JP4575772B2 - 腸のコレステロール結合タンパク質の単離方法 - Google Patents
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Description
って必須である胆汁酸を製造するのを助ける。最後になったが特に重要なことに、コレステロールは、細胞膜および細胞構造の主成分であり、体組織の基礎的要素の一種である。コレステロールなしでは、哺乳動物の生命は存続しない。
a] 生物材料を用意し、
b] a]の生物材料を、放射標識された、前記タンパク質に特異的に結合することができる光反応性2−アゼチジノン化合物と共にインキュベートし、
c] 該生物材料を可溶化し、細胞破片を除去し、
d] 上清を、小麦胚芽レクチンアガロースを保持するデバイス上に加え、
e] d]の小麦胚芽レクチンアガロースからの溶離液を、ヒドロキシルアパタイトカラムに施し、これをリン酸緩衝液勾配によって溶離させて、
f] e]の放射標識画分を、分取SDS−PAGE上にロードし、
g] 該放射標識画分を回収し、また可能ならば沈殿させる。
装置を用いることができる。UV光による照射後の細胞の破壊は、慣用の方法を用いて行われる。この例としては、凍結および融解の繰返し、細胞の超音波処理、フレンチプレスの使用または界面活性剤および酵素の添加が挙げられる。細胞溶解物のタンパク質の分画は、例えば硫酸アンモニウムによる沈殿により、分画遠心法またはクロマトグラフィー技術の適用により行うことができる。この目的に適当なクロマトグラフィー技術としては、例えば、1次元もしくは2次元の変性もしくは未変性のポリアクリルアミドゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーがある。これらの技術は、熟練した技術者にはよく知られており、例えば「Current Protocols in Protein Science」; John E. Caligan; Ben M. Dunn; Hidde L. Ploegh; David W. Speicher; Paul T. Wingfield; Wiley and Sons; ISBNO-471-11184-8に詳細に取り扱われている。
a] 生物材料を用意し、
b] a]の生物材料を、放射標識されているかまたはビオチン標識されているコレステロール再摂取の光反応性阻害剤と共にインキュベートし、
c] b]の生物材料を可溶化し、細胞破片を除去し、
d] 上清を、クロマトグラフィー処理に付すか、またはストレプトアビジン−アガロース上に加え、
e] 溶離液をSDS−PAGE上に加え、
f] 140〜150kDaの大きさの範囲に泳動したタンパク質を切り出し、溶離させ、また可能ならばリフォールドさせる。
a] 本発明のタンパク質を含む生物材料を用意し、
b] 化合物を用意し、
c] 該生物材料と該化合物を接触させて、
d] c]の生物材料により摂取されるコレステロール量を測定し、
e] d]の結果を、a]の生物材料と同じ種類および/または組織特異性を有するがb]の化合物と接触させていない生物材料からコレステロール摂取を測定した対照実験の結果と比較し、
f] e]の結果において、b]の化合物と接触させた細胞のコレステロール摂取の減少が測定される場合、これは、コレステロール再摂取を阻害する化合物を示している。
好ましくは100〜5000Daである。この化合物は、化合物を含むコレステロール類似物、タンパク質、ペプチド、または脂肪酸であってよい。
イソプロパノール160mL中のアニスアルデヒド50g(370mmol)に、パラ−ニトロアニリン51g(370mmol)を加えた。80℃で2時間後に、生成物が沈殿した。反応混合物を室温に冷却し、ろ過した。残留物をイソプロパノールで洗浄した。乾燥後に、黄色結晶形態の生成物2、62.9gを得た(収率66%):C14H13N2O3 (257.27)。
7 (Fluka)、1.35g(4.0mmol)を、DMF(ジメチルホルムアミド)1
5mLに溶解した。以下のもの:TOTU (Fluka)4.8g、オキシム(ヒドロキシイミノ−cyanouceti acid−エチルエステル; Fluka)1.6g、およびNEM(4−エチル−モルホリン)5.5mLを段階的に加えた。室温で1時間後、反応液を酢酸エチル100mLで希釈し、水で3回洗浄した。有機相をMgSO4で乾燥し、濾過し、濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー(酢酸エチル/n−ヘプタン2:1)で精製した。生成物8、0.58g(41%)を、非晶質固体形態で得た:C45H45N3O6(723. 8) MS(ESI+) 724.4 (M + H+)。
