MXPA06008124A - Npc1l1 (npc3) y metodos para identificar ligandos del mismo. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona polipeptidos y nucleotidos NPC1L1 de humano, raton y rata que codifican los polipeptidos; se proporcionan metodos para detectar ligandos que se unen a NPC1L1 y bloquean la absorcion intestinal de colesterol, tambien se incluye un metodo para identificar ligandos que se unen a NPC1L1 y bloquean la absorcion intestinal de colesterol, tambien se incluye un metodo para identificar ligandos que se unen a NPC1L1 utilizando membranas derivadas de preparaciones derivadas de borde ciliado; se pueden utilizan compuestos que se unen a NPC1L1 para inhibir la absorcion intestinal de colesterol en un sujeto.

Description

NPC1L1 (NPC3) Y M TODOS PARA IDENTIFICAR LIGANDOS DEL MISMO La invención reclamada en la presente invención se realizó a nombre de Merck & Co., Inc. y Schering-Plough Corporation, como partes de un acuerdo de investigación conjunta que fue en el momento o antes de la fecha en la que se reclamó la invención. Esta solicitud reclama prioridad al número de serie 60/537,341 , presentada el 16 de enero de 2004.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención incluye polipéptidos de NPC1 L1 y polinucleótidos los cuales codifican los polipéptidos, métodos de uso y métodos para identificar moduladores y ligandos de los mismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Un factor que lleva al desarrollo de enfermedad vascular, una causa que ocasiona muerte en las naciones industrializadas, es el colesterol elevado en suero. Se estima que 19% de los norteamericanos entre las edades de 20 y 74 años de edad tienen niveles elevados de colesterol en suero. La forma más prevalente de enfermedad vascular es la arteriosclerosis, una condición asociada con el engrasamiento y endurecimiento de la pared arterial. La arteriosclerosis de los vasos sanguíneos más grandes se refiere como aterosclerosis. La aterosclerosis es el factor predominante que subyace a los trastornos vasculares tales como enfermedad arterial coronaria, aneurisma aórtico, enfermedad arterial de las extremidades inferiores y enfermedad cerebrovascular. Los esteres de colesterilo son un componente principal de las lesiones ateroscleróticas y la forma principal de almacenamiento del cholesterol en las células de la pared arterial. La formación de los esteres de colesterilo también es un paso en la absorción intestinal del colesterol de la dieta. Por lo tanto, la inhibición de la formación de éster de colesterilo y la reducción del colesterol en suero pueden inhibir la progresión de la formación de la lesión aterosclerótica, disminución de la acumulación de esteres de colesterilo en la pared arterial, y bloqueo de la absorción intestinal del colesterol de la dieta. La regulación de la homeostasis del colesterol en todo el cuerpo en mamíferos y en los animales incluye la regulación de la absorción intestinal de colesterol, tráfico de colesterol celular, biosíntesis del colesterol de la dieta y modulación de la biosíntesis del colesterol, biosíntesis del ácido biliar, biosíntesis de esteroides y el catabolismo de las lipoproteínas en plasma que contienen colesterol. La regulación de la absorción del colesterol intestinal ha probado ser un medio efectivo por medio del cual se regulan los niveles de colesterol en suero. Por ejemplo, un inhibidor de la absorción del colesterol, la ezetimiba ( ), se ha mostrado que es efectiva a este respecto. Una composición farmacéutica que contiene ezetimiba está comercialmente disponible a partir de Merck/Schering-Plough Pharmaceuticals, Inc. bajo el nombre comercial Zetia®. La identificación de un gen blanco a través del cual actúa la ezetimiba es importante para entender el proceso de absorción del colesterol y para el desarrollo de otros inhibidores novedosos de la absorción. La presente invención dirige esta necesidad mediante la provisión de un homólogo de rata y de un homólogo de ratón de la NPC1 L1 de humano (también conocida como NPC3; Genbank Número de Acceso AF192522; Davies, et al., (2000) Genomics 65(2): 137-45 e loannou, (2000) Mol. Genet.

Metab. 71 (1-2): 175-81), un blanco de la ezetimiba. La NPC1L1 es una proteína N-glucosilada que comprende un motivo YQRL (SEQ ID NO: 38) (por ejemplo, una señal de transporte de la red trans-golgi hacia la membana plasmática; véase Bos, et al., (1993) EMBO J. 12: 2219-2228; Humphrey, et al., (1993) J. Cell. Biol. 120: 1123-1135; Ponnambalam, et al., (1994) J. Cell. Biol. 125: 253-268 y Rothman, et al., (1996) Science 272: 227-234) el cual exhibe distribución tisular limitada y abundancia gastrointestinal. También, el promotor de la NPC1 L1 de humano incluye una secuencia consenso para unión de la Proteína de Unión al Elemento Regulado por Esterol 1 (SREBP1 - por sus siglas en inglés) (Athanikar, et al., (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95: 4935-4940; Ericsson, et al., (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93: 945-950; Metherall, et al., (1989) J. Biol. Chem. 264: 15634-15641 ; Smith, et al., (1990) J. Biol. Chem. 265: 2306-2310; Bennett, et al., (1999) J. Biol. Chem. 274: 13025-13032 y Brown, et al., (1997) Cell 89: 331-340). La NPC1 L1 tiene una homología de la secuencia de aminoácidos del 42% con respecto a la NPC1 de humano (Genbank No. de acceso AF002020), un receptor responsable de la enfermedad de Niemann-Píck C1 (Carstea, et al., (1997) Science 277: 228-231 ). La enfermedad de Niemann- Pick C1 es un trastorno genético extraño en humanos el cual resulta en la acumulación de lipoproteína de baja densidad (LDL) -derivada a partir del colesterol no esterificado en lisosomas (Pentchev, et al., (1994) Biochim. Biophys. Acta. 1225: 235-243 y Vanier, et al., (1991 ) Biochim. Biophys. Acta. 1096: 328-337). Además, el colesterol se acumula en la red trans-golgi de células npcl", y se retrasan la ubicación del colesterol, hacia y a partir de la membrana plasmática. Las NPC1 y NPC1 L1 cada una posee 13 segmentos que se extienden transmembranalmente así como un dominio sensible al esterol (SSD). Varias otras proteínas, incluyendo HMG-CoA Reductasa (HMG-R), proteína parchada (PTC) y la Proteína de activación por la Escisión de la Proteína para Unión al Elemento Regulador del Esterol (SCAP - por sus siglas en inglés), incluyen un SSD el cual participa en la sensibilidad de los niveles de colesterol posiblemente mediante un mecanismo que incluye la unión directa al colesterol (Gil, et al., (1985) Cell 41 : 249-258; Kumagai, et al., (1995) J. Biol. Chem. 270: 19107-19113; Hua, et al., (1996) Cell 87: 415-426; y Radhakrishnan, A., et al., "Direct binding of cholesterol to the purified membrane región of SCAP: Mechanism for a sterol-sensing domain", Mol Cell 15, 259-268 (2004)).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa en el descubrimiento de que la NPC1L1 es el blanco a través del cual actúa la ezetimiba, y consecuentemente desempeña un papel crítico en la regulación del esterol y el transporte y absorción intestinal del 5a-estanol, por ejemplo absorción del colesterol. Por consiguiente, esta invención se provee para el uso de NPC1 L1 en un ensayo para la identificación del ligandos que bloquean el transporte intestinal del esterol y 5a-estanol mediado por NPC1L1. La presente invención provee métodos para la identificación de ligandos del NPC1 L1 los cuales incluyen poner en contacto a NPC1 L1 con una 2-azetidinona sustituida marcada de manera detectable, preferiblemente 2-azetidinona-glucurónido sustituida, y un compuesto candidato, y determinar si el compuesto candidato se une a NPC1 L1. La modulación de la unión de la 2-azetídinona sustituida a NPC1 L1 mediante la unión del compuesto candidato a NPC1 L1 indica que el compuesto candidato es un ligando que se une a NPC1 L1 y es un inhibidor de la absorción del esterol y del 5a-estanol. La presente invención también provee un método para la identificación de un ligando de NPC1L1 que comprende poner en contacto a NPC1 L1 con una 2-azetidinona sustituida marcada de manera detectable, preferiblemente 2-azetidinona-glucurónido sustituida, y medir la unión de la 2-azetidinona sustituida marcada de manera detectable a NPC1 L1 en la presencia y ausencia de un compuesto candidato, en donde la unión disminuida de la 2-azetidinona sustituida marcada de manera detectable a NPC1 L1 en la presencia del compuesto candidato indica que dicho compuesto candidato es un ligando de NPC1 L1 y es un inhibidor de la absorción del esterol y del 5a-estanol. La presente invención también provee un método para identificar un compuesto que inhibe la absorción intestinal del esterol o 5a-estanol mediada por NPC1 L1 incluyendo el contacto de NPC1 L1 con un ligando marcado de manera detectable y el compuesto candidato y determinar el compuesto candidato se une a NPC1 L1 , en donde la unión de dicho compuesto candidato a NPC1 L1 modula la unión de dicho ligando a NPC1 L1 , en donde dicha modulación indica que el compuesto candidato es un inhibidor de la absorción intestinal del esterol o del 5a-estanol. La presente invención provee métodos para identificar un ligando de NPC1 L1 que comprenden (a) poner en contacto una célula hospedera (por ejemplo, células de riñon embrionario de humano (HEK) 293, célula de ovario de hámster chino (CHO), una célula J774, una célula de macrófago o una célula Caco2) que expresa un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 12 o un fragmento funcional del mismo sobre una superficie celular, en la presencia de una cantidad conocida de una azetidinona sustituida marcada de manera detectable (por ejemplo, con 3H, 14C, 125l, 35S o marcada de manera fluorescente) (por ejemplo, ezetimiba), con una muestra a ser evaluada para la presencia de un ligando de NPC1L1 ; y (b) medir la cantidad de azetidinona sustituida marcada de manera detectable (por ejemplo, ezetimiba) específicamente unida al polipéptido; en donde un ligando NPC1 L1 en la muestra se identifica al medir la unión sustancialmente reducida de la azetidinona sustituida marcada de manera detectable (por ejemplo, ezetimiba) al polipéptido, en comparación con lo que se podría medir en la ausencia de dicho ligando. También se provee otro método para identificar un ligando de la NPC1L1. El método comprende (a) colocar, en una suspensión acuosa, una pluralidad de partículas de soporte, impregnadas con un elemento fluorescente (por ejemplo, silicato de itrio, óxido de itrio, difeniloxazol y poliviniltolueno), a las cuales se les une una célula hospedera (por ejemplo, célula de ovario de hámster chino (CHO), una célula J774, una célula de macrófago o una célula Caco2) que expresa un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 12 o un fragmento funcional del mismo sobre una superficie celular; (b) añadir, a la suspensión, una azetidinona sustituida radiomarcada (por ejemplo, con 3H, 14C o 125l (por ejemplo, ezetimiba) y una muestra a ser evaluada para la presencia de un ligando, en donde la radiomarca emite energía de radiación capaz de activar al elemento fluorescente después de la unión de la azetidinona sustituida (por ejemplo, ezetimiba) al polipéptido para producir energía luminosa, mientras que la azetidinona sustituida radiomarcada (por ejemplo, ezetimiba) que no se une al polipéptido, generalmente se encuentra demasiado lejos de las partículas de soporte para permitir que la energía radioactiva active al elemento fluorescente; y (c) medir la energía luminosa emitida por el elemento fluorescente en la suspensión; en donde un ligando de NPC1 L1 en la muestra se identifica por la medición sustancialmente reducida de la emisión de la energía luminosa, en comparación con lo que se podría medir en la ausencia de dicho ligando. También se provee un método para identificar un ligando de NPC1L1 que comprende (a) poner en contacto una célula hospedera (por ejemplo, célula de ovario de hámster chino (CHO), una célula J774, una célula de macrófago o una célula Caco2) que expresa un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 12 o un fragmento funcional del mismo sobre una superficie celular con esterol (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol marcado de manera detectable (por ejemplo, con 3H, 14C o 125l) y con una muestra a ser evaluada para la presencia de un ligando; y (b) medir la cantidad de esterol (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol marcado de manera detectable en la célula; en donde se identifica un antagonista de NPC1 L1 en la muestra mediante la medición sustancialmente reducida del esterol (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol marcado de manera detectable dentro de la célula hospedera, en comparación con lo que se podría medir en la ausencia de dicho antagonista y en donde se identifica un agonista de NPC1L1 en la muestra mediante la medición sustancialmente incrementada del esterol (por ejemplo, colesterol) o 5?-estanol marcado de manera detectable dentro de la célula hospedera, en comparación con lo que se medir en la ausencia de dicho agonista . La presente invención incluye métodos para inhibir la toma intestinal de esterol (por ejemplo, colesterol) o 5 -estanol mediada por NPC1 L1 , en un sujeto, mediante la administración al sujeto de una sustancia identificada por los métodos de selección descritos en la presente invención. Dichas sustancias incluyen compuestos tales como antagonistas de molécula pequeña de NPC1 L1 diferentes a la ezetimiba. También se contemplan métodos para antagonizar la absorción del esterol (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol mediada por NPC1 L1 mediante la administración de anticuerpos anti-NPC1 L1. La absorción de esterol (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol mediada por NPC1L1 también se puede antagonizar mediante cualquier método el cual reduce la expresión de NPC1 L1 en un organismo. Por ejemplo, la expresión de NPC1 L1 se puede reducir mediante la introducción de un ARNm NPC1 L1 anti-sentido dentro de una célula de un organismo o mediante la mutación genética del gen NPC1L1 en un organismo (por ejemplo, mediante knockout completo, alteración, truncación o mediante la introducción de una o más mutaciones puntuales). También se incluye en la presente invención un mamífero transgénico mutante (por ejemplo, ratón, rata, perro, conejo, cerdo, conejillo de Indias, gato, caballo), preferiblemente un ratón que comprende una mutación homocigota o heterocigota (por ejemplo, alteración, truncación, una o más mutaciones puntuales, knockout) de NPC1L1 endógeno, cromosomal en donde, preferiblemente, el ratón no produce ninguna proteína NPC1 L1 funcional. Preferiblemente, el ratón mutante, que carece de NPC1 L1 funcional, exhibe un nivel reducido de absorción intestinal del esterol (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol y/o un nivel reducido de esterol en suero (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol y/o un nivel reducido de esterol en hígado (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol en comparación con aquel de un ratón mutante que comprende NPC1 L1 funcional. Preferiblemente, en el cromosoma del ratón mutante, la región de NPC1 L1 (SEQ ID NO: 45) deletada es a partir del nucleótido 790 al nucleótido 998. En una modalidad, NPC1 L1 (SEQ ID NO: 11 ) se deleta a partir del nucleótido 767 al nucleótido 975. Cualquier descendiente o progenie de un ratón parental mutante a NPC1 L1 (por ejemplo, npcH1 ) de la invención el cual ha heredado un alelo mutante npcH1 también es parte de la presente invención. El alcance de la presente invención también incluye un método para seleccionar una muestra para un antagonista de la absorción intestinal del esterol (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol que comprende (a) proveer una sustancia que contiene esterol (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol (por ejemplo, que comprende colesterol radio marcado, tales como 14C-colesterol o 3H-colesterol) a un primer y segundo ratón que comprende un gen funcional de NPC1L1 y a un tercer ratón mutante que carece de un NPC1L1 funcional; (b) administrar la muestra al primer ratón que comprende un NPC1 L1 funcional pero no al segundo ratón; (c) medir la cantidad de absorción del esterol (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol en el intestino de dicho primero, segundo y tercer ratón (por ejemplo, mediante la medición del colesterol en suelo); y (d) comparar los niveles de absorción intestinal del esterol (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol en cada ratón; en donde se determina que la muestra contiene el antagonista de la absorción intestinal del esterol (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol cuando el nivel de absorción intestinal del esterol (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol en el primer ratón y tercer ratón es menor que la cantidad de absorción intestinal del esterol (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol en el segundo ratón. La presente invención también comprende un equipo que comprende (a) una azetidinona sustituida (por ejemplo, ezetimiba) en una forma de dosis farmacéutica (por ejemplo, una pildora o tableta que comprende 10 mg de azetidinona sustituida (por ejemplo, ezetimiba)); y (b) información, por ejemplo en la forma de un inserto, indicando que NPC1 L1 es un blanco de la ezetimiba. El equipo también puede incluir simvastatina en una forma de dosis farmacéutica (por ejemplo, una pildora o tableta que comprende 5 mg, 10 mg, 20 mg, 40 mg u 80 mg de simvastatina). La simvastatina en forma de dosis farmacéutica y la ezetimiba en forma de dosis farmacéutica se pueden asociar en una pildora o tableta particular o en pildoras o tabletas separadas. La presente invención también provee cualquier célula aislada de mamífero (por ejemplo, célula aislada de ratón, célula aislada de rata o célula aislada de humano) la cual carece de un gen el cual codifica o puede producir un polipéptido NPC1 L1 funcional. La célula aislada se puede aislar a partir de un ratón mutante que comprende una mutación homocigota del NPC1 L1 endógeno, cromosomal en donde el ratón no produce ninguna proteína NPC1L1 funcional. Además, la mutación puede' ser en un gen el cual cuando no ha sido mutado codifica una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 (por ejemplo, que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 11 ). La célula se puede aislar o derivar a partir de tejido de duodeno, de vesícula biliar, de hígado, de intestino delgado o de estómago. La célula puede ser un enterocito.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1A muestra una gráfica de unión por saturación en equilibrio que exhibe la unión del 3H-EZE-glucurónido a las vesículas de la membrana del borde en cepillo de rhesus (BBM). La unión total observada (Total) se muestra como cículos abiertos; la unión no específica (NS) como triángulos, y la unión específica (unión-S) como círculos sólidos.

La figura 1 B muestra un análisis de Scatchard de la unión de 3H-EZE-glucurónido a las vesículas de la membrana del borde en cepillo de rhesus. La figura 2A muestra una gráfica de unión por saturación en equilibrio que exhibe la unión de 3H-EZE-glucurónido (1 ) a las vesículas de membrana de borde en cepillo de rata. Se incluyen la unión total observada (círculos abiertos) y la unión no específica (triángulos), determinada en la presencia de 100 µM de ezetimiba no marcada y glucurónido; la unión específica (círculos sólidos) se evaluó a partir de la diferencia entre la unión total y la unión no específica. La unión se midió en 2.5 mg de proteína/ml en un volumen de 100 µl después de 1 hora de incubación. Los datos se ajustaron mediante regresión no lineal como se describe en los métodos. La figura 2B muestra análisis de Scatchard de la unión de 3H-EZE-glucurónido a las vesículas de membrana de borde en cepillo de rata. Los datos de unión identifican un sitio particular de alta afinidad con KD = 542 nM y Bmax= 20.7 pmol/mg de proteína. La figura 3A muestra el análisis de la cinética de asociación del 3H-EZE-glucurónido en vesículas de la membrana del borde en cepillo de la rata. Las condiciones fueron 25 nM de 1 y 3 mg/ml de proteína a 25°C. La constante de velocidad de segundo orden kon (0.55 x10"4M~V1) se calculó a partir de k0bs (0.004 s" ) como se describe en los métodos. La figura 3B muestra un análisis de la cinética de disociación del 3H-EZE-glucurónido 1 en vesículas de la membrana del borde en cepillo de la rata. Después de que se formó el complejo mediante la incubación de 25 nM de 1 y 3 mg/ml proteína por 1 hora, la disociación se inició mediante la competencia con 100 µM de ezetimiba glucurónido no marcado. La curva es teórica para k0ff= 0.0024 s"1. La figura 4A muestra el análisis de la cinética de asociación del 3H-EZE-glucurónido en vesículas de membrana del borde en cepillo de rhesus. La figura 4B muestra un análisis de la cinética de disociación del 3H-EZE-glucurónido en vesículas de membrana del borde en cepillo de rhesus. Las figuras 5A y 5B muestran los resultados de un ensayo de unión en donde 3H-EZE- glucurónido se disocia en EZE-glucurónido y el compuesto 2 a partir de las vesículas de membrana del borde en cepillo de rhesus (5A) y de rata (5B). La figura 6 muestra los resultados de un ensayo de unión en donde 35S-2 se disocia en EZE-glucurónido y 2 a partir de vesículas de membrana del borde en cepillo de ratón. Las figuras 7A y 7B muestran la distribución de unión de 3H-EZE-glucurónido a las membranas del borde en cepillo de rhesus (7A) y de rata (7B) preparadas a partir de diversas porciones del tejido intestinal de rhesus (7A) y de rata (7B).

La figura 8 muestra los resultados de un ensayo de unión en donde 35S-2 se disocia en EZE-glucurónido y diversos análogos a partir de las células CHO transfectadas con NPC1 L1 de rata.' La figura 9 muestra los resultados de un ensayo de unión en donde 35S-2 se disocia en EZE-glucurónido y diversos análogos a partir de las células CHO transfectadas con NPC1 L1 de humano. Las figuras 10A y 10B muestran la unión de 35S-2 a las vesículas de membrana del borde en cepillo preparadas a partir de ratones de tipo silvestre (10A) y ratones knockout para NPC1 L1 (-/-). La figura 11 muestra los resultados de un ensayo de unión en donde 35S-2 se disocia en el compuesto 2 a partir de vesículas de membrana del borde en cepillo de ratones de tipo silvestre y ratones knockout para NPC1 L1 (-/-). La figura 12A muestra la determinación en equilibrio de la KD para ezetimiba glucurónido mediante la competencia del compuesto no marcado en contra de i en membranas del borde en cepillo del enterocito de rata. Las membranas (1.5 mg/ml proteína) se incubaron con 1 (50 nM) y las concentraciones indicadas de ezetimiba glucurónido por 1 hora para asegurar el equilibrio. La KD en equilibrio es de 600 nM. La figura 12B muestra las mediciones correspondientes para mono rhesus, las cuales se llevaron a cabo entre 0.5 y 1.25 mg/ml de proteína y 22-50 nM 1_, con tiempo de incubación de más de 3 horas. La KD en equilibrio es de 38.6 nM.

La figura 13 muestra la expresión de NPC1 L1 en células HEK-293 utilizando análisis Western blot (Panel 1 ) e inmunofluorescencia (Panel 2, letras A, B, C y D). La figura 14A muestra la unión del 3H-ezetimiba glucurónido a membranas del borde en cepillo de enterocito a partir de ratones de tipo silvestre y ratones deficientes en NPC1L1 en la presencia de detergente. La figura 14B muestra estudios de competencia de ezetimiba glucurónido no marcado en contra de ezetimiba glucuronide marcado. La figura 15 muestra el efecto de los detergentes, taurocolate y digitonina, sobre la unión del [3H]ezetimiba glucurónido.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención incluye polipéptidos NPC1 L1 partir de rata, humano y ratón, junto con polinucleótidos de codifican los polipéptidos respectivos. Preferiblemente, el polipéptido NPC1 L1 de rata comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 2, la NPC1 L1 de humano comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 4 y el polipéptido NPC1 L1 de ratón comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 12. El polinucleótido NPC1 L1 de rata de SEQ ID NO: 1 ó 10 codifica el polipéptido NPC1 L1 de rata. El polinucleótido NPC1 L1 de humano de SEQ ID NO: 3 codifica el polipéptido NPC1 L1 de humano. El polinucleótido NPC1 L1 de ratón de SEQ ID NO: 11 ó 13 codifica el polipéptido NPC1 L1 de ratón. La presente invención incluye cualquier polinucleótido aislado o polipéptido aislado que comprende una secuencia nucleótidos o de aminoácidos que se refiere a continuación, en el cuadro 1.

CUADRO 1 Polinucleótidos y polipéptidos de la invención Una NPC1 L1 de humano también se describe bajo Genbank Número de Acceso AF192522. Como se discute a continuación, la secuencia nucleotídica de la NPC1 L1 de rata establecida anteriormente en SEQ ID NO: 1 se obtuvo a partir de una marca de secuencia expresada (EST) a partir de una librería de ADNc de enterocito de yeyuno de rata. Las SEQ ID NOs: 5-7 incluyen secuencias nucleotídicas parciales de tres clonas independientes de ADNc. Se determinó la secuencia cascada abajo de la SEQ ID NO: 5 EST (603662080F1 ); los datos de secuenciación a partir de estos experimentos se establecieron anteriormente en SEQ ID NO: 8.. También se determinaron las secuencias cascada arriba; estos datos se establecieron anteriormente en SEQ ID NO: 9. Las SEQ ID NOs: 43 y 44 son las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos, respectivamente, de la NPC1 L1 de humano las cuales se describen bajo Genbank No. de acceso: AF192522 (véase Davies, et al., (2000) Genomics 65 (2): 137-45). La SEQ ID NO: 45 es la secuencia nucleotídica de una NPC1 L1 de ratón la cual se describe bajo Genbank No. de acceso AK078947. NPC1 L1 media la absorción intestinal del esterol (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol. La inhibición de NPC1 L1 en un paciente es un método útil para reducir la absorción intestinal del esterol (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol y esterol en suero (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol en el paciente. Reduciendo el nivel de absorción intestinal del esterol (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol y el esterol en suero (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol en un paciente es una forma útil para tratar o prevenir la presencia de aterosclerosis, particularmente aterosclerosis inducida por la dieta. Como se utiliza en la presente invención, el término "esterol" incluye, pero no se limita a, colesterol y fitoesteroles (incluyendo, pero no limitados a, sitoesterol, campesterol, estigmasterol y avenosterol). Como se utiliza en la presente invención, el término "5a-estanol" incluye, pero no se limita a, colestanol, 5a-campestanol y 5a-sitoestanol. Sin limitarse por la presente hipótesis, los ejemplos presentan un mejor entendimiento de la interacción molecular putativa entre NPC1L1 y el colesterol. A este respecto, una de las características más importantes de NPC1 L1 es que contiene el dominio para sensibilización al esterol (SSD) originalmente observado en SCAP (proteína activadora de la escisión SREBP). SCAP controla la activación de las proteínas de unión al elemento regulador del esterol (SREBP), un factor de transcripción el cual controla más de 35 genes relacionados con la homeostasis de líquidos y del colesterol (Brown, M. S. & Goldstein, J. L. A proteolytic pathway that controls the cholesterol content of membranes, cells, and blood. Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 96, 11041-11048 (1999)). El SSD, que consiste de -180 aminoácidos en un paquete de 5 hélices putativas que se extienden a través de la membrana, también sirve como una función reguladora en dos enzimas clave en la ruta de la biosíntesis del colesterol y está presente en el receptor en parche. Recientemente, se ha demostrado una alta afinidad de unión del colesterol al SSD sobre SCAP (Radhakrishnan, A., Sun, L, Kwon, H. J., Brown, M. S. & Goldstein, J. L.,"Direct binding of cholesterol to the purified membrane región of SCAP: Mechanism for a sterol-sensing domain", Mol. Cell 15, 259-268 (2004)), sugiriendo que el colesterol se puede unir de manera similar al SSD de NPC1 L1 , y genera la posibilidad de que la ezetimiba pueda competir con el colesterol por la unión en este sitio.

Biología molecular De conformidad con la presente invención se pueden emplear técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, y ADN recombinante dentro de la capacidad de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la literatura. Véase, por ejemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (en la presente invención "Sambrook, et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, volúmenes I y II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. (1985)); Transcription and Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. (1984)); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. (1986)); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, (1986)); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubel, et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).

Las secuencias retro-transcritas de SEQ ID NO: 10 y de SEQ ID NO: 13 utilizan el código de una sola letra que se muestra en el cuadro 1 del anexo C, apéndice 2 de la PCT Administrative Instruction en the Manual of Patent Examination Procedure. Un "polinucleótido", "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" se puede referir a la forma polimérica de! éster de fosfato de los ribonucleósidos (adenosina, guanosina, uridina o citidína; "moléculas de ARN") o deoxiribonucleósidos (deoxiadenosina, deoxiguanosina, deoxitímidina, o deoxicitidina; "moléculas de ADN"), o cualesquiera análogos de fosfoéster de los mismos, tales como fosforotioatos y tioésteres, en forma de cadena sencilla, en forma de cadena doble o de otra forma. Una "secuencia polinucleotídica", "secuencia de ácido nucleico" o "secuencia nucleotídica" es una serie de bases nucleotídica (también denominados "nucleótidos") en un ácido nucleico, tal como ADN o ARN, y significa cualquier cadena de dos o más nucleótidos. Una "secuencia codificante" o una secuencia "que codifica" un producto de expresión, tal como un ARN, polípéptido, proteína, o enzima, es una secuencia nucleotídica que, cuando se expresa, resulta en la producción del producto. El término "gen" significa una secuencia de ADN que codifica para o corresponde a una secuencia particular de ribonucleótidos o aminoácidos la cual comprende toda o parte de una más moléculas de ARN, proteínas o enzimas, y pueden incluir o no secuencias reguladoras de ADN, tal como secuencias promotoras, las cuales determinan, por ejemplo, las condiciones bajo las cuales se expresa el gen. Los genes se pueden transcribir a partir de ADN hacia ARN el cual se puede traducirdo o no hacia una secuencia de aminoácidos. La presente invención incluye fragmentos de ácido nucleico de cualesquiera de SEQ ID NOs: 1 , 5-11 ó 13. Un "fragmento" de ácido nucleico incluye al menos aproximadamente 30 (por ejemplo, 31 , 32, 33, 34), preferiblemente al menos aproximadamente 35 (por ejemplo, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33 ó 34), más preferiblemente al menos aproximadamente 45 (por ejemplo, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43 ó 44), y más preferiblemente al menos aproximadamente 126 o más nucleótidos contiguos (por ejemplo, 130, 131 , 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 400, 500, 1000 ó 1200) a partir de cualesquiera de SEQ ID NOs: 1 , 5-11 ó 13. La presente invención también incluye fragmentos de ácido nucleico que consisten de al menos aproximadamente 7 (por ejemplo, 9, 12, 17, 19), preferiblemente al menos aproximadamente 20 (por ejemplo, 30, 40, 50, 60), más preferiblemente aproximadamente 70 (por ejemplo, 80, 90, 95), incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 100 (por ejemplo, 105, 110, 114) e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 115 (por ejemplo, 117, 119, 120, 122, 124, 125, 126) nucleótidos contiguos a partir de cualesquiera de SEQ ID NOs: 1 , 5-11 0 13.

Como se utiliza en la presente invención, el término "oligonucleótido" se refiere a un ácido nucleico, generalmente de no más de aproximadamente 100 nucleótidos (por ejemplo, 30, 40, 50, 60, 70, 80, o 90), que se puede hibridar con una molécula de ADN genómico, una molécula de ADNc, o una molécula de ARNm que codifica un gen, ARNm, ADNc, u otro ácido nucleico de interés. Los oligonucleótidos pueden estar marcados, por ejemplo, mediante la incorporación de 32P-nucleótidos, 3H-nucleótidos, 14C-nucleótidos, 35S-nucleótidos o nucleótidos a los cuales se les ha conjugado covalentemente una marca, tal como biotina. En una modalidad, un oligonucleótido marcado se puede utilizar como una sonda para detectar la presencia de un ácido nucleico. En otra modalidad, se pueden utilizarlos oligonucleótidos (uno o ambos de los cuales pueden estar marcados) como iniciadores para PCR, ya sea para la clonación de longitud total o de un fragmento del gen, o para detectar la presencia de ácidos nucleicos. Generalmente, los oligonucleótidos se preparan sintéticamente, preferiblemente en un sintetizador de ácido nucleico. Una "secuencia de proteínas", "secuencia peptídica" o "secuencia polipeptídica" o "secuencia de aminoácidos" se puede referir a una serie de dos o más aminoácidos en una proteína, péptido o polipéptido. La "proteína", "péptido" o "polipéptido" incluye una extensión contigua de dos o más aminoácidos. Los péptidos preferidos de la invención incluyen aquellos establecidos en cualesquiera de SEQ ID NOs: 2 ó 12 así como variantes y fragmentos de los mismos. Dichos fragmentos preferiblemente comprenden al menos aproximadamente 10 (por ejemplo, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ó 19), más preferiblemente al menos aproximadamente 20 (por ejemplo, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40), e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 42 (por ejemplo, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120 ó 130) o más residuos de aminoácidos contiguos a partir de cualesquiera de SEQ ID NOs: 2 ó 12. La presente invención también incluye polipéptidos, preferiblemente polipéptidos antigénicos, que consisten de al menos aproximadamente 7 (por ejemplo, 9, 10, 13, 15, 17, 19), preferiblemente al menos aproximadamente 20 (por ejemplo, 22, 24, 26, 28), incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 30 (por ejemplo, 32, 34, 36, 38) e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 40 (por ejemplo, 41 , 42) aminoácidos contiguos a partir de cualesquiera de SEQ ID NOs: 2 ó 12. Los polipéptidos de la invención se pueden producir mediante escisión proteolítica de un péptido intacto, mediante síntesis química o mediante la aplicación de la tecnología de ADN recombinante y no se limitan a polipéptidos delineados por los sitios de escisión proteolítica. Los polipéptidos, ya sea solos o entrecruzados o conjugados a una molécula vehículo para volverlos más inmunogénicos, son útiles como antígenos para inducir la producción de anticuerpos y fragmentos de los mismos. Los anticuerpos se pueden utilizar, por ejemplo, en inmunoensayos para purificación por inmunoafinidad o para la inhibición de NPC1 L1 , etc.

