("가용화 완충액") 속에 4℃에서 60분 동안 1mg/㎖의 단백질 농도에서 용해시켰다. 또는, 막 단백질을 10mM 트리스/헤페스 완충액(pH 7.4) 중의 1% SDS와 함께 4℃에서 10분 동안 10mg/㎖의 단백질 농도에서 용해 시킨 다음 10mM 트리스/헤페스 완충액(pH 7.4)/1% n-옥틸글루코사이드로 1:10으로 희석시킬 수 있다. 원심분리한 후, 용해된 막 단백질을 함유하는 상청액을 혼합하고, 세정제로서 1% n-옥틸글루코사이드를 함유하는 적당한 크로마토그래피용 완충액으로 희석시켰다.

광반응성 2-아제티디논 C-1으로 광친화력 표지화시킨 후 콜레스테롤 흡수 억제제에 대한 방사능 표지된 145kDa 결합 단백질의 정제 :

광친화력 표지화

래빗 회장 솔가장자리 막 소포(단백질 250㎍) 8개 샘플을 암흑 속에 20℃에서 30분 동안 10mM 트리스/헤페스 완충액(pH 7.4)/100mM NaCl/100mM 만니톨 중의 66nM(0.3μCi)의 [³H]C-1과 함께 항온처리하였다. 코네티컷주 햄던에 소재한 더 서든 울트라바이올렛 캄파니에서 시판하는 4 RPR 2537 Å 램프가 장착된 Rayonet RPR 100 광화학 반응기 속에서 254nm에서 30초 동안 조사한 후, 샘플을 수거하고 원심분리한 후 막 소포를 10mM 트리스/헤페스 완충액(pH 7.4)/300mM 만니톨 2㎖에 재현탁시키고, 20℃에서 20분 후 원심분리시켰다. 이러한 과정을 3회 반복하였다. 수득된 펠렛을 "가용화 완충액" 2㎖를 사용하여 용해시켰다. 원심분리한 후, 40㎕ 분취량의 상청액을 덜어내어, SDS PAGE에 이은 겔의 슬라이싱으로 막 단백질로의 방사능의 삽입에 대해 분석하였다.

밀 배아 렉틴 친화력 크로마토그래피

용해된 막 단백질을 함유하는 상청액을 밀 배아 렉틴 아가로스 겔 0.5㎖에 첨가하였다. 20℃에서 30분 후, 비드를 원심분리하여 수거하고 10mM 트리스/헤페스 완충액(pH 7.4)/100mM NaCl/100mM 만니톨/1%(w/v) n-옥틸글루코사이드 2㎖로 3회 세척하였다. 흡착된 단백질을 10mM 트리스/헤페스 완충액(pH 7.4)/100mM NaCl/100mM 만니톨/300mM N-아세틸-D-글루코스아민 2㎖를 4회 분할하여 용출시켰다; 모든 용출물에서, 아미노펩티다아제 N 및 수크라제의 활성을 측정하고, 100㎕ 분취량의 각 분획 단백질을 침전시켜 SDS-PAGE로 분석하였다.

하이드록실아파타이트 크로마토그래피

밀 배아 렉틴 크로마토그래피의 N-아세틸글루코스아민 용출물을 10mM 인산나트륨 완충액(pH 7.4)/1%(w/v) n-옥틸글루코사이드로 10배 희석시키고, 10mM 인산나트륨 완충액(pH 7.4)/1%(w/v) n-옥틸글루코사이드로 평형화시킨 하이드록실아파타이트 컬럼(높이 10cm, 직경 1cm)에 0.25㎖/분의 일정한 속도에서 1㎖의 분획이 수집되도록 적용하였다. 이어서, 단백질을 10mM 인산나트륨 완충액(pH 7.4)/1%(w/v) n-옥틸글루코사이드 10㎖에 이어 인산염을 10 내지 250mM로 15㎖, 250 내지 700mM로 15㎖, 700 내지 1000mM로 10㎖의 농도 구배로 하여 용출시켰다. 각 분획에서, 아미노펩티다아제 N 및 수크라제의 활성 및 방사능을 측정하였다. 각 분획으로부터, 100㎕를 덜어내어, 단백질을 침전시킨 다음 SDS-PAGE에 의해 겔을 2mm 조각으로 슬라이싱하여 방사능 표지된 단백질의 분포를 측정하였다.