ンタン酸−[2−(4−アジド−フェニル)−1−(4−{4−[3−(3−ヒドロキシ−3−フェニル−プロピル)−2−(4−メトキシ−フェニル)4−オキソ−アゼチジン−1−イル]−フェニルカルバモイル}−ブチルカルバモイル)−エチル]−アミド(14)
ウサギの小腸の刷子縁組織からの小胞を、当業者に既知の方法により単離した(Kramerら、J. Biol. Chem. 268, 18035-18046 (1993))。本発明の式Ia)、またはIb)、またはIc)、またはId)、またはIe)の放射標識化合物を用いて、Rayonet RPR-100型(The Southern Ultraviolet Company, Hamden, Conn.から入手可能)の光化学反応装置中で、光親和性標識を行った。その刷子縁膜小胞(タンパク質100〜200μg)を、10mMTris/Hepes緩衝液(pH7.4)、100mMNaCl、100mMマンニトール中の該化合物の1種(体積200μL)と共に、暗所で、20℃で5分間インキュベートした。刷子縁小胞の代わりに、細胞小器官、特にその膜を使用することもできる。以下の記述は、これらに同様に適用される。暗所でのインキュベーションの後に、20秒間または60秒間254nmのUV光で照射した。次いで、刷子縁小胞を、上述の緩衝液で2回洗浄した。従来の技術、例えばエタノールの添加、塩もしくは界面活性剤の添加、加熱、凍結および融解の繰り返し、または当業者に既知の他の適当な方法により、タンパク質を沈殿させて、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分画した。放射標識されたタンパク質は、LSCまたはフルオログラフィによって検出可能であった。刷子縁組織の標識されたタンパク質の、化合物に対する親和性は、1〜100nMの範囲であった。
体重4〜5kgのオスニュージーランド白ウサギ(Harlem Winkelmann, Borchem,ドイツ)を、Altronine(R)標準食餌C 2023 (Altronin(R), Lage,ドイツ)で、自由な状態で飼育した。胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、大腸、直腸および腎臓の刷子縁膜小胞を、M
g2+沈降方法により調製した。ラット肝ミクロソームおよびラット脂肪細胞膜を、標準技術により調製した。
腸のコレステロール吸収を、Zilversmit/Hughes方法の改良法により測定した。標準食餌(Altronin(R), Lage,ドイツ)で飼育したオスNMRIマウス(Charles River Deutschland GmbH, Salzfeld,ドイツ)を、12時間食餌を与えず飢餓状態にした。ビヒクルとして0.5%メチルセルロース/5%Solutol(BASF, Ludwigshafen,ドイツ)の溶液0.5mLを、各コレステロール吸収阻害剤3mgと共に、またはこれを含まずに、各動物に強制栄養によって与え、続けて0.24μCi[14C]コレステロールおよび0.25μCi[3H]シトステロールを含むIntralipid(R)溶液0.25mL(Pharmacia & Upjohn, Erlangen,ドイツ)を与えた。動物(各群につき5匹のマウス)を代謝ケージで飼育し、糞を回収した。24時間後に、動物を殺して糞および肝臓中の放射活性を燃焼分析により測定した。
ウサギ小腸の刷子縁膜小胞を光親和性標識後、10mM Tris/Hepes緩衝液(pH7.4)/300mMマンニトールで数回洗浄した。得られたペレットを、10mM Tris/Hepes緩衝液(pH7.4)/75mM KCl/5mM MgCl2/1mM EGTA/1mM DTT/1% (w/v) n−オクチルグルコシド/1% Triton X-100/1% (w/v)(「可溶化緩衝液」)中で、4℃で60分間可溶化して、タンパク質濃度1mg/mLとした。別法として、膜タンパク質は、10mM Tris/Hepes緩衝液(pH7.4)中の1% SDSを用いて、4℃で10分間可溶化して、タンパク質濃度10mg/mLとして、続けて10mM Tris/Hepes緩衝液(pH7.4)/1% n−オクチルグルコシドで1:10希釈してもよい。遠心分離後に、可溶化された膜タンパク質を含む上清を、界面活性剤として1%n−オクチルグルコシドを含む適当なクロマトグラフィー用緩衝液と混合し、希釈した。