Los términos "polinucleótido aislado" o "polipéptido aislado" incluye un polinucleótido (por ejemplo, molécula de ARN o ADN, o un polímero mezclado) o un polipéptido, respectivamente, los cuales están parcialmente o completamente separados a partir de otros componentes que normalmente se encuentran en las células o en sistemas de expresión de ADN recombinante. Estos componentes incluyen, pero no se limitan a, membranas celulares, paredes celulares, ribosomas, polimerasas, componentes del suero y secuencias genómicas extrañas. Un polinucleótido o polipéptido aislado será, preferiblemente, una composición de moléculas esencialmente homogénea pero la cual puede contener cierta heterogeneidad. La "amplificación" del ADN como se utiliza en la presente invención puede denotar el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para incrementar la concentración de una secuencia particular de ADN dentro de una mezcla de secuencias de ADN. Para una descripción de PCR véase Saiki, et al., Science (1988) 239: 487. El término "célula hospedera" incluye cualquier célula de cualquier organismo que se selecciona, modifica, transfecta, transforma, crece, o utiliza o manipula de cualquier forma, para la producción de una sustancia por la célula, por ejemplo, la expresión o replicación, por la célula, de un gen, una secuencia de ADN o ARN o una proteína. Las células hospederas preferidas incluyen células HEK-293, célula de ovario de hámster chino (CHO), células J774 macrófago de murino o cualquier otra línea celular de macrófago y células Caco2 del epitelio intestinal de humano. La secuencia nucleotídica de un ácido nucleico se puede determinar mediante cualquier método conocido en la técnica (por ejemplo, secuenciación química o secuenciación enzimática). La "secuenciación química" del ADN incluye métodos tales como aquel de Maxam y Gilbert (1977) (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 74: 560), en el cual el ADN se escinde al azar utilizando reacciones individuales específicas de las bases. La "secuenciación enzimática" del ADN incluye métodos tales como aquel de Sanger (Sanger, et al., (1977) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 74: 5463). Los ácidos nucleicos en la presente invención se pueden flanquear mediante secuencias reguladoras naturales (control de la expresión), o se pueden asociar con secuencias heterólogas, incluyendo promotores, sitios internos para entrada al ribosoma (IRES) y otras secuencias para sitios de unión al ribosoma, potenciadores, elementos de respuesta, supresores, secuencias señal, secuencias de poliadenilación, intrones, regiones no codificantes hacia 5' y 3', y los similares. En general, un "promotor" o "secuencia promotora" es una región reguladora del ADN capaz de unirse a una ARN polimerasa en una célula (por ejemplo, directamente o a través de otras proteínas o sustancias unida al promotor) y que inicia la transcripción de una secuencia codificante. En general, una secuencia promotora está unida a su extremo 3' mediante el sitio de inicio de la transcripción y se extiende hacia el extremo 5' (dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción en cualquier nivel. Dentro de la secuencia promotora se puede encontrar un sitio para inicio de la transcripción (convenientemente definido, por ejemplo, mediante mapeo con nucleasa S1 ), así como dominios para unión a la proteína (secuencias consenso) responsables para la unión de la ARN polimerasa. El promoter se puede asociar de manera operable con otras secuencias para el control de la expresión, incluyendo secuencias potenciadoras y represoras o con un ácido nucleico de la invención. Los promotores que se pueden utilizar para controlar la expresión del gen incluyen, pero no se limitan a, promotor del citomegalovirus (CMV) (Patentes de E.U.A. Nos. 5,385,839 y 5,168,062), la región del promotor temprano de SV40 (Benoist, et al., (1981 ) Nature 290: 304-310), el promotor contenido en el repetido terminal largo hacia 3' del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto, et al., (1980) Cell 22: 787-797), el promotor de la timidina cinasa del herpes (Wagner, et al., (1981 ) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78: 1441-1445), las secuencias reguladoras del gen de la metalotioneína (Brinster, et al., (1982) Nature 296: 39-42); vectores de expresión procarionte tales como el promotor de la ß-lactamasa (Villa-Komaroff, et al., (1978) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731 ), o el promotor tac (DeBoer, et al., (1983) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80: 21-25); véase también "Useful Proteins from recombinant bacteria" en Scientific American (1980) 242: 74-94; y los elementos promotores a partir de levadura o de otros hongos tales como el promotor Gal 4, el promotor ADC (alcohol dehidrogenasa), el promotor PGK (fosfoglicerol cinasa) o el promotor de la fosfatasa alcalina. Una secuencia codificante se encuentra "bajo el control de", "funcionalmente asociada con" u "operativamente asociada con" secuencias de control de la transcripción y la traducción en una célula cuando las secuencias dirigen la transcripción mediada por la ARN polimerasa de la secuencia codificante hacia ARN, preferiblemente ARNm, el cual puede ser entonces un RNA procesado (si contiene intrones) y, opcionalmente, se traduce hacia una proteína codificada por la secuencia codificante. Los términos que "expresa" y "expresión" significan que se permite o que se ocasiona que la información en un gen, secuencia de ARN o de ADN se manifieste; por ejemplo, produciendo una proteína mediante la activación de las funciones celulares implicadas en la transcripción y traducción de un gen correspondiente. Una secuencia de ADN se expresa en o por una célula para formar un "producto de expresión" tales como ARN (por ejemplo, ARNm) o una proteína. También se puede decir que el producto de expresión mismo se "expresa" por la célula. El término "transformación" significa la introducción de un ácido nucleico dentro de una célula. El gen o secuencia introducida se puede denominar una "clona". Una célula hospedera que recibe el ADN o ARN introducido ha sido "transformada" y es un "transformante" o una "clona". El ADN o ARN introducido a una célula hospedera puede provenir a partir de cualquier fuente, incluyendo células del mismo género o especie que la célula hospedera, o a partir de células de un género o especie diferente. El término "vector" incluye un vehículo (por ejemplo, un plásmido) por medio del cual se pueden introducir una secuencia de ADN o de ARN dentro de una célula hospedera, de manera que se transforma al hospedero y, opcionalmente, se promueve la expresión y/o replicación de la secuencia introducida. Los vectores que se pueden utilizar en esta invención incluyen plásmidos, virus, bacteriófago, fragmentos de ADN que se pueden integrar, y otros vehículos que pueden facilitar la introducción de los ácidos nucleicos dentro del genoma del hospedero. Los plásmidos son la forma más comúnmente utilizada de vector pero todas las otras formas de vectores que sirven a una función similar y las cuales se conocen, o se conocerán en la técnica son adecuadas para uso en la presente invención. Véase, por ejemplo, Pouweis, et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985 y Suplementos, Elsevier, N. Y., y Rodríguez et al. (eds.), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, 1988, Buttersworth, Boston, MA. El término "sistema de expresión" significa una célula hospedera y un vector compatible los cuales, bajo condiciones adecuadas, pueden expresar una proteína o ácido nucleico el cual se porta por el vector y se introduce a la célula hospedera. Los sistemas comunes de expresión incluyen células hospederas de E. coli y vectores plasmídicos, células hospederas de insecto y vectores de Baculovirus, y células hospederas de mamífero y vectores. La expresión de los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos NPC1 L1 de esta invención se puede llevar a cabo mediante métodos convencionales ya sea en células procariontes o eucariontes. Aunque se emplean más frecuentemente células hospederas de E. coli en los sistemas de procariontes, se conocen en la técnica muchas otras bacterias, tales como diversas cepas de Pseudomonas y Bacillus, y también pueden ser utilizadas. Las células hospederas adecuadas para la expresión de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de NPC1 L1 incluyen procariontes y eucariontes superiores. Los procariontes incluyen tanto organismos gram-negativos como gram-positivos, por ejemplo, E. colí y B. subtilis. Los eucariontes superiores incluyen líneas celulares establecidas para cultivo de tejidos a partir de células animales, tanto de origen no mamífero, por ejemplo, células de insecto, y aves, como de origen de mamífero, por ejemplo, humano, primates, y roedores. Los sistemas de vector-hospedero procarionte incluyen una amplia variedad de vectores para muchas especies diferentes. Un vector representativo para la amplificación del ADN es pBR322 o muchos de sus derivados (por ejemplo, pUC18 ó 19). Los vectores que se pueden utilizar para expresar los polipéptidos de NPC1L1 incluyen, pero no se limitan a, aquellos que contienen el promotor lac (serie pUC); el promotor trp (pBR322-trp); el promotor Ipp (la serie pIN); los promotores lambda-pP o pR (pOTS); o promotores híbridos tal como ptac (pDR540). Véase Brosius et al., "Expression Vectors Employing Lambda-, trp-, lac-, and Ipp-derived Promoters", en Rodríguez y Denhardt (eds.) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, 1988, Buttersworth, Boston, pp. 205-236. Muchos polipéptidos pueden ser expresados a niveles elevados, en un sistema de expresión de E. coli/T7 como se describe en las Patentes de E.U.A. Nos. 4,952,496; 5,693,489 y 5,869,320 y en Davanloo, P., et al., (1984) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81 : 2035-2039; Studier, F. W., et al., (1986) J. Mol. Biol. 189: 113-130; Rosenberg, A. H., et al., (1987) Gene 56: 125-135; y Dunn, J. J., et al., (1988) Gene 68: 259. También se pueden utilizar células de eucariontes superiores para cultivo de tejidos para la producción recombinante de los polipéptidos NPC1 L1 de la invención. Aunque se puede utilizar cualquier línea celular de eucarionte superior para cultivo de tejidos, incluyendo sistemas de expresión de baculovirus en insecto, se prefieren las células de mamífero. La transformación o transfección y propagación de dichas células se ha vuelto un procedimiento de rutina. Los ejemplos de líneas celulares útiles incluyen células HeLa, líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO), células J774, células HEK-293, células Caco2, líneas celulares de riñon de rata recién nacida (BRK), líneas celulares de insecto, líneas celulares de ave, y líneas celulares de mono (COS). Usualmente los vectores de expresión para dichas líneas celulares incluyen un origen de la replicación, un promotor, un sitio de inicio de la traducción, sitios de procesamiento del ARN (si se utiliza ADN genómico), un sitio de poliadenilación, y un sitio para término de la transcripción. Estos vectores también contienen, usualmente, un gen para selección o gen para amplificación. Los vectores de expresión adecuados pueden ser plásmidos, virus, o retrovirus que portan promotores derivados, por ejemplo, a partir de fuentes tales como adenovirus, SV40, parvovirus, virus de vaccinia, o citomegalovirus. Los ejemplos de vectores de expresión incluyen pCR®3.1 , pCDNAl , pCD (Okayama, ét al., (1985) Mol. Cell Biol. 5: 1 136), pMCI neo Poli-A (Thomas, et al., (1987) Cell 51 : 503), pREP8, pSVSPORT y derivados de los mismos, y vectores de baculovirus tales como pAC373 o pAC610. Una modalidad de la invención incluye NPC1 L1 unida a la membrana. En esta modalidad, NPC1L1 se puede expresar en la membrana celular de una célula eucarionte y la proteína unida la membrana se puede aislar a partir de la célula mediante métodos convencionales los cuales se conocen en la técnica. La presente invención también incluye fusiones las cuales incluyen los polipéptidos de NPC1 L1 y los polinucleótidos de NPC1 L1 de la presente invención y una segunda porción polipeptídica o polinucleótida, la cual se puede referir como una "marca". Las fusiones de la presente invención pueden comprender cualesquiera de los polinucleótidos o polipéptidos anteriormente establecidos en el cuadro 1 o cualquier subsecuencia o fragmentos de los mismos (anteriormente discutidos). Los polipéptidos fusionados de la invención se pueden construir convenientemente, por ejemplo, mediante la inserción de un polinucleótido de la invención o fragmento del mismo dentro de un vector de expresión. Las fusiones de la invención pueden incluir marca las cuales facilitan la purificación o detección. Dichas marcas incluyen glutationa-S-transferasa (GST), marcas de hexahistidina (His6), marcas de la proteína de unión a la maltosa (MBP), marcas de hemaglutinína (HA), marcas de la proteína de unión a celulosa (CBP) y marcas myc. Las marcas detectables tales como 32P, 35S, 3H, 99mTc, 123l, 111ln, 68Ga, 18F, 125l, 131l, 113mln, 76Br, 67Ga, 99mTc, 123l, 111ln y 68Ga también se pueden utilizar para marcar los polipéptidos y polinucleótidos de la invención. Los métodos para la construcción y uso de dichas fusiones son muy convencionales y se conocen bien en la técnica. Las modificaciones (por ejemplo, modificaciones post-traduccionales) que se presentan en polipéptidos frecuentemente serán una función de cómo se elabora. Para los polipéptidos elaborados mediante la expresión de un gen clonado dentro de un hospedero, por ejemplo, la naturaleza y grado de las modificaciones, en gran parte, serán determinados por la capacidad de modificación post-traduccional de la célula hospedera y las señales de modificación presentes en la secuencia de aminoácidos del polipéptido. Por ejemplo, como se sabe bien, la glicosilación frecuentemente no se presenta en hospederos bacterianos tales como E. coli. Por consiguiente, cuando se desea la glicosilación, un polipéptido se puede expresar en un hospedero glicosilante, generalmente una célula eucarionte. Frecuentemente las células de insecto portan glicosilaciones post-traduccionales las cuales son similares a aquellas de las células de mamífero.

Por esta razón, los sistemas de expresión en células de insecto se han desarrollado para expresar, de manera eficiente, proteínas de mamífero que tienen patrones nativos de glicosilación. Una célula de insecto que se puede utilizar en esta invención es cualquier célula derivada a partir de un organismo de la clase Insecta. Preferiblemente, el insecto es Spodoptera fruigiperda (Sf9 o Sf21 ) o Trichoplusia ni (High 5). Los ejemplos de los sistemas de expresión en insecto que se pueden utilizar con la presente invención, por ejemplo para producir el polipéptido NPC1 L1 , incluyen Bac-To-Bac (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) o Gateway (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Si se desea, las enzimas para deglicosilación se pueden utilizar para remover carbohidratos unidos durante la producción en sistemas de expresión eucarionte. Otras modificaciones también pueden incluir la adición de esteres alifáticos o amidas al extremo carboxilo del polipéptido. La presente invención también incluye análogos de los polipéptidos NPC1L1 los cuales contienen modificaciones, tales como la incorporación de residuos de aminoácidos no naturales, o residuos de aminoácidos fosforilados tales como residuos de fosfotirosina, fosfoserina o fosfotreonina. Otras modificaciones potenciales incluyen sulfonación, biotinilación, o la adición de otras porciones. Por ejemplo, los polípéptidos NPC1 L1 de la invención se pueden asociar con un polímero el cual incrementa la vida media del péptido en el cuerpo de un sujeto. Los polímeros preferidos incluyen polietilenglicol (PEG) (por ejemplo, PEG con un peso molecular de 2 kDa, 5 kDa, 10 kDa, 12 kDa, 20 kDa, 30 kDa y 40 kDa), dextrán y monometoxipolietilenglicol (mPEG). Los péptidos de la invención también se pueden formar en ciclo. Específicamente, los residuos amino- y carboxi-terminales de un polipéptido NPC1 L1 o dos residuos internos de un polipéptido NPC1 L1 de la invención se pueden fusionar para crear un péptido en forma de ciclo. Los métodos para formar péptidos en ciclo son convencionales y se conocen bien en la técnica; por ejemplo, véase Gurrath, et al., (1992) Eur. J. Biochem. 210: 911-921. La presente invención contempla cualquier modificación superficial o ligera a las secuencias de aminoácidos o secuencias nucleotídicas las cuales corresponden a los polipéptidos de la invención. En particular, la presente invención contemplates variantes conservativas de la secuencia de los ácidos nucleicos los cuales codifican ios polipéptidos de la invención. Las "variantes conservativas de la secuencia" de una secuencia polinucleotídíca son aquellas en las cuales un cambio de uno o más nucleótidos en un codón dado no resulta en la alteración del aminoácido codificado en esa posición. Las variantes conservativas de la función de los polipéptidos de la invención también se contemplan por la presente invención. Las "variantes conservativas de la función" son aquellas en las cuales uno o más residuos de aminoácidos en una proteína o enzima ha sido cambiado sin alterar la conformación general y función del polipéptido, incluyendo, pero, de ninguna manera, limitado a, el reemplazo de un aminoácido con uno que tiene propiedades similares. Los aminoácidos con propiedades similares se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, los aminoácidos polares/hidrófilos los cuales pueden ser intercambiables incluyen asparagina, glutamina, serina, cisteína, treonina, lisina, arginina, histidina, ácido aspártico y ácido glutámico; aminoácidos no polares/hidrófobos los cuales pueden ser intercambiables incluyen glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, tirosina, fenilalanina, triptofano y metionina; aminoácidos, ácidos, los cuales pueden ser intercambiables incluyen ácido aspártico y ácido glutámico y aminoácidos básicos, los cuales pueden ser intercambiables incluyen histidina, lisina y arginina. La presente invención incluye polinucleótidos que codifican NPC1L1 de rata, humano o ratón y fragmentos de los mismos así como ácidos nucleicos los cuales hibridan con los polínucleótídos. Preferiblemente, los ácidos nucleicos hibridan bajo condiciones de baja severidad, más preferiblemente bajo condiciones de severidad moderada y más preferiblemente bajo condiciones de alta severidad. Una molécula de ácido nucleico es "hibridable" a otra molécula de ácido nucleico, tal como un ADNc, ADN genómico, o ARN, cuando una forma en cadena sencilla de la molécula de ácido nucleico se puede fijar a la otra molécula de ácido nucleico bajo las condiciones apropiadas de temperatura y fuerza iónica de la solución (véase Sambrook, et al., anteriormente mencionado). Las condiciones de temperatura y de fuerza iónica determinan la "severidad" de la hibridación. Las condiciones típicas para una hibridación de baja severidad son 55°C, 5X SSC, 0.1 % de SDS, 0.25% de leche, y sin formamida a 42°C; o 30% de formamida, 5X SSC, 0.5% de SDS a 42°C. Las condiciones típicas para hibridación por severidad moderada son similares a las condiciones de baja severidad excepto que la hibridación se lleva a cabo en 40% de formamida, con 5X o 6X SSC a 42°C. Las condiciones para hibridación por alta severidad son similares a las condiciones de baja severidad excepto que las condiciones de hibridación se llevan a cabo en 50% de formamida, 5X o 6X SSC y, opcionalmente, a una mayor temperatura (por ejemplo, mayor de 42°C: 57°C, 59°C, 60°C, 62°C, 63°C, 65°C o 68°C). En general, SSC es NaCI 0.15 M y citrato de Na 0.015 M. La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias, aunque, dependiendo de la severidad de la hibridación, inconsitencias entre las bases son posibles. La severidad apropiada para los ácidos nucleicos hibridables depende de la longitud de los ácidos nucleicos y del grado de complementación, variables bien conocidas en la técnica. A mayor grado de similitud o de homología entre dos secuencias nucleotídicas, mayor severidad bajo las cuales se pueden hibridar los ácidos nucleicos. Para híbridos de más de 100 nucleótidos en longitud, se han derivado ecuaciones para el cálculo de la temperatura de fusión (véase Sambrook, et al., anteriormente mencionado, 9.50-9.51 ). Para hibridación con ácidos nucleicos más cortos, por ejemplo, oligonucleótidos, la posición de las inconsistencias se vuelve más importante, y ia longitud de los oligonucleótidos determina su especificidad (véase Sambrook, et al., anteriormente mencionado). También se incluyen en la presente invención polinucleótidos que comprenden secuencias nucleotídicas y polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos las cuales son al menos aproximadamente 70% idénticas, preferiblemente al menos aproximadamente 80% idénticas, más preferiblemente al menos aproximadamente 90% idénticas y más preferiblemente al menos aproximadamente 95% idénticas (por ejemplo, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%) a las secuencias nucleotídícas de referencia de NPC1 L1 de rata (por ejemplo, cualesquiera de SEQ ID NOs: 1 ó 5-10) y secuencias de aminoácidos (por ejemplo, SEQ ID NO: 2), secuencias nucleotídicas de referencia de NPC1L1 de humano (por ejemplo, SEQ ID NO: 3) y secuencias de aminoácidos (por ejemplo, SEQ ID NO: 4) o las secuencias nucleotídicas de referencia de NPC1L1 de ratón (por ejemplo, cualesquiera de SEQ ID NOS: 11 ó 13) y secuencias de aminoácidos (por ejemplo, SEQ ID NO: 12), cuando la comparación se lleva a cabo mediante un algoritmo BLAST en donde los parámetros del algoritmo se seleccionan para producir la coincidencia más larga entre las secuencias respectivas, en comparación con la longitud total de las secuencias de referencia respectiva. También se incluyen en la presente invención los polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos las cuales son al menos aproximadamente 70% similares, preferiblemente al menos aproximadamente 80% similares, más preferiblemente al menos aproximadamente 90% similares y más preferiblemente al menos aproximadamente 95% similares (por ejemplo, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%) con respecto a la secuencia de aminoácidos de referencia de NPC1 L1 de rata de SEQ ID NO: 2, la secuencia de aminoácidos de referencia de NPC1 L1 de humano de SEQ ID NO: 4 o la secuencia de aminoácidos de referencia de NPC1 L1 de ratón de SEQ ID NO: 12, cuando la comparación se llevan a cabo con un algoritmo BLAST en donde los parámetros del algoritmo se seleccionan para producir la coincidencia más larga entre las secuencias respectivas en comparación con la longitud total de las secuencias de referencia respectivas. La identidad de secuencia se refiere a la coincidencia exacta entre los nucleótidos o aminoácidos de dos secuencias las cuales son comparadas. La similitud de secuencia se refiere tanto a las coincidencias exactas entre los aminoácidos de dos polipéptidos los cuales se comparan además de las coincidencias entre los aminoácidos no idénticos, bioquímicamente relacionados. Los aminoácidos bioquímicamente relacionados los cuales comparten propiedades similares y los cuales pueden ser intercambiables se discutieron anteriormente. Las siguientes referencias con respecto al algoritmo BLAST se incorporan en la presente invención como referencias: BLAST ALGORITHMS: Altschul, S. F., et al., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410; Gish, W., et al., (1993) Nature Genet. 3: 266-272; Madden, T. L., et al., (1996) Meth. Enzymol. 266: 131-141 ; Altschul, S. F., et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402; Zhang, J., et al., (1997) Genome Res. 7: 649-656; Wootton, J. C, et al., (1993) Comput. Chem. 17: 149-163; Hancock, J. M., et al., (1994) Comput. Appl. Biosci. 10: 67-70; ALIGNMENT SCORING SYSTEMS: Dayhoff, M. O., et al.,"A model of evolutionary change in proteins" en Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, supl. 3. M. O. Dayhoff (ed.), pp. 345- 352, Nati.

Biomed. Res. Found., Washington, DC; Schwartz, R. M., et al., "Matrices for detecting distant relationships" en Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, supl. 3. M. O. Dayhoff (ed.), pp. 353-358, Nati. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Altschul, S. F., (1991) J. Mol. Biol. 219: 555-565; States, D. J., et al., (1991) Methods 3: 66-70; Henikoff, S., et al., (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919; Altschul, S. F., et al., (1993) J. Mol. Evol. 36: 290-300; ALIGNMENT STATISTICS: Karlin, S., et al., (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268; Karlin, S., et al., (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877; Dembo, A., et al., (1994) Ann. Prob. 22: 2022-2039; y Altschul, S. F. "Evaluating the statistícal significance of múltiple distinct local alignments" en Theoretical and Computational Methods in Genome Research (S. Suhai, ed.), (1997) pp. 1-14, Plenum, New York.

Purificación de proteína Las proteínas, polipéptidos y fragmentos antigénicos de esta invención se pueden purificar mediante métodos estándares, incluyendo, pero no limitados a, precipitación con sal o alcohol, cromatografía por afinidad (por ejemplo, utilizada en conjunción con un polipéptido NPC1L1 marcados para purificación como se discutió anteriormente), la electroforesis preparativa en disco de gel, foco isoeléctrico, cromatografía líquida de alta resolución (CLAR), CLAR en fase reversa, filtración en gel, cromatografía por intercambio y partición de catión y anión, y distribución a contracorriente. Dichos métodos de purificación se conocen bien en la técnica y se describen, por ejemplo, en "Guide to Protein Purification", Methods en Enzymology. Vol. 182, M. Deutscher, Ed., 1990, Academic Press, New York, NY. Los pasos de purificación se pueden seguir por la realización de ensayos para la actividad de unión al receptor como se describe a continuación. Particularmente en donde un polipéptido NPC1 L1 se aisla a partir de una fuente celular o tejido, es preferible incluir uno o más inhibidores de enzimas proteolítícas en el sistema de ensayo, tales como fluoruro de fenilmetansulfonil (PMSF), Pefabloc SC, pepstatina, leupeptina, quimostatina y EDTA.

Moléculas de anticuerpo Los fragmentos antigénicos (incluyendo inmunogénicos) de los polipéptidos NPC1L1 de la invención se encuentran dentro del alcance de la presente invención (por ejemplo, 42 o más aminoácidos contiguos a partir de SEQ ID NO: 2, 4 ó 12). Los péptidos antigénicos pueden ser útiles, entre otras cosas, para la preparación de moléculas aisladas de anticuerpo las cuales reconocen a NPC1L1. Las moléculas aisladas de anticuerpo anti-NPC1 L1 son lígandos útiles de INPC1 L1. Un antígeno es cualquier molécula que se puede unir específicamente a un anticuerpo. Algunos antígenos no pueden inducir, por sí mismos, la producción de anticuerpo. Aquellos que pueden inducir la producción de anticuerpos son inmunógenos.

Preferiblemente, los anticuerpos anti-NPC1 L1 aislados reconocen un péptido antigénico que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de SEQ ID NOs: 39-42 (por ejemplo, un antígeno derivado a partir de NPC1L1 de rata). Más preferiblemente, el anticuerpo es A0715, A0716, A0717, A0718, A0867, A0868, A1801 o A1802. El término "molécula de anticuerpo" incluye, pero no se limita a, anticuerpos y fragmentos (preferiblemente fragmentos de unión al antígeno) de los mismos. El término incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos biespecíficos, fragmentos del anticuerpo Fab, fragmentos del anticuerpo F(ab)2, fragmentos del anticuerpo Fv (por ejemplo, H O VL), fragmentos del anticuerpo Fv de cadena sencilla y fragmentos del anticuerpo dsFv. Además, las moléculas de anticuerpo de la invención pueden ser anticuerpos completamente de humano, anticuerpos de ratón, anticuerpos de rata, anticuerpos de conejo, anticuerpos de cabra, anticuerpos de pollo, anticuerpos humanizados o anticuerpos quiméricos. Aunque no siempre es necesario, cuando los polipéptidos NPC1 L1 se utilizan como antígenos para inducir la producción de anticuerpo en un hospedero inmunológicamente competente, los fragmentos antigénicos más pequeños se vuelven inicialmente, de manera preferible, más inmunogénica mediante entrecruzamiento o concatenación, o mediante acoplamiento a una molécula vehículo inmunogénica (por ejemplo, una macromolécula tiene la propiedad de inducir de manera independiente una respuesta inmunológica en un animal hospedero, tal como toxina de difteria o de tétanos). El entrecruzamiento o la conjugación a una molécula vehículo se puede requerir debido a que los fragmentos polipeptídicos pequeños algunas veces actúan como haptenos (moléculas las cuales son capaces de unirse específicamente a un anticuerpo pero que son incapaces de inducir la producción de anticuerpo, por ejemplo, no son inmunogénicas). La conjugación de dichos fragmentos a una molécula vehículo inmunogénica los vuelve más inmunogénícos a través de lo que se conoce comúnmente como el "efecto vehículo". Las moléculas vehículo incluyen, por ejemplo, proteínas y compuestos poliméricos naturales o sintéticos tales como polipéptidos, polisacáridos, lipopolisacáridos, etc. Las moléculas vehículo de proteína se prefieren especialmente, incluyendo, pero no limitadas a, hemocíanina de lapa cerradura y proteínas de suero de mamífero tales como gammaglobulína de humano o de bovino, albúmina de suero de humano, bovino o de conejo, o derivados metilados u otras derivados de dichas proteínas. Otros vehículos de proteína serán evidentes a aquellos expertos en la técnica. Preferiblemente, el vehículo de proteína será externo al animal hospedero en el cual se inducen anticuerpos en contra de los fragmentos. El acoplamiento covalente a la molécula vehículo se puede lograr utilizando métodos bien conocidos en la técnica, la elección exacta de los cuales se puede dictar por la naturaleza de la molécula vehículo utilizada. Cuando la molécula vehículo inmunogénica es una proteína, los fragmentos de la invención se pueden acoplar, por ejemplo, utilizando carbodiimidas solubles en agua tales como diciclohexilcarbodiimida o glutaraldehído. Los agentes para acoplamiento, tales como éstos, también se pueden utilizar para entrecruzar los fragmentos a sí mismos sin el uso de una molécula vehículo separada. Dicho entrecruzamiento dentro de agregados también puede incrementar la inmunogenicidad. La inmunogenicidad también se puede incrementar mediante el uso de adyuvantes conocidos, solos o en combinación con acoplamiento o agregación. Los adyuvantes para la vacunación de animales incluyen, pero no se limitan a, Adjuvante 65 (que contiene aceite de cacahuate, monooleato de mannida y monoestearato de aluminio); adyuvante completo de Freund o adyuvante incompleto de Freund; geles minerales tales como hídróxído de aluminio, fosfato de aluminio y alumbre; agentes tensioactivos tales como hexadecilamina, octadecilamina, lisolecitina, bromuro de dimetildíoctadecilamonio, N,N-d¡octadec¡l-N',N'-bis(2-hidroximetil)propanediamina, metoxihexadecilglicerol y polioles plurónicos; polianiones tales como pirano, sulfato de dextrán, poli IC, ácido poliacrílico y carbopol; péptidos tales como muramil dipéptido, dimetilglicina y tuftsina; y emulsiones de aceite. Los polipéptidos también podrían ser administrados después de la incorporación dentro de liposomas u otros microvehículos. Se describe la información que se refiere a los adyuvantes y a los diversos aspectos de los inmunoensayos, por ejemplo, en la serie por P. Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, 3a Edición, 1987, Elsevier, New York. Otras referencias útiles que abarcan métodos para la preparación de antisuero policlonal incluyen Microbiology, 1969, Hoeber Medical División, Harper y Row; Landsteiner, Specificity of Serological Reactions, 1962, Dover Publications, New York, y Williams, et al., Methods in Immunology and Immunochemistry, Vol. 1 , 1967, Academic Press, New York. Las moléculas de anticuerpo anti-NPC1 L1 de la invención preferiblemente reconocen NPC1 L1 de humano, ratón o rata; no obstante, la presente invención incluye moléculas de anticuerpo las cuales reconocen NPC1 L1 a partir de cualesquier especies, preferiblemente mamíferos (por ejemplo, gato, oveja o caballo). La presente invención también incluye complejos que comprenden un polipéptido NPC1 L1 de la invención y una molécula de anticuerpo antí-NPC1 L1. Dichos complejos se pueden elaborar simplemente al poner en contacto la molécula de anticuerpo con su polipéptido cognado. Se pueden utilizar diversos métodos para elaborar las moléculas de anticuerpo de la invención. Los anticuerpos de humano se pueden elaborar, por ejemplo, mediante métodos los cuales son similares a aquellos descritos en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,625,126; 5,877,397; 6,255,458; 6,023,010 y 5,874,299. Las células de hibridoma las cuales producen los anticuerpos monoclonales anti-NPC1L1 se pueden producir mediante métodos los cuales se conocen comúnmente en la técnica. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, la técnica de hibridoma originalmente desarrollada por Kohler, et al., (1975) (Nature 256: 495-497), así como la técnica de trioma (Hering, et al., (1988) Biomed. Biochim. Acta. 47: 211-216 y Hagiwara, et al., (1993) Hum. Antibod. Hybridomas 4: 15), la técnica de hibridoma en célula B de humano (Kozbor, et al., (1983) Immunology Today 4: 72 y Cote, et al., (1983) Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A 80: 2026-2030), y la técnica de EBV-hibridoma (Colé, et al., en Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96, 1985). El ELISA se puede utilizar para determinar si las células de hibridoma expresan anticuerpos anti-NPC1 L1. Las moléculas de anticuerpo anti-NPC1 L1 de la presente invención también se pueden producir de manera recombinante (por ejemplo, en un sistema de expresión E. coli/T7 como se discutió anteriormente). En esta modalidad, los ácidos nucleicos que codifican las moléculas de anticuerpo de la invención (por ejemplo, VH o VL) se pueden insertar dentro de un plásmido basado en pet y expresado en el sistema de E. coli/T7. Existen varios métodos por medio de los cuales se producen anticuerpos recombinantes los cuales se conocen en la técnica. Un ejemplo de un método para la producción recombinante de anticuerpos se describe en la Patente de E.U.A. No. 4,816,567. Véase también Skerra, A., et al., (1988) Science 240: 1038-1041 ; Better, M., et al., (1988) Science 240: 1041-1043 y Bird, R. E., et al., (1988) Science 242: 423-426. El término "anticuerpo monoclonal", incluye un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, por ejemplo, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por las posibles mutaciones, que se presentan de manera natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigidos en contra de un sitio antigénico particular. Los anticuerpos monoclonales son ventajosos puesto que se pueden sintetizar mediante un cultivo de hibridoma, esencialmente no contaminado por otras inmunoglobulínas. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que se obtiene a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, y no se considera que requiera la producción del anticuerpo mediante cualquier método particular. Los anticuerpos monoclonales a ser utilizados de conformidad con la presente invención se pueden elaborar mediante el método de hibridoma como se describe por Kohler, et al., (1975) Nature 256: 495. El término "anticuerpo policlonal" incluye un anticuerpo el cual se produjo entre o en la presencia de uno o más de otros anticuerpos, no idénticos. En general, los anticuerpos policlonales se producen a partir de un B-linfocito en la presencia de otros B-linfocitos diferentes los cuales producen anticuerpos no idénticos. Típicamente, los anticuerpos policlonales se obtienen directamente a partir de un animal inmunizado (por ejemplo, un conejo). Un "anticuerpo biespecífico" comprende dos regiones diferentes de unión al antígeno las cuales se unen a diferentes antígenos. Los anticuerpos biespecíficos, así como los métodos de elaboración y uso de los anticuerpos, son convencionales y se conocen bien en la técnica. Los anticuerpos anti-idiotípicos o anti-idiotipos son anticuerpos dirigidos en contra de la región para combinación del antígeno o de la región variable (denominada el idiotipo) de otra molécula de anticuerpo. Como se describe por Jerne (Jerne, N. K., (1974) Ann. Immunol. (Paris) 125c: 373 y Jerne, N.K., et al., (1982) EMBO 1 : 234), la inmunización con una molécula de anticuerpo que expresa un paratopo (sitio para combinación del antígeno) para un antígeno dado (por ejemplo, NPC1L1 ) producirá un grupo de anti-anticuerpos, algunos de los cuales comparten, con el antígeno, una estructura complementaria al paratopo. La inmunización con una subpoblación de los anticuerpos anti-idiotípícos producirá, a su vez, una subpoblación de anticuerpos o subpoblaciones de células inmunes que son reactivas al antígeno inicial. El término "anticuerpo completamente de humano" se refiere a un anticuerpo el cual comprende solamente secuencias de ¡nmunoglobulina de humano. De manera similar, "anticuerpo de ratón" se refiere a un anticuerpo el cual comprende solamente secuencias de inmunoglobulina de ratón. "Anticuerpo quimérico de humano/ratón" se refiere a un anticuerpo el cual comprende una región variable de ratón (VH y VL) fusionada a una región constante de humano.