제조용 SDS 겔 전기영동

방사능 표지된 145kDa 단백질을 함유하는 분획을 수집하여 단백질을 클로로 포름/메탄올로 침전시켰다. SDS-샘플 완충액(62.5mM 트리스/HCl(pH 6.8)/ 2% SDS/5% 2-머캅토에탄올/10% 글리세롤/0.001% 브로모페놀 블루)에 용해시킨 후, 샘플을 원심분리하고, 투명한 상청액을 제조용 7.5% SDS 겔의 분리 겔(분리 겔의 직경 28mm, 길이 5cm)에 적용하였다. 500V(40mM, 6W)에서 전기영동을 수행하여, 용출물을 1.5㎖ 분획으로 분별하였다. 150㎕ 분취량의 각각의 분획을 SDS-PAGE로 단백질 조성을 분석하는 데 사용하였다.

스트렙트아비딘-비오틴 친화력 크로마토그래피에 의한 콜레스테롤 흡수 억제제에 대한 145kDa 결합 단백질의 정제:

래빗 회장 솔가장자리 막 소포(단백질 250㎍) 10개 샘플을 암흑 속에 20℃에서 30분 동안 10mM 트리스/헤페스 완충액(pH 7.4)/100mM NaCl/100mM 만니톨 중의 200μM 의 비오틴-표지된 콜레스테롤 억제제 C-4와 함께 항온처리한 다음 4 RPR 2537 Å-램프가 장착된 Rayonet RPR 100 광화학 반응기 속에서 254nm에서 30초 동안 조사하였다. 소포를 수집한 후, 이를 트리스/헤페스 완충액(pH 7.4)/300mM 만니톨 2㎖로 3회 세척하였다. 최종 펠렛을 4℃에서 1시간 동안 "가용화 완충액" 2㎖에 현탁시켰다. 원심분리한 후, 투명한 상청액을 스트렙트아비딘-아가로스 비드 0.5㎖와 혼합하여 4℃에서 2시간 동안 교반하에 유지시켰다. 원심분리한 후, 비드를 4℃에서 10분 동안 10mM 트리스/헤페스 완충액(pH 7.4)/300mM 만니톨/1% n-옥틸글루코사이드/4mM PMSF/4mM 요오드아세트아미드/4mM EDTA 2㎖와 함께 항온처리한 다음 원심분리시켰다. 이러한 과정을 2회 반복한 후, 5mM 비오틴을 함유하는 상기 완충액 2㎖를 3회로 나누어 스트렙트아비딘-아가로스 비드로부터 단백질을 용출시켰다. 모든 용출물로부터, 아미노펩티다아제 N 및 수크라제의 효소 활성을 측정하기 위해 그리고 SDS-PAGE로 분석하기 위해 분취량을 덜어내었다. 최종 정제를 위해, 콜레스테롤 흡수 억제제에 대한 공유적으로 개질된 145kDa 결합 단백질을 함유하는 비오틴 용출물을 상기한 바와 같은 제조용 SDS 겔 전기영동에 의해 성취하였다.

효소적 분해 :

두 가지 과정에 의해 분리한 145kDa 단백질을 클로로포름/메탄올로 침전시켜 트리스/HCl 완충액(pH 6.8)/6.2% SDS/0.5% 2-머캅토에탄올/0.0005% 브로모페놀 블루 3㎕에 재용해시켰다. 상기한 완충액 속에서 새로 제조한 키모트립신 용액(35ng/㎖) 5㎕를 첨가하여 30℃에서 1시간 동안 항온처리하여 효소적 분해를 수행하였다. 4mM EDTA/4mM PMSF/4mM 요오드아세트아미드를 함유하는 SDS 샘플 완충액을 첨가하여 반응을 중단시키고 95℃로 5분 동안 가열한 다음 트리스/트리신 겔에서 SDS-PAGE를 수행하였다.