ウサギ回腸刷子縁膜小胞(タンパク質250μg)の8個の試料を、10mM Tris/Hepes緩衝液(pH7.4)/100mM NaCl/100mMマンニトール中の66nM(0.3μCi) [3H]C−1で、20℃で30分間、暗所でインキュベートした。4 RPR 2537Åランプを備えたRayonet RPR 100光化学反応装置(The Southern Ultraviolet Company, Hamden, コネチカット州,米国)中で、254nmで30秒間放射した後に、試料を回収し、遠心分離後に、膜小胞を10mM Tris/Hepes緩衝液(pH7.4)/300mMマンニトール、2mL中に再懸濁し、20℃で20分後、遠心分離した。この手順を3回繰返した。得られたペレットを「可溶化緩衝液」2mLで可溶化した。遠心分離後、上清のアリコート40μLを取り、SDS−PAGEを行い、ゲルを薄切りにして膜タンパク質中への放射活性の取り込みについて分析した。
可溶化された膜タンパク質を含む上清を、小麦胚芽レクチンアガロースゲル0.5mLに添加した。20℃で30分後、遠心分離によりビーズを回収し、10mM Tris/Hepes緩衝液(pH7.4)/100mM NaCl/100mMマンニトール/1% (w/v) n−オクチルグルコシド、2mLで3回洗浄した。摂取したタンパク質を、10mM Tris/Hepes緩衝液(pH7.4)/100mM NaCl/100mMマンニトール/300mM N−アセチル−D−グルコサミン、2mL、4部で溶離させて;全溶離液において、アミノペプチダーゼNおよびスクラーゼの活性を測定し、各画分のアリコート100μLからタンパク質を沈殿させて、SDS−PAGEにより分析した。
小麦胚芽レクチンクロマトグラフィーのN−アセチルグルコサミン溶離液を、10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)/1%(w/v)n−オクチルグルコシドで10倍希釈し、10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)/1%(w/v)n−オクチルグルコシドで平衡化したヒドロキシルアパタイトカラム(高さ10cm、直径1cm)に付して、一定速度0.25mL/分で、1mL画分を回収した。続けてタンパク質を、次のようにして溶離させた:10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)/1%(w/v)n−オクチルグルコシド、10mL、続けて、ホスフェート勾配:ホスフェート10〜250mMで15mL、250〜700mMで15mL、そして700〜1000mMで10mL。各画分において、アミノペプチダーゼNおよびスクラーゼの活性および放射活性を測定した。各画分100μLを取り出し、タンパク質を沈殿させ、続けてSDS−PAGEを行い、ゲルを2mm片に薄切りにして、放射活性標識されたタンパク質の分布を決定した。
放射活性標識された145kDaタンパク質を含む画分を回収し、タンパク質をクロロホルム/メタノールで沈殿させた。試料を、SDS−試料緩衝液(62.5mM Tris/HCl(pH6.8)2%SDS/5%2−メルカプトエタノール/10%グリセロール/0.001%ブロモフェノールブルー)中に溶解した後に遠心分離し、透明な上清を分取7.5%SDSゲル(直径28mm;分離ゲル長:5cm)の分離ゲルに付した。500V(40mM、6W)で電気泳動を行い、溶離液を1.5mL画分に分けた。各画分のアリコート150μLを、SDS−PAGEによるタンパク質組成の分析に用いた。