Los anticuerpos "humanizados" anti-NPC1 L1 también se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Las formas humanizadas de anticuerpos no de humano (por ejemplo, de murino) son inmunoglobulinas quiméricas, las cuales contienen secuencias mínimas derivadas a partir de inmunoglobulina no de humano. En la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas de humano (anticuerpo recipiente) en las cuales los residuos a partir de una región determinante de la complementariedad del recipiente están reemplazadas por residuos a partir de una región determinante de la complementariedad de una especie no de humano (anticuerpo donante), tal como ratón, rata o conejo, que tiene una especificidad, afinidad y capacidad deseada. En algunos casos, los residuos de la estructura base de Fv de la inmunoglobulina de humano también se reemplazan por los residuos correspondientes no de humano. Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena sencilla" o "sFv" incluyen los dominios VH y/o VL de un anticuerpo, en donde esto dominios están presentes en una cadena polipeptídica particular. Generalmente, el polipéptido sFv comprende adicionalmente un enlazador polipeptídico entre los dominios VH y V lo cual permite que sFv forme la estructura deseada para unión al antígeno. Las técnicas descritas para la producción de anticuerpo de cadena sencilla (Patentes de E.U.A. Nos. 5,476,786; 5,132,405 y 4,946,778) se pueden adaptar para producir anticuerpos anti-NPC1 L1 específicos, de cadena sencilla. Para una revisión de sFv véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore, eds., Springer-Verlag, N. Y., pp. 269-315 (1994). Los "fragmentos de Fv estabilizados mediante enlaces disulfuro" y "dsFv" incluyen moléculas que tienen una cadena pesada variable (VH) y/o una cadena ligera variable (VL) las cuales están asociadas mediante un enlace disulfuro. Los fragmentos de anticuerpo dentro del alcance de la presente invención también incluyen fragmentos F(ab)2 los cuales se pueden producir mediante escisión enzimática de una IgG por, por ejemplo, pepsina. Los fragmentos de Fab se pueden producir mediante, por ejemplo, reducción de F(ab)2 con ditiotreitol o mercaptoetilamina.

Un fragmento FV es una región V o V . Dependiendo de las secuencias de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas se pueden asignar a diferentes clases. Existen al menos cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG y IgM, y varias de estas se pueden dividir adicionalmente hacia subclases (¡sotipos), por ejemplo, lgG-1 , lgG-2, lgG-3 e lgG-4; lgA-1 e lgA-2. Las moléculas de anticuerpo anti-NPCIL1 de la invención también se pueden conjugar a una porción química. La porción química puede ser, entre otras, un polímero, un radionúclido o un factor citotóxico. Preferiblemente, la porción química es un polímero el cual incrementa la vida media de la molécula de anticuerpo en el cuerpo de un sujeto. Los polímeros adecuados incluyen, pero por ningún medio se limitan a, polietilenglicol (PEG) (por ejemplo, PEG con un peso molecular de 2 kDa, 5 kDa, 10 kDa, 12 kDa, 20 kDa, 30 kDa o 40 kDa), dextrán y monometoxipolietilenglícol (mPEG). Los métodos para la producción de anticuerpos anti-IL8 PEGilados los cuales se describen en la Patente de E.U.A. No. 6,133,426 se pueden aplicar a la producción de anticuerpos anti-NPC1 L1 PEGílados de la invención. Lee, et al., (1999) (Bioconj. Chem. 10: 973-981 ) describen anticuerpos de cadena sencilla conjugados a PEG. Wen, et al., (2001) (Bioconj. Chem. 12: 545-553) describen anticuerpos conjugados con PEG los cuales están unidos a un quelante de radiometal (ácido dietilentriaminpentaacético (DTPA)). Las moléculas de anticuerpo de la invención también se pueden acoplar con marcas tales como 99Tc, 90Y, 111ln, 32P, 14C, 125l, 3H, 131l, 11C, 150, 13N ) 18Fj 35S_ 51C.. 57T?) 226^ 60^ 59^ 57^ 152^ 67^ 217^ 211^ 212pb) 47Sc, 109Pd, 234Th, 40K, 157Gd, 55Mn, 52Tr o 56Fe. Las moléculas de anticuerpo de la invención también se pueden conjugar con marcas fluorescentes o quimioluminiscentes, incluyendo fluoróforos tales como quelantes de tierras raras, fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, isotiocianato, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaladehído, fluorescamina, 152Eu, dansilo, umbeliferona, luciferina, marca de luminal, marca de isoluminal, una marca de éster aromático de acridinio, una marca de ¡midazol, una marca de sal de acridimio, una marca de éster de oxalato, una marca de acuorina, 2,3- dihidroftalazinedionas, biotína/avidina, marcas de giro y radicales libres estables. Las moléculas de anticuerpo también se pueden conjugar a un factor citotóxíco tal como toxina de difteria, cadena A de la exotoxina de Pseudomonas aeruginosa, cadena A de la ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas y compuestos de Aleurites fordii (por ejemplo, ácidos grasos), proteínas de diantina, las proteínas de Phytolacca americana PAPI, PAPII, y PAP-S, inhibidor de la momordica charantia, curcína, crotina, inhibidor de la saponaria officinalis, mitogelina, restrictocina, fenomicina, y enomicina. Se puede emplear cualquier método conocido en la técnica para la conjugación de las moléculas de anticuerpo de la invención a las diversas porciones, incluyendo aquellos métodos descritos por Hunter, et al., (1962) Nature 144: 945; David, et al., (1974) Biochemistry 13: 1014; Pain, et al., (1981 ) J. Immunol. Meth. 40: 219; y Nygren, J., (1982) Histochem. and Cytochem. 30: 407. Los métodos para la conjugación de anticuerpos son convencionales y se conocen bien en la técnica.

Ensayos de selección La invención permite la identificación de ligandos selectivos de NPC1 L1 (por ejemplo, SEQ ID NO: 2, 4 ó 12) que pueden ser útiles en el tratamiento y manejo de una variedad de condiciones médicas, incluyendo esterol elevado en suero (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol. Por lo tanto, NPC1 L1 de esta invención se puede emplear en sistemas de selección para identificar ligandos. Estos ligandos pueden ser agonistas o antagonistas de NPC1 L1. Esencialmente, estos ensayos proveen métodos para ia identificación de ligandos de NPC1 L1 mediante el uso de (1) NPC1 L1 , (2) un ligando NPC1 L1 conocido apropiado, agonista o antagonista, por ejemplo, un esterol (tales como colesterol, fitoesteroles, incluyendo, pero no limitados a, sitoesterol, campesterol, estigmasterol y avenosterol), un producto de oxidación del colesterol, un 5a-estanol (incluyendo, pero no limitados a, colestanol, 5a-campestanol y 5a-sitoestanol), una azetidinona sustituida (por ejemplo, ezetimiba), BODIPY-ezetimiba (Altmann, et al., (2002) Biochim. Biophys. Acta 1580 (1 ): 77-93) o 4",6"-bis[(2-fluorofenil)carbamoil]-beta-D-celobiosil derivado de 11-cetotigogenina como se describe en DeNinno, et al., (1997) (J. Med. Chem. 40 (16): 2547-54) o una azetidinona sustituida, y (3) una muestra a ser evaluada para la presencia de un ligando candidato de NPG1 L1. El término "específico" cuando se utiliza para describir la unión de, por ejemplo, un ligando de NPC1 L1 en un ensayo de selección es un término de la técnica el cual se refiere al grado por medio del cual el ligando o antagonista (por ejemplo, azetidinona sustituida, ezetimiba, esterol (tal como colesterol) o 5a-estanol) se une preferencialmente a NPC1 L1 en comparación con otras proteínas en el sistema de ensayo. Por ejemplo, la detección de la unión específica de un ligando de NPC1 L1 que se une específicamente a NPC1 L1 es evidente cuando se genera una señal en el ensayo para indicar que dicha unión excede, en cualquier grado, una señal generada en un control negativo en donde, por ejemplo, NPC1L1 o el ligando está ausente. Además, "la unión específica" incluye la unión de un ligando ya sea directamente a NPC1 L1 o indirectamente, por ejemplo vía otra porción, en un complejo del cual NPC1 L1 es una parte. La porción a la cual se une un ligando de NPC1 L1 puede ser otra proteína o una modificación post-traduccional de NPC1 L1 (por ejemplo, una cadena lipídica o una cadena de carbohidrato). Los ejemplos no limitantes de azetidinonas sustituidas adecuadas para uso en los ensayos de selección incluyen aquellas descritas en las Patentes de E.U.A. Nos. RE37.721 ; 5,631 ,365; 5,767,115; 5,846,966; 5,688,990; 5,656,624; 5,624,920; 5,698,548; 5,756,470; 5,688,787; 5,306,817; 5,633,246; 5,627,176; 5,688,785; 5,744,467; 5,846,966; 5,728,827; 6,632,933 y Solicitud de Patente de E.U.A. No. de Publicación 2003/0105028 - cada una de las cuales se incorpora en la presente invención como referencia en su totalidad. La presente invención provee un método por medio del cual se evalúa si una muestra contiene un ligando de NPC1L1 mediante la determinación de si la muestra contiene un compuesto candidato el cual compite para la unión entre el ligando conocido (por ejemplo, ezetimiba, ezetimiba-glucurónido, compuesto 2, etc.) y NPC1L1. El ligando puede ser un agonista o antagonista. En una modalidad de la invención, se altera la unión del ligando conocido (por ejemplo, ezetimiba, ezetimiba-glucurónido, compuesto 2, etc.) a NPC1 L1. El término "ligando conocido" se refiere a un compuesto el cual se sabe que se une a NPC1L1 y el cual puede estar marcado de manera detectable para uso en los ensayos de selección y métodos descritos en la presente invención. Los "ligandos conocidos" incluyen los 2-azetidinona sustituida glucurónidos los cuales pueden estar marcados de manera detectable para uso en los ensayos de selección como se describe en la presente invención. La ezetimiba se puede preparar mediante una variedad de métodos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica, por ejemplo tales como los descritos en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,631 ,365, 5,767,115, 5,846,966, 6,207,822, Solicitud de Patente de E.U.A. No. de Publicación 2002/0193607 y Solicitud de Patente PCT WO 93/02048, cada una de las cuales se incorpora en la presente invención como referencia en su totalidad. "Muestra", "compuesto candidato" o "sustancia candidato" se refiere a un compuesto o composición la cual se evalúa en una prueba o ensayo, por ejemplo, para la capacidad de unirse a NPC1 L1 (por ejemplo, SEQ ID NO: 2, 4 ó 12) o un fragmento funcional de la misma. La composición puede comprender compuestos candidatos, tales como moléculas pequeñas, péptidos, nucleótidos, polinucleótidos, partículas subatómicas (por ejemplo, partículas a, partículas ß) o anticuerpos. La presente invención provee métodos para la identificación de ligandos de un compuesto que se une a NPC1 L1 ios cuales incluyen poner en contacto NPC1L1 con una 2-azetidinona sustituida marcada de manera detectable, preferiblemente 2-azetidinona-glucurónido sustituido, y un compuesto candidato, y determinar si el compuesto candidato se une a NPC1L1, en donde la unión de dicho compuesto candidato a NPC1L1 modula la unión de la 2-azetidinona sustituida marcada de manera detectable a NPC1L1. La modulación de la unión de la 2-azetidinona sustituida a NPC1 L1 por la unión del compuesto candidato a NPC1 L1 indica que el compuesto candidato es un ligando que se une a NPC1 L1. También es una buena indicación de que el compuesto candidato puede ser un inhibitor de la absorción del esterol y 5a-estanol in vivo. La presente invención también provee un método para identificar un ligando de NPC1L1 que comprende poner en contacto NPC1 L1 con una 2-azetidinona sustituida marcada de manera detectable, preferiblemente 2-azetídinona-glucurónido sustituido, y midiendo la unión de NPC1 L1 de la 2-azetidinona sustituida marcada de manera detectable en la presencia y ausencia de un compuesto candidato, en donde la unión disminuida de la 2-azetidinona sustituida marcada de manera detectable a la NPC1 L1 en la presencia del compuesto candidato indica que dicho compuesto candidato es un ligando de NPC1L1 y es un inhibidor de la absorción del esterol y 5a-estanol. La 2-azetidinona sustituida se marca de manera detectable con 3H, 35S, 125l, o una 2-azetidinona sustituida marcada de manera fluorescente. Preferiblemente, la 2-azetidinona sustituida se marca con 35S o 125l, y particularmente 35S.

Preferiblemente, la 2-azetidinona sustituida es 2-azetidinona sustituida-glucurónido. Los compuestos que son 2-azetidinona-glucurónidos sustituidos son aquellos que tienen la siguiente estructura (I): (i) en donde X1 representa un grupo que une el glucurónido al anillo 4-fenilo, por ejemplo pero no limitado a -O- o -alquilo de C1-3-, X2 representa un alcanediilo opcionalmente sustituido, y en donde cualquiera de los grupos fenilo puede estar opcionalmente sustituido. Los ejemplos de la porción fenil-X2- en la estructura (I) incluyen aquellos representados en la posición 4 en la estructura de 2-azetidinona que se muestra a continuación en la estructura (II). Los ejemplos adicionales de 2-azetidinona-glucurónidos sustituidos incluyen pero no se limitan a aquellos descritos en la Patente de E.U.A. No. 5,756,470, WO 02/066464 y US 2002/0137689. Los ejemplos adicionales de los compuestos 2-azetidinona-glucurónido sustituidos incluyen aquellos que tienen la estructura (II) y sales y esteres farmacéuticamente aceptables de los mismos como sigue: AÍ' --<X?t. ( (ID en donde: Ar1 se selecciona a partir del grupo que consiste de arilo y arilo R4 sustituido; X, Y y Z se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste de -CH2-, -CH(alquilo de C1-6)- y -C(alquílo de C?-6)2-; R se selecciona a partir del grupo que consiste de -OR6, -0(CO)R6, -0(CO)OR9, -0(CO)NR6R7, un residuo de azúcar, un residuo de diazúcar, un residuo de triazúcar y un residuo de tetra-azúcar; R1 se selecciona a partir del grupo que consiste de -H, -alquilo de C-?-6 y arilo, o R y R1 juntos son oxo; R2 se selecciona a partir del grupo que consiste de -OR6, -0(CO)R6, -0(CO)OR9 y -0(CO)NR6R7; R3 se selecciona a partir del grupo que consiste de -H, -alquilo de C1-6 y arilo o R2 y R3 juntos son oxo; q, r y t se seleccionan cada uno independientemente a partir de 0 y i ; m, n y p se seleccionan cada uno independientemente a partir de 0, 1 , 2, 3 y 4; R4 es 1-5 sustituyentes independientemente seleccionados cada vez que se presentan a partir del grupo que consiste de: -OR5, -0(CO)R5, -0(CO)OR8, -O-alquilo de C1-5-OR5, -0(CO)NR5R6, -NR5R6, -NR5(CO)R6, -NR5(CO)OR8, -NR5(CO)NR6R7, -NR5S02R8, -COOR5, -CONR5R6, -COR5, -S02NR5R6, -S(0)tR8, -O-alquilo de d.io-COOR5, -O-alquilo de C?-?0-CONR5R6 y fluoro; R5, R6 y R7 se seleccionan independientemente cada vez que representan a partir del grupo que consiste de -H, alquilo de C1-6, arilo y alquilo de C -6 arilo-sustituido; R8 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste de alquilo de C-?-6, arilo y alquilo de C-?-6 arilo-sustituido; R9 se selecciona a partir del grupo que consiste de -C=C-CH2-NR10R11, -C=C-C(0)R13, y -(CH2)3-NR10R14; R10 se selecciona independientemente cada vez que representa a partir de -H y -alquilo de C-?_3; R11 se selecciona a partir del grupo que consiste de -H, - alquilo de C1-3, -C(0)-alquilo de C1-3, -C(O)-NR10R10, -S02-alquilo de C?-3, y -S02-fenilo; y R12 se selecciona a partir de OH OH (referido en la presente invención (referido en la presente invención como "glucurón ido") corno "meti l éster glucurónido"); R »13 se selecciona a partir del grupo que consiste de -OH y - R14 se selecciona a partir del grupo que consiste de -C(0)-alquilo de C1-3, -C(O)-NR10R10, -S02-alquilo de C1-3 y -S02-feniIo. En una modalidad de fórmula II se encuentran los compuestos en donde q, r y t se seleccionan cada uno independientemente a partir de 0 y 1 ; y m, n y p se seleccionan cada uno independientemente a partir de 0, 1 , 2, 3 y 4; con la condición de que al menos uno de q y r es 1 , y la suma de m, n, p, q y r es 1 , 2, 3, 4, 5 ó 6; y con la condición de que cuando p es 0 y r es 1 , la suma de m, q y n es 1 , 2, 3, 4, ó 5. En una segunda modalidad de fórmula II se encuentran los compuestos de fórmula lia, En una clase de cada una de estas modalidades se encuentran los compuestos en donde R9 es -C=C-CH2-NR10R11. En otra clase de cada una de estas modalidades se encuentran los compuestos en donde R9 contiene un grupo -S02-, por ejemplo, en donde R9 se selecciona a partir del grupo que consiste de -C=C-CH2-NR10R11, -C=C-C(O)NR10R11, -(CH2)3-NR10-S02-alquilo de C?-3 y -(CH2)3-NR10-SO2-fenilo, y R11 se selecciona a partir de -S02-alquilo de C?_3, y -S02-fenilo. El término "alquilo" se pretende que incluya tanto grupos hidrocarburo univalentes alifáticos saturados de cadena ramificada como grupos hidrocarburo univalentes alifáticos saturados de cadena recta que tienen el número especificado de átomos de carbono. Los ejemplos de grupos alquilo incluyen, pero no se limitan a, metilo (Me), etilo (Et), n-propilo (Pr), n-butilo (Bu), n-pentilo, n-hexilo, y los isómeros de los mismos tales como isopropilo (i-Pr), isobutilo (i-Bu), secbutilo (s-Bu), ter-butilo (t-Bu), isopentilo, isohexilo y los similares. Si no existe un prefijo especificado (tales como "n-" para normal, "s-" para segundo, "t-" para ter, "i-" para iso) con un grupo alquilo denominado, estonces se pretende que el grupo alquilo denominado sea un grupo n-alquilo (por ejemplo, "propilo" es "n-propilo"). Se pretende que el término "arilo" incluya fenilo (Ph), naftilo, indenilo, tetrahidronaftilo o indanilo. Se prefiere el fenilo. Los grupos protectores adecuados (designados como "PG" en la presente invención) para los grupos hidroxilo de R12 cuando R12 es un glucurónido o metil éster glucurónido incluyen pero no se limitan a aquellos que se sabe que son útiles como grupos protectores del carbohidrato, tales como por ejemplo bencilo, acetilo, benzoilo, ter-butilodifenilsililo, trimetilsililo, para-metoxibenzilo, bencilídina, y metoxi metilo. Las condiciones requeridas para añadir y remover selectivamente dichos grupos protectores se encuentran en los libros de texto estándar tal como Greene, T, y Wuts, P. G. M., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, 1999. Los compuestos de fórmula II pueden contener uno o más centros asimétricos y por lo tanto se pueden presentar como racematos y mezclas racémicas, enantiómeros particulares, mezclas enantíoméricas, mezclas diaestereoméricas y diaestereómeros individuales, y todas esas formas isoméricas se encuentran dentro del alcance de la fórmula II. Los isótopos radiactivos de los compuestos de fórmula II son particularmente útiles en dichos ensayos, por ejemplo compuestos de fórmula II en donde el azufre se reemplaza con -35S-"caliente", y particularmente en donde el isótopo de azufre radiactivo se incorpora dentro de la porción R9. El uso de todos esos isótopos radiactivos de los compuestos de fórmula II en un ensayo para identificar los ligandos de NPC1 L1 se incluye dentro del alcance de esta invención. El término "sales farmacéuticamente aceptables" significa sales no tóxicas de los compuestos de fórmula II las cuales se preparan generalmente mediante la reacción del ácido libre con una base orgánica o inorgánica adecuada, particularmente aquellas formadas con cationes tales como sodio, potasio, aluminio, calcio, litio, magnesio, zinc y tetrametilamonio, así como aquellas sales formadas a partir de aminas tales como amonio, etílendiamina, N-metílglucamina, lisina, arginina, ornitina, colina, N,N'-dibenciletilendiamina, cloroprocaína, dietanolamina, procaína, N-bencilfenetilamina, 1 -p-clorobencil-2-pirrolidina-1 '-il-metilbencimidazol, dietilamina, piperazina, morfolina, 2,4,4-trimetil-2-pentamina y tris(hidroximetil)aminometano. Cuando los compuestos de fórmula II son básicos, las sales se pueden preparar a partir de ácidos no tóxicos farmacéuticamente aceptables, incluyendo ácidos inorgánicos y orgánicos. Dichos ácidos incluyen ácido acético, bencensulfónico, benzoico, camforsulfónico, cítrico, etansulfónico, fumárico, glucónico, glutámico, bromhídrico, clorhídrico, isetiónico, láctico, maléico, málico, mandélico, metansulfónico, múcico, nítrico, pamóico, pantoténico, fosfórico, succínico, sulfúrico, tartárico, p-toluensulfónico, y los similares. Particularmente preferidos son los ácidos cítrico, bromhídrico, clorhídrico, maléico, fosfórico, sulfúrico, y tartárico. Los ejemplos de esteres farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, -alquilo de C?- y -alquilo de C?-4 sustituido con fenilo, dimetilamino y acetilamíno. "Alquilo de C?- " en la presente invención incluye cadenas alifáticas rectas o ramificadas que contienen de 1 a 4 átomos de carbono, por ejemplo metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, ¡so-propilo, sec-butilo y ter-butilo.

Los compuestos de fórmula estructural II se pueden preparar de conformidad con los procedimientos del siguiente esquema utilizando materiales apropiados, y se ejemplifican adicionalmente por los ejemplos específicos a continuación. Se puede emplear una variedad de técnicas cromatográficas en la preparación de los compuestos de fórmula II. Estas técnicas incluyen, pero no se limitan a: cromatografía líquida de alta resolución (incluyendo cromatografía normal reversa y cromatografía en fase quiral); cromatografía fluida súper crítica; cromatografía preparativa en capa fina; cromatografía instantánea con gel de sílice o cromatografía en fase reversa con gel de sílice; cromatografía de intercambio iónico; y cromatografía radial. Todas las temperaturas son en grados Celsius a menos que se mencione de otra manera. Algunas abreviaturas utilizadas en la presente invención incluyen: Ac Acilo (CH3C(0)-) Bn bencilo cale. Calculado Celíte tierra diatomácea Celite™ Dess-Martin Periodinano 1 ,1 ,1-tris(acetiloxi)-1 ,1-dihidro-1,2- benzodoxol-3-(1 H)-ona DMF N,N-dimetilformamída equiv. Equivalente(s) ES-MS Espectroscopia de masa iónica por electroaspersión EtOAc acetato de etilo h Hora(s) HPLC cromatografía líquida de alta resolución min Minuto(s) m.p. Punto de fusión MS espectro de masas r. t. (o rt) temperatura ambiente TFA ácido trifluoro acético THF Tetrahidrofurano Tic cromatografía en capa fina El esquema general a continuación ilustra un método para la síntesis de compuestos de fórmula estructural 11-4. Todos los sustituyentes son como se definen en la fórmula II a menos que se indique de otra manera. En este método, 11-1 se trató con una alquina terminal de tipo II-2 en la presencia de un catalizador de paladio tal como tetrakis trifenilfosfina paladio (0) o [1 , -bis(difenílfosf¡no)ferroceno]dicloropaladio (II) o los similares, y yoduro de cobre (I). La reacción usualmente se lleva a cabo en un solvente orgánico inerte tal como DMF, entre temperatura ambiente y 100°C, por un período de 6-48 horas, y el producto es una alquina interna de fórmula estructural II-3. La alquina II-2 puede contener un átomo radiactivo tal como 35S para proveer el aducto radiomarcado correspondiente después de la reacción con 11-1. La conversión de II-3 hacia II-4 se puede lograr utilizando una variedad de métodos hidrolíticos conocidos por aquellos expertos en la técnica de síntesis orgánica. Por ejemplo, un protocolo de hidrólisis particularmente suave incluye el tratamiento de II-3 con una base amina terciaria tal como trietilamina, o diisopropiletilamina o los similares, en un sistema de solvente mezclado que comprende metanol y agua. El producto de la reacción es un compuesto de fórmula estructural II-4. Mediante la utilización de los procedimientos descritos en la presente invención, un experto en la técnica puede preparar fácilmente compuestos adicionales de fórmula II.

ESQUEMA Dos tipos adicionales de sistemas de selección que se pueden utilizar incluyen un ensayo de unión del ligando marcado (por ejemplo, ensayo de unión directa o ensayo de centelleo por proximidad (SPA)) y un ensayo de "toma de esterol (por ejemplo, colesterol) o 5ct-estanol". Un ligando marcado, para uso en el ensayo de unión, se puede obtener mediante el marcado de un esterol (por ejemplo, colesterol) o un 5 -estanol o un agonista o antagonista conocido de NPC1 L1 con un grupo mensurable (por ejemplo, 35S, 125l o 3H). Diversas formas marcadas de esteróles (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanoles están comercialmente disponibles o se pueden generar utilizando técnicas estándares (por ejemplo, colesterol-[1 ,2-3H(N)], colesterol-[1 ,2,6,7-3H (N)] o colesterol-[7-3H(N)]; American Radiolabeled Chemicals, Inc; St. Louis, MO). En una modalidad preferida, la ezetimiba está marcada de manera fluorescente con un grupo BODIPY (Altmann, et al., (2002) Biochim. Biophys. Acta 1580 (1 ): 77-93) o está marcada con un grupo detectable tal como 35S, 125l o 3H, preferiblemente 35S.

Ensayo de unión directa. Típicamente, una cantidad dada de NPC1 L1 de la invención (por ejemplo, SEQ ID NO: 2, 4 ó 12) o un complejo que incluye NPC1 L1 se pone en contacto con cantidades en incremento de un ligando marcado o un antagonista o agonista conocido (anteriormente discutido) y se mide la cantidad del ligando unido, marcado o el antagonista o agonista conocido después de la remoción del ligando no unido, marcado o del antagonista o agonista conocido mediante lavado. Conforme se incrementa la cantidad del ligando marcado o de agonista o antagonista conocido, eventualmente se alcanza un punto en el cual todos los sitios para unión al receptor están ocupados o saturados. La unión específica al receptor del ligando marcado o del agonista o antagonista conocido se elimina mediante un gran exceso de ligando no marcado o agonista o antagonista conocido. Preferiblemente, se utiliza un sistema de ensayo en el cual la unión no específica del ligando marcado o antagonista o agonista conocido al receptor es mínima. La unión no específica típicamente es menor del 50%, preferiblemente menor del 15%, más preferiblemente menor del 10%, y más preferiblemente de 5% o menor, con respecto a la unión total del ligando marcado o antagonista o agonista conocido. En el ensayo de unión básico, el método para la identificación de un ligando NPC1 L1 , agonista o antagonista incluye: (a) poner en contacto NPC1 L1 (por ejemplo, SEQ ID NO: 2 ó 4 ó 12), un fragmento de! mismo o un complejo que incluye NPC1L1 , en la presencia de una cantidad conocida de esterol marcado (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol o antagonista o agonista conocido (por ejemplo, ezetimiba marcada) con una muestra a ser evaluada para la presencia de un ligando NPC1 L1 , agonista o antagonista; y (b) medir la cantidad de esterol marcado (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol o antagonista o agonista conocido directamente o indirectamente unido a NPC1 L1. Un ligando NPC1 L1 en la muestra se identifica mediante la medición de la unión directa o indirecta sustancialmente reducida del esterol marcado (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol o antagonista o agonista conocido a NPC1L1 , en comparación con lo que se podría medir en la ausencia de dicho ligando. Por ejemplo, unión directa o indirecta reducida entre [3H]-colesterol y NPC1L1 en la presencia de una muestra puede sugerir que la muestra contiene una sustancia la cual compite en contra de [3H]-colesterol para la unión a NPC1L1. Este ensayo puede incluir un experimento control que carece de cualquier unión dependiente del ligando NPC1L1 (por ejemplo, esterol tales como colesterol o 5a-estanol). En este ensayo, por ejemplo, una célula completa o una membrana celular que carece de cualquier NPC1 L1 funcional, por ejemplo, una célula o membrana aislada o derivada a partir de un ratón NPC1 L1 mutante transgénico de la invención, se ensaya para unión al ligando. Cuando se selecciona una muestra para la presencia de un antagonista NPC1 L1 , es útil comparar el nivel de unión observada en la presencia de una muestra a ser evaluada con aquella de un experimento control, como se describe en la presente invención, la cual carece completamente de la unión dependiente de NPC1L1. Idealmente, aunque de ninguna forma necesariamente, el nivel de unión observado en la presencia de una muestra que contiene un antagonista será similar a aquel del experimento control. Alternativamente, una muestra se puede evaluar directamente para la unión a NPC1 L1 (por ejemplo, SEQ ID NO: 2, 4 ó 12). Un ensayo básico de este tipo puede incluir los siguientes pasos: (a) poner en contacto NPC1 L1 (por ejemplo, SEQ ID NO: 2 ó 4 ó 12), un fragmento de la misma o un complejo que incluye NPC1 L1 con un compuesto candidato marcado (por ejemplo, [3H]-ezetimiba); y (b) detectar la unión directa o indirecta entre el compuesto candidato marcado y NPC1 L1. De nuevo, este experimento se puede llevar a cabo junto con un experimento control en donde la unión dependiente de NPC1L1 está completamente ausente. Por ejemplo, el ensayo se puede llevar a cabo utilizando una célula completa o una membrana celular que carece de cualquier NPC1L1 funcional (por ejemplo, célula o membrana celular derivada a partir de un ratón npcI H" transgénico, mutante como se describe en la presente invención). Un compuesto candidato el cual se encuentra que se une a NPC1 L1 puede funcionar como un ligando, agonista o antagonista de NPC1L1 (por ejemplo, mediante la inhibición de la toma del esterol (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol).

En una modalidad de la invención, el compuesto candidato unido se cuantifica después de la filtración utilizando filtros de fibra de vidrio. En un aspecto de esta modalidad, el compuesto candidato unido se detecta después de filtración al vacío en un tubo particular de filtros de fibra de vidrio GF/C obtenidos a partir de Whatman. Los filtros se pueden pretratar al sumergirlos en 0.5% de polietilenimina para reducir la unión no especifica. La filtración se logra mediante la adición de regulador de pH enfriado con hielo al tubo de ensayo, vertiendo la mezcla a través del filtro, y luego enjuagando el tubo y el filtro dos veces más con un regulador de pH adicional. El regulador de pH puede ser un regulador de pH Tris o regulador de pH MES (NaCI 120 mM, 0.1 % de colato de sodio, y MES 20 mM a pH 6.70). Los filtros se pueden contar utilizando fluido para centelleo, por ejemplo, Packard DM líquido o Packard Ultima Gold MV. Alternativamente, la filtración al vacío de la muestra en una placa Millipore de 96 pozos (Whatman GF/C) también se puede utilizar para lograr una precisión adecuada de manera bien conocida por aquellos expertos en la técnica.

Ensayo SPA. Los ligandos NPC1 L1 también se pueden medir utilizando ensayos de centelleo por proximidad (SPA). Los ensayos SPA son convencionales y se conocen bien en la técnica; véase, por ejemplo, la Patente de E.U.A. No. 4,568,649. En SPA, el blanco de interés se inmoviliza a una microesfera pequeña de aproximadamente 5 mieras en diámetro. La microesfera, típicamente, incluye un núcleo sólido para centelleo el cual ha sido revestido con una película de polihidroxi, la cual a su vez contiene moléculas para acoplamiento, las cuales permiten la formación de enlaces genéricos para el diseño del ensayo. Cuando una molécula marcada con un radioisótopo se une a la microesfera, el radioisótopo se lleva a proximidad cercana con el elemento para centelleo y la transferencia de energía efectiva a partir de los electrones que se emite por el isótopo tomará lugar resultando en la emisión de luz. Mientras que el radioisótopo permanece libre en la solución, se encuentra demasiado lejos del elemento para centelleo y el electrón disipará la energía hacia el medio acuoso y por lo tanto permanece sin ser detectado. El elemento para centelleo se puede detectar con un contador para centelleo. En general, las marcas de 3H, 125l y 35S son adecuadas para SPA. Para el ensayo de eventos de unión mediados por el receptor, la aglutinina de la lectina del germen de trigo (WGA) se puede utilizar como la molécula para acoplamiento al lecho de SPA (Amersham Biosciences; Piscataway, NJ). El lecho acoplado a WGA captura las membranas celulares glicosiladas y glicoproteínas y se ha utilizado para una amplia variedad de fuentes del receptor y membrana de célula cultivada. El receptor se inmoviliza sobre el lecho de WGA-SPA y se genera una señal después de la unión de un ligando marcado con un isótopo. Otras moléculas para acoplamiento las cuales pueden ser útiles para los ensayos SPA para unión al receptor incluyen poli-L-lisina y WGA/polietileneimina (Amersham Biosciences; Piscataway, NJ).