SDS 겔 전기영동

SDS-PAGE는 아크릴아미드 97.2%와 N,N-메틸렌 비스아크릴아미드 2.8%의 비율에서 7 내지 10.5%의 겔 농도로 전기영동 시스템 LE 2/4(제조원; Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany)를 사용하여 수직 스텝 겔(vertical stab gel)(20 ×17 ×0.15cm)에서 수행하거나, 분석적 목적으로 전기영동 시스템 Xcell II(제조원; Novex)를 사용하여 예비-캐스팅된 NOVEX 겔(4 내지 12%, 12% 또는 15%, 제조원; Invitrogen, Groningen, The Netherlands)에서 수행하였다. 전기영동에 의한 펩타이드 단편의 분리는 쉐그레와 야고브(Schaggre & Jagow)에 따라 트리스/트리신 겔(16.5%)에서 수행하였다. 전기영동 후, 겔을 12.5% 트리클로로아세트산에 고정시킨 다음 Serva Blue R 250로 염색하였다. 방사능의 분포를 측정하기 위해, 각각의 겔 라인을 2mm 조각으로 절단하여, 단백질을 조직 가용화제 Biolute S 250㎕로 가수분해시키고, 신틸레이터 Quickszint 501 4㎖를 사용하여 액체 신틸레이션 계수를 수행하였다.

콜레스테롤 흡수 억제제에 대한 145kDa-결합 단백질의 용해:

콜레스테롤 흡수 억제제에 대한 145kDa-결합 단백질을 정제하기 위한 선결조건은 이러한 전체 막 단백질을 비-변성 상태로 만족스럽게 용해시키는 것이다. 각종 세정제를 사용한 용해 실험에서, 광표지된 단백질이 SDS의 경우에는 약 80 내지 90% 용해되고 쯔비터젠(Zwittergen) 9-13의 경우에는 약 60%가 용해될 수 있는 반면에 CHAPS, NP-40, 디지토닌(digitonin) 및 트리톤-X-114의 경우에는 상당한 용해가 달성되지 않는 것으로 밝혀졌다. 10mM 트리스/헤페스 완충액(pH 7.4)/300mM 만니톨 중의 트리톤-X-100, n-옥틸글루코사이드, 데실말토사이드, 도데실말토사이드 또는 콜레스테롤헤미숙시네이트/도데실말토사이드와 같은 비이온성 세정제의 1% 용액은 145kDa 단백질을 부분 용해시켜 이의 정제를 방해한다. 145kDa 단백질을 60 내지 80% 용해시켜 정제 과정을 가능케 하는 2개의 프로토콜이 최종적으로 밝혀졌다: a) 1% SDS로 용해시킨 다음 0.1% SDS/1% n-옥틸글루코사이드의 출발 농도로 되도록 1% n-옥틸글루코사이드로 희석시키는 방법, b) 10mM 트리스/헤페스 완충액(pH 7.4)/75mM KCl/5mM MgCl₂/1mM EGTA/1mM DTT/1% 트리톤 X-100/1% n-옥틸글루코사이드("가용화 완충액")로 용해시키는 방법. 용해 과정에 의해 크로마토그래피 과정으로 솔가장자리 막 단백질을 성공적으로 분별할 수 있었다.

비오틴-표지된 2-아제티디논 광친화력 프로브의 설계 :

콜레스테롤 흡수 억제제에 대한 표적 단백질의 1단계 정제를 위해, 본 발명자들은 스페이서를 통해 비오틴 함유 광불안정 그룹 N-(비오티닐)-4-아지도페닐 알라닌을 2-아제티디논 콜레스테롤 흡수 억제제의 N-페닐 또는 벤질아미노 환의 파라 위치에 커플링시켰다. 구조 활성 관계에서, 이러한 위치가 장내 콜레스테롤 흡수 억제에 대한 생체내 효능을 유지시키면서 상당한 화학적 개질을 가능케 하는 것으로 입증되었다. 비오틴-표지된 광친화력 표지 C-4를 NMRI-마우스에 적용시킨 후, 장내 콜레스테롤 흡수는 용량-의존적으로 억제되었는데, 이는 단백질(들) 동정을 위한 선결요건인 비오틴-표지된 광불안정 콜레스테롤 흡수 억제제의 생물학적 효능이 이러한 프로브에 의한 장내 콜레스테롤 흡수에 관여함을 나타낸다. 래빗 소장 BBMV를 농도를 증가시킨 비오틴-표지된 콜레스테롤 억제제 C-4의 존재하에서 아지도벤조일 유도체[³H]C-1로 광친화력 표지화시키면 145kDa 단백질의 표지화 정도가 농도 의존적으로 감소하는데, 이는 소장 장세포의 솔가장자리 막에서의 C-4와 콜레 스테롤 흡수 억제제에 대한 145kDa 결합 단백질과의 특이적인 상호작용을 나타낸다.