ウサギ回腸刷子縁膜小胞(タンパク質200μg)の10個の試料を、10mM Tris/Hepes緩衝液(pH7.4)/100mM NaCl/100mMマンニトール中で、200μMビオチン標識コレステロール阻害剤C−4と共に、暗所で30分間、20℃でインキュベートし、次いで4 RPR 2537Åランプを備えたRayonet RPR-100光化学反応装置中で、254nmで30秒間放射した。小胞を回収後、Tris/Hepes緩衝液(pH7.4)/300mMマンニトール、2mLで3回洗浄した。最終的に得られたペレットを「可溶化緩衝液」2mL中に4℃で1時間懸濁した。遠心分離後、透明な上清を、ストレプトアビジン−アガロースビーズ0.5mLと混合し、4℃で2時間撹拌を続けた。遠心分離後、ビーズを、10mM Tris/Hepes緩衝液(pH7.4)/300mMマンニトール/1%n−オクチルグルコシド/4mM PMSF/4mMヨードアセタミド/4mM EDTA、2mLと共に4℃で10分間インキュベートし、続けて遠心分離した。この手順を2回繰り返した後、タンパク質が、ストレプトアビジン−アガロースビーズから、5mMビオチンを含む上記の緩衝液2mL、3部中に溶離した。アミノペプチダーゼNおよびスクラーゼの酵素活性を測定するために、およびSDS−PAGEにより分析するために、全溶離液からアリコートを取り出した。最終精製のために、コレステロール吸収阻害剤に共有結合する、修飾型145kDa結合タンパク質を含むビオチン溶離液を、上述の分取SDSゲル電気泳動によって得た。
両方の手順により単離した145kDaタンパク質を、クロロホルム/メタノールで沈殿させて、Tris/HCl緩衝液(pH6.8)/6.2% SDS/0.5% 2−メル
カプトエタノール/0.0005%ブロモフェノールブルー、3μL中に再溶解した。上記の緩衝液中に新しく調製したキモトリプシン溶液(35ng/mL)5μLを加え、30℃で1時間インキュベートして、酵素断片化を行った。4mM EDTA/4mM PMSF/4mMヨードアセタミドを含むSDS試料緩衝液を加え、95℃で5分間加熱することにより反応を停止し、続けてTris/トリシンゲル上のSDS−PAGEを行った。
電気泳動システムLE2/4(Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg,ドイツ)を使用して垂直スタッブゲル(20×17×0.15cm)中で、ゲル濃度7〜10.5%、アクリルアミド97.2%およびN,N−メチレンビスアクリルアミド2.8%の比で、または、分析のために、電気泳動システムXcell II (Novex社製)を使用してプレキャストNOVEXゲル(4〜12%、12%または15%、Invitrogen (Groningen, The Netherlands))中で、SDS−PAGEを行った。ペプチド断片の電気泳動による分離を、Schaeggre & Jagowに従い、Tris/トリシン ゲル(16.5%)中で行った。電気泳動後、ゲルを12.5%トリクロロ酢酸中で固定し、続けてServa Blue R 250で染色した。放射活性の分布を測定するために、ゲルレーンをそれぞれ2mm片に切り、組織可溶化剤Biolute S 250μLでタンパク質を加水分解し、シンチレーターQuickszint 501、4mLを用いて液体シンチレーションを計数した。
コレステロール吸収阻害剤に結合する145kDa結合タンパク質の精製の必須条件は、この内在性膜タンパク質が非変性状態で十分に可溶化することである。種々の界面活性剤による可溶化実験から、CHAPS、NP-40、ジギトニンおよびTriton-X-114では有意な可溶化が達成されないのに対して、SDSを用いると光標識タンパク質の約80〜90%が、およびZwittergent9〜13を用いると約60%が可溶化され得ることが明らかになった。10mM Tris/Hepes緩衝液(pH7.4)/300mMマンニトール中の、Triton-X-100、n−オクチルグルコシド、デシルマルトシド、ドデシルマルトシドまたはコレステロールへミスクシネート/ドデシルマルトシドのような非イオン性界面活性剤の1%溶液は、145kDaタンパク質を部分的に可溶化するのみであり、従ってこれの精製を阻害した。最終的に、145kDaタンパク質の60〜80%を可溶化して、これによって精製手順を可能にする、2種のプロトコルを見出した、即ち:a)1%SDSで可溶化し、続けて1%n−オクチルグルコシドで希釈して、出発濃度0.1%SDS/1%n−オクチルグルコシドとする;b)10mM Tris/Hepes緩衝液(pH7.4)/75mM KCl/5mM MgCl2/1mM EGTA/1mM DTT/1% Triton X-100/1%n−オクチルグルコシド(「可溶化緩衝液」)で可溶化する。可溶化手順は、クロマトグラフィー手順による刷子縁膜タンパク質の良好な分画を可能した。