Véase, por ejemplo, Berry, J. A., et al., (1991 ) Cardiovascular Pharmacol. 17 (Supl. 7): S143-S145; Hoffman, R., et al., (1992) Anal. Biochem. 203: 70-75; Kienhus, et al., (1992) J. Receptor Research 12: 389-399; Ping, S., et al., (1992) Neuron 9: 1067-1079. El elemento para centelleo contenido en los glóbulos de SPA puede incluir, por ejemplo, silicato de itrio (YSi), óxido de itrio (YOx), difeníloxazol o poliviniltolueno (PVT) el cual actúa como solvente sólido para la difenilantracina (DPA). El ensayo de SPA se puede utilizar para analizar si una muestra contiene un ligando NPC1 L1. En estos ensayos, una célula hospedera la cual expresa NPC1L1 (por ejemplo, SEQ ID NO: 2 ó 4 ó 12) sobre la superficie celular o una fracción de membrana de la misma se incuba con y se captura mediante glóbulos de SPA (por ejemplo, glóbulos de YOx revestidos con WGA o glóbulos de YSi revestidos con WGA). Los glóbulos que contienen la NPC1 L1 se incuba con el ligando marcado, conocido o agonista o antagonista (por ejemplo, 3H-colesterol, 3H-ezetimiba, 125l-ezetimíba o un análogo de 35S-ezetimiba). La mezcla de ensayo incluye adicionalmente cualquier muestra a ser evaluada o un blanco (por ejemplo, agua). Después de una incubación opcional, se mide el centelleo utilizando un contador para centelleo. Un ligando NPC1L1 , agonista o antagonista se puede identificar en la muestra mediante la medición de las fluorescencia sustancialmente reducida, en comparación con lo que se podría medir en la ausencia de dicho ligando, agonista o antagonista (blanco). La medición de la secuencia sustancialmente reducida puede sugerir que la muestra contiene una sustancia la cual compite para la unión directa o indirecta a NPC1L1 con el ligando conocido, agonista o antagonista. Alternativamente, se puede identificar una muestra como un ligando de NPC1 L1 mediante la detección directa de la unión en el ensayo de SPA. En este ensayo, una versión marcada del compuesto candidato a ser evaluado se puede colocar en contacto con la célula hospedera que expresa NPC1L1 o una fracción membranal de la misma la cual se une a glóbulos de SPA. La fluorescencia se puede ensayar entonces para detectar la presencia de un complejo entre el compuesto candidato marcado y la célula hospedera o fracción membranal que expresa NPC1 L1 o un complejo que incluye NPC1 L1. Un compuesto candidato el cual se une directamente o indirectamente a NPC1 L1 puede poseer actividad agonista o antagonista a NPC1 L1. Los ensayos SPA también se pueden llevar a cabo junto con un experimento control que carece de cualquier unión dependiente de NPC1 L1. El experimento control se puede llevar a cabo, por ejemplo, con una célula o membrana celular que carece de cualquier NPC1L1 funcional (por ejemplo, célula o membrana celular derivada a partir de un ratón npcHT transgénico, mutante como se describió en la presente invención). Cuando se lleva a cabo el experimento control, el nivel de unión observado en la presencia de la muestra a ser tratada para la presencia de un antagonista se puede comparar con aquel observado en el experimento control.

Ensayo de toma de esterol/5a-estanol. Los ensayos también se pueden llevar a cabo para determinar si una muestra puede agonizar o antagonizar la toma de esterol (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol mediada por NPC1 L1. En estos ensayos, se puede poner en contacto una célula hospedera que expresa NPC1 L1 (por ejemplo, SEQ ID NO: 2 ó 4 ó 12) sobre la superficie celular (anteriormente discutido) con esterol (por ejemplo, 3H-colesterol o 125l-colesterol)) o 5a-estanol marcado de manera detectable junto con ya sea una muestra o un blanco. Después de una incubación opcional, las células se pueden lavar para remover esterol o 5a-estanol no absorbido. La toma de esterol o 5 -estanol se puede determinar mediante la detección de la presencia del esterol o 5a-estanol marcado en las células hospederas. Por ejemplo, las células ensayadas o usadas o fracciones de las mismas (por ejemplo, fracciones resueltas mediante cromatografía en capa fina) se pueden poner en contacto con un elemento para centelleo líquido y el centelleo se puede medir utilizando un contador para centelleo. En estos ensayos, un antagonista de NPC1L1 en la muestra se puede identificar mediante la medición de la toma sustancialmente reducida de esterol marcado (por ejemplo, 3H-colesterol) o 5a-estanol, en comparación con lo que se podrían medir en la ausencia de dicho antagonista y un agonista se puede identificar mediante la medición de la toma sustancialmente incrementada del esterol marcado (por ejemplo, 3H-colesterol) o 5a-estanol, en comparación con lo que se podría medir en la ausencia de dicho agonista .

Los ensayos de toma también se pueden llevar a cabo junto con un experimento control que carece de cualquier toma dependiente de NPC1L1. El experimento control se puede llevar a cabo, por ejemplo, con una célula que carece de cualquier NPC1 L1 funcional (por ejemplo, célula derivada a partir de un ratón npcH1" transgénico, mutante como se describió en la presente invención). Cuando se lleva a cabo el experimento control, el nivel de toma observado en la presencia de la muestra que se evalúa para la presencia de un antagonista se puede comparar con aquel observado en el experimento control.

Fuente de NPC1L1. En principio, se podría llevar a cabo un ensayo de unión de la invención utilizando un polipéptido NPC1L1 soluble de la invención, por ejemplo, después de la producción y replegamiento mediante métodos estándares a partir de un sistema de expresión de E. coli u otro sistema de expresión procarionte o eucarionte, y el complejo resultante de receptor-ligando marcado se podría precipitar, por ejemplo, utilizando un anticuerpo en contra del receptor. Posteriormente se podría lavar el precipitado y se podría medir la cantidad de ligando unido, marcado o antagonista o agonista. Alternativamente, NPC1 L1 se une a la membrana. Un ácido nucleico que codifica un polipéptido NPC1 L1 de la invención (por ejemplo, SEQ ID NO: 2, 4 ó 12) se puede transfectar dentro de una célula hospedera apropiada, por medio de la cual la NPC1 L1 se incorporará dentro de la membrana de la célula. Posteriormente se puede aislar una fracción de la membrana a partir de la célula y se puede utilizar como una fuente de NPC1 L1 para ensayo. Alternativamente, la célula completa que expresa NPC1 L1 en la superficie celular se puede utilizar en un ensayo. Preferiblemente, la unión específica de ligando marcado o antagonista o agonista conocido a una célula hospedera no transfectada/no transformada o a una fracción membranal a partir de una célula hospedera no transfectada/no transformada será insignificante. Diversas membranas se pueden utilizar directamente como una fuente de NPC1 L1 para los sistemas de selección anteriormente descritos, por ejemplo unión directa, ensayo de centelleo por proximidad, ensayo de toma de esterol/5a estanol. Como se describió en los ejemplos 5, 6, 7, 8, 9, 17, 27, y 29, NPC1L1 se expresa altamente en ciertos tejidos, especialmente en las células del borde en cepillo de los tejidos intestinales. Por lo tanto, las preparaciones de vesículas de membrana del borde en cepillo (BBM) se pueden utilizar como una fuente de NPC1 L1. Las membranas se pueden derivar a partir de tejido intestinal de mamífero a partir de tejidos de rhesus, rata, ratón o humano. Las membranas se pueden derivar a partir de células del borde en cepillo de tejidos intestinales. Dichas membranas se preparan convencionalmente mediante la recolección de tejido intestinal a partir de animales recientemente sacrificados. La mucosa del tejido se raspa, se recolecta dentro de soluciones con pH regulado, y se homogeneiza. Los restos celulares se remueven y las fracciones de membrana se recolectan mediante centrifugación. Se pueden utilizar las técnicas convencionales conocidas por un experto en la técnica para la preparación de vesículas de membrana del borde en cepillo. Véase Hauser, H., Howell, K., Dawson, R. M. C, Bowyer, D. E. Biochim. Bíophys. Acta 602, 567-577 (1980); Kramer, W., Girbig, F., Gutjahr, U., Kowalewski, S., Jouvenal, K., Muller, G., Tripier, D., Wess, G. J. Biol. Chem. 268, 18035-18046 (1993); Rigtrup, K. M., Ong, D. E. Biochemistry 31 , 2920-2926 (1992). La preparación de membrana puede estar en forma vesicular o en forma no vesicular. Alternativamente, los liposomas y preparaciones liposomales que comprenden NPC1 L1 también pueden ser una fuente viable de NPC1L1 para los ensayos de selección del presente método reclamado. También se pueden utilizar las células cultivadas in vitro que expresan NPC1L1. Las células hospederas se pueden preparar mediante la transformación o transfección de un ácido nucleico que codifica una NPC1L1 de la invención dentro de una célula hospedera apropiada, por medio de la cual el receptor se incorpora dentro de la membrana de la célula. Posteriormente se puede aislar una fracción membranal a partir de la célula y se puede utilizar como una fuente del receptor para ensayo. Alternativamente, en un ensayo, se puede utilizar toda la célula que expresa el receptor en la superficie celular. Preferiblemente, la unión específica del ligando marcado o antagonista o agonista conocido a una célula hospedera o fracción membranal no transfectada/no transformada a partir de una célula hospedera no transfectad/no transformada será insignificante. Las células hospederas preferidas incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), células J774 de macrófagos de murino, células HEK-293 o cualquier otra línea celular de macrófago y células Caco2 epiteliales intestinales de humano. La presente invención provee un método para identificar un ligando de NPC1L1 utilizando estas preparaciones de membrana, por ejemplo al poner en contacto membranas que comprenden NPC1L1 , tales como las preparaciones de vesícula de membrana del borde en cepillo, con compuestos de azetidinona sustituida marcada de manera detectable los cuales son ligandos conocidos de NPC1 L1 , agonistas o antagonistas, y un compuesto candidato y determinar si el compuesto candidato se puede unir a NPC1 L1. La unión del compuesto candidato a NPC1 L1 puede modular la unión a los ligandos NPC1 L1 marcados de manera detectable, agonistas o antagonistas a NPC1 L1. Además, se puede identificar un ligando NPC1 L1 mediante la medición de la unión de NPC1 L1 con los ligandos de NPC1 L1 marcados de manera detectable, agonistas o antagonistas en la presencia y ausencia del compuesto candidato en donde la unión disminuida de los ligandos de NPC1 L1 marcados de manera detectable, agonistas o antagonistas a NPC1 L1 es una indicación de que el compuesto candidato es un ligando de NPC1 L1. NPC1 L1 también se puede obtener mediante la solubilización de las fracciones de membrana que comprenden NPC1L1. Las membranas se pueden obtener como se discutió anteriormente, por ejemplo, a partir de tejido o células cultivadas in vitro de mamífero.

Afinidades de unión de los ligandos de NPC1L1. La afinidad y especificidad del ligando conocido (por ejemplo, 2-azetidinona-glucurónido sustituida, marcada de manera detectable) para NPC1L1 son importantes para la identificación de ligandos que se unen a NPC1L1 en un ensayo de selección. Se entiende que el ligando conocido será marcado para uso en el ensayo de selección. En una modalidad de la invención, la afinidad de unión del ligando conocido para NPC1 L1 de humano tiene un valor KD equivalente o menor que aquel del valor KD de la ezetimiba glucurónido 1 para NPC1 L1 de humano. En un aspecto de esta modalidad, la afinidad de unión del ligando conocido para NPC1L1 de humano tiene un valor KD de aproximadamente 200 nM o menor; particularmente tiene un valor KD de aproximadamente 100 nM o menor; mas particularmente tiene un valor KD de aproximadamente 50 nM o menor; incluso más particularmente tiene un valor KD de aproximadamente 20 nM o menor; y más particularmente tiene un valor KD de aproximadamente 10 nM o menor. Para utilidad en el ensayo, esencialmente no existe un límite inferior en el valor KD del ligando conocido y puede ir, por ejemplo, hacia abajo en el intervalo pM. Conforme el valor KD disminuye, la afinidad de unión del ligando para NPC1 L1 de humano se incrementa, lo cual es deseable para el ensayo de selección.

En otra modalidad de la invención, la afinidad de unión del ligando conocido para NPC1 L1 de rata tiene un valor KD equivalente o menor que aquel del valor KD de la ezetimiba glucurónido 1 para NPC1L1 de rata. En un aspecto de esta modalidad, la afinidad de unión del ligando conocido para NPC1 L1 de rata tiene un valor KD de aproximadamente 200 nM o menor; particularmente tiene un valor KD de aproximadamente 100 nM o menor; mas particularmente tiene un valor KD de aproximadamente 50 nM o menor; incluso más particularmente tiene un valor KD de aproximadamente 20 nM o menor; y más particularmente tiene un valor KD de aproximadamente 10 nM o menor. En otra modalidad de esta invención, el ligando conocido para NPC1L1 de humano se selecciona a partir de (a) una 2-azetidinona sustituida-glucurónido que contiene azufre marcado con 35S, y particularmente un compuesto de fórmula II en donde R9 contiene un grupo -S02- y (b) una 2-azetidinona-glucurónido sustituida marcada con 125l. En un aspecto de esta modalidad, el ligando conocido para NPC1 L1 de humano se selecciona a partir de (a) una 2-azetidinona sustituida-glucurónido que contiene azufre marcado con 35S, y particularmente un compuesto de fórmula II en donde R9 contiene un grupo -S02-, y (b) una 2-azetidinona-glucurónido sustituida marcada con 125l, y tiene un valor KD equivalente o menor que el valor KD de la ezetimiba glucurónido 1. En otro aspecto de esta modalidad, el ligando conocido para NPC1 L1 de humano se selecciona a partir de (a) una 2-azetidinona sustituida- glucurónido que contiene azufre marcado con 35S, y particularmente un compuesto de fórmula II en donde R9 contiene un grupo -S02-, y (b) una 2-azetídinona-glucurónido sustituida marcada con 125l, y tiene un valor KD de aproximadamente 200 nM o menor; particularmente tiene un valor KD de aproximadamente 100 nM o menor; mas particularmente tiene un valor KD de aproximadamente 50 nM o menor; incluso más particularmente tiene un valor KD de aproximadamente 20 nM o menor; y más particularmente tiene un valor KD de aproximadamente 10 nM o menor. Cuando se utiliza ezetimiba glucurónido marcada con 3H en la selección para identificar los ligandos NPC1 L1 de entre los compuestos candidatos utilizando membranas derivadas de ratón, los compuestos candidatos identificados como ligandos de NPC1 L1 son preferiblemente aquellos candidatos que exhiben una afinidad de unión que tiene un valor KD de aproximadamente 12,000 nM o menor, preferiblemente de aproximadamente 1000 nM o menor, más preferiblemente de aproximadamente 100 nM o menor, y más preferiblemente de aproximadamente 10 nM o menor. Cuando se utiliza ezetimiba glucurónido marcada con 3H en la selección para identificar los ligandos NPC1 L1 utilizando membranas derivadas de ratón o membranas derivadas de humano, los compuesto candidatos identificados como ligandos de NPC1L1 son preferiblemente aquellos candidatos que exhiben una afinidad de unión que tiene un valor KD de aproximadamente 1000 nM o menor, preferiblemente de aproximadamente 100 nM o menor, y más preferiblemente de aproximadamente 10 nM o menor. Cuando se utiliza ezetimiba glucurónido marcada con 3H en la selección para identificar los ligandos NPC1L1 utilizando membranas derivadas de mono rhesus, los compuestos candidatos identificados como ligandos de NPC1 L1 son preferiblemente aquellos candidatos que exhiben afinidad de unión que tiene un valor KD de aproximadamente 50 nM o menor, y preferiblemente de aproximadamente 10 nM o menor. Cuando se utiliza el compuesto 2 marcado con 35S en la selección para identificar los ligandos NPC1 L1 de entre los compuestos candidatos utilizando membranas derivadas de rata o de humano, los compuestos candidatos identificados como ligandos de NPC1L1 son preferiblemente aquellos candidatos que exhiben una afinidad de unión que tiene un valor KD en el intervalo de aproximadamente 10 µM a aproximadamente 1 nM. Cuando se utilizan compuestos de 2-azetidinona sustituida glucurónido marcados con 125l en el ensayo con membranas de rata o de humano, los compuestos candidatos identificados como ligandos de NPC1 L1 son preferiblemente aquellos candidatos que exhiben una afinidad de unión que tiene un valor KD en el intervalo de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 10 pM, y preferiblemente de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 10 pM.

Ensayo en ratón. La presente invención comprende un ratón mutante, transgénico el cual carece de cualquier NPC1 L1. Este ratón puede servir como un experimento control conveniente en los ensayo de selección para identificar inhibidores de la absorción intestinal del esterol (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol, preferiblemente inhibidores de NPC1L1. Preferiblemente, un ensayo en ratón de la presente invención podría comprender los siguientes pasos: (a) suministrar una sustancia que contiene esterol (por ejemplo, colesterol), o 5a-estanol (por ejemplo, que comprende colesterol radiomarcado, tales como 14C-colesterol o 3H-colesterol) a un primer y segundo ratón que comprende un gen funcional de NPC1L1 y a un tercer ratón mutante, que carece de un NPC1L1 funcional; La sustancia que contiene esterol (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol preferiblemente contiene colesterol marcado, tal como un colesterol radiomarcado, por ejemplo, colesterol marcado con 3H o 14C. La sustancia que contiene esterol (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol también puede incluir esterol frío, no marcado (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanoI tal como en aceite de maíz. En estos ensayos, el tercer ratón mutante npcH1" sirve como un experimento control (+) el cual exhibe niveles bajos de absorción intestinal de esterol (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol y el segundo ratón sirve como un experimento control (-) el cual exhibe niveles normales, no inhibidos de absorción intestinal de esterol (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol. Al segundo ratón no se le administra la muestra a ser evaluada para un antagonista de NPC1L1. El primer ratón es experimental. (b) administrar la muestra al primer ratón que comprende una NPC1L1 funcional pero no al segundo ratón; (c) medir la cantidad de absorción de esterol (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol el intestino de dicho primero, segundo y tercer ratón; La absorción intestinal de esterol (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol se puede medir mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, el nivel de absorción se puede ensayar mediante la medición del nivel de esterol en suero (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol. (d) comparar los niveles de absorción intestinal de esterol (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol en cada ratón; en donde se determina que la muestra contiene el antagonista de la absorción intestinal de esterol (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol cuando los niveles de absorción intestinal de esterol (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol en el primer ratón y en el tercer ratón son menores que la cantidad de absorción intestinal de esterol (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol en el segundo ratón. Preferiblemente, si la muestra contiene un inhibidor de la absorción intestinal de esterol (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol (por ejemplo, un inhibidor de NPC1 L1 ), el nivel de absorción del esterol (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol en el primer ratón será similar a aquel del tercer ratón mutante a npcUL Un experimento control alternativo (+) el cual se puede utilizar en estos ensayos de selección es un ratón que comprende NPC1 L1 funcional al cual se le administra un antagonista conocido de NPC1L1 , tal como ezetimiba.

Composiciones farmacéuticas Los ligandos NPC1 L1 descubiertos, por ejemplo, mediante los métodos de selección anteriormente descritos se pueden utilizar terapéuticamente (por ejemplo, en una composición farmacéutica) para estimular o bloquear la actividad de NPC1 L1 y, por lo tanto, para tratar cualquier condición médica ocasionada o mediada por NPC1L1. Además, las moléculas de anticuerpo de la invención también se pueden utilizar terapéuticamente (por ejemplo, en una composición farmacéutica) para unirse a NPC1 L1 y, por lo tanto, bloquear la capacidad de NPC1 L1 para unirse a un esterol (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol. El bloqueo de la unión de un esterol (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol podría prevenir la absorción de la molécula (por ejemplo, por las células intestinales tales como enterocitos). El bloqueo de la absorción del esterol (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol podría ser una forma útil para disminuir los niveles de esterol en suero (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol en un sujeto y, por lo tanto, reducir la incidencia de, por ejemplo, hiperlipidemia, aterosclerosis, enfermedad cardiaca coronaria, accidente cerebrovascular o arteriosclerosis. El término "sujeto" o "paciente" incluye cualquier organismo, preferiblemente animales, más preferiblemente mamíferos (por ejemplo, ratones, ratas, conejos, perros, caballos, primates, gatos) y más preferiblemente humanos. El término "composición farmacéutica" se refiere a una composición que incluye un ingrediente activo y un vehículo farmacéuticamente aceptable y/o adjuvante. Aunque las composiciones de esta invención se podrían administrar en una solución simple, éstas se utilizan más típicamente en combinación con otros materiales tales como vehículos, preferiblemente vehículos farmacéuticamente aceptables. Los vehículos farmacéuticamente aceptables, útiles, pueden ser cualesquiera sustancias compatibles, no tóxicas adecuadas para la administración de las composiciones de la invención a un sujeto. Se puede incluir agua estéril, alcohol, grasas, ceras, y sólidos inertes en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los adyuvantes farmacéuticamente aceptables (agentes para regulación de pH, agentes dispersantes) también se pueden incorporar dentro de la composición farmacéutica. Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas de la invención se encuentran en la forma de una pildora o una cápsula. Los métodos para la formulación de pildoras y cápsulas se conocen muy bien en la técnica. Por ejemplo, para administración oral en la forma de tabletas o cápsulas, el componente de fármaco activo se puede combinar con cualquier vehículo oral inerte, no tóxico, farmacéuticamente aceptable, tales como lactosa, almidón, sacarosa, celulosa, estearato de magnesio, fosfato dicálcico, sulfato de calcio, talco, mannitol, alcohol etílico (formas líquidas) y los similares. Además, cuando se desea o es necesario, también se pueden incorporar dentro de la mezcla aglutinantes adecuados, lubricantes, agentes desintegrantes y agentes colorantes. Los aglutinantes adecuados incluyen almidón, gelatina, azúcares naturales, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas tales como acacia, alginato de sodio, carboximetilcelulosa, polietilenglicol y ceras. Entre los lubricantes se pueden mencionar para uso en estas formas de dosis, ácido bórico, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio, y los similares. Los desintegrantes incluyen almidón, metilcelulosa, goma guar y los similares. Los agentes edulcorantes y saborizantes y conservadores también se pueden incluir cuando sea apropiado. Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar en conjunción con una segunda composición farmacéutica o sustancia. En modalidades preferidas, ia segunda composición incluye un fármaco que disminuye el colesterol. Cuando se utiliza una terapia de combinación, ambas composiciones se pueden formular dentro de una composición particular para administración simultánea o se pueden formular separadamente en dos o más composiciones (por ejemplo, un equipo). Las formulaciones pueden estar presentes de manera conveniente en una forma de dosis unitaria y se pueden preparar mediante cualesquiera métodos bien conocidos en la técnica de la farmacia. Véase, por ejemplo, Gilman et al. (eds.) (1990), The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8a Ed., Pergamon Press; y Remington's Pharmaceutical Sciences, anteriormente mencionado, Easton, Penn.; Avis et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, New York; Lieberman et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, New York; y Lieberman et al. (eds.) (1990), Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, New York. El régimen de dosis implicado en una aplicación terapéutica se puede determinar por un médico, considerando varios factores los cuales pueden modificar la acción de la sustancia terapéutica, por ejemplo, la condición, peso corporal, sexo y dieta del paciente, la severidad de cualquier infección, tiempo de administración, y otros factores clínicos. Frecuentemente, las dosis de tratamiento se titulan hacia arriba a partir de un nivel bajo para optimizar la seguridad y eficiencia. Las dosis se pueden ajustar para considerar los pesos moleculares más pequeños y posiblemente las vidas medias disminuidas (tiempos de eliminación) después de la administración. Una "cantidad efectiva" de un ligando de la invención puede ser una cantidad que reducirá de manera detectable el nivel de absorción intestinal del esterol (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol o que reducirá de manera detectable el nivel de esterol en suero (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol en un sujeto al que se le administra la composición. Los protocolos típicos para la administración terapéutica de dichas sustancias se conocen bien en la técnica. La composición farmacéutica de la invención se puede administrar, por ejemplo, mediante una ruta parenteral o no parenteral. Las pildoras y cápsulas de la invención se pueden administrar oralmente. Las composiciones inyectables se pueden administrar con dispositivos médicos conocidos en la técnica; por ejemplo, mediante la inyección con una aguja hipodérmica. Las composiciones farmacéuticas inyectables de la invención también se pueden administrar con un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja; tales como los dispositivos descritos en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,399,163; 5,383,851 ; 5,312,335; 5,064,413; 4,941 ,880; 4,790,824 o 4,596,556.

Anti-sentido La presente invención también comprende oligonucleótidos anti-sentido capaces de hibridar específicamente al ARNm que codifica NPC1 L1 (por ejemplo, cualesquiera de las SEQ ID NOs: 1 , 3, 5-11 ó 13) que tienen secuencias de aminoácidos definidas por, por ejemplo, SEQ ID NO: 2 ó 4 ó 12 o una subsecuencia de las mismas de manera que se previene la traducción del ARNm. Adicionalmente, esta invención contempla oligonucleótidos anti-sentido capaces de hibridar específicamente con la molécula de ADN genómico que codifica NPC1 L1 , por ejemplo, que tienen secuencias de aminoácidos definidas por SEQ ID NO: 2 ó 4 ó 12 o una subsecuencia de las mismas.

Esta invención provee adicionalmente composiciones farmacéuticas que comprenden (a) una cantidad de un oligonucleótido efectiva para reducir la absorción del esterol (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol mediada por NPC1 L1 al pasar a través de una membrana celular y unirse específicamente con el ARNm que codifica la NPC1 L1 en la célula de manera que se previene su traducción y (b) un vehículo farmacéuticamente aceptable capaz de pasar a través de una membrana celular. En una modalidad, el oligonucleótido se acopla a una sustancia que inactiva el ARNm. En otra modalidad, la sustancia que inactiva el ARNm es una ribozima. La reducción del nivel de expresión de NPC1 L1 mediante la introducción del ARN de NPC1 L1 anti-sentido dentro de las células de un paciente es un método útil para reducir la observación intestinal de esterol (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol y el colesterol en suero en el paciente.

Equipos Los equipos de la presente invención incluyen ezetimiba, preferiblemente combinada con un vehículo farmacéuticamente aceptable, en una formulación farmacéutica, más preferiblemente en una forma de dosis farmacéutica tal como una pildora, un polvo, un líquido inyectable, una tableta, un agente para dispersión, una cápsula, una tableta o un supositorio. Véase por ejemplo, Gilman et al. (eds.) (1990), The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8a Ed., Pergamon Press; y Remington's Pharmaceutical Sciences, anteriormente mencionado, Easton, Penn.; Avis et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, New York; Lieberman et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, New York; y Lieberman et al. (eds.) (1990), Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, New York. Preferiblemente, la forma de dosis es una tableta Zetia® (Merck/Schering-Plough Corp.). La ezetimíba se puede abastecer en cualquier forma conveniente. Por ejemplo, las tabletas que contienen ezetimiba se pueden abastecer en botellas de 30, 90 ó 500. Los equipos de la presente invención también incluyen información, por ejemplo en la forma de un texto en el paquete, indicando que el blanco de la ezetimiba es la NPC1 L1 (NPC3). El término "blanco de la ezetimiba" indica que la ezetimiba reduce la absorción intestinal del esterol (por ejemplo, colesterol) o 5a-estanol, ya sea directamente o indirectamente, al antagonizar a la NPC1 L1. La forma del inserto puede tomar cualquier forma, tal como un papel o un medio electrónico tal como un medio magnéticamente registrado (por ejemplo, disco flexible) o un CD- ROM. El texto en el paquete también puede incluir otra información con respecto a las composiciones farmacéuticas y formas de dosis en el equipo. Generalmente, dicha información ayuda a los pacientes y médicos en el uso de las composiciones farmacéuticas incluidas y formas de dosis de manera efectiva y segura. Por ejemplo, la siguiente información con respecto a la ezetimiba (por ejemplo, Zetia®) y/o simvastatina (por ejemplo, Zocor®) se puede abastecer en el inserto: farmacocinéticas, farmacodinámicas, estudios clínicos, parámetros de eficiencia, indicaciones y uso, contraindicaciones, advertencias, precauciones, reacciones adversas, sobre dosis, dosis adecuada y administración, cómo se suministra, condiciones adecuadas de almacenamiento, referencias e información de la patente. Los equipos de la invención también pueden incluir simvastatina ) preferiblemente combinada con vehículo farmacéuticamente aceptable, en una formulación farmacéutica, más preferiblemente en una forma de dosis farmacéutica tales como una pildora, un polvo, un líquido inyectable, una tableta, granos para dispersión, una cápsula, una tableta o un supositorio. Preferiblemente, la forma de dosis de la simvastatina es una tableta Zocor® (Merck & Co.; Whitehouse Station, NJ). Las tabletas o pildoras que comprenden simvastatina se pueden suministrar en cualquier forma conveniente. Por ejemplo, las pildoras o tabletas que comprenden 5 mg de simvastatina se pueden suministrar como sigue: botellas de 30, 60, 90, 100 ó 1000. Las pildoras o tabletas que comprenden 10 mg de simvastatina se pueden suministrar como sigue: botellas de 30, 60, 90, 100, 1000 ó 10,000. Las pildoras o tabletas que comprenden 20 mg de simvastatina se pueden suministrar como sigue: botellas de 30, 60, 90, 100, 1000 ó 10,000. Las pildoras o tabletas que comprenden 40 mg de simvastatina se pueden suministrar como sigue: botellas de 30, 60, 90, 100 ó 1000. Las pildoras o tabletas que comprenden 80 mg de simvastatina se pueden suministrar como sigue: botellas de 30, 60, 90, 100, 1000 0 10,000. La ezetimíba y simvastatina se pueden suministrar, en el equipo, como composiciones separadas o se pueden combinar dentro de una composición particular. Por ejemplo, la ezetimiba y simvastatina se pueden suministrar dentro de una forma de dosis farmacéutica particular, común (por ejemplo, pildora o tableta) como en formas de dosis farmacéuticas separadas (por ejemplo, dos pildoras o tabletas separadas).

Células npcH1" La presente invención provee cualquier célula aislada de mamífero, (por ejemplo, una célula aislada de ratón, una célula aislada de rata o una célula aislada de humano) la cual carece de un gen NPC1 L1 el cual codifica o puede producir una proteína NPC1 L1 funcional. Incluidos dentro de esta modalidad se encuentran los genes mutantes npclll que comprenden una mutación puntual, truncación o deleción de la región genética codificante o cualquier elemento regulador (por ejemplo, un promotor). Por ejemplo, la célula se puede aislar a partir de un ratón mutante que comprende una mutación homocigota de NPC1 L1 endógena, cromosomal en donde el ratón no produce ninguna proteína NPC1 L1 funcional (por ejemplo, el ratón se describe a continuación en el ejemplo 22). Además, la presente invención comprende cualquier célula, tejido, órgano, fluido, ácido nucleico, péptido u otra sustancia biológica derivada o aislada a partir de dicho ratón mutante, particularmente un ratón mutante, transgénico el cual no produce ninguna NPC1L1 funcional, en donde la región deletada de NPC1L1 endógena, cromosomal, en el ratón, corresponde a los nucleótidos 790-998 de la secuencia nucleotídica establecida en SEQ ID NO: 45. La célula aislada se puede aislar o derivar, por ejemplo, a partir del duodeno, vesícula biliar, hígado, intestino delgado o estómago del ratón mutante. Además, la célula puede ser un enterocito. Las células mutantes npd ir son útiles, por ejemplo, para uso de los experimentos control en los ensayos de selección (véase por ejemplo, anteriormente mencionado) puesto que éstas carecen de cualquier toma o unión del esterol, 5a-estanoI o ezetimiba dependiente de NPC1 L1. El nivel de inhibición ocasionado por una muestra particular, en un ensayo de selección, se puede comparar con aquel de un ensayo que se lleva a cabo con la célula mutante. Idealmente, aunque de ninguna forma de manera necesaria, en un ensayo de selección, por ejemplo, como se describió en la presente invención, se observará la misma cantidad de unión por una célula no mutante o membrana celular, en la presencia de un antagonista, como se observa en conexión con una célula mutante de NPC1 L1 o membrana celular sola.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se proveen para describir más claramente la presente invención y no deben considerarse como limitantes del alcance de la invención de ninguna forma.

EJEMPLO 1 Clonación y expresión de la NPC1 L1 de rata, ratón y de humano.

Las NPC1 L1 de rata, NPC1 L1 de ratón o NPC1 L1 de humano se pueden amplificar convenientemente utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En este método, el ADN a partir de una librería de ADNc de rata, ratón o humano se pueden amplificar utilizando iniciadores apropiados y condiciones estándar para PCR. El diseño de los iniciadores y las condiciones óptimas para amplificación constituyen técnicas estándares las cuales se conocen comúnmente en la técnica. Un gen NPC1 L1 amplificado se puede expresar convenientemente, de nuevo, utilizando métodos los cuales se conocen comúnmente en la técnica. Por ejemplo, NPC1L1 se puede insertar dentro de un vector plasmídico basado en pET (Stratagene; La Jolla, CA), cascada abajo del promotor de la T7 ARN polimerasa. Luego el plásmido se puede transformar dentro de un sistema de expresión T7 (por ejemplo, células BL21 DE3 de E. coli), se puede crecer en un medio de cultivo e inducir (por ejemplo, mediante la adición de IPTG al cultivo bacteriano).