트리튬-표지된 2-아제티디논 콜레스테롤 흡수 억제제 C-1으로 광표지된 145kDa 결합 단백질의 정제 :

광표지된 145kDa 결합 단백질은 수크라제/이소말타제 복합체 또는 아미노펩티다아제 N과 같은 솔가장자리 막의 매우 풍부한 막 단백질이 SDS-겔 상에서 이동하는 분자량 범위에 국재화되기 때문에 따라서 서열 측정을 위해 이러한 단백질들로부터 완전히 분리해내는 것이 필수적이다. 생화학적 조사 결과, 145kDa 단백질은 N-글리카나제로 탈글리코실화시킬 경우 분자량이 145kDa에서 110kDa으로 이동하는 글리코실화된 융합 막 단백질인 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명자들은 친화력 크로마토그래피를 위한 추정 리간드로서 각종 렉틴을 조사하였다. 밀 배아 렉틴 아가로스의 경우, 광표지된 145kDa 단백질의 완전 지연이 성취되지만 수크라제 및 아미노펩티다아제 N의 효소 활성의 70 내지 80%가 용리되었다. N-아세틸글루코스아민의 경우, 방사능 표지된 145kDa 단백질 전량이 아미노펩티다아제 N 및 수크라제 활성의 30 내지 50%와 함께 용출될 수 있었다. 전체적으로, 콜레스테롤 흡수 억제제에 대한 145kDa 결합 단백질의 4 내지 5배 농축(enrichment)이 성취되었다. 추가의 정제를 위해, 다수의 상이한 과정으로 평가하였다. 모노 Q 또는 모노 S 컬럼에서의 이온 교환 크로마노그래피에 의해 수크라제/이소말타아제로부터 완전 분리되었고 아미노펩티다아제 N으로부터 부분 분리되었으며, 반면에 금속-킬레이트화-친화력-크로마토그래피에서는 뚜렷한 분리가 성취되지 않았다. 하이드록실아파타이트 크로마토그래피에서는, 145kDa 단백질의 강한 농축 및 수크라제와 아미노펩티다아제 N으로부터의 분리가 성취되었다. 최적화된 포스페이트 농도 구배 프로파일에 의해 다른 막 단백질로부터 145kDa 단백질이 거의 완전하게 분리되었다; 145kDa 단백질은 높은 포스페이트 농도에서 용출되었고 수크라제 또는 아미노펩티다아제 N의 상당한 효소 활성을 나타내지 않았다. 최종 정제는 하이드록실아파타이트 크로마노그래피로부터의 용출물의 제조용 SDS-PAGE에 의해 성취되었다. 순수한 145kDa 단백질의 추정량은 하이드록실아파타이트 컬럼에 적용된 물질의 1 내지 3%인데, 이는 농축 인자가 솔가자자리 막에 대해서는 150 내지 500배이고 장세포 총 단백질에 대해서는 2500 내지 10000배가 성취되었음을 나타낸다.

비오틴-표지된 광불안정 콜레스테롤 흡수 억제제로 광친화력 표지화시킨 후 스트렙트아비딘-비오틴 친화력 크로마토그래피에 의한 콜레스테롤 흡수 억제제에 대한 145kDa 결합 단백질의 정제 :