コレステロール吸収阻害剤の標的タンパク質のワンステップ精製のために、本発明者らは、ビオチン含有光分解性基であるN−(ビオチニル)−4−アジドフェニルアラニンを、スペーサーを介して、2−アゼチジノンコレステロール吸収阻害剤のN−フェニルまたはベンジルアミノ環のパラ位に結合させた。構造活性相関により、腸のコレステロール吸収の阻害についての生体内効力を維持する重要な化学修飾が、この位置で可能であることが示された。ビオチン標識光親和性ラベルC−4をNMRI−マウスに適用後、腸のコレステロール吸収は容量依存性で阻害され、ビオチン標識光分解性コレステロール吸収阻害剤の生物学的有効性を示し、タンパク質を同定するための前提条件は、このプローブにより腸のコレステロール吸収に関連づけられた。ビオチン標識コレステロール阻害剤C−4の増加濃度の存在下で、ウサギ小腸BBMVをアジドベンゾイル誘導性[3H]C−1で光親和性標識することによって、145kDaタンパク質の標識の程度が濃度依存性で減少し、これは、小腸細胞の刷子縁膜における、コレステロール吸収阻害剤に結合する145kDa結合タンパク質とのC−4の特異的相互作用を示唆する。
光標識した145kDa結合タンパク質は、SDSゲル上でスクラーゼ/イソマルターゼ複合体またはアミノペプチダーゼNのような刷子縁膜の非常に多量の膜タンパク質が移動する分子量範囲に局在化し、従って、配列決定のためには、これらのタンパク質から完全に分離することが不可欠である。生化学研究を行い、この145kDaタンパク質は、N−グリカナーゼによる脱グリコシル化に際して分子量が145kDaから110kDaに移動したことから、グリコシル化された内在性膜タンパク質であると同定された。従って本発明者らは、アフィニティークロマトグラフィーのための推定のリガンドとして種々のレクチンを調べた。小麦胚芽レクチンアガロースにより、スクラーゼおよびアミノペプチダーゼN活性の70〜80%が溶離したのに対して、光標識145kDaタンパク質は完全にその溶離が遅滞(retardation)された。N−アセチルグルコサミンにより、放射標識145kDaタンパク質の全量を、30〜50%のアミノペプチダーゼNおよびスクラーゼ活性と共に溶離することができた。全体として、コレステロール吸収阻害剤に結合する145kDa結合タンパク質を4〜5倍濃縮することができた。更に精製するために、多数の異なる手法を評価した。MonoQまたはMonoSカラム上でイオン交換クロマトグラフィーを行うことによって、スクラーゼ/イソマルターゼから完全に分離されたが、アミノペプチダーゼNからは部分的にしか分離されなかった。一方、金属−キレート−アフィニティークロマトグラフィーでは、はっきりとした分離は得られなかった。ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーでは、145kDaタンパク質が大幅に濃縮され、スクラーゼおよびアミノペプチダーゼNから分離することができた。至適化されたホスフェート勾配プロフィールにより、145kDaタンパク質を他の膜タンパク質からほぼ完全に分離することができた;145kDaタンパク質は、高濃度のホスフェートで溶離し、スクラーゼまたはアミノペプチダーゼNの有意な酵素活性は見られなかった。ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーからの溶離液を、分取SDS−PAGEに付して、最終精製を行った。純粋な145kDaタンパク質の推定量は、ヒドロキシルアパタイトカラムに付された材料の1〜3%であり、濃縮係数は、刷子縁膜について、150倍<濃縮係数<500倍であり、腸細胞総タンパク質について、2500〜10000倍であった。
ウサギ小腸BBWVを、200μMのC−4と共にインキュベートし、254nmで紫外線照射して架橋した。可溶化後、ビオチン標識2−アゼチジノンコレステロール吸収阻害剤を含む共有結合修飾したタンパク質を、ストレプトアビジン−ビーズで抽出した。十分に洗浄した後、結合したタンパク質を10mMビオチン溶液で溶離させて、SDS−PAGEで分析した。ストレプトアビジン−ビーズによって、主にMw145kDaの1種のタンパク質が保持されており、一方、紫外線照射を行わないと、タンパク質は全く検出されなかった。これは、145kDaタンパク質が、ビオチン標識された光分解性コレステロール吸収阻害剤C−4に結合する1次結合タンパク質であることを示している。ストレプトアビジン−ビーズからのビオチン抽出物は、スクラーゼ/イソマルターゼまたはアミノペプチダーゼNの検出可能な酵素活性を有さず、これは、溶離した145kDaタンパク質が、おそらくは、ビオチン標識コレステロール吸収阻害剤の共有結合によって修飾された、単一のタンパク質部分であることを示している。C−4による光標識の際に、エゼチミブのような他のコレステロール吸収阻害剤が200μM存在することによって、ストレプトアビジンビーズで抽出可能な145kDaタンパク質の量は減少する。これは、同一の結合部位についての、C−4とのコレステロール吸収阻害剤の直接的競合を示して