EJEMPLO 2 Ensayo de unión directa Preparación de membrana: Las células Caco2 transfectadas con vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica NPC1 L1 (por ejemplo, SEQ ID NO: 2, 4 ó 12) se cosechan mediante incubación en EDTA 5 mM/solución salina con pH regulado con fosfato después del pipeteo repetido. Las células se centrifugan 5 minutos a 1000 x g. El EDTA/PBS se decantó y se añadió un volumen igual de Tris-HCI 50 mM, pH 7.5 enfriado en hielo y las células se fragmentan con un Polytron (punta PT10, ajuste de 5.30 segundos). Los núcleos y las células no fragmentadas se sedimentaron a 1000 x g por 10 minutos y luego el sobrenadante se centrifugó a 50,000 x g por 10 minutos. El sobrenadante se decantó, el concentrado se resuspendió mediante Polytron, se tomó una muestra para ensayo de proteína (ácido bicinconínico, Pierce), y el tejido se centrifugó de nuevo a 50,000 x g. Los concentrados se almacenaron en congelamiento a -20°C.

Ensayo de unión: Para la unión en saturación, se incubaron cuatro concentraciones de [3H]-ezetimiba (15 Ci/milimoles) sin y con ezetimiba 10"5 M por triplicado con 50 µg de proteína membranal en un volumen total de 200 µl de Tris-HCI 50 mM, pH 7.5, por 30 minutos a 30°C. Las muestras se filtraron en filtros GF/B y se lavaron tres veces con 2 ml de regulador de pH Tris frío. Los filtros se secaron en un horno de microondas, se impregnaron con elemento para centelleo Meltilex wax, y se contaron a una eficiencia del 45%. Para los ensayos de unión por competencia, se incubaron cinco concentraciones de una muestra por triplicado con [3H]-ezetimiba 18 nM y 70 µg de proteína membranal bajo las condiciones anteriormente descritas. Las curvas se ajustan a los datos con el programa para ajuste de curvas de mínimos cuadrados no lineal Prism (GraphPad Software) y los valores Ki se derivaron a partir de los valores IC50 de conformidad con Cheng y Prusoff (Cheng, Y.C., et al., (1973) Biochem. Pharmacol. 22: 3099-3108).

EJEMPLO 3A Ensayo SPA Para cada pozo de una placa de 96 pozos, se preparó una mezcla de reacción de 10 µg de membranas que sobre-expresan NPC1 L1-CHO de humano, ratón o rata (Biosignal) y se prepararon 200 µg/pozo de glóbulos YSi-WGA-SPA (Amersham) en 100 ul en regulador de pH para ensayo NPC1 L1 (HEPES 25 mM, pH 7.8, CaCI2 2 mM, MgCI2 1 mM, NaCI 125 mM, 0.1 % de BSA). Una solución de almacenamiento 0.4 nM del ligando [125l]-ezetimiba se preparó en el regulador de pH para ensayo NPC1 L1. Las soluciones anteriormente mencionadas se añadieron a una placa para ensayo de 96 pozos como sigue: 50 µl de regulador de pH para ensayo NPC1L1 , 100 µl de mezcla de reacción, 50 µl de solución para almacenamiento (la concentración final del ligando es de 0.1 nM). Las placas para ensayo se agitaron por 5 minutos en un agitador para placas, luego se incubaron por 8 horas antes de que se determinaran las cpm/pozo en un contador Microbeta Trilux (PerkinElmer). Estos ensayos indicarán que la [125l]-ezetimiba se une a las membranas celulares que expresan NPC1L1 de humano, ratón o rata. Se obtendrán resultados similares si el mismo experimento se lleva a cabo con colesterol radiomarcado (por ejemplo, 125l-colesterol).

EJEMPLO 3A Ensayo SPA alterno Las concentraciones finales deben ser: 35S-2 1 nM (Km -2-5 nM, -50,000 dpm/ensayo); 1 µg de membranas (receptor~1-2 nM); 0.007%-0.03% de taurocolato (0.140 µl de solución de almacenamiento de al 1 %); 0.010%-0.05% de digitonina (0.200 µl de solución de almacenamiento al 1%); 5% de DMSO (1.00 µl de inhibidores). En cada pozo de una placa de 96 pozos se colocó 1 µl de solución inhibidora de DMSO, y luego se añadieron el radioligando y los detergentes como una solución 2X en 10 µl de regulador de pH A. Se agitó por minuto para asegurar que el inhibidor y del ligando estaban mezclados, antes de iniciar con 9 µl de la solución diluida del receptor en regulador de pH A. Después de agitar de nuevo, la placa se incubó a 37°C por 2 horas. Luego se añadieron los glóbulos WGA (0.3 mg) como una suspensión de 3 µl en regulador de pH A, luego se agitó por 30 minutos. Se obtuvieron resultados similares si las membranas eran pre-incubadas con glóbulos por 30 minutos antes de añadir los ligandos. Finalmente, se diluye a 300 µl con regulador de pH A, se cubre la placa, se agita a 3,000 rpm x 5 minutos, y se lee durante 2 minutos por pozo en el contador "Microbeta".

Soluciones de almacenamiento Ligando: 35S-2 es 525.42 nM, 0616 Ci/µl, en acetonitrilo; act. espec. = 3.8916 X 10"4 fmol/dpm; 1168 Ci/milimoles) Membranas: 3er lote recombinante de humano expresado en células HEK-293; 20.2 µg/µl de solución de almacenamiento; -20-40 pmol de NPC1 L1/mg de proteína Regulador de pH A: NaHC0326 mM; NaH2P04 0.96 mN; HEPES 5 mM; adición opcional de glucosa 5.5 mM; NaC1 117 mM; KCl 5.4 mM EJEMPLO 4 Ensayo de toma de colesterol Las células CHO que expresan cualquier SR-B1 o tres diferentes clonas de NPC1 L1 de rata o una clona de NPC1 L1 de ratón se sometieron a ayuno durante toda la noche en medio libre de colesterol luego se dosificaron con [3H]-colesterol en una emulsión de micelas sintéticas mezcladas por 4 minutos, 8 minutos, 12 minutos o 24 minutos en la ausencia o presencia de ezetimiba 10 µM. Las células se cosecharon y los lípidos se extrajeron de manera orgánica. Los lípidos extraídos se colocaron sobre placas de cromatografía de capa fina (CCF) y se resolvieron dentro de una fase de vapor orgánico. Se aislaron las bandas de colesterol libre para cada ensayo y contaron en un contador para centelleo. Las células que expresan SR-B 1 exhibieron un incremento en la toma de [3H]-colesterol tan pronto como a los 4 minutos lo cual también se inhibió por la ezetimiba. Las tres clonas de rata y la clona de ratón parecieron producir niveles de fondo de toma de [3H]-colesterol los cuales fueron similares a aquellos de la célula CHO no transformada. Estos experimentos producirán datos que demuestran que las células CHO pueden llevar a cabo la toma de [3H]-colesterol dependiente de NPC1 L1 de ratón, rata y humano cuando se desarrollan condiciones experimentales más óptimas.

EJEMPLO 5 Expresión de NPC1 L1 de rata en tejido de rata Wistar En estos experimentos, se evaluó la expresión del ARNm de NPC1 L1 de rata, en varios tejido de rata. Los tejidos evaluados fueron esófago, estómago, duodeno, yeyuno, íleon, colon proximal, colon distal, hígado, páncreas, corazón, aorta, bazo, pulmón, riñon, cerebro, músculo, testículos, ovario, úteros, glándula adrenal y glándula tiroides. Las muestras de ARN total se aislaron a partir de al menos 3 animales machos y 3 animales hembras y se agruparon. Luego las muestras se sometieron a PCR cuantitativa en tiempo real utilizando el análisis Taqman utilizando sondas de oligonucleótidos fluorogénicos estándares marcados de manera dual. Los diseños de sonda típica incorporan un colorante 5' reportero (por ejemplo, 6FAM (6-carboxifluoresceína) o VIC) y un colorante 3' eliminador (por ejemplo, TAMRA (6-carboxitetrametil-rodamina)).

NPC1 L1 de rata: Hacia adelante: TCTTCACCCTTGCTCTTTGC (SEQ ID NO: 14) Reverso: AATGATGGAGAGTAGGTTGAGGAT (SEQ ID NO: 15) Sonda: [6FAM]TGCCCACCTTTGTTGTCTGCTACC[TAMRA] (SEQ ID NO: 16) Actina ß de rata: Hacia adelante: ATCGCTGACAGGATGCAGAAG (SEQ ID NO: 17) Reverso: TCAGGAGGAGCAATGATCTTGA (SEQ ID NO: 18) Sonda: [VICjAGATTACTGCCCTGGCTCCTAGCACCAT [TAMRA] (SEQ ID NO: 19) Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un formato de 96 pozos con 25 µl de la mezcla de reacción en cada pozo que contiene: Piatinum SuperMix (12.5 µl), colorante de referencia ROX (0.5 µl), cloruro de magnesio 50 mM (2 µl), ADNc a partir de la reacción de RT (0.2 µl). Las reacciones Multiplex contienen los iniciadores específicos del gen a 200 nM cada uno y la sonda marcada con FAM a 100 nM y los iniciadores específicos del gen a 100 nM cada uno y la sonda marcada con VIC a 50 nM. Las reacciones se llevaron a cabo con un programa cíclico estándar de 2-pasos, 95°C por 15 segundos y 60°C por 1 minuto, por 40 ciclos. Los niveles más elevados de expresión se observaron en el tejido de duodeno, yeyuno e íleon. Los datos indican que la NPC1 L1 desempeña un papel en la absorción del colesterol en el intestino.

EJEMPLO 6 Expresión de la NPC1L1 de ratón en tejido de ratón En estos experimentos, se evaluó la expresión del ARNm de NPC1L1 de ratón, en varios tejidos. Los tejidos evaluados fueron glándula adrenal, BM, cerebro, corazón, isletas de Langerhans, Ll, intestino delgado, riñon, hígado, pulmón, MLN, PLN, músculo, ovario, glándula pituitaria, placenta, placa de Peyer, piel, bazo, estómago, testículos, timo, glándula tiroides, útero y tráquea. Las muestras de ARN total se aislaron a partir de al menos 3 animales machos y 3 animales hembras y se agruparon. Luego las muestras se sometieron a PCR cuantitativa en tiempo real utilizando el análisis de Taqman utilizando los siguientes iniciadores y sondas: NPC1L1 de ratón: Hacia adelante: ATCCTCATCCTGGGCTTTGC (SEQ ID NO: 20) Reverso: GCAAGGTGATCAGGAGGTTGA (SEQ ID NO: 21 ) Sonda: [6FAM]CCCAGCTTATCCAGATTTTCTTCTTCCGC [TAMRA] (SEQ ID NO: 22) Los niveles más elevados de expresión se observaron en el tejido de la placa de Peyer, intestino delgado, vesícula biliar y estómago. Estos datos son consistentes con un papel de NPC1 L1 en la absorción del colesterol la cual toma lugar en el sistema digestivo.

EJEMPLO 7 Expresión de NPC1L1 de humano en tejido de humano En estos experimentos, se evaluó el nivel de expresión del ARNm de NPC1L1 de humano en 2045 muestras que representan 46 tejidos normales. El análisis de expresión del gen basado en microarreglo se llevó a cabo en Affymetrix HG-U95 GeneChip utilizando una sonda de ARNc que corresponde a los pares de bases 4192-5117 (SEQ ID NO: 43) de conformidad estricta con los protocolos establecidos de Affymetrix. Los fragmentos génicos se seleccionaron bajo un tubo multiplicador de bajo fotón (PMT), y los datos se normalizaron utilizando cualquiera de los algoritmos Affymetrix MAS 4.0 o MAS 5.0. Además se utilizaron "espigas" para la mayoría de las muestras para construir una curva estándar y obtener valores de concentración de ARN de conformidad con los algoritmos y procedimientos de Gene Logic. Un resumen de estos resultados se indica a continuación, en el cuadro 2.

CUADRO 2 Nivel de expresión del ARNm de NPC1L1 en diversos tejidos de humano o o Los datos sombreados corresponden a los tejidos en donde se detectaron los niveles más elevados de ARNm de NPC1 L1. La columna "Presente" indica la proporción de muestras de tejidos específicos evaluados en donde se detectó el ARNm de NPC1 L1. La columna "Ausente" indica la proporción de muestras de tejidos específicos evaluados en donde no se detectó el ARNm de NPC1 L1. Las columnas "menor de 25%", "mediana" y "superior de 75%" indican la distribución estadística de las intensidades relativas de la señal de NPC1 L1 observada para cada serie de tejido evaluado.

EJEMPLO 8 Distribución de la NPC1 L1 de rata, IBAT de rata o ARNm de SR-B1 de rata en intestino delgado de rata En estos experimentos, se evaluó la distribución del ARNm de NPC1 L1 de rata a lo largo del eje proximal-distal de los intestinos delgados de rata. Los intestinos se aislaron a partir de cinco animales independientes y se dividieron en 10 secciones de longitud aproximadamente igual. El ARN total se aisló y analizó, mediante PCR cuantitativa en tiempo real utilizando el análisis de Taqman, para los niveles de expresión localizada de la NPC1 L1 de rata, IBAT de rata (transportador ¡leal de ácido biliar) o ARNm de SR-BI de rata. Los iniciadores y sondas utilizados en los análisis fueron: NPC1 L1 de rata: Hacia adelante: TCTTCACCCTTGCTCTTTGC (SEQ ID NO: 23) Reverso: AATGATGGAGAGTAGGTTGAGGAT (SEQ ID NO: 24) Sonda: [6FAM]TGCCCACCTTTGTTGTCTGCTACC[TAMRA] (SEQ ID NO: 25) Vilina de rata: Hacia adelante: AGCACCTGTCCACTGAAGATTTC (SEQ ID NO: 26) Reverso: TGGACGCTGAGCTTCAGTTCT (SEQ ID NO: 27) Sonda: [VIC]CTTCTCTGCGCTGCCTCGATGGAA[TAMRA] (SEQ ID NO:28) SR-B1 de rata: Hacía adelante: AGTAAAAAGGGCTCGCAGGAT (SEQ ID NO: 29) Reverso: GGCAGCTGGTGACATCAGAGA (SEQ ID NO: 30) Sonda: [6FAM]AGGAGGCCATGCAGGCCTACTCTGA[TAMRA] (SEQ ID NO:31 ) IBAT de rata: Hacia adelante: GAGTCCACGGTCAGTCCATGT (SEQ ID NO: 32) Reverso: TTATGAACAACAATGCCAAGCAA (SEQ ID NO: 33) Sonda: [6FAMJAGTCCTTAGGTAGTGGCTTAGTCCCTGGAAGC TCr AMRA] (SEQ ID NO: 34) Los niveles de expresión del ARNm de cada sección intestinal del animal se analizaron separadamente, luego el nivel de expresión observado se normalizó hacia el nivel observado de ARNm de vilina en esa sección intestinal. Posteriormente se promediaron los niveles de expresión del ARNm observados, normalizados para cada sección. Los niveles de expresión de NPC1 L1 y de SR-B1 fueron más elevados en el yeyuno (acciones 2-5) en comparación con aquellas de las secciones más distales del íleon. Puesto que se cree que el yeyuno es el sitio de la absorción del colesterol, estos datos sugieren dicho papel para la NPC1 L1 de rata. La distribución de IBAT que favorece al íleon está bien documentada y sirve como un control para el experimento.

EJEMPLO 9 Análisis in situ del ARNm de NPC1L1 de rata en tejido de yeyuno de rata La localización del NPC1 L1 de rata ARNm se caracterizó por el análisis de hibridación in situ de secciones seriales de yeyuno de rata. Las sondas utilizadas en este análisis fueron: T7-sonda sentido: GTAATACGACTCACTATAGGGCCCTGACGGTCCTTCCTGAGGGAATCTTC AC (SEQ ID NO: 35) T7-sonda antisentido: GTAATACGACTCACTATAGGGCCTGGGAAGTTGGTCATGGCCACTCCAG C (SEQ ID NO: 36) Las sondas de ARN se sintetizaron utilizando amplificación por T7 ARN polimerasa de un fragmento de ADN amplificado por PCR que corresponde a los nucleótídos nucleótidos 3318 a 3672 de NPC1L1 de rata (SEQ ID NO 1 ). Las sondas sentido y anti-sentido de ARNc marcadas con digoxígenina-UTP se generaron a partir de promotor T7 utilizando el equipo para marcado de ARN DIG siguiendo las instrucciones del fabricante. Las criosecciones seriales de yeyuno de rata se hibridaron con las sondas sentido y antisentido. El marcado con digoxigenina se detectó con el equipo para detección de ácido nucleico DIG basado en los métodos previos. Una señal positiva se caracteriza por la depositación de un producto de reacción rojo en el sitio de hibridación. La sonda anti-sentido mostró una fuerte tinción del epitelio a lo largo del eje cripta-vello a una baja amplificación (40X). Los niveles de expresión observados del ARNm de NPC1L1 de rata pueden haber sido de una manera mayores en las criptas que en las puntas de los vellos. A una baja amplificación (200X), se observó tinción en los enterocitos pero no en las células en copa. La ausencia de tinción observada con la sonda sentido (control) confirmó la alta especificidad de la señal NPC1 L1 anti-sentido. Estos datos proveyeron la evidencia adicional del papel de NPC1 L1 de rata en la absorción intestinal de colesterol.

EJEMPLO 10 El análisis de FACS de la unión de la ezetimiba marcada de manera fluorescente con células CHO transfectadas de manera transitoria En estos experimentos, se evaluó la capacidad de la ezetimiba marcada con BODIPY (Altmann, et al., (2002) Biochim. Biophys. Acta 1580 (1 ): 77-93) para unirse a NPC1 L1 y a SR-B1. "BODIPY" es un grupo fluorescente el cual se utilizó para detectar la BODIPY-ezetimiba. Las células de ovario de hámster chino (CHO) se transfectaron de manera transitoria con ADN de NPC1 L1 de rata (rNPC1 L1/CHO), ADN de NPC1 L1 de ratón (mNPC1L1/CHO), ADN de SR-B1 de ratón (mSRBI/CHO) o ADN de EGFP (EGFP/CHO). EGFP es una proteína verde fluorescente mejorada la cual se utilizó como un control positivo. Las células CHO transfectadas o células CHO no transfectadas se tiñeron entonces con ezetimiba marcada con BODIPY 100 nM y se analizaron mediante FACS. También se llevaron a cabo los experimentos control en donde no se marcaron las células con la BODIPY-ezetimiba y en donde las células CHO no transfectadas se marcaron con la BODIPY-ezetimiba. No se observó tinción en las células CHO, rNPC1 L1/CHO o mNPC1 L1/CHO no transfectadas. La fluorescencia se detectó en las células EGFP/CHO control positivas. La tinción también se detectó en las células SR-B1/CHO de ratón. Estos datos muestran que, bajo las condiciones evaluadas, la BODIPY-ezetimiba es capaz de unirse a SR-B1 y que dicha unión no se eliminó por la presencia del grupo fluorescente BODIPY. Cuando se determinan condiciones más óptimas, se mostrará que BODIPY-ezetimiba marca a las células rNPC1L1/CHO y mNPC1L1/CHO.

EJEMPL0 11 Análisis FACS de las células CHO transfectadas de manera transitoria marcadas con el anticuerpo M2 Anti-FLAG En estos experimentos, se evaluó la expresión de NPC1 L1 marcada con FLAG en las células CHO. Las células CHO se transfectaron de manera transitoria con ADN de NPC1 L1 de ratón, ADN de NPC1 L1 de rata, ADN de FLAG-NPC1L1 de rata o ADN de FLAG-NPC L1 de ratón. La marca de 8 aminoácidos FLAG utilizada fue DYKDDDDK (SEQ ID NO: 37) la cual se insertó en el asa extracelular amino terminal justo después de la secuencia señal para secreción. Las células se incubaron con anticuerpo monoclonal de ratón M2 anti-FLAG comercialmente disponible seguido por un anticuerpo secundario anti-ratón marcado con BODIPY. Posteriormente las células tratadas fueron analizadas mediante FACS. El anticuerpo M2 tiñó las células CHO transfectadas con ADN de FLAG-NPC1 L1 de rata y con FLAG-NPC1 L1 de ratón. No se observó tinción en las células CHO transfectadas con ADN de NPC1 L1 de ratón y con ADN de NPC1 L1 de rata. Estos datos mostraron que NPC1 L1 de rata y NPC1 L1 de ratón no poseen una fluorescencia significativa, inherente y no se unen mediante el anticuerpo anti-FLAG. El marcado observado dependiente de FLAG de las células indica que las proteínas de FLAG-NPC1 L1 de ratón y de FLAG-NPC1L1 de rata se localizan en la membrana celular de las células CHO.

EJEMPLO 12 Análisis FACS de la quimera FLAG-NPC1L1-EGFP de rata en las células CHO transfectadas de manera transitoria En estos experimentos, se evaluó la localización superficial y citoplásmica de la NPC1L1 de rata en las células CHO. Las células CHO se transfectaron de manera transitoria con ADN de FLAG-NPC1 L1 de rata o con ADN de FLAG-NPC1 L1-EGFP. En estas fusiones, la marca FLAG se encuentra en el amino-terminal de la NPC1 L1 de rata y la fusión EGFP se encuentra en el carboxi-terminal de la NPC1 L1 de rata. Luego las células se tiñeron con el anticuerpo M2 anti-FLAG de ratón (primario) seguido por una tinción secundaria con un anticuerpo anti-ratón marcado con BODIPY. En los experimentos control, las células se tiñeron solamente con el anticuerpo secundario y no con el anticuerpo primario (M2). Posteriormente las células teñidas se analizaron mediante FACS. En un experimento control, las células transfectadas con FLAG-NPC1 L1 de rata se tiñeron con el anticuerpo secundario anti-ratón BODIPY pero no con el anticuerpo primario. Los datos demostraron que el anticuerpo secundario, anti-ratón no poseía una especificidad significativa para la FLAG-NPC1 L1 de rata y que la FLAG-NPC1 L1 de rata, misma, no posee una presencia significativa. En otro experimento control, las células FLAG-NPC1L1-EGFP no marcadas de rata fueron analizadas mediante FACS. En estos experimentos, se detectó autofluorescencia de la proteína verde fluorescente mejorada (EGFP). Las células FLAG-NPC1 L1 de rata se tiñeron con anticuerpo M2 anti-FLAG de ratón y con el anticuerpo secundario anti-ratón marcado con BODIPY y se analizaron mediante FACS. Los datos a partir de este análisis muestran que las células se marcaron con el anticuerpo secundario marcado con BODIPY, lo cual indica la expresión de la proteína FLAG-NPC1 L1 de rata en la superficie de las células CHO. Las células FLAG-NPC1 L1-EGFP de rata se tiñeron con anticuerpo M2 anti-FLAG de ratón y con el anticuerpo secundario anti-ratón marcado con BODIPY y se analizaron mediante FACS. Los datos a partir de este análisis muestran que ambos marcadores (BODIPY y EGFP) estuvieron presentes indicando la expresión en superficie de la proteína quimérica. Los datos también indican que una porción de la proteína se localiza dentro de las células y se puede asociar con vesículas de transporte. Estos datos apoyan un papel para la NPC1 L1 de rata en el transporte vesicular del colesterol o de la proteína expresada en organelos subcelulares tal como el retículo endoplásmico rugoso.

EJEMPLO 13 Análisis FACS y microscopía fluorescente de la quimera FLAG-NPC1 1- EGFP de rata en una línea celular CHO clonada En estos experimentos, se evaluó la localización celular de la NPC1 L1 de rata mediante análisis FACS y mediante inmunohístoquímica. Las células CHO se transfectaron con ADN de FLAG-NPC1 L1-EGFP de rata y se tiñeron con anticuerpo M2 anti-FLAG de ratón y posteriormente con un anticuerpo secundario anti-ratón marcado con BODIPY. En la fusión, la marca FLAG se encuentra en el amino-terminal de NPC1 L1 de rata y la marca de la proteína verde fluorescente mejorada (EGFP) se localiza en el carboxi-terminal de la NPC1L1 de rata. Posteriormente las células teñidas se analizaron mediante FACS y mediante microscopía por fluorescencia. Las células transfectadas con ADN de FLAG-RPC1 L1-EGFP de rata se tiñeron con el anticuerpo M2 anti-FLAG de ratón y posteriormente con el anticuerpo secundario anti-ratón marcado con BODIPY. El análisis FACS de las células detectó ambos marcadores indicando la expresión en superficie de la proteína quimérica. Las células transfectadas con FLAG-NPC1L1-EGFP de rata se analizaron mediante microscopía por fluorescencia a una amplificación 63X. El análisis de microscopía por fluorescencia de las células indica una tinción no nuclear con una tinción significativa de organelos perinucleares. La resolución de la imagen no pudo confirmar la presencia de proteína vesicular asociada.

Estos datos indican que la proteína de fusión se expresa en la membrana celular de las células CHO.

EJEMPLO 14 Generación de anticuerpos policlonales de conejo anti-NPC1L1 de rata Los péptidos sintéticos (SEQ ID NO: 39-42) que contienen un residuo de cisteína amino- o carboxi-terminal se acoplaron a la proteína vehículo de hemocianina de lapa cerradura (KLH) a través de un enlace dísulfuro y se utilizaron como antígeno para generar antisuero policlonal en conejos blancos de Nueva Zelanda (con un intervalo de 3-9 meses de edad). El péptido KLH se emulsificó mediante la mezcla con un volumen igual de adyuvante de Freund, y se inyectó dentro de tres sitios dorsales subcutáneos. Antes del programa de inmunización de 16 semanas se recolectó una muestra de suero pre-inmune que se siguió por una inyección primaria de 0.25 mg del péptido KLH y 3 inyecciones de refuerzo programadas de 0.1 mg del péptido KLH. Los animales fueron sangrados a partir de la arteria auricular y la sangre se dejó coagular y posteriormente se recolectó el suero mediante centrifugación El título de anticuerpo anti-péptido se determinó con un ensayo inmunosorbente asociado a enzima (ELISA) con péptido libre unido en fase sólida (1 µg/pozo). Los resultados se expresaron como la recíproca de la dilución de suero que resulta en una DO 50 de 0.2. La detección se obtuvo utilizando la IgG biotinilada anti-conejo, conjugado de estreptavidina-peroxidasa de rábano (HRP-SA), y ABTS.

EJEMPLO 15 Análisis FACS de la expresión de NPC1L1 de rata en células CHO transfectadas de manera transitoria con ADN de NPC1 L1 de rata utilizando antisuero de conejo Anti-NPC1L1 de rata En estos experimentos, se evaluó la expresión de NPC1 L1 de rata en la superficie de células CHO. Las células CHO se transfectaron con ADN de NPC1 L1 de rata, luego se incubaron ya sea con suero preinmune de conejo o con suero anti-NPC1L1 de rata de 10 semanas anteriormente descrito, en el ejemplo 14 (por ejemplo, A0715, A0716, A0867 o A0868). Posteriormente las células marcadas con antisuero primario se tiñeron con un anticuerpo secundario anti-conejo modificado con BODIPY seguido por análisis FACS. No se observó anticuerpo marcado en la superficie para ninguna de las muestras de suero pre-inmune. El marcado específico de la superficie celular de las células NPC1L1 transfectadas de rata se observó para ambos A0715 y A0868. El antisuero A0716 y A0867 no reconoce la expresión en superficie de NPC1L1 de rata en este formato de ensayo. Esto indica que la proteína NPC1 L1 nativa, no fusionada de rata se expresa en las células CHO y se localiza en las membranas de células CHO. La expresión en la superficie celular de NPC1 L1 es consistente con un papel en la absorción intestinal del colesterol.

EJEMPLO 16 Análisis FACS de las células CHO transfectadas de manera transitoria con ADN de FLAG-NPC1L1 de ratón o ADN de FLAG-NPC1L1 de rata o células CHO no transfectadas utilizando antisuero NPC1 L1 de conejo anti-rata En estos experimentos, se evaluó la expresión de FLAG- NPC1 L1 de ratón y de FLAG-NPC1 L1 de rata en células CHO. Las células CHO se transfectaron de manera transitoria con ADN de FLAG-NPC1 L1 de ratón o con ADN de FLAG-NPC1 L1 de rata. Las células transfectadas con FLAG-NPC1 L1 de ratón y FLAG-NPC1 L1 de rata se marcaron con cualquier suero A0801 , A0802, A0715 o A0868 (véase el ejemplo 14) o con anticuerpo anti-FLAG, M2. Posteriormente las células marcadas se tiñeron con anticuerpo secundario anti-conejo marcado con BODIPY y se analizaron mediante FACS. Las células CHO no transfectadas se analizaron de la misma manera que las líneas celulares transfectadas. La tinción positiva de las células CHO no transfectadas no se observó para ninguno de los anticuerpos evaluados. Se observó el marcado dependiente del suero A0801 de las células transfectadas con FLAG-NPC1 L1 de rata pero no se observó dicho marcado de las células FLAG-NPC1 L1 de ratón. No se observó el marcado dependiente del suero A0802 de las células transfectadas con FLAG-NPC1 L1 de ratón o con FLAG-NPC1L1 de rata. Se observó el marcado fuerte dependiente del suero A0715 de las células transfectadas con FLAG-NPC1 L1 de rata y se observó el marcado débil dependiente del suero A0715 de las células transfectadas con FLAG-NPC1L1 de ratón. Se observó el marcado débil dependiente del suero A0868 de las células transfectadas con NPC1L1 de rata y transfectadas con NPC1 L1 de ratón. Se observó el marcado fuerte dependiente del anticuerpo anti-FLAG M2 de las células transfectadas con FLAG-NPC1 L1 de rata y de las células transfectadas con FLAG-NPC1 L1 de ratón. La tinción fuerte de M2 probablemente se debe al hecho de que M2 es un anticuerpo monoclonal purificado por afinidad de concentración conocida. En contraste, los antisueros respectivos son policlonales, no purificados y que contienen una concentración incierta de anticuerpo anti-NPC1 L1 de rata. Estos datos proveen evidencia adicional de que las proteínas FLAG-NPC1 L1 de ratón y FLAG-NPC1 L1 de rata se expresan en las células CHO y se localizan en las membranas de la célula CHO. La expresión en la superficie celular de NPC1 L1 es consistente con un papel en la absorción intestinal del colesterol.

EJEMPLO 17 Análisis inmunohistoquímico del tejido de yeyuno de rata con antisuero A0715 de conejo anti-NPC1L1 de rata En estos experimentos, la localización de la NPC1 L1 de rata en el yeyuno de rata se analizó mediante inmunohistoquímica. El yeyuno de rata se removió, inmediatamente se embebió en el compuesto O. O T. y se congeló en nitrógeno líquido. Se cortaron secciones (6 µm) con un microtomo criostato y se montaron sobre portaobjetos de vidrio. Las secciones se secaron al aire a temperatura ambiente y luego se fijaron en fijador de Bouin. La inmunotinción con estreptavidina-biotina-peroxidasa se llevó a cabo utilizando el equipo Histostain-SP. La actividad endógena de peroxidasa tisular se bloqueó con una incubación de 10 minutos en 3% de H202 en metanol, y la unión no específica del anticuerpo se minimizó por una incubación de 45 minutos en 10% de suero no inmune de conejo. Las secciones se incubaron con un antisuero A0715 o A0868 de NPC1 L1 de conejo anti-rata a una dilución 1 :500 a 4°C, seguido por incubación con IgG biotinylated de cabra anti-conejo y con estreptavidina-peroxidasa. Subsecuentemente, las secciones se desarrollaron en un sistema de tinción de aminoetil carbazol (AEC)-H202 y se contratiñeron con hematoxilina y se determinaron mediante un microscopio. Una reacción positiva utilizando este protocolo se caracteriza por la depositación de un producto de reacción de color rojo en el sitio de reacción del antígeno-anticuerpo. Los núcleos se presentaron de color azul a partir de la contratinción con hematoxílina. Los controles se llevaron a cabo de manera simultánea en las secciones vecinas a partir del mismo bloque de tejido. Los procedimientos control consistieron de lo siguiente: (1 ) sustituir el anticuerpo primario con el suero pre-inmune, (2) sustituir el anticuerpo primario con el suero de conejo no inmune, (3) sustituir el anticuerpo primario con PBS, (4) sustituir el anticuerpo secundario con PBS. El ejemplo muestra tejido teñido con suero A0715 anti-NPC1 L1 de rata o con el suero preinmune analizado a baja amplificación (40X) y a alta amplificación (200X). El tejido teñido con A0715, a baja amplificación, mostró una tinción positiva, fuerte de la capa epitelial de las células con vellocidades (enterocitos). El tejido teñido con A0715 a una alta amplificación mostró una tinción positiva, fuerte de las membranas apicales del enterocito. No se observó tinción en el tejido tratado solamente con suero preinmune. Se obtuvieron resultados similares con el suero A0868. Estos datos indican que la NPC1 L1 de rata se expresa en el yeyuno de rata la cual es consistente con un papel en la absorción intestinal del colesterol.

EJEMPLO 18 Ensayo de toma del colesterol marcado En este ejemplo, se evaluó la capacidad de las células CHO transfectadas de manera estable con NPC1 L1 de rata para toma de colesterol marcado. En estos ensayos, se evaluó la toma de colesterol, a una concentración particular, en un experimento de pulso-caza. Los datos generados en estos experimentos se establecen, a continuación, en el cuadro 3. Células: A. células CHO transfectadas de manera estable con ADNc de NPC1 L1 de rata B. CHO de fondo (sin transfección) Las células se sembraron a 500,000 células/pozo (mL) en placas de 12 pozos.

Procedimiento: Todos los reactivos y placas de cultivo se mantuvieron a 37°C a menos que se mencione de otra manera. Ayuno. El medio de mantenimiento (F12 HAMS, 1 % de Pen/Strep, 10% de FCS) se removió y las células se enjuagaron con medio HAMS libre de suero. Luego el medio libre de suero se reemplazó con 1 mL de medio para "ayuno" (F12 HAMS, Pen/Strep, 5% de suero deficiente en lipoproteína (LPDS). Una placa de cada línea celular se mantuvo en ayuno durante toda la noche. Las dos placas remanentes se designaron "sin ayuno" (véase a continuación).

Pre-incubación. El medio se removió a partir de todas las placas, se enjuagó con HAMS libre de suero y se reemplazó con medio para ayuno por 30 minutos.