래빗 소장 BBMV를 C-4 200μM과 함께 항온처리하고, 254nm에서 자외선 조사하여 가교결합시켰다. 용해시킨 후, 공유결합에 의해 개질된, 비오틴-표지된 2-아제티디논 콜레스테롤 흡수 억제제를 함유하는 단백질을 스트렙트아비딘-비드로 추출하였다. 강력하게 세척한 후, 결합된 단백질을 비오틴 10mM 용액으로 용출시켜 SDS-PAGE로 분석하였다. 스트렙트아비딘-비드에 의해서는 주로 1개의 Mr-145kDa의 단백질이 유지되는데 반해, 자외선 조사를 생략하면 어떠한 단백질도 검출되지 않았는데, 이는 145kDa 단백질이 비오틴-표지된 광불안정 콜레스테롤 흡수 억제제 C-4에 대한 주요 결합 단백질임을 나타낸다. 스트렙트아비딘-비드로부터의 비오틴 추출물은 검출 가능한 효소 활성의 수크라제/이소말타아제 또는 아미노펩티다아제 N을 함유하지 않았는데, 이는 용출된 145kDa 단백질이 아마도 비오틴-표지된 콜레스테롤 흡수 억제제의 공유결합에 의해 개질된 1개의 단일 단백질 잔기임을 나타낸다. C-4로 광표지화시키는 동안 이제티미브와 같은 기타의 콜레스테롤 흡수 억제제 200μM이 존재하면 스트렙트아비딘 비드로 추출 가능한 145kDa 단백질의 양이 감소되는데, 이는 동일한 결합 부위에서 콜레스테롤 흡수 억제제와 C-4가 직접 경쟁함을 나타낸다; 반대로, 담즙산, 지방산, 글루코즈, 올리고펩타이드 또는 아미노산에 대한 기타의 장내 영양소 운반체에 대한 기질은 추출 가능한 145kDa 단백질의 양에 영향을 미치지 않았다. 이러한 표지화 실험을 기타의 기관으로부터의 세포 막을 사용하여 수행한 결과, 래빗 소장-십이지장, 공장 및 회장-으로부터 BBMV를 표지화함으로써만 145kDa 단백질이 추출될 수 있으며, 반면에 위, 맹장, 결장, 직장, 신장, 간 또는 지방세포로부터 BBMV를 표지화한 후에는 스트렙트아비딘 비드에 의해 어떠한 145kDa 단백질도 지연되지 않은 것으로 밝혀졌다. 따라서, 145kDa 결합 단백질은 단지 장내 콜레스테롤 흡수가 일어나는 해부학적 부위인 십이지장, 공장 및 회장로부터 정제될 수 있다. 밀 배아 렉틴- 및 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 및 스트렙트아비딘-비오틴-친화력 크로마토그래피에 의해 정제된 145kDa 단백질은 SDS-겔에서 구별될 수 없다. 키모트립신으로 효소 분해시킨 후, 다수의 펩타이드가 4 내지 35kDa의 분자량 범위에 있는 거의 동일한 펩타이드 패턴이 수득되었는데, 이는 두 방법으로 정제한 145kDa 단백질이 동일하며, 전적으로는 아니나 주로 하나의 단백질 잔기만을 함유함을 나타낸다.

Claims

장 조직 또는 세포를 제공하는 단계(a),

단계(a)로부터의 장 조직 또는 세포를, 방사능 표지되어 있고 145kDa 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 광반응성 2-아제티디논 화합물과 함께 항온처리하는 단계(b),

장 조직 또는 세포를 용해시키고 세포 파편을 제거하는 단계(c),

밀 배아 렉틴 아가로스를 포함하는 장치에 상청액을 첨가하는 단계(d),

단계(d)로부터의 밀 배아 렉틴 아가로스의 용출액을 하이드록실아파타이트 컬럼에 적용하는 단계(e),

단계(e)로부터의 방사능 표지된 분획을 제조용 SDS-PAGE에 로딩하는 단계(f) 및

방사능 표지된 분획을 수거하는 단계(g)

를 포함하고, 여기서 상기 광반응성 2-아제티디논 화합물이 화학식 I의 화합물인, 145kDa 단백질의 분리방법.

화학식 I

위의 화학식 I에서,

R은

이다.
제1항에 있어서, 장 조직 또는 세포가 사람, 랫트, 마우스 또는 래빗의 장 세포 배양액 또는 회장 솔가장자리 세포로부터의 장 조직 또는 세포인 방법.
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장 조직 또는 세포를 제공하는 단계(a),

단계(a)로부터의 장 조직 또는 세포를, 비오틴-표지되어 있는 콜레스테롤 흡수의 광반응성 억제제와 함께 항온처리하는 단계(b),

단계(b)로부터의 장 조직 또는 세포를 용해시키고 세포 파편을 제거하는 단계(c),

상청액을 스트렙트아비딘-아가로스에 첨가하는 단계(d),

용출액을 SDS-PAGE에 첨가하는 단계(e) 및

크기가 140 내지 150kDa인 단백질을 절제 및 용출시키는 단계(f)

를 포함하고, 여기서 상기 비오틴-표지되어 있는 콜레스테롤 흡수의 광반응성 억제제가 화학식 14의 화합물인, 145kDa 단백질의 분리방법.

화학식 14
제4항에 있어서, 장 조직 또는 세포가 사람, 랫트, 마우스 또는 래빗의 장 세포 배양액 또는 회장 솔가장자리 세포로부터 유래된 것인 방법.
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