いる;対照的に、胆汁酸、脂肪酸、グルコース、オリゴペプチドまたはアミノ酸のための他の腸の栄養輸送体の基質は、抽出可能な145kDaタンパク質の量に影響しなかった。種々の器官からの細胞膜を用いたこれらの標識実験を行うことにより、ウサギの胃、盲腸、大腸、直腸、腎臓、肝臓または脂肪細胞からのBBMVの標識後には、ストレプトアビジン−ビーズで遅滞される145kDaタンパク質は抽出されなかったのに対して、小腸(十二指腸、空腸および回腸)からのBBMVの標識によってのみ、145kDaタンパク質が抽出されることが明らかになった。従って、145kDa結合タンパク質は、腸コレステロール吸収が起こる解剖学的部位、即ち十二指腸、空腸および回腸から精製できるのみであった。小麦胚芽レクチンクロマトグラフィーおよびヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーによって、およびストレプトアビジン−ビオチン−アフィニティークロマトグラフィーによって精製した145kDaタンパク質は、SDSゲル上では区別できない。キモトリプシンによる酵素断片化の後に、4〜35kDaの分子量範囲の多数のペプチドとほぼ一致したペプチドパターンが得られ、これは両方法によって精製された145kDaタンパク質が同一のものであり、排他的にではないにしても、大部分は、ただ1種のタンパク質部分のみを含んでいることを示している。
Claims (4)
- a] ヒト、ラット、マウスまたはウサギの、腸細胞培養または回腸刷子縁細胞由来の腸組織または腸細胞である生物材料を用意し、
b] a]の生物材料を、放射標識された、タンパク質に特異的に結合することができる光反応性2−アゼチジノン化合物と共にインキュベートし、
c] SDSおよびn−オクチルグルコシドを含むまたはトリトンX−100およびn−オクチルグルコシドを含む可溶化緩衝液を用いて該生物材料を可溶化し、細胞破片を除去し、
d] 上清を、小麦胚芽レクチンアガロースを保持するデバイス上に加え、
e] d]の小麦胚芽レクチンアガロースからの溶離液を、ヒドロキシルアパタイトカラムに施し、
f] e]の放射標識画分を、分取SDS−PAGE上にロードし、
g] 該放射標識画分を回収し、また可能ならば沈殿させる、
ことからなる、145kDaの大きさを有するタンパク質の単離方法であり、
ここで、光反応性2−アゼチジノン化合物が、次の式Iの構造:
式中、Rは次の基a)およびb):
- a] ヒト、ラット、マウスまたはウサギの、腸細胞培養または回腸刷子縁細胞由来の腸組織または腸細胞である生物材料を用意し、
b] a]の生物材料を、放射標識されているかまたはビオチン標識されているコレステロール取込の光反応性阻害剤と共にインキュベートし、
c] SDSおよびn−オクチルグルコシドを含むまたはトリトンX−100およびn−オクチルグルコシドを含む可溶化緩衝液を用いてb]の生物材料を可溶化し、細胞破片を除去し、
d] 上清を、クロマトグラフィー処理に付すか、またはストレプトアビジン−アガロース上に加え、
e] 溶離液をSDS−PAGE中に加え、
f] 140〜150kDaの大きさの範囲に泳動したタンパク質を切り出し、溶離させ、また可能ならばリフォールドさせる、
ことからなる、145kDaの大きさを有するタンパク質の単離方法であり、
ここで、ビオチン標識されているコレステロール取込の光反応性阻害剤が、次の構造:
そして、ここで、d]のクロマトグラフィー処理が、
I] 上清を、小麦胚芽レクチンアガロースを保持するデバイス上に加え、
II] I]からの小麦胚芽レクチンアガロースの溶離液を、ヒドロキシルアパタイトカラムに施す、
単離方法。
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