Pulso con 3H-colesterol. Los siguientes se añadieron directamente a cada pozo. 0.5 µCi de 3H-colesterol (-1.1 X 106 dpm/pozo) en 50 µl de una micela mezclada de sal biliar. Taurocolato de sodio 4.8 mM (2.581 mg/mL) Oleato de sodio 0.6 mM (0.183 mg/mL) Colesterol 0.25 mM (0.1 mg/mL) Dispersado en medio para "ayuno" mediante vibración ultrasónica Concentración final de colesterol en medio = 511 µg/mL Los puntos del tiempo de pulso de colesterol marcado fueron de 0, 4, 12 y 24 minutos. Se prepararon los pozos por triplicado para cada tratamiento. Lavado. A los tiempos designados, el medio se aspiró y las células se lavaron una vez con regulador de pH A de Hobbs (Tris 50 mM, 0.9% de NaCI, 0.2% de BSA, pH 7.4) y una vez con regulador de pH B de Hobbs (Tris 50 mM, 0.9% de NaCI, pH 7.4 (sin BSA)) a 37°C.

Procesamiento/análisis. Las células se digirieron durante toda la noche con NaOH 0.2 N, 2 mL/pozo a temperatura ambiente. Una alícuota de 1.5 mL se removió a partir de cada pozo, se neutralizó y contó para radioactividad mediante conteo de centelleo. Se ensayaron dos alícuotas adicionales de 10 µl a partir de todos los pozos para proteína total mediante el método de Pierce micro BCA. La cantidad de colesterol marcado observado en las células se normalizó mediante la cantidad de proteína en las células.

CUADRO 3 Toma de 3H-colesterol por las células CHO transfectadas con una NPC1L1 de rata o SR-B1 de ratón o células CHO no transfectadas Colesterol total, dmp Colesterol total, dmp proteína ± sem proteína ± sem Tiempo, NPC1L1 CHO NPC1L1 CHO minuto Después de3H-colesterol 0 2067+46 4568+1937 Sin ayuno 10754±166 22881±9230 4 2619±130 2868+193 15366±938 15636±1471 12 2868±193 4459±170 15636±1471 24622+966 24 7010+89 7204+173 41129+689 39361±1207 0 1937+273 2440+299 ayuno 10909±1847 12429+1673 4 3023±308 2759±105 17278+1650 14307±781 12 2759±105 4857±186 14307+781 26270±1473 24 6966±72 7344±65 39196±174 38381+161 dpm = desintegraciones por minuto sem = error estándar de la media EJEMPLO 19 Efecto de la ezetimiba sobre la toma de colesterol El efecto de la ezetimiba sobre la capacidad de las células CHO transfectadas de manera estable con NCP1L1 de ratón o de rata o SR-B1 de ratón para toma de colesterol marcado con 3H se evaluó en experimento de pulso-caza. Se evaluaron una clona de ADNc de NPC1 L1 de ratón (C7) y tres clonas de NPC1 L1 de rata (C7, C17 y C21 ). También se evaluó la capacidad de las células CHO transfectadas de manera estable con SR-B1 de ratón, NPC1 L1 de ratón y NPC1 L1 de rata para toma de colesterol marcado, en la ausencia de ezetimiba, en los experimentos de pulso-caza. Los datos generados en estos experimentos se establecen a continuación, en los cuadros 4 y 5. Adicíonalmente, también se evaluó la cantidad de colesterol total tomado por las células CHO transfectadas y no transfectadas en la presencia de cuatro diferentes concentraciones de colesterol no marcado. Los datos a partir de estos experimentos se establecen a continuación, en el cuadro 6.

Células: A. células CHO transfectadas de manera estable con ADNc de NPC1L1 de rata o de ratón B. CHO de fondo (sin transfección) C. células CHO transfectadas con SR-B1 Las células se sembraron a 500,000 células/pozo (mL) en placas de 12 pozos.

Procedimiento: Todos los reactivos y placas de cultivo se mantuvieron a 37°C a menos que se mencione de otra manera. Ayuno. El medio de mantenimiento (F12 HAMS, 1 % de Pen/Strep, 10% de. FCS) se removió y las células se enjuagaron con medio HAMS libre de suero. Luego el medio libre de suero se reemplazó con 1 mL de medio para "ayuno" (F12 HAMS, Pen/Strep, 5% de suero deficiente en lipoproteína (LPDS). Luego las células se mantuvieron en ayuno durante toda la noche. Pre-incubación/pre-dosis. El medio se removió a partir de todas las placas y se reemplazó con el medio para ayuno recientemente preparado y se preincubó por 30 minutos. La mitad de los pozos recibieron medio que contenía ezetimiba (solución de almacenamiento en EtOH; concentración final = 10 µM). Pulso con 3H-colesterol. Los siguientes se añadieron directamente a cada pozo: 0.5 µCi de 3H-colesterol (-1.1 X 106 dpm/pozo) en 50 µl de una micela mezclada de sal biliar Taurocolato de sodio 4.8 mM (2.581 mg/mL) Oleato de sodio 0.6 mM (0.183 mg/mL) Colesterol 0.25 mM (0.1 mg/mL) Dispersado en medio para "ayuno" mediante vibración ultrasónica Concentración final de colesterol en medio = 5 µg/mL Los puntos de tiempo del pulso de colesterol marcado fueron de 4, 12, 24 minutos y 4 horas. Los pozos por triplicado se prepararon para cada tratamiento. Lavado. A los tiempos designados, el medio se aspiró y las células se lavaron una vez con regulador de pH A de Hobbs (Tris 50 mM, 0.9% de NaCI, 0.2% de albúmina de suero de bovino (BSA), pH 7.4) y una vez con regulador de pH B de Hobbs (Tris 50 mM, 0.9% de NaCI, pH 7.4 (sin BSA)) a 37°C.

Procesamiento/análisis. A. Puntos de tiempo a 4. 12, 24 minutos: Las células se digirieron durante toda la noche con NaOH 0.2 N, 2 mL/pozo, temperatura ambiente. Una alícuota de 1.5 mL se removió a partir de cada pozo, se neutralizó y contó para radioactividad mediante conteo de centelleo.

B. Punto de tiempo a 4 horas: Las células digeridas se analizaron mediante cromatografía en capa fina para determinar el contenido de éster de colesterol en las células.

Los extractos se colocaron sobre placas de CCF y se procesaron por 30 minutos en 2 ml de fase móvil de hexano:isopropanol (3:2) por 30 minutos, seguido por un segundo procesamiento en una fase móvil de 1 ml de hexano:isopropanol (3:2) por 15 minutos.

C. Determinación de proteína de extractos celulares. Las placas que contenían una muestra de los extractos celulares se colocaron en un agitador orbital a 120 rpm por los tiempos indicados y de los extractos se agruparon en tubos de 12 X 75. Las placas se secaron y se añadió NaOH (2 ml/pozo). Posteriormente se determinó el contenido de proteína de las muestras. Se ensayaron dos alícuotas adicionales de 50 µl a partir de todos los pozos para la proteína total mediante el método de Pierce micro BCA. La cantidad de colesterol marcado observado en las células se normalizó a la cantidad de proteína en las células.

CUADRO 4 Colesterol total en las células CHO transfectadas en la presencia y ausencia de ezetimiba EZ = ezetimiba CUADRO 5 Ester de Colesterol en células CHO en la presencia y ausencia de ezetimiba EZ = ezetimiba CUADRO 6 Toma de colesterol marcado en la presencia de cantidades en incremento de colesterol no marcado Colestcrol total, dpm ± sem Colesterol total, dpm/mg proteina ± sem SR-B1 mMPClLl(C7) rNPC!LI(C2) Control CHO SR-BI mNPCILI(C7) rNPCIL!(C2) Colesterol frío Pulso 24 minutos 3 µg/mL 12271 ±430 49603 ± 2428 14250+1628 10656+1233 I08936±54I3 541562 ±13785 14076 ± 14433 94945+ 12926 10 µg/mL 16282 ±2438 79967 + 8151 25465 + 3037 13225 ±4556 151283 ±23345 880224 ± 82254 250985+27481 123433 ±34092 30 µg/mL 14758 ± 1607 71925+3863 19001 + 1530 13218+ 1149 135109 + 12106 796236+18952 180436+ 12112 111522 ±6941 100 µg/mL 16458 + 1614 58185+4548 15973+1665 11560+1132 1 9559 ±17977 630143 ±3718 147717+8261 I0132S ±7191 Ester colesterílico, dpm + sem Ester colesterílico, dpm/mg proteina ± sem Control CHO SR-BI mNPClLl(C7) rNPCILI(C2) Control CHO SR-B1 mNPCILI(C7) rNPCILI(C2) 3 µg/mL 2737 ± 114 39596 ±1241 1561 + 1 4015+47 22050 + 978 382641 ±5955 136S4 + 2I7 32020 ±641 10 µg/mL 1646+76 17292 + 362 998+36 1866 + 33 13323 + 606 157914 ±3400 8917±467 14849 ± 127 30 µg/mL 970 ±46 6642 ±153 537 ±82 970 ±9 7627 ± 325 63547+1760 4885 ±748 7741 + 100 100 µg/mL 895 ±156 4777 ±27 407+7 777+16 7135 ±1230 45088 + 1526 1663 ±68 6005+198 Colesterol libre, dpm ± sem Colesterol libre, dpm/mg proteúia ± sem Control CHO SR-BI mNPClLl(C7) rNPClLl(C2) SR-BI mNPCILl(C7) rNPCILI(C2) Pulso 4 horas 3 µg/mL 89013+3724 211783+3268 10343 ±2112 92244 + 987 717308 ±34130 2047695 ±1621 914107 + 5869 735498 ±11209 10 µg/mL 136396 ±8566 278216+10901 196173 ±4721 125144 ± 877 1105118+76074 2540130 ±92471 1753072 ±86573 996824 ±27850 30 µg/mL 131745 ±2922 224429 + 2556 149172 ±19689 117143+4976 1036195 + 21142 2I493I5±78061 1357136+ 180264 934772 ±43202 ICO µg/mL 79336 + 4011 231470*4221 114599 ±2803 93538+ 1588 632965 ± 29756 2I82022±36793 1035979 + 30329 723225 ±21694 Ester colesterílico, dpm ± sem Ester colesterílico, dpm/mg proteína ± sem Control CHO SR-B1 mNPClLl(C7) rNPClLI(C2) SR-BI mNPCI I(C7) rNPCILI(C2) Pulso 24 horas 3 µg/mL 57373 ± 2704 162296 ± 1644 22986 ±940 59377 + 953 357629 ±14639 1248900 ±18565 160328 ±6565 401315 ±5557 10 µg/mL 33730 ±1296 í 12315 ± 373 14836 ±552 31797+525 215004 ±5942 830231 + 12764 98594 +4205 200451 ±5239 30 µg/mL 19193 ±100 58668 ±1413 8878 ±355 18963 ±380 122071 + 1271 446581 ±3472 59091 ±2967 119728 + 2131 100 µg/mL 16761 +398 31280 ±1270 8784 + 946 14933 + 311 103235 ±1739 272796±13392 60670+ 4597 96215+1023 Colesterol libre, dpm ± sem Colesterol libre, dpm/mg proteina ± sem Control CHO SR-B1 mNPClLl(C7) rNPCILI(C2) SR-BI mNPC!LI(C7) rNPCILI(C2) Pulso 24 horas 3 µg/mL 248985+4207 357819+4519 285610±5187 227244+ 1016 1552637+18954 2752957±24984 1993256 ±56968 1536023 + 10304 10 µg/mL 231208 ±8972 269822 + 5872 311777 + 8227 231666 + 6198 I477414±85954 1984473 ±17420 2069980+25517 1461157 + 5 517 30 µg/mL 203566 + 6008 225273 ±5932 279604 ±6612 209372 + 3386 1294878 ±41819 1716066±5258l 1859476 ±29507 1321730 ±5452 100 µg/mL 178424 ±2379 167082 + 2211 229832 ±4199 182678 + 7709 1099648 + 25160 1455799 ±9885 1599244+76938 1177546+51191 EJEMPLO 20 Ensayo de toma de colesterol marcado En este ejemplo, se evaluó la capacidad de las células CHO transfectadas de manera transitoria con NPC1L1 de rata o SR-B1 de ratón para toma de colesterol marcado. También se evaluó la capacidad de la NPC1 L1 de rata para potenciar la capacidad de las células CHO transfectadas con SR-B1 de ratón para toma de colesterol marcado. En estos ensayos, la toma de colesterol, a una concentración particular, se evaluó en experimentos de pulso-caza. Los datos generados en estos experimentos se establecen a continuación, en el cuadro 7.

Células: A. células CHO de fondo (sin transfección). B. Las células CHO transfectadas de manera transitoria con SR- B1 de ratón. C. CHO transfectadas de manera transitoria con ADNcs de NPC1L1 de rata (n=8 clonas). Las células transfectadas de manera transitoria se sembraron a 300,000 células/pozo (mL) en placas de 12 pozos.

Procedimiento: Todos los reactivos y placas de cultivo se mantuvieron a 37°C a menos que se mencione de otra manera. Ayuno. El medio de mantenimiento (F12 HAMS, 1 % de Pen/Strep, 10% de FCS) se removió a partir de las células y se reemplazó con 1 mLde medio para "ayuno" (F12 HAMS, Pen/Strep, 5% de suero deficiente en lipoproteína (LPDS). Las células se sometieron a ayuno por 1 hora.

Pulso con 3H-colesterol. Los siguientes se añadieron directamente a cada pozo. 0.5 µCi 3H-colesterol (-1.1 X 106 dpm/pozo) en 50 µl de una micela mezclada de sal biliar. Taurocolato de sodio 4.8 mM (2.581 mg/mL) Oleato de sodio 0.6 mM (0.183 mg/mL) Colesterol 0.25 mM (0.1 mg/mL) Dispersado en medio para "ayuno" mediante vibración ultrasónica Concentración final de colesterol en medio = 5 µg/mL Los puntos de tiempo de pulso de colesterol marcado fueron de 24 minutos y 4 horas. Pozos por triplicado para cada tratamiento. Lavado. A los tiempos designados, el medio se aspiró y las células se lavaron una vez con regulador de pH A de Hobbs (Tris 50 mM, 0.9% de NaCI, 0.2% de BSA, pH 7.4) y una vez con regulador de pH B Hobbs (Tris 50 mM, 0.9% de NaCI, pH 7.4 (sin BSA)) a 37°C.

Procesamiento/análisis A. Punto de tiempo a 24 minutos: Las células se digirieron durante toda la noche con NaOH 0.2 N, 2 mL/pozo a temperatura ambiente. Una alícuota de 1.5 mL se removió a partir de cada pozo, se neutralizó y contó para radioactividad mediante conteo de centelleo. B. Punto de tiempo a 4 horas: Las células digeridas se analizaron mediante cromatografía en capa fina para determinar el contenido de éster de colesterol en las células. Los extractos se colocaron sobre placas de cromatografía en capa fina y se procesaron en 2 ml de la fase móvil que contenía hexano:isopropanol (3:2) por 30 minutos, seguido por un segundo procesamiento en 1 mi de la fase móvil que contenía hexano:isopropanol (3: 2) por 15 minutos C. Determinación de proteína de los extractos celulares: Las placas que contenían una muestra de los extractos celulares se colocaron en un agitador orbital a 120 rpm por los tiempos indicados y los extractos se agruparon en tubos de 12X75. Las placas se secaron y se añadió NaOH (2 ml/pozo). Posteriormente se determinó el contenido de proteína de las muestras. Se ensayaron dos alícuotas adicionales de 50 µl a partir de todos los pozos para proteína total mediante el método de Pierce micro BCA. La cantidad de colesterol marcado observado en las células se normalizó a la cantidad de proteína en las células.

CUADRO 7 Toma de colesterol en células CHO transfectadas de manera transitoria EJEMPLO 21 Expresión de NPC1 L1 de rata, ratón y de humano.

En este ejemplo, NPC1 L1 se introdujo dentro de las células y se expresó. Se clonaron las construcciones de expresión de NPC1 L1 específicas de especie dentro del plásmido pADNc3 utilizando los iniciadores de PCR específicos de la clona para generar el ORF flanqueado por sitios de restricción apropiados compatibles con el poliadaptador del vector. Para las tres especies de NPC1L1 , se utilizó en ARN de tejido total del intestino delgado como un molde para la reacción de transcriptasa reversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) utilizando oligo dT como el iniciador del molde. La NPC1 L1 de rata se clonó como un fragmento EcoRI, NPC1 L1 de humano se clonó como un fragmento Xbal/Notl y NPC1L1 de ratón se clonó como un fragmento EcoRI. Las secuencias de las cadenas hacia adelante y reversas de cada clona se llevaron a cabo para confirmar la integridad de la secuencia. Los procedimientos estándares de transfección transitoria se utilizaron con las células CHO. En una placa de 6 pozos se sembraron células CHO 1 día antes de la transfección a una densidad de siembra de 2 X 105 células/pozo. Al siguiente día, las células se incubaron con 2 µg de ADN plasmídico y 6 µlde Lipofectamina por 5 horas seguido a un cambio de medio recientemente preparado. Cuarenta y ocho horas después, las células se analizaron para expresión de NPC1 L1 utilizando antisuero anti-SPC1 L1 mediante cualquier método FACS o western blot. Para establecer líneas celulares estables a largo plazo que expresan NPC1L1 , las células CHO transfectadas se seleccionaron en la presencia de geneticina (G418, 0.8 mg/ml) como se recomienda por el fabricante (Life Technologies). Después de un mes de selección en cultivo, la población celular se tiñó con antisuero anti-NPC1 L1 y se seleccionó mediante FACS. Las células individuales positivas a la tinción se clonaron después de aislamiento mediante dilución limitante y posteriormente se mantuvieron en medio para selección que contenía geneticina (0.5 mg/ml). Se han generado otros tipos celulares menos susceptibles a los procedimientos de transfección utilizando sistemas de vector adenoviral. Este sistema que se utiliza para expresar NPC1 L1 se deriva a partir de Ad 5, un adenovirus de tipo C. Este vector adenoviral recombinante defectuoso en replicación se elabora para que sea defectuoso a través de las modificaciones de las regiones E1 , E2 y E4. El vector también tiene modificaciones adicionales a la región E3 que generalmente afectan los genes de la región E3b RIDa y RIDb. La expresión de NPC1 L1 se dirigió utilizando el promotor CMV como un cassette de expresión sustituido en la región E3 del adenovirus. Las NPC1 L1 de rata y de ratón se amplificaron utilizando los iniciadores específico de la clona flanqueados por sitios de restricción compatibles con el vector tipo adenovirus. Las partículas infecciosas del adenovirus se produjeron a partir de células 293-D22 en títulos de 5 X 1010 P/mL. Los usados virales se utilizaron para infectar células resistentes a las metodologías estándares de transfección. En las células Caco2, las cuales son altamente resistentes a la expresión de la proteína heteróloga, se ha mostrado que la expresión de NPC1 L1 mediada por adenovirus mediante análisis de western blot analysis persiste al menos 21 días después de la infección.

EJEMPLO 22 Ratón transgénico Knock-Out para NPC1L1 Los ratones knockout para NPC1 L1 se construyeron vía mutagénesis dirigida. Esta metodología utiliza una construcción para direccionamiento diseñada para deletar una región específica de gen de NPC1 L1 de ratón. Durante el proceso de direccionamiento se insertó el gen reportero lacZ en E. coli bajo el control del promotor endógeno de la NPC1 L1. La región a ser deletada en NPC1L1 (SEQ ID NO: 45) es a partir del nucleótido 790 al nucleótido 998. El vector para direccionamiento contiene el cassette LacZ-Neo flanqueado por 1.9 kb del brazo 5' terminal con el nucleótido 789 y el brazo 3' de 3.2 kb iniciando con el nucleótido 999. El ADN genómico a partir de la línea de célula madre embrionaria recombinante se ensayó para recombinación homologa utilizando PCR. Los fragmentos amplificados de ADN se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa. Los PCRs prueba emplearon un iniciador específico del gen, el cual yace por fuera de y es adyacente al brazo del vector para direccionamiento, se apareja con uno de tres iniciadores específicos a la secuencia del cassette LacZ-Neo. Para la reconfirmación por PCR hacia 5', se utilizó el oligonucleótido específico de NPC1L1 ATGTTAGGTGAGTCTGAACCTACCC (SEQ ID NO: 46) y para la reconfirmación de PCR hacia 3' se utilizó el oligonucleótido específico de NPC1 L1 GGATTGCATTTCCTTCAAGAAAGCC (SEQ ID NO: 47). La genotipificación de ratón F2 se llevó a cabo mediante PCR múltiple utilizando el iniciador hacia adelante específico de NPC1 L1 TATGGCTCTGCCCTCTGCAATGCTC (SEQ ID NO: 48) el iniciador hacia adelante específico del cassette LacZ-Neo TCAGCAGCCTCTGTTCCACATACACTTC (SEQ ID NO: 49) en combinación con el iniciador reverso específico del gen NPC1 L1 GTTCCACAGGGTCTGTGGTGAGTTC (SEQ ID NO: 50) que se permite para la determinación tanto de los alelos seleccionados como de los alelos endógenos. El análisis de los productos de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa distingue al ratón de tipo silvestre, al ratón heterocigoto y al ratón homocigoto nulo entre sí.

EJEMPLO 23 Absorción aguda de colesterol en ratones deficientes en NPC1L1 Para determinar si la NPC1 L1 desempeña un papel en la absorción de colesterol, se estudiaron los ratones deficientes en NPC1 L1. Los ratones deficientes en NPC1L1 (-/-) se generaron mediante cruza de ratones heterocigotos (+/) para obtener ratones de tipo silvestre (+/+) y ratones deficientes en NPC1 L1 (-/-). Los ratones que no se sometieron a ayuno (de 6.5-9 semanas de edad, con fondo genético mezclado de 129 y C57BL/6) se pesaron y agruparon (n = 2-1- y n= 4+/+). Todos los animales fueron dosificados mediante cebadura (agujas para alimentación, 24G x1 pulgada (2.54 cm), Popper y Sons, NY) con 0.1 ml de aceite de maíz (Sigma; St. Louis, MO) que contenía 1 µCi de 14C-colesterol (New England Nuclear, [4" 14C] colesterol, NEC-018) y 0.1 mg de masa del colesterol vehículo (Sigma; St. Louis, MO). Dos horas después, la sangre se recolectó mediante punción cardiaca. El hígado se removió, se pesó, y se colocaron tres muestras dentro de viales para conteo 20 ml. los tejidos se digirieron en 1 ml de NaOH 1 N a 60°C durante toda la noche. Los tejidos digeridos se acidificaron mediante la adición de 250 µl de HCl 1 a 4N antes del conteo por centelleo líquido (LSC). El plasma se aisló mediante centrifugación a 10,000 rpm por 5 minutos en una microfuga y se tomaron alícuotas de 100 µl por duplicado del plasma para LSC. La absorción de colesterol, se evaluó mediante esta técnica precisa y se expresó como la cantidad total de colesterol radiactivo en el plasma y en el hígado, demostrando que los ratones de tipo silvestre (+/+) absorbieron un promedio de 11 ,773 dpm y los ratones deficientes en NPC1L1 absorbieron 992 dpm del colesterol 14C. Estos resultados indican que los ratones deficientes en NPC1 L1 tienen una reducción del 92% en la absorción del colesterol. Estos datos confirman el papel de la NPC1 L1 en la absorción intestinal del colesterol. La inhibición de la absorción del colesteroi mediada por NPC1 L1 , en un sujeto, mediante la administración de los antagonistas de NPC1 L1 , tal como la ezetimiba, al sujeto, son una forma útil para reducir los niveles de colesterol en suero y la presencia de aterosclerosis en el sujeto.

EJEMPLO 24 Absorción de colesterol en ratones Knockout para NPC1L1 (NPC3) (método de relación Fecal: colesterol/sitoestanol) En este ejemplo, la absorción de colesterol y la actividad de la ezetimiba se determinó en los ratones knockout para NPC1 L1 (-/-), en los ratones heterocigotos (+/-), y en los ratones de tipo silvestre con edad coincidente (+/+). La absorción del colesterol en los ratones se determinó mediante el método relación del isótopo fecal dual como se describió por Altmann et al. (Biochim. Biophys. Acta. 1580 (1 ): 77-93 (2002)). Los ratones (n= 4-6/grupo) fueron alimentados con una dieta de croqueta estándar para roedor y en algunos grupos se trataron diariamente con una dosis máxima efectiva de la ezetimiba (10 mg/kg). Los ratones fueron suministrados mediante cebadura con 14C-colesterol (1 µCi, 0.1 mg de colesterol no marcado) y 3H-sitoestanol (2 µCi) en 0.1 ml de aceite de maíz. Las heces se conectaron por 2 días y se determinaron los niveles fecales de 14C-colesterol y 3H-sitoestanol mediante la combustión en un Packard Oxidizer. La fracción de colesterol absorbido, como se evaluó por la técnica de isótopo dual fecal, fue similar en los ratones de tipo silvestre (+/+) y en los ratones heterocigotos (+/-) alimentados con una dieta de croqueta (los ratones heterocigotos absorbieron a 46 + 5% y los ratones de tipo silvestre con edad coincidente absorbieron 51 ± 3% de la dosis de 14C-colesterol). Los ratones knockout para NPC1 L1 (-/-) absorbieron 15.6 + 0.4% del 14C-colesterol, lo cual fue similar a los ratones de tipo silvestre tratados con una dosis máxima efectiva de ezetimiba (16.1 ± 0.3%), y se redujo en un 69% en comparación con los ratones de tipo silvestre (p < 0.001 ). En los ratones knockout para NPC1L1 tratados con ezetimiba a 10 mg/kg/día, la absorción del colesterol fue similar a aquella observada en los ratones knockout no tratados (16.2 ± 0.6% en comparación con 15.6% ± 0.4%, respectivamente). Por lo tanto, la mayor parte de la absorción del colesterol es dependiente de la presencia del NPC1 L1 y la absorción residual del colesterol en ratones que carecen de NPC1 L1 no es sensible al tratamiento con ezetimiba. Estos resultados indican que la NPC1 L1 participan en la toma y la absorción de colesterol en los enterocitos del intestino delgado y se encuentra en la ruta a que es sensible a la ezetimiba.

EJEMPLO 25 Ensayo de selección del ratón (absorción aguda de colesterol) Se utilizó el siguiente ensayo de selección para identificar la presencia de un antagonista de NPC1 L1 en una muestra.

Los ratones deficientes en NPC1 L1 (-/-) se generaron mediante la cruza de ratones heterocigotos (+/) para obtener ratones de tipo silvestre (+/+) y ratones deficientes en NPC1 L1 (-/-). En una primera serie de experimentos, los ratones que no se sometieron a ayuno (6.5-9 semanas de edad, con fondo genético mezclado de 129 y C57BL/6) se pesaron y se agruparon (n= 1 a A-I- y n= 1 a 4 +/+). Todos los animales fueron suministrados mediante cebadura (agujas para alimentación, 24G x 1 pulgada (2.54 cm), Popper y Sons, NY) con 0.1 ml de aceite de maíz (Sigma; St. Louis, MO) que contenía 1 µCi 14C-colesterol (New England Nuclear, [4"14C] colesterol, NEC-018) y 0.1 mg masa de colesterol vehículo (Sigma; St. Louis, MO). En otra serie de experimentos, 1 a 4 ratones NPC1 L1 de tipo silvestre (+/+) se trataron de manera idéntica con los ratones en la primera serie de experimentos, anteriormente mencionada, excepto que a los ratones se les suministró adicionalmente una muestra a ser evaluada para la presencia de un antagonista de NPC1 L1. Dos horas después, la sangre se recolectó a partir de cada ratón mediante punción cardiaca. El hígado se removió, se pesó, y se colocaron tres muestras dentro de viales de 20 ml para conteo. Los tejidos se digirieron en 1 ml de NaOH 1 N a 60°C durante toda la noche. Los tejidos digeridos se acidificaron mediante la adición de 250 µl de HCl 4N antes del conteo por centelleo líquido (LSC). El plasma se aisló mediante centrifugación a 10,000 rpm por 5 minutos en una microfuga y se tomaron alícuotas de 100 µl por duplicado para LSC. La absorción del colesterol, que se evaluó mediante esta técnica precisa se expresa como la cantidad total de colesterol radiactivo en el plasma e hígado. Se determinó que la muestra evaluada contenía un antagonista de NPC1 L1 cuando los niveles de absorción del colesterol (como se midió por los métodos anteriormente descritos) en el ratón NPC1 L1 de tipo silvestre (+/+) al cual se le proporcionó la muestra y en el ratón deficiente en NPC1 L1 (-/-) fueron menores que la cantidad de absorción del colesterol en el ratón NPC1 L1 de tipo silvestre (+/+) el cual no fue alimentado con la muestra.

EJEMPLO 26 Ensayo de selección del ratón(método de relación fecal: colesterol/sitoestanol) Se utilizó el siguiente ensayo de selección para identificar la presencia de un antagonista de NPC1 L1 en una muestra. La absorción de colesterol en los ratones se determinó mediante el método de isótopo fecal dual como se describió por Altmann et al. (Biochim. Bíophys. Acta. 1580 (1 ): 77-93 (2002)). Tres grupos de ratones (n=1-6/grupo) se reúnen. Dos grupos separados comprenden ratones NPC1 L1 de tipo silvestre (+/+) y un grupo comprende ratones deficientes en NPC1 L1 (-/-).

Cada grupo se alimenta con una dieta de croqueta estándar para roedor y en algunos grupos se trataron diariamente. Los ratones fueron alimentados mediante cebadura con 14C-co leste rol (1 µCi, 0.1 mg de colesterol no marcado) y 3H-sitoestanol (2 µCi) en 0.1 ml de aceite de maíz. Un grupo de ratones, el cual comprende ratones NPC1 L1 de tipo silvestre (+/+) se alimenta adicionalmente con una muestra a ser evaluada para la presencia de un antagonista de NPC1L1. Las heces se recolectaron por 2 días y se determinaron los niveles fecales de 14C-colesterol y 3H-sitoestanol mediante combustión en un Packard Oxidizer. Se determinó que la muestra evaluada contenía un antagonista de NPC1 L1 cuando los niveles de absorción de colesterol y/o sitoestanol (como se midió por los métodos anteriormente descritos) en el ratón NPC1 L1 de tipo silvestre (+/+) el cual fue alimentado con la muestra y en el ratón deficiente en NPC1L1 (-/-) son menores que la cantidad de absorción de colesterol y/o sitoestanol en el ratón NPC1 L1 de tipo silvestre (+/+) el cual no fue alimentado con la muestra.

EJEMPLO 27 Análisis de unión utilizando vesícula de membrana del borde en cepillo El siguiente ensayo de selección se puede utilizar para identificar la presencia de un ligando de NPC1 L1 en una muestra.

Materiales. Los siguientes dos compuestos se sintetizaron para el ensayo de unión descrito en la presente invención, 3H-ezetimiba glucurónido 1 (34.5 Ci/milimoles) y su derivado 35S-propargil-sulfonamida 2 (800-1100 Ci/milimoles). ezetimíba -glucurónido 1 S-propargil-sulfonamida ezetimiba -glucurónido 2 Síntesis de ezetimiba glucurónido y S-propargil-sulfonamida ezetimiba-glucurónido. La ezetimiba glucurónido (compuesto 1) (también referida como EZE-glucurónido) que puede elaborar de conformidad con los procedimientos en la Patente de E.U.A. No. 5,756, 470. El esquema general a continuación ¡lustra un método para la síntesis del compuesto 2 y del compuesto 35S-2 radiomarcado.

Preparación del compuesto 35S-2 (compuesto 2 con 35S radiomarcado) Paso A: Preparación de [35S]N-prop-2-in-1-ilmetansulfonamida (i). El volumen apropiado de [35S]cloruro de metan sulfonilo (véase Dean, D. C; et al., J. Med. Chem. 1996, 39, 1767) totalizando 3.5 mCi se removió a partir de una solución de almacenamiento en cloruro de metileno y se colocó en un matraz cónico de 5 mL. Luego éste se destiló a presión atmosférica hasta que el volumen fue de aproximadamente 50 µL. A esta solución inmediatamente se le añadieron 50 µL de propargilamina. Después de 15 minutos, la mezcla de reacción se diluyó con 10 mL de acetato de etilo, se lavó con solución saturada de bicarbonato de sodio (3 x 2 mL), y se secó sobre sulfato de sodio. Después de la filtración, la solución resultante tuvo una cuenta de 3.3 mCi y una pureza radioquímica de 99.9 % mediante CLAR (columna Zorbax XDB C8, 4.6 x 150 mm, 5 % de acetonitrilo: H2O (0.1 % de TFA) a 100 % de acetonitrilo, 15 minutos de gradiente lineal, 1 mL/min, tR = 4.4 min). Paso B: Preparación de [35S]4-[(2S,3R)-3-[(3S)-3-(4-fluorofenil)- 3-hidroxipropil]-1 -{3-[(metilsulfonil)amino]prop-1 -in-1 -il}fenil)-4-oxoazetidin-2-iljfenil metil-ß-D-glucopiranosiduronato ([35S]) (iii). Disolver 3.0 mCi de [35S]N-prop-2-in-1-ilmetansulfonamida, 1 mg de compuesto ii (preparado de conformidad con Burnett, D. S. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2002), vol. 12, p. 311 ), y 1 µL de trietilamina en 100 µL de dimetilformamida dentro de un tubo plástico para microfuga. A esta solución se le añadieron 10 µL de una solución de almacenamiento que contenía 8.1 mg de tetrakis (trifenilfosfina) paladio(O) y 1.4 mg de yoduro de cobre en 1 mL de dimetilformamida. Agitar a temperatura ambiente por sesenta horas tiempo en el cual la CLAR indicó 55% de conversión. Esta mezcla de reacción, la cual tuvo una pureza radioquímica de 44.4% mediante CLAR (columna Zorbax XDB C8, 4.6 x 150 mm, 5% de aceto n ¡tri lo :H2O (0.1 % de TFA) a 100% de acetonitrilo, 15 minutos de gradiente lineal, 1 mL/min, tR = 9.3 min) se tomó directamente para el siguiente paso. Paso C: Preparación del ácido [35S]4-[(2S,3R)-3-[(3S)-3-(4-fluorofenil)-3- hidroxipropil]-1-(4-{3-[(metilsulfonil)amino]prop-1-¡n-1-il}fen¡l)-4-oxoazetidin-2-il] fenil ß-D-glucopiranosidurónico 35S-2. La mezcla de reacción sin purificar que contenía el compuesto iii se trató con 25 µL de metanol, 90 µL de agua, y 30 uL de trietilamina y se agitó a temperatura ambiente por una hora tiempo en el cual se concentró casi hasta secarla bajo una corriente lenta de nitrógeno. El residuo se disolvió en 1 :1 acetonitr¡lo:H20 y se sometió a cromatografía semi-preparativa (columna Zorbax XDB C8 250 x 9.4 mm, 70:30 acetonitrilo:H20 (0.1 % de TFA) 4 mL/min, inyecciones 1 x 0.2 mL). Se obtuvieron 540 µCi del producto el cual tuvo una pureza radioquímica de 99.9% mediante CLAR (columna Zorbax XDB C8, 4.6 x 150 mm, 70:30 acetonitrilo: H20 (0.1 % de TFA), 1 mL/min, tR= 10. 41 min) y se coeluyó con una muestra auténtica del compuesto 2. LC/MS m/z = 508 (producto-glucurónido-H20), SA = 769 Ci/milimoles.

Preparación alterna de 35S-2. Paso A: Preparación de iii. El volumen apropiado de [35S] cloruro de metan sulfonilo (véase Dean, D. C; et al., J. Med. Chem. 1996, 39, 1767) totalizando 1.3 mCi se removió a partir de una solución de almacenamiento en cloruro de metileno y se colocó en un matraz cónico de 5 mL. Luego éste se destiló a presión atmosférica hasta que el volumen fue de aproximadamente 50 µL. A esta solución inmediatamente se le añadió una solución de 1 mg de y en 5 µL de piridina (recientemente destilada sobre hidruro de calcio). CH La solución se agitó a temperatura ambiente por cinco minutos, tiempo en el cual se concentró casi hasta secarla bajo una corriente lenta de nitrógeno. Esta mezcla de reacción, la cual tuvo una pureza radioquímica de 80.1 % mediante CLAR (columna Zorbax XDB C8, 4.6 x 150 mm, 5% de acetonitrilo:H20 (0.1% de TFA) a 100% de acetonitrilo, 15 minutos de gradiente lineal, 1 mL/min, tR = 9.3 min) se tomó directamente para el siguiente paso. Paso B: Preparación de 35S-2. La mezcla de reacción sin purificar que contenía iii se trató con 25 µL de metanol, 90 µL de agua, y 30 µL de trietilamina y se agitó a temperatura ambiente por una hora, tiempo en el cual se concentró casi hasta secarla bajo una corriente lenta de nitrógeno. El residuo se disolvió en 1 :1 acetonitrilo:H20 y se sometió a cromatografía preparativa (columna Zorbax XDB C8 250x 9.4 mm, 70: 30 acetonitriio:H20 (0.1% de TFA) 4 mL/min, inyecciones 1 x 0.2 mL). 350 µCi del producto se obtuvieron el cual tuvo una pureza radioquímica de 98.4 % mediante CLAR (columna Zorbax XDB C8, 4.6 x 150 mm, 70:30 acetonitrilo:H20 (0.1 % de TFA), 1 mL/min, tR = 10.4 min) y se coeluyó con una muestra auténtica del 2. LC/MS m/z = 508 (producto-glucurónido-H20), SA = 911 Ci/milimoles. Siguiendo el mismo procedimiento general para la síntesis de 35S-2, excepto omitiendo el marcado, se pueden preparar los compuestos 2 y ]y.

Preparación de vesículas de la membrana del borde en cepillo (BBMV). Las membranas se prepararon a partir de intestinos de macaco Rhesus (Macaca mulatta), rata (macho Sprague-Dawley), y ratón (macho C57BL/6J), utilizando el método de precipitación de Mg++ descrito en las siguientes referencias y con modificaciones descritas a continuación (Hauser, H., Howell, K., Dawson, R. M. C, Bowyer, D. E. Biochim. Biophys. Acta 602, 567-577 (1980); Kramer, W., Girbig, F., Gutjahr, U., Kowalewski, S., Jouvenal, K., Muller, G., Tripier, D., Wess, G. J. Biol. Chem. 268, 18035-18046 (1993); Rigtrup, K. M., Ong, D. E. Biochemistry 31 ,2920-2926 (1992)). Los intestinos a partir de animales recientemente preparados se cortaron en segmentos, se perfundieron con solución salina con regulador de pH enfriado en hielo (regulador de pH A: NaHC03 26 mM, NaH2P04 0.96 mM, HEPES 5 mM, glucosa 5.5 mM, NaCI 117 mM, KCl 5.4 mM, pH = 7.4), se colocaron sobre placas de vidrio en frío, se abrieron longitudinalmente, y la mucosa se raspó con portaobjetos de vidrio para microscopio. Esta mucosa se pudo utilizar fresca o congelada con resultados idénticos. Para preparar las membranas, los raspados de mucosa se resuspendieron en 20 volúmenes de regulador de pH frío que consistía de D-mannitol 300 mM, EGTA 5 mM, Tris 12 mM, pH 7.4 con HCl, y que contenía PMSF 0.1 mM y una dilución 1 % de un cóctel de un inhibidor de proteasa (set 1 , Calbiochem). Estos se homogeneizaron utilizando un Polytron a velocidad media sobre hielo hasta que la inspección con un microscopio indicó una lisis completa de la célula. Posteriormente, añadió lentamente MgCI2 sólido con agitación a una concentración final de 10 mM, y la solución se mantuvo en agitación sobre hielo por 15 minutos. Los restos celulares se removieron mediante centrifugación por 15 minutos a 3,000g, y las membranas se recuperaron mediante centrifugación por 60 minutos a 48,000g. Posteriormente las membranas se enjuagaron mediante re-suspensión en un regulador de pH que contenía D-mannitol 50 mM, EGTA 5 mM, y Tris 2 mM a pH 7.40, y se centrifugaron por 60 minutos a 48,000 g. El concentrado final se resuspendió en NaCI 120 mM y Tris 20 mM a pH 7.40 hasta una concentración de -10- 20 mg de proteína/ml, se alicuotó, se concentró en nitrógeno líquido, y se almacenó a -80°C. La actividad fue estable de manera indefinida y se pudo congelar-descongelar con mínima pérdida de la actividad.

La proteína membranal se midió mediante el ensayo de Bradford (Bradford, M. M. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976)) utilizando albúmina de suero de bovino como estándar. El enriquecimiento en las membranas del borde en cepillo se evaluó utilizando gamma-glutamiltransferasa como una enzima marcadora (Kramer, W., Girbig, F., Gutjahr, U., Kowaiewski, S., Jouvenal, K., Muller, G., Tripier, D., Wess, G. J. Biol. Chem. 268, 18035-18046 (1993)), lo cual indicó un enriquecimiento de 6 veces sobre el homogeneizdo inicial.

Ensayo de unión. Los ensayos se llevaron a cabo en tubos de ensayo de vidrio de 12 x 75 mm y a un volumen total de 20-100 ul. En general, las membranas congeladas se diluyeron en regulador de pH A o regulador de pH A que contenía 0.03% de taurocolato y 0.05% de digitonina hasta una concentración final de 0.02 a 5 mg/ml. Los ligandos radiomarcados típicamente fueron 25-50 nM para 3H-ezetimiba (EZE) glucurónido 1 , y 3-5 nM para su análogo 35S 2, en el ensayo, y éstos se administraron como soluciones de DMSO o CH3CN. Los ligandos para competencia se añadieron de manera similar como soluciones de DMSO para producir un contenido total de solvente orgánico de 2-10 %. La unión no específica se definió mediante competencia con 100 uM ezetimiba glucurónido. Posteriormente se encontró que al menos 2 componentes del regulador de pH A, el bicarbonato y las sales de fosfato, no eran importantes y se omitieron de manera rutinaria. Para asegurar que se estableció el equilibrio, las reacciones con el compuesto 1 se incubaron al menos 3 horas para las membranas de rhesus y al menos una hora para las membranas de rata a temperatura ambiente, y con el compuesto 2 por tanto tiempo como por 2 horas a 37°C con las membranas en cepillo de rhesus y de rata. Adicionalmente, las reacciones con el compuesto 2 se incubaron por tanto tiempo como por 2 horas a 37°C con membranas a partir de las células HEK-293 que expresan NPC1L1 de ratón, de rata o de humano. El ligando de unión se cuantificó mediante filtración al vacío en un tubo particular utilizando filtros de fibra de vidrio GF/C. Los filtros de fibra de vidrio (GF/C) se obtuvieron a partir de Whatman. Los filtros se pretrataron al sumergirlos en 0.5% de polietilenimina para reducir la unión no especifica. La filtración se logró mediante la adición de 2.5 ml de regulador de pH enfriado en hielo (NaCI 120 mM, 0.1 % de colato de sodio, y MES 20 mM a pH 6.70) al tubo para ensayo, vertiendo la mezcla a través del filtro, y luego enjuagando el tubo y el filtro dos veces más con otros 2 x 2.5 ml de regulador de pH. Los filtros se contaron en viales de 7 ml utilizando fluido para centelleo líquido Packard DM. Se llevaron a cabo los ensayos por triplicado, el error estándar típicamente fue de < 4%. Como un ejemplo, se proporciona un ensayo de 100 µl ensayo de membranas del borde en cepillo de rata a 2 mg/ml en la presencia de 400,000 dpm (50 nM) de 3H-ezetimiba glucurónido que produjo una unión especifica de 15,000 dpm y una unión no especifica de 3,000 dpm. Los filtros contribuyeron a la mayoría de la unión no específica (2,000 dpm).

Alternativamente, la filtración al vacío del compuesto 2 sobre una placa de 96 pozos Millipore (Whatman GF/C) también se puede utilizar para alcanzar una precisión adecuada.

Análisis de los datos. Los datos a partir de los experimentos por saturación se sometieron a un análisis de Scatchard, y se llevó a cabo la regresión lineal para producir la constante de disociación en equilibrio (Kd) y la concentración máxima del receptor (Bmax). Los coeficientes de correlación para estas determinaciones típicamente fueron mayores de 0.96. Los datos a partir de los experimentos de competencia se analizaron y se determinaron los valores IC50 a partir de las gráficas de Hill de los datos de unión. Los datos cinéticos para la asociación y disociación del ligando se sometieron al análisis de Weiland y Molinoff (Weiland, G., Molinoff,. B. Life Sci. 29, 313-330 (1981 )). La constante de velocidad de disociación para (k-i) se determinó directamente para una gráfica de primer orden de la disociación del ligando contra el tiempo. La velocidad de asociación del ligando (k-i) se determinó a partir de la ecuación ki = kobs ([LRe]/([L] [LRjmax)) en donde [L] es la concentración del ligando, [LRe] es la concentración del complejo en equilibrio, [LRjmax es el número máximo de receptores presentes, y kobs es la pendiente de la gráfica en pseudo-primer orden Ln([LE]c/([LR]c-[LR] t)) contra el tiempo.

Análisis de unión. La ezetimiba se convierte rápidamente hacia su glucurónido in vivo, y se piensa que este metabolito es en gran medida, si no es que exclusivamente, responsable para la inhibición de la toma del colesterol. Por consiguiente, tanto la 3H-ezetimiba como su derivado correspondiente de glucurónido (1 ) se prepararon y evaluaron para la unión a las preparaciones intestinales de la membrana del borde en cepillo, utilizando una técnica de filtración mediante tubo particular al vacío. Como un resultado de la naturaleza hidrófoba de la 3H-ezetimiba, se observó una alta unión no específica, impidiendo su uso como un radioligando para el ensayo de unión. No obstante, debido a las propiedades físicas mejoradas del derivado de glucurónido, se observó unión específica con este radioligando y se utilizó para evaluar la unión en las membranas intestinales del borde en cepillo de rhesus, rata, y ratón. Los raspados intestinales de rhesus, rata, y ratón se homogeneizaron y se aislaron las membranas del borde en cepillo. Se observó la unión específica exclusivamente en la fracción membranal. Las gráficas muestran la unión total, no específica, y específica a las membranas del borde en cepillo de rhesus (figura 1 ) y de rata (figura 2). Las alícuotas de rhesus BBMV (83 µg/ensayo) o de rata BBMV (250 µg/ensayo) se incubaron con concentraciones en incremento de 3H-EZE-glucurónido. Se muestran la unión total y la unión no específica determinadas en la presencia de 10-100 uM EZE-glucurónido. La unión específica se calculó a partir de la diferencia entre la unión total y la unión no específica. Los datos se ajustaron mediante regresión no lineal como se describió anteriormente, y se muestra la gráfica de Scatchard lineal. En las membranas de rhesus, los datos corresponden a un sitio único de unión con Kd = 41 nM y una concentración de 5.5 pmol/mg de la proteína membranal. La afinidad es -10 veces menor en las membranas de rata (Kd = 540 nM). 3H-EZE-glucurónido no es el mejor ligando para un ensayo de unión para el ratón blanco debido a la baja afinidad de los compuestos en la membrana de ratón. Estas potencias correlacionan escasamente con la sensibilidad de estas especies al inhibidor de la toma de colesterol ezetimiba.

Velocidades constantes para la unión y disociación. La ezetimiba -glucurónido se muestra que se une, y forma un complejo relativamente de vida larga con su receptor. De hecho, esto fue clave para detectar la interacción en un ensayo tradicional de unión al filtro, puesto que las interacciones del ligando/receptor con valores Kd mayores de 100 nM frecuentemente no se reconocen debido a las velocidades de disociación típicas de los ligandos. Las constantes de velocidad para la asociación (kon) y disociación (k0ff) del compuesto 1 se determinaron para las membranas de rata y de rhesus, y se utilizó como un método alternativo para calcular la constante de disociación (Kd) de conformidad con la relación Kd =k0ff/k0n- 300 µg/ensayo de vesículas de membrana del borde en cepillo de rata se incubaron con 3H-EZE-glucurónido 25 nM a temperatura ambiente por hasta tres horas para los estudios de cinética de asociación. 83 µg/ensayo de vesículas de membrana del borde en cepillo de rhesus se incubaron con 3H- EZE- glucurónido 25 nM a temperatura ambiente por hasta cinco horas para los estudios de cinética de asociación. La unión no específica que se midió en la presencia de EZE-glucurónido 100 µM se sustrajo a partir de la unión total para calcular la unión específica que se muestra en las figuras 3A y 4A. Para el estudio de cinética de disociación, se incubaron las vesículas de membrana del borde en cepillo de rata con 3H-EZE-glucurónido 25 nM por 2 horas a temperatura ambiente y se inició la disociación del ligando mediante la adición de EZE- glucurónido 100 µM. Las vesículas de membrana del borde en cepillo de rhesus se incubaron con 3H-EZE-glucurónido 42 nM por 4 horas a temperatura ambiente y se inició la disociación del ligando mediante la adición de EZE-glucurónido 100 µM. Para ambos estudios de disociación en rata y en rhesus, las muestras se recolectaron en diversos momentos y se detectó una radiomarca. Las curvas de disociación se muestran en las figuras 3B (rata) y 4B (rhesus). Para membranas de rata, la constante de velocidad para la asociación es kon = 5,540 M"1 s"1 (en comparación con 108 a109 M"1 s"1 para el encuentro que controla la difusión), y la velocidad de constante para la disociación es = 2.4x10"3 s~\ que corresponde a una vida media de 4.7 minutos. Los datos se muestran en la figura 3, en donde las líneas sólidas son teóricas para estas constantes de velocidad. El valor Kd pronosticado a partir de estas constantes de velocidad (Kd = k0ff/kon = 440 nM) concuerda bien con aquel medido en el equilibrio (Kd = 540nM). Para las membranas de rhesus, en donde 3H-ezetimiba glucurónido es al menos 10 veces más potente (como se describió anteriormente), la velocidad de asociación permanece siendo la misma pero la vida media para el disociación del complejo se incremente a -90 minutos. Estos datos se muestran en la figura 4, en donde las líneas teóricas corresponden a kon= 3,900 M" s"1 y k0ff= 1.23x10"4 s"1, y Kd pronosticada = 32 nM en comparación con aquella medida en el equilibrio (Kd = 41 nM).

EJEMPLO 28 Análisis de unión de un potente ligando de NPC1L1 Un análogo marcado con 35S de propargil-sulfonamida de ezetimiba glucurónido (35S-2) se identificó como un antagonista NPC1 L1 potencial. El compuesto 2 se preparó como se describió en el ejemplo 27 y se encontró que mejora marcadamente la afinidad para algunas especies de vesículas de membrana del borde en cepillo. Para las vesículas de membrana del borde en cepillo de rhesus, se incubaron 56 µg de proteína/ensayo con 3H-EZE- glucurónido 25 nM en la presencia de concentraciones en incremento de EZE-glucurónido y 2. Para las membranas de vesículas del borde en cepillo de rata, se incubaron 150 µg de proteína/ensayo con 3H-EZE-glucurónido 50 nM en la presencia de concentraciones en incremento de EZE- glucurónido y 2. Para las vesículas de membrana del borde en cepillo del ratón, se incubaron 20 µg de proteína/ensayo con 35S-2 3 nM en la presencia de concentraciones en incremento de EZE- glucurónido y 2. 2 es más potente en contra de las preparaciones de membrana del borde en cepillo del enterocito a partir de las ratas (35 veces), pero es equipotente con la ezetimiba glucurónido para las preparaciones de membrana de rhesus (figuras 5A y 5B, cuadro 8). También se mejoró la afinidad para las membranas de ratón (figura 6, cuadro 8).

CUADRO 8 Resumen de las constantes de inhibición (Ki) para la unión de ezetimiba glucurónido 1 y su derivado de propargil-sulfonamida 2 a membranas intestinales del borde en cepillo de rata, y ratón Los valores Ki son en nM.

EJEMPLO 29 Distribución de la unión de la 3H-ezetim¡ba glucurónido a los tejidos intestinales Los estudios previos han establecido que la absorción del colesterol ocurre principalmente en el yeyuno, y es sustancialmente menor en el íleon y duodeno. Para determinar si la actividad de unión se distribuye de manera similar, se utilizaron los ensayos de unión utilizando la 3H-ezetimiba glucurónido (3H-1) como un radioligando para determinar la distribución de los sitios de unión en las secciones a partir de los intestinos de rhesus y rata. Para los estudios de rhesus, se separaron 10 cm que corresponden al íleon de un intestino delgado de rhesus y el intestino remanente se dividió en tres segmentos, (proximal, medio y distal) de longitud igual (70 cm cada uno). Para los estudios en rata, 10 cm que corresponden al íleon de un intestino delgado de rhesus se separaron y el intestino remanente se dividió en tres segmentos, (proximal, medio y distal) de longitud igual (36 cm cada una). Las vesículas de membrana del borde en cepillo se prepararon como se describió en el ejemplo 27. Las alícuotas de las vesículas (100-200 µg) proteína/ensayo se incubaron con 3H-EZE-glucurónido 50 nM en la ausencia y presencia de EZE-glucurónido 100 µM. Como se muestra en las figuras 7A y 7B, la unión específica para la 3H-ezetimiba glucurónido tiene un pico en el yeyuno de ambas especies, consistente con el patrón previamente observado de absorción de colesterol.

EJEMPLO 30 Correlación de la actividad de unión in vitro e in vivo de la NPC1 L1 Para determinar si la actividad de unión in vitro pronostica la eficiencia ¡n vivo, el enantiómero de ezetimiba glucurónido y varios análogos estructurales cercanos de ezetimiba glucurónido que fueron evaluados en el ensayo de unión a la membrana de rata se evaluaron en un estudio sobre la absorción aguda de colesterol en rata como se describió en los ejemplos 23-26. Los análogos seleccionados tuvieron un intervalo de potencias in vitro, y se anticiparon para tener propiedades físicas similares a la ezetimiba glucurónido (cuadros 9 y 12). El enantiómero, el cual tiene una Kd > 100,000 nM para la rata blanco, fue inactiva en el ensayo in vivo. Para los otros análogos, se observa la misma clasificación de orden de potencia en los ensayos in vitro e in vivo, la evidencia adicional sugiere que la unión observada se debe al blanco de ezetimiba.

CUADRO 9 Valores ICso de EZE-gluc y análogos para inhibir la unión de 3H-EZE-gluc a las vesículas de membrana del borde en cepillo de rata Compuestos 1, 3, 5, 6 y 7.

Estructura base para el compuesto 4.

EJEMPLO 31 Afinidades de unión de ezetimiba glucurónido y sus análogos a NPC1 L1 recombinante NPC1 L1 se identificó como un blanco candidato de ezetimiba a partir de una búsqueda de bases de datos genéticos para los motivos de unión el colesterol. Subsecuentemente, se encontró que los ratones deficientes en NPC1L1 tienen una reducción del 80% en la absorción del colesterol, y no responden al tratamiento con ezetimiba, sugiriendo fuertemente que esta proteína se requiere para la eficiencia de la ezetimiba.

Para determinar si NPC1L1 es el blanco directo de la ezetimiba, se compararon las afinidades de unión para la ezetimiba glucurónido y varios análogos a las células tansfectadas de NPC1 L1 y vesículas de membrana del borde en cepillo de rata. Las células CHO tansfectadas con NPC1 L1 de rata (-500,000 células/ensayo) se incubaron con 35S-2 5 nM (-1 millón de dpm/ensayo) por 2 horas a 37°C en la ausencia o presencia de concentraciones en incremento de EZE-glucurónido (compuesto 1 ), compuestos 2, 3, 5, 6, ó 8. El compuesto 8 es un análogo del compuesto 2 en donde el grupo hidroxilo en la porción 3-hidroxilpropil de 2 se reemplaza con un grupo oxo. NPC1 L1 de humano tansfectada con células CHO (-600,000 células/ensayo) se incubó con 35S-2 5 nM (-1 millón de dpm/ensayo) en regulador de pH A por 2 horas a 37°C en la ausencia o presencia de concentraciones en incremento de EZE-glucurónido (compuesto 1 ), compuestos 2, 3, 5, 6, u 8. Como se muestra en las figuras 9 y 12, y el cuadro 10, las afinidades para las proteínas recombinantes y nativas son virtualmente idénticos, proveyendo evidencia precisa de que la NPC1 L1 es el blanco directo de la ezetimiba en tejidos de mamífero, y que no se requieren otras proteínas para su unión.

Las afinidades de ezetimiba glucurónido y análogos de las mismas también se determinaron para la NPC1L1 recombinante de humano. Los resultados, como se muestran en la figura 9, indican que el glucurónido ezetimiba (1 ) tiene una afinidad para la proteína de humano de 907 nM. El análogos de propargil-sulfonamida (2) es aproximadamente 50 veces más potente, con una kd = 21 nM, sugiriendo que estos compuestos tienen el potencial para la potencia mejorada de la absorción del colesterol en el hombre.

CUADRO 10 Comparación de las constantes de inhibición (Ki) para la unión a las membranas intestinales del borde en cepillo de rata y membranas a partir de células transfectadas con NPC1L1 de rata EJEMPLO 32 Unión de 35S-2 a las membranas a partir de ratones de tipo silvestre y ratones deficientes en NPC1L1 La confirmación final de que NPC1L1 es el blanco de la ezetimiba se proveyó mediante los estudios de unión con 35S-2 en membranas intestinales del borde en cepillo a partir de ratones deficientes en NPC1 L1 y de ratones controla. Las vesículas membranales a partir del borde en cepillo se prepararon a partir de tejido intestinal de ratones de tipo silvestre y de ratones knockout para NPC1L1 (-/-). 15, 30 y 60 µg de proteína/ensayo de vesículas membranales el borde en cepillo se incubaron con 35S-2 4 nM en regulador de pH A por 3 horas a 37°C en la presencia y ausencia de EZE-glucurónido 100 µM. Los resultados, que se muestran en las figuras 10A y 10B, indican que no se observó unión detectable en las membranas a partir de ratones deficientes en NPC1 L1 , mientras que las membranas control de tipo silvestre de edad coincidente tuvieron unión detectable. La afinidad de unión observada en este experimento en las membranas de ratón control (Kd=156 nM) fue virtualmente idéntica a aquella observada en los estudios previos (figura 11 ).

EJEMPLO 33 Análisis de unión utilizando vesículas de membrana del borde en cepillo a partir de rata, ratón y mono rhesus Los estudios de unión se llevaron a cabo para comparar la afinidad de unión relativa de la ezetimiba glucurónido a diversas vesículas de membrana del borde en cepillo. La 3H-ezetimiba glucurónido 1 se preparó como se describió en el ejemplo 27. Las membranas del borde en cepillo se prepararon como se describió en el ejemplo 27. Ensayos de unión. Los ensayos se llevaron a cabo en tubos de ensayo de vidrio de 12 x 75 mm y con un volumen total de 20-100 µL. En general, las membranas congeladas se diluyeron en regulador de pH A o regulador de pH A que contenía 0.03% de taurocolato y 0.05% de digitonina hasta una concentración final de 0.5 a 5 mg/ml (regulador de pH A: NaHC03 26 mM, NaH2PO4 0.96 mM, HEPES 5 mM, glucosa 5.5 mM, NaCI 117 mM, KCl 5.4 mM, pH = 7.4). Las concentraciones finales de [3H] ezetimiba glucurónido 1 típicamente fueron de 25-50 nM, y se administraron como soluciones de DMSO o CH3CN. De manera similar se añadieron los ligandos competentes como soluciones de DMSO para producir un contenido de solvente orgánico total de 1-5 %. La unión no específica se definió mediante la competencia con 100-500 µM ezetimiba glucurónido. Se encontró que al menos tres componentes de regulador de pH A, el bicarbonato y las sales de fosfato, y la glucosa, no eran importantes y se omitieron de manera rutinaria. Las reacciones se incubaron hasta que se alcanzó el equilibrio (una hora para las membranas de rata o tres horas para las membranas de rhesus). El ligando unido se recuperó mediante filtración al vacío en un tubo particular sobre filtros de fibra de vidrio Whatman GF/C. Los filtros se pretrataron al sumergirlos en 0.5% de polietilenimina para reducir la unión no específica. La filtración se logró mediante la adición de 2.5 ml de regulador de pH (NaCI 120 mM, 0.1 % de colato de sodio, y MES 20 mM a pH 6.7) enfriado con hielo al tubo de ensayo, vertiendo la mezcla a través del filtro, y luego enjuagando el tubo y filtrando dos veces más con otros 2 x 2.5 ml del regulador de pH. Los filtros se contaron en viales de 7 ml utilizando fluido para centelleo líquido Ultima Gold MV a partir de Packard. En donde se realizaron ensayos por triplicado, el error estándar típicamente fue de < 4%. Como un ejemplo, un ensayo con 100 µl de membranas del borde en cepillo de rata a 2 mg/ml en la presencia de 400,000 dpm (50 nM) [3H] ezetimiba glucurónido produjo 15,000 dpm de uniones específicas y 3,000 dpm de uniones no específicas. Los filtros contribuyeron en gran parte a la unión no específica (2,000 dpm). Análisis de datos. Después de la corrección para la unión no específica, unión por saturación los datos se ajustaron mediante regresión no lineal (Sigma Plot) a la expresión [B] = Bmax x[L]/([L] +KD). Las gráficas lineales de Scatchard se muestran para ilustración. Los datos en Ki a partir de los experimentos de competencia se analizaron mediante regresión no linear a la expresión [B]=[Bo]/(1 +[l]/Kiobs), y cuando se requirió fueron corregidos para competencia por radioligando como Ki = Kiobs/(1 +[L*]/KD). Las constantes de velocidad de primer orden (k0bs y k0ff) se determinaron mediante regresión no linear a la ecuación de velocidad de primer orden A= A0e"kt. Los datos cinéticos para kon se analizaron de conformidad con Weiland y Molinoff (32), utilizando la ecuación kon = k0bs ([LR]e/([L] [LR]max)), en donde [L] es la concentración del ligando, [LR]e es la concentración del complejo en equilibrio, [LRjmax es el número máximo de receptores presentes, y k0bs es la constante aparente de velocidad de primer orden. Análisis de unión. Se llevaron a cabo los estudios de unión utilizando la [3H] ezetimiba glucurónido, un ensayo tradicional con filtración rápida sobre filtros de fibra de vidrio utilizando preparaciones de membranas del borde en cepillo de enterocito a partir de rata, ratón y mono rhesus (cuadro 1 1 ). El cuadro 11 muestran las afinidades de unión de [3H] ezetimiba glucurónido a las membranas en la ausencia de detergentes. La unión observada fue específica, saturable, y consistente con un sitio molecular particular. El análisis de Scatchard y la ventana de unión específica/no específica para rata y mono se muestran en la figura 12. La afinidad de unión es relativamente débil en membranas de rata (KD = 542 nM) y que incluso más débil en membranas de murino (KD = 10,000 nM). En contraste, la afinidad de unión en las membranas de mono rhesus es aproximadamente 10 veces mayor (KD= 41 nM). El número de sitios de unión varía de 5-20 pmol/mg de proteínas de membrana dependiendo de las especies y la preparación. Se determinaron las velocidades de unión y disociación de la [3H] ezetimiba glucurónido y se encontró que son lentas en relación con aquellas típicamente observadas para las interacciones de proteína-ligando. Por ejemplo, las constantes de velocidad para la asociación a las membranas del borde en cepillo de rata y mono son kon= 5.54 y 3.90 x103 M"1 s"1 (figura 12). Estas son 100,000 veces más pequeñas que aquellas típicamente observadas para un encuentro de difusión controlada, 108 a 109 M"1 s"1. De manera similar, estos complejos tienen una vida inusualmente larga, se disocian con constantes de velocidad de koff = 2.4 x 10"3 s"1 y 1.2 x 10"4 s"1 a 25°C, equivalentes a vidas medias de 4.7 y 96 minutos para los complejos de rata y mono, respectivamente. En comparación, las vidas medias son normalmente < 1 segundo para la disociación de la difusión común controlada, KD de los ligandos 100 nanomolar. Estas son valores de constantes de velocidad pronosticadas KD (KD = k0ff/kon) de 440 y 32 nM, respectivamente, las cuales coinciden con aquellas medidas mediante titulación en equilibrio (figura 12), y mediante saturación como se describió anteriormente. Dichos compiejos que se forman de manera lenta, con larga vida, sugieren que los cambios conformacionales en la proteína son limitantes de la velocidad.

CUADRO 11 Comparación de la afinidad de unión de la ezetimiba y eficiencia entre especies El cuadro 11 también muestra una correlación entre la unión in vitro e in vivo de la [3H] ezetimiba glucurónido en diversas preparaciones de membranas del borde en cepillo del enterocito a partir de rata, ratón y mono rhesus. Los valores ED50 in vivo se derivan a partir de los estudios de absorción del colesterol y suministro del colesterol. El orden de clasificación de la potencia de la ezetimiba (ED50) in vivo es como sigue: rhesus (0.0005 mpk) > rata (0.03 mpk) > ratón (0.5 mpk) es el mismo que el orden de la afinidad de unión in vitro (IC50) como sigue: mono rhesus (41 nM) < rata (542 nM) < ratón (12,000 nM). Las afinidades de unión de 1 a las membranas del borde en cepillo correlaciona bien entre las especies con sensibilidad a la inhibición de la toma de colesterol in vivo por ezetimiba (ratón < rata < mono) (Clader, J. W. The discovery of ezetimibe; A view from outside the receptor. J Med. Chem. 47, 1-9 (2004); Davis, H. R. Jr., Compton, D. S., Hoos, L. & Tetzioff, G. Ezetimibe, a potent cholesterol absorption inhibitor, inhibits the development of atherosclerosis in ApoE knockout mice. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 21 , 2032-2038 (2001 ); Burnett, D. A. Beta-lactam cholesterol absorption inhibitors. Curr. Med. Chem. 11 , 1873-1887 (2004), consistente con la hipótesis de que el ensayo es relevante al blanco de ezetimiba in vivo (cuadral 1 ). Puesto que es evidente que esta interacción es muy específica, se preparó el glucurónido del enantíómero de ezetimiba y se encontró que es completamente inactivo in vitro (Ki > 100 x KD para la ezetímiba glucurónido en todas las especies), consistente con su ausencia de actividad in vivo en un modelo de absorción aguda de colesterol en rata (véase el cuadro 12 en el cual se analiza el enantiómero).

EJEMPLO 34 NPC1L1 tiene el blanco de ezetimiba en las células HEK293 gue expresan NPC1 L1 Este ejemplo demuestra que la ezetimiba se une específicamente a las células HEK293 que expresan NPC1L1. Expresión transitoria de NPC1 L1. El plásmido pCR3. 1 que expresa NPC1L1 de rata (Genbank AY437867) o NPC1L1 de humano (Genbank AY437865) se prepararon utilizando protocolos estándares de biología molecular. Las células HEK-293 (ATCC) se sembraron a 10 x106 células por botella T-225 (Corning) en DMEM que contenía 10% de suero de ternera fetal, 4.5 g/L de D-glucosa y L-glutamina, 18 horas antes de la transacción. Estas se transfectaron de manera transitoria con 25 µg de ADN utilizando el reactivo para transfección Fugene (Roche Biochemical) a una relación de 6:1 Fugene:ADN. Después de la transfección, las células se incubaron a 37°C y 5% de C02 por 48 horas, y luego se cosecharon utilizando un regulador de pH para disociación celular basado en PBS (Gibco), se concentraron a 500 x g, se congelaron de manera instantánea sobre hielo seco, y se almacenaron a ~80°C. Preparación de membrana a partir de las células HEK-293. Las membranas se prepararon mediante la resuspensión de los concentrados celulares congelados en diez volúmenes de 20 mM HEPES/Tris regulador de pH a pH 7.40 que contenía 8% de sacarosa, y sonicando las suspensiones con una sonda para sonicación sobre hielo hasta que la mayoría de las células estuvieron fragmentadas. Para aislar las membranas, los sonicados se centrifugaron a 1600 x g por 10 minutos para remover los restos celulares, y luego los sobrenadantes se centrifugaron a 125,000 x g por 1 hora para recuperar las membranas. Las membranas se resuspendieron en 20 mM HEPES/Tris regulador de pH a pH 7.40 que contenía NaCI 160 mM y 5% de glicerol, y se almacenaron a 10-20 mg/ml de proteína a -80°C. Persiguiendo la reciente evidencia que indica que NPC1 L1 es un componente importante de la ruta inhibida por la ezetimiba, las NPC1 L1 recombinante de rata y de humano se expresan en células 293 de riñon embrionario humano (HEK) (figura 13, Panel 1 ). Los usados celulares a partir de las células HEK-293 que expresan NPC1L1 (líneas 1 y 3 del panel 1 figura 13) y las células de tipo silvestre (líneas 2 y 4 del panel 1 figura 13) se analizaron mediante electroforesis en gel y Western blot con un anticuerpo anti-NPC1 L1 A1801. Se incluyó un exceso del péptido específico a NPC1 L1 para evaluar la especificidad del anticuerpo para NPC1L1 (línea 3 y 4 del panel 1 figura 13). Los estudios de unión preliminares utilizando 1 revelaron unión específica a las preparaciones de membrana a partir de células que expresan NPC1 L1 , y unión no específica a membranas a partir de células no tansfectadas (datos no mostrados). La unión a las células que expresan NPC1 L1 también se observó con un análogo de ezetimiba glucurónido fluorescente marcado con BODIPY (SCH354909) (figura 13, panel 2A). El panel 2 de la figura 13 muestra imágenes de microscopio confocal de un análogo fluorescente de la ezetimiba glucurónido (SCH354909) unido a la superficie de las células NPC1L1-293 cells (panel 2A), la unión no específica de SCH354909 a las células NPC1 L1-293 en la presencia de ezetimiba glucurónido 100 µM no marcada (panel 2B), la unión de SCH354909 a las células HEK 293 de tipo silvestre (panel 2C), y la unión no específica de SCH354909 a las células HEK 293 de tipo silvestre en la presencia de ezetimiba glucurónido 100 µM no marcada (panel 2D). En cada caso, las células sembradas se incubaron en medio de cultivo con SCH354909 500 nM por 4 horas a 37°C. Las células se lavaron subsecuentemente con PBS y la fluorescencia se detectó utilizando microscopía confocal. La unión de SCH345909 fue claramente evidente en la superficie de la membrana celular de las células que expresan NPC1 L1 y se eliminó completamente en la presencia de exceso de ezetimiba glucurónido no marcada (figura 13, panel 2C). No se observó unión en las células HEK 293 de tipo silvestre (figura 13, paneles 2B y 2D). Estos resultados demuestran que la ezetimiba glucurónido se une específicamente a NPC1 L1.

EJEMPLO 35 NPC1 L1 como el blanco in vivo de la ezetimiba Para obtener evidencia de que la NPC1 L1 es el blanco de unión directo de la ezetimiba in vivo, se determinaron las afinidades de unión de 1 y de diversos análogos clave para NPC1 L1 recombinante de rata y de humano expresada en membranas de células HEK-293 y en comparación con aquellas de las membranas intestinales del borde en cepillo de enterocito nativos de rata y de rhesus. Se seleccionó una serie de análogos de la ezetimiba con una tenue diversidad estructural, pero sin afinidades de unión con las membranas nativas del borde en cepillo que abarcaron un intervalo de 1000 veces. El cuadro 12 muestra una comparación de las afinidades de unión (valores Ki) para las membranas de células NPC1 L1-293 recombinantes y membranas nativas del borde en cepillo. Los análogos seleccionados de la ezetimiba glucurónido se compararon en contra de las membranas con NPC1 L1 recombinante de rata y de humano preparadas a partir de células HEK-293 tansfectadas de manera transitoria en comparación con las membranas nativas del borde en cepillo de rata y de rhesus. Los ensayos de unión se llevaron a cabo en un volumen final de 20 µl en la presencia de 0.03% de taurocolato de sodio y 0.05% de digitonina hasta que se alcanzó el equilibrio. Se utilizaron 1.25 mg de proteína/ml y 100 nM de 1 para los experimentos con las proteínas nativas de rata, recombinantes de rata, y recombinantes de humano, y se utilizaron 1.25 mg de proteína/ml y 20 nM de 1 para los experimentos en mono rhesus nativo. La unión total observada y la unión no específica, respectivamente, en la ausencia de inhibición fueron para la rata nativa: 7,700 & 1 ,100, para la rata recombinante: 33,000 & 1 ,100, para el mono rhesus nativo: 7,300 &367, y para el humano recombinante: 19,200 & 1 ,000 dpm. Las estructuras análogas se definen en el cuadro 12. El compuesto 4 tiene la configuración estereoquímica 3S, 4R, y es el glucurónido del enantiómero de la ezetimiba. Estas determinaciones se llevaron a cabo en regulador de pH que contenía 0.03% de taurocolato y 0.05% de digitonina, niveles por debajo las concentraciones micelares críticas de estos detergentes. Estas condiciones mejoraron la unión aparente en tanto como 20 veces para las preparaciones recombinantes (principalmente un efecto Bmax), y en gran medida facilitaron una comparación cuantitativa de los valores K para 1 y sus análogos. Como se muestra en el cuadro 12, los valores Ki para las membranas NPC1 L1 recombinantes de rata y nativas del borde en cepillo de rata son virtualmente idénticos, sugiriendo fuertemente que NPC1 L1 es el blanco molecular de la ezetimiba in vivo. En el caso de las membranas a partir de células que expresan NPC1 L1 recombinante de humano, las afinidades de unión también son paralelas con aquellas observadas en las membranas de rata, mientras que las afinidades de unión para las membranas nativas del borde en cepillo de rhesus son de manera uniforme -10 veces más potentes. Este resultado es consistente con el hallazgo de que la ezetimiba es un orden de magnitud más potente en el mono que en el humano o rata (Clader, J. W. The discovery of ezetimibe; A view from outside the receptor. J Med. Chem. 47, 1-9 (2004); Jeu, L. & Cheng, J. W. Pharmacology and therapeutics of ezetimíbe (SCH 58235), a cholesterol-absorption ¡nhibitor. Clin. Ther. 25, 2352-2387 (2003)).

CUADRO 12 *el glucurónido del enantiómero de ezetimiba tiene la configuración 3S, 4R Evidencia conclusiva de que la NPC1 L1 es el blanco de la ezetimiba se proveyó por los estudios con tejidos a partir de ratones deficientes en NPC1L1. Las membranas del borde en cepillo del enterocito preparadas a partir de ratones deficientes en NPC1 L1 no mostraron una afinidad de unión específica detectable para 1 , mientras que las membranas a partir de ratones de tipo silvestre coincidentes en edad mostraron un alto nivel de unión específica con una KD= 12 µM (figura 14). Para la figura 14A, las membranas del borde en cepillo del enterocito se prepararon a partir de ratones deficientes en NPC1 L1 y ratones de la misma camada de tipo silvestre, del mismo sexo, y se evaluaron para la unión de 1. Las condiciones para la unión fueron 5 mg/ml de proteína y 500 nM de 1 en un volumen de 20 µl y en la presencia de 0.03% de taurocolato de sodio y 0.05% de digitonina. Las membranas a partir de ratones de tipo silvestre se encuentran hacia la izquierda y las membranas a partir de ratones deficientes en NPC1 L1 se encuentran hacia la derecha. La gráfica de barras indica la unión total (barra izquierda), la unión no específica en la presencia de ezetimiba glucurónido fría 500 µM (barra media), y la unión específica (barra derecha), respectivamente para cada uno de los ratones de tipo silvestre y deficientes en NPC1L1 , y las barras de error representan mediciones por triplicado. Las gráficas muestran que aunque la unión específica se detecta fácilmente en los ratones de tipo silvestre, ésta está ausente en los ratones deficientes en NPC1 L1. La figura 14B muestra una gráfica que muestra la competencia de la ezetimiba glucurónido no marcada en contra de 1. Las membranas a partir de ratones de tipo silvestre (curva superior) produjeron una Ki =12,000 nM, mientras que la unión específica fue virtualmente indetectable y las membranas a partir de animales knockout (curva inferior). Las condiciones fueron aquellas descritas en la figura 14A. Los presentes estudios incluyen una comparación cuantitativa de la unión entre las proteínas recombinantes y las proteínas de las membranas del borde en cepillo. SR-BI (eliminador del receptor tipo B1 ) se identificó previamente como un blanco potencial utilizando una estrategia de clonación de expresión que emplea la unión de ezetimiba a las proteínas candidato; esta hipótesis se eliminó fácilmente cuando no se afectó ni la absorción del colesterol ni la actividad de la ezetimíba en los ratones deficientes en SR-BI (Altmann, S. W. et al. The identification of intestinal scavenger receptor class B, type 1 (SR-B1 ) by expression cloning and its role in cholesterol absorption.

Biochem. Biophs. Acta 1580, 77-93 (2002)). Los resultados muestran que la ezetimiba se une a las membranas intestinales nativas y a las células que expresan NPC1 L1 recombinante con afinidad comparable, y no se une a las membranas a partir de ratones deficientes en NPC1 L1 , indicando una interacción específica de la unión entre la NPC1 L1 y la ezetimiba. Junto con los hallazgos previamente publicados de que los ratones deficientes en NPC1 L1 son defectuosos en la toma intestinal del coiesterol, y ya no responden a ezetimiba (Altmann, S. W. et al. Niemann-Pick Cl Likel Protein is critical for intestinal cholesterol absorption. Science 303, 1201-1204 (2004)), estos datos establecen definitivamente a la NPC1 L1 como el blanco directo de la ezetimiba.

EJEMPLO 36 Efecto de los detergentes sobre la unión de la f H] ezetimiba glucurónido Un aspecto práctico del trabajo con la proteína recombinante fue que el número de sitios de unión en las membranas de células NPC1L1-293 tansfectadas inicialmente pareció ser bastante bajo. La influencia de una combinación de 0.03% de taurocolato y 0.05% de digitonina sobre la unión específica estas preparaciones y las preparaciones de membrana nativa del borde en cepillo del enterocito es dramática como se ilustra en la figura 15. Cantidades iguales (25 µg de proteína) de membranas del borde en cepillo de rata, membranas a partir de las células HEK-293 que expresan de manera transitoria la NPC1 L1 recombinante de rata y de humano, se incubaron con 25 nM de 1 en un volumen final de 20 µl hasta que se alcanzó el equilibrio. Las condiciones de incubación fueron regulador de pH A con y sin taurocolato de sodio y digitonina hasta una concentración final de 0.03% y 0.05%, respectivamente. En el eje X, "C" denota los controles en la ausencia de detergente, y "+det" la respuesta en la presencia de ambos detergentes. Los resultados demuestran en agrupamientos de 3 barras; se muestra la unión total (barra de la izquierda en cada grupo de 3 barras), la unión no específica en la presencia de ezetimiba glucurónido 100 pM no marcada (barra el medio en cada grupo de 3 barras), y la unión específica (barra de la derecha en cada grupo de 3 barras).

EJEMPLO 37 Afinidades de unión de la ezetimiba glucurónido y varios análogos de la NPC1L1 en membranas de rata y de mono rhesus Como se determinó a partir de los resultados del ensayo de unión utilizando 3H-ezetimiba glucurónido con la membranas del borde en cepillo de rata, se determinó que los compuestos evaluados representativos de fórmula II tienen una IC50 de aproximadamente 13,000 nM o menor, y particularmente ciertos compuestos evaluados tuvieron una IC50 de aproximadamente 1900 nM o menor, más particularmente ciertos compuestos evaluados tuvieron una IC50 de aproximadamente 1000 nM o menor, y más particularmente ciertos compuestos evaluados tuvieron una IC50 de menos de 100 nM. Como se determinó a partir de los resultados del ensayo de unión utilizando 3H-ezetimiba glucurónido con membrana del borde en cepillo de rhesus, se determinó que los compuestos evaluados representativos de fórmula II tuvieron una IC50 de aproximadamente 4200 nM o menor, y particularmente ciertos compuestos evaluados tuvieron una IC50 de aproximadamente 165 nM o menor, más particularmente ciertos compuestos evaluados tuvieron una IC5o de menos de 100 nM, y más particularmente ciertos compuestos evaluados tuvieron una IC50 de menos de 50 nM. Las designaciones a continuación se utilizan en los ejemplos que siguen para cierta repetitividad utilizando los intermediarios: OH Los compuestos (3R,4S)-3-[(3S)-3-(4-fluorofenil)-3-hidroxipropil]- 4-(4-hidroxífen¡l)-1-(4-iodofenil)azetidin-2-ona (i-6) y 4-[(2S,3R)-3-[(3S)-3-(4-fIuorofenil)-3-hidroxipropil]-1 -(4-¡odofenil)-4-oxoazetídin-2-il]fenil metil ß-D-glucopiranosíduronato (i-7) se prepararon de conformidad con Burnett, D.S.; Caplen, M. A.; Domaiski, M. S.; Browne, M. E.; Davis, H. R. Jr.; Clader, J. W. Bioorg. Med. Chem. Lett. (2002), 12, 311. El compuestos i-8 es el análogo hidroxi-protegido de í-7, en donde el grupo protegido es acilo. Las siguientes definiciones también se utilizan en los ejemplos que siguen: EJEMPLO 38 Preparación de N-prop-2-in-1-ilacetamida (i-1) El cloruro de acetilo (0.52 mL, 7.3 milimoles) se añadió a una solución en agitación de propargilamina (0.5 mL, 7.3 milimoles) y dimetilaminopiridina (18 mg, 0.14 milimoles) en piridina (2.5 mL) a 0°C, y la mezcla resultante se dejó calentar a temperatura ambiente. Después de aproximadamente 15 horas, la mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó sucesivamente con HCl 1 N y salmuera. La fase orgánica se secó (Na2S04), se filtró y concentró in vacuo para producir el compuesto del título (i-l), el cual se utilizó sin purificación adicional.

EJEMPLO 39 Preparación de N-prop-2-in-1-ilbencensulfonam¡da (i-2) El cloruro de bencen sulfonilo (1.16 mL, 9.1 milimoles) se añadió una solución en agitación de propargilamina (0.62 mL, 9.1 milimoles) y dimetilaminopiridina (22 mg, 0.18 milimoles) en piridina (5 mL) a temperatura ambiente. La solución resultante se envejeció a temperatura ambiente por aproximadamente 15 horas. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó sucesivamente con HCl 1 N y salmuera. La fase orgánica se secó (Na2SO ), se filtró y concentró in vacuo para producir el compuesto del título (i-2), el cual se utilizó sin purificación adicional.

EJEMPLO 40 Preparación de N,N-Dimetil-N'-prop-2-in-1-ilurea (i-3) El cloruro de dimetil carbamolo (0.84 mL, 9.1 milimoles) se añadió a una solución en agitación de propargilamina (0.62 mL, 9.1 milimoles) y dimetilaminopiridina (22 mg, 0.18 milimoles) en piridina (5 mL) a temperatura ambiente. La suspensión resultante se agitó a temperatura ambiente por aproximadamente 15 horas. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó sucesivamente con HCl 1 N y salmuera. La fase orgánica se secó (Na2S0 ), se filtró y concentró in vacuo para producir el compuesto del título (i-3), el cual se utilizó sin purificación adicional.

EJEMPLO 41 Preparación de N-Metil-N-prop-2-in-1-ilmetansulfonamida (i-4) El cloruro de metansulfonilo (1.12 mL, 14.5 milimoles) se añadió a una solución en agitación de N-metilpropargilamina (1.22 mL, 14.5 milimoles) y dimetilaminopiridina (35 mg, 0.30 milimoles) en piridina (10 mL) a temperatura ambiente. Después de envejecer por aproximadamente 15 horas, la mezcla de reacción se vertió dentro de acetato de etilo y se lavó sucesivamente con HCl 1 N y salmuera. La fase orgánica se secó (Na2SO4), se filtró y concentró in vacuo, para producir el compuesto del título (i-4), el cual se utilizó sin purificación adicional.

EJEMPLO 42 Preparación de N-prop-2-in-1-ilmetansulfonamida (i-5) El cloruro de metansulfonilo (1.40 mL, 18.1 milimoles) se añadió gota a gota a una solución en agitación de propargilamina (1.00 g, 18.1 milimoles) y dimetilaminopiridina (44.0 mg, 0.36 milimoles) en piridina (10 mL) a 0°C. Después de envejecer por aproximadamente 15 horas, la mezcla de reacción se vertió dentro de HCl 1 N y se extrajo dos veces con acetato de etilo. Los extractos orgánicos combinados se lavaron con bicarbonato de sodio acuoso saturado, salmuera, se secaron (MgSO ), se filtraron y concentraron in vacuo, para producir el compuesto del título i-5. El producto i-5 sin purificar se cristalizó al dejarlo en reposo y se utilizó sin purificación adicional.

EJEMPLO 43 Preparación de N-(3-(4-r(2S,3R)-3-r(3S)-3-(4-fluorofen¡l)-3-hidroxipropin-2- (4-hidroxifenip-4-oxoazetidin-1-¡pfenil}prop-2-in-1-ii)metansuifonamida (compuesto 6a) La trietilamina (7 equivalentes) se añadió a una solución de (3R,46)-3-[(3S)-3-(4-fluorofenil)-3-hidroxipropil]-4-(4-hidroxifenil)-1-(4-iodofenil) azetidin-2-ona (i-6) (1.00 equivalente), N-prop-2-in-1-ilmetansulfonamida (i-5) (1.50 equivalentes), tetrakistrifenilfosfina paladio (0) (0.15 equivalentes) y yoduro de cobre(l) (0.30 equivalentes) en DMF (concentración 0.1 M con respecto al producto final) bajo una atmósfera de nitrógeno y la solución resultante se envejeció a temperatura ambiente. Después del término de la reacción, los elementos volátiles se evaporaron in vacuo y el residuo sin purificar se puede purificar mediante cromatografía instantánea sobre gel de sílice para producir el compuesto del título.

EJEMPLO 44 Paso A: Preparación de 4-í(2S,3R)-3-r(3S)-3-(4-fluorofenil)-3-hidroxipropíp-1 -(4-{3-[(metilsulfonil)amino1prop-1 -in-1 -il|fenil)-4-oxoazetidin-2-¡nfenil metil ß-D-glucopiranosiduronato (compuesto 7a) La trietilamina (0.07 mL, 0.502 milimoles) se añadió a una solución en agitación de 4-[(2S,3R)-3-[(3)-3-(4-fluorofenil)-3-hidroxipropil]-1-(4-iodofenil)-4- oxoazetidín-2-il] fenil metil ß-D-glucopiranosiduronato (i-7) (0.050 g, 0.071 milimoles), N-prop-2-in-1-ilmetansulfonamida (i-5) (0.014 g, 0.105 milimoles), tetrakistrifenilfosfina paladio(O) (0.012 g, 0.010 milimoles) y yoduro de cobre (0.005 g, 0.026 milimoles) en DMF (0.5 mL) bajo una atmósfera de nitrógeno y la solución resultante se envejeció a temperatura ambiente por 18 horas. Los elementos volátiles se evaporaron in vacuo y el residuo sin purificar se purificó mediante cromatografía instantánea sobre gel de sílice (gradiente de elución; 0-25% metanol/cloruro de metileno como eluyente) para producir el compuesto del título; m/z (ES) 713 (MH+), 505.

Paso B: Preparación del ácido 4-í(2S,3R)-3-r(3S)-3-(4-fluorofenil)-3-hidroxipropill-1-(4-{3-[(metilsulfonil)amino1prop-1-in-1-il}fenil)-4-oxoazetidin-2-iljfenil ß-D-glucopiranosidurónico (el compuesto 7 también se puede referir en la presente invención como el compuesto 2) OH Una solución del compuesto 7a en metanol/agua/trietilamina (1 : 7: 2; 1 mL) se agitó a temperatura ambiente por aproximadamente 1.5 horas. Los elementos volátiles se evaporaron in vacuo y el residuo sin purificar se purificó mediante cromatografía líquida preparativa de alta resolución en fase reversa sobre YMC Pack fase ProC18 (gradiente de elución; 10-65% de acetonitrilo/agua como eluyente, 0.1 % de modificador TFA) para producir el compuesto del título (7b); m/z (ES) 699 (MH+), 505; HRMS (ES) m/z calculado para C34H36FN2OnS (MH+) 699.2024, encontrado 699.2016.

EJEMPLO 45 (Compuestos 6B a 6G y 7C a 7N) Los siguientes compuestos de fórmula lia se han preparado (como se indica por los datos de MS provistos) o se pueden preparar utilizando los procedimientos sintéticos generales descritos en el ejemplo 43 (que se muestra en el cuadro 13) o en el ejemplo 44 (que se muestra en el cuadro 14).

CUADRO 13 CUADRO 14 EJEMPLO 46 Paso A: Preparación de 4-((2S.3R)-3-r(3S)-3-(4-fluorofenil)-3-hidrox¡propil1-4-oxo-1-(4-l"(trimetilsilil)etinil1fenil)azetidin- 2-¡l)fenil metil ß-D-glucopiranosiduronato (8a) OH La trietilamina (69. 0L, 0.495 milimoles) se añadió a una solución en agitación de i-7 (50.0 mg, 0.071 milimoles), trimetilsililacetileno (12.0 µl, 0.085 milimoles), tetrakistrifenilfosfina paladio (0) (13.0 mg, 0.011 milimoles) y yoduro de cobre (5.10 mg, 0.028 milimoles) en DMF (0.5 mL) bajo una atmósfera de nitrógeno y la solución resultante se envejeció a temperatura ambiente por 18 horas. Los elementos volátiles se evaporaron in vacuo y el residuo sin purificar se purificó mediante cromatografía instantánea sobre gel de sílice (gradiente de elución; 0-25% metanol/cloruro de metileno como eluyente) para producir el compuesto del título (8a); m/z (ES) 660 (M-OH)+, 470.

Paso B: Preparación del ácido 4- (2S,3R)-1-(4-etinilfenil)-3-r(3S)- 3-(4-fluorofen¡l)-3-hidroxipropil1-4-oxoazetidin-2-il} fenil ß-D-glucopiranosidurónico (8b) Una solución de 8a en metanol/agua/trietilamina (0.25 mL: 1.10 mL: 0.40 mL) se agitó a temperatura ambiente por aproximadamente 6 horas. Los elementos volátiles se evaporaron in vacuo y el residuo sin purificar se purificó mediante cromatografía líquida preparativa de alta resolución en fase reversa sobre YMC Pack fase Pro C18 (gradiente de elución; 10-65% de acetonitrilo/agua como eluyente, 0.1 % de modificador TFA) para producir el compuesto del título (8b); m/z (ES) 574 (M-OH)+, 398; HRMS (ES) m/z calculada para C32H31FNO9 (MH+) 592.1983, encontrado 592.1985.

EJEMPLO 47 Paso A: Preparación de 4: 3R)-3-r(3S)-3-(4-fluorofenil)-3-h¡droxipropin-1-(4-{3-f(metilsulfonil)amino1propil)fenil)-4-oxoazetidin-2-¡nfenil metil ß-D-glucopiranosiduronato (9a) HO Una mezcla de 7a (40.0 mg, 0.056 milimoles) y paladio (~8 mg de 10 % en peso (base seca) sobre carbón activado) en metanol (2 mL) se hidrogenó a presión atmosférica por aproximadamente 1 hora. La mezcla de reacción se filtró a través de un tapón corto de celite, eluyendo copiosamente con metanol, y el filtrado se evaporó in vacuo para producir el compuesto del título (9a); m/z (ES) 509 (M-azúcar-OH)+.

Paso B: Preparación del ácido 4-r(2S,3R)-3-IT3S)-3-(4-fluorofen¡l)-3- h¡drox¡prop¡n-1-(4-{3-r(metilsulfonil)aminolpropil)fenil)-4-oxoazetidin-2-illlfenil ß-D-glucopiranosidurónico (9b) Una solución de 9a en metanol/agua/trietilamina (1 : 7: 2,1 mL) se agitó a temperatura ambiente por aproximadamente 1 hora. Los elementos volátiles se evaporaron in vacuo y el residuo sin purificar se purificó mediante cromatografía líquida preparativa de alta resolución en fase reversa sobre YMC Pack fase Pro C18 (gradiente de elución; 10-65% de acetonitrilo/agua como eluyente, 0.1% de modificador TFA) para producir el compuesto del título (9b); m/z (ES) 735 (M+Na)+, 685 (M-OH)+, 509 (M-azúcar-OH) +; HRMS (ES) m/z calculada para C34H39FN2O11S (MH+) 703.2337, encontrado 703.2337.

EJEMPLO 48 Paso A: Preparación de 4-((2S,3R)-3-r(3S)-3-acetoxi)-3-(4-fluorofenil)propin-1-f4-(3-([ter-butilo(dimetilsil¡poxi)prop-1-in-1-il)fenip-4-oxoacetidin-2-il}fenil metil 2,3,4-tri-O-acetil-ß-D-qlucopiranosiduronato (10a) La trietilamina (170 µL, 1.25 milimoles) se añadió a una solución de i-8 (156 mg, 0.178 milimoles), ter-butilodimetil (2-propiniloxí)silano (43.0 µL, 0.214 milimoles), diclorobistrifenilfosfinapaladio (II) (12.0 mg, 0.018 milimoles) y yoduro de cobre (7.00 mg, 0.036 milimoles) en DMF (1.3 mL) bajo una atmósfera de nitrógeno y la solución resultante se envejeció a temperatura ambiente por aproximadamente 20 horas. La mezcla de reacción se vertió dentro de bicarbonato de sodio acuoso saturado y se extrajo dos veces con éter dietílico. Los extractos orgánicos combinados se lavaron con agua, salmuera, se secaron (MgSO ), se filtraron y el filtrado se concentró in vacuo. La purificación del residuo sin purificar mediante cromatografía instantánea sobre gel de sílice (gradiente de elución; 15-40% acetato de etilo/hexanos como eluyente) produjo el compuesto del título 10a.

Paso B: Preparación de 4-f(2S.3R)-3-K3S)-3-(acetiloxi)-3-(4-fluorofenil) propill-1-[4 (3-hidroxiprop-1-in-1-il)fenil1-4-oxoacetidin-2-il}fenil metil 2,3.4-tri-O-acetil-ß-D-glucopiranosiduronato (10b) El hidrato de tetrabutiloamonio fluoruro (39.0 mg, 0.148 milimoles) se añadió a 10a (136 mg, 0.148 milimoles) en tetrahidrofurano (1.5 mL), y la solución resultante se envejeció a temperatura ambiente por 1 hora. La mezcla de reacción se vertió dentro de cloruro de amonio saturado acuoso y se extrajo dos veces con éter. Los extractos orgánicos combinados se lavaron con bicarbonato de sodio saturado, salmuera, se secaron (MgSO ), se filtraron y concentraron in vacuo. La purificación del residuo sin purificar mediante cromatografía instantánea sobre gel de sílice (50% acetato de etilo/hexanos) produjo el compuesto del título 10b.

Paso C: Preparación de 4-((2S.3R)-3-r(3S)-3-(acetiloxi)-3-(4-fluorofenil) propill-4-oxo-1 -F4-(3-oxoprop-1 -in-1 -il)fenillazetidin-2-il}fenil metil 2.3.4-tr¡-O-acetil-ß-D-glucopiranosiduronato (10c) El peryodinano de Dess-Martin (33.0 mg, 0.077 milimoles) se añadió a una solución de 10b (62.0 mg, 0.077 milimoles) y piridina (31.0 µL, 0.386 mílimoles) en diclorometano (1 mL) a temperatura ambiente. Después de 30 minutos, la mezcla de reacción se vertió dentro de bicarbonato de sodio acuoso saturado, y se extrajo dos veces con acetato de etilo. Los extractos orgánicos combinados se lavaron con agua, salmuera, se secaron (MgSO ), se filtraron y concentraron in vacuo. La purificación del residuo sin purificar mediante cromatografía instantánea sobre gel de sílice (gradiente de elución; 20-40% acetato de etilo/hexanos) produjo el compuesto del título 10c.

Paso D: Preparación de 4-(r2S.3R)-3-r(3S)-3-(acetilox¡)-3-(4-fluorofenil) propil1-1-f4-(carboxietinil)fenil1-4-oxoazetidin-2-¡l}fenil metil 2,3,4-tri-O-acetil-ß-Dglucopiranosiduronato (1 Od) Una solución acuosa (0.1 mL) de difosfato ácido sódico (9.00 mg, 0.065 milimoles) y clorito de sodio (5.00 mg, 0.055 milímoles) se añadió a una solución de 10c (37.0 mg, 0.046 milimoles) en alcohol ter-butílico (0.4 mL), dioxano (0.2 mL) y isobutileno (-0.1 mL) a temperatura ambiente. Después de 1.5 horas, la mezcla de reacción se concentró in vacuo y el residuo sin purificar se trituró repetidamente con acetato de etilo. Los elementos orgánicos lavados se secaron (Na2SO ), se filtraron y concentraron in vacuo para producir el compuesto del título 10d.

Paso E: Preparación del ácido 4-(2S13R)-1-r4-(carboxietinil)fen¡l1-3-K3S)- 3-(4-fluorofenil)-3-hidroxipropin-4-oxoazetid¡n-2-il> fenil ß-D-glucopiranosidurónico (10e) Una solución de 4-{(2S,3R)-3-[(3S)-3-(acetiloxi)-3-(4-fluorofenil)propil]-1 -[4-(carboxietinil)fen¡l]-4-oxoazetidin-2-il}fen¡l metil 2,3,4-tri-O-acetil-ß-D-glucopiranosiduronato (10d) y cianuro de sodio (-1 mg, 0.020 milimoles) en metanol (3 mL) se calentó a 45°C. Después de 22 horas, la mezcla de reacción se concentró bajo presión reducida y se disolvió en metanol/agua/trietilamina (1 : 7: 2, 1 mL). Después de agitar a temperatura ambiente por aproximadamente 1 hora, los elementos volátiles se evaporaron in vacuo y el residuo sin purificar se purificó mediante cromatografía líquida preparativa de alta resolución en fase reversa sobre YMC Pack fase Pro C18 (gradiente de elución; 10-60% de acetonitrilo/agua como eluyente, 0.1 % de modificador TFA) para producir el compuesto del título (10e), m/z (ES) 442.0 (M-azúcar- OH)+, 618.0 (M-OH)+; HRMS (ES) m/z calculada para C33H31FNOH (MH+) 636.1881 , encontrado 636.1889 EJEMPLO 49 Paso A: Preparación de 4-((2S.3R)-3-f(3S)-3-(acetiloxi)-3-(4-fluorofenil)prop¡p-1- (4-(3-fetilamino)-3-oxoprop-1-in-1-il]fenil}-4-oxoazetidin-2-¡Dfenil metil 2,3,4-tri-O-acetil-ß-D-qlucopiranosiduronato (11a) Una solución 1 M de clorhidrato de etilamina y díisopropiletilamina en DMF (40.0 µL, 0.40 milimoles) se añadió a clorhidrato de 4-{(2S,3R)-3-[(3S)-3-(acetiloxi)-3-(4-fluorofeníl)prop¡l]-1-[4-(carboxietinil)fen¡l]-4-oxoazetidin-2-il}fenil metil 2,3,4-tri-O-acetil-ß-D-glucopiranosiduronato (10d) (27.0 mg, 0.033 milimoles), 1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida (19.0 mg, 0.099 milimoles) e 1-hidroxibenzotriazol (8.00 mg, 0.059 milimoles) en DMF (0.25 mL). Después de 4.5 horas, la mezcla de reacción se vertió dentro de acetato de etilo y se lavó sucesivamente con agua y salmuera. La capa orgánica se secó, se filtró y concentró bajo presión reducida. La purificación del residuo sin purificar mediante cromatografía instantánea sobre gel de sílice (gradiente de elución; 50-60% acetato de etilo/hexanos) produjo el compuesto del título 11a.

Paso B: Preparación del ácido 4-(2S.3R)-1-(4-r3-(etilamino)-3-oxoprop-1-in-1-¡pfenil}-3- (3S)-3-(4-fluorofenil)-3-hidrox¡prop¡l]-4-oxoazet¡din-2-il> fenil ß-D-glucopiranosidurónico (11b) OH Una solución de 4-((2S,3R)-3-[(3S)-3-(acetiloxi)-3-(4-fluorofenil)propil]-1-{4-(3-(etiIamino)-3-oxoprop-1-in-1-il]fen¡l}-4-oxoazetidin-2-il)fenil metil 2,3,4-tri-O-acetil-ß-D-glucopiranosiduronato (11 a) (22.0 mg, 0.026 milimoles) y cianuro de sodio (~1 mg, 0.020 milimoles) en metanol (3 mL) se calentó a 45°C. Después de 18 horas, la mezcla de reacción se concentró bajo presión reducida y se disolvió en metanol/agua/trietilamina (1 : 3: 1 , 2.5 mL). Después de agitar a temperatura ambiente por aproximadamente 1 hora, los elementos volátiles se evaporaron in vacuo, y el residuo sin purificar se purificó mediante cromatografía líquida preparativa de alta resolución en fase reversa sobre YMC Pack fase Pro C18 (gradiente de elución; 10-60%acetonitrilo/agua como eluyente, 0.1 % de modificador TFA) para producir el compuesto del título (11b) m/z (ES) 663.0 (M+H)+; HRMS (ES) m/z calculada para C35H36FN2O10 (MH+) 663.2354, encontrado 663.2341.

La presente invención no se debe limitar en su alcance por las modalidades específicas descritas en la presente invención. De hecho, serán evidentes diversas modificaciones de la invención además de aquellas descritas en la presente invención a aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción precedente. Se pretende que dichas modificaciones caigan dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Las patentes, solicitudes de patente, publicaciones, descripciones del producto, Números de Acceso Genbank y protocolos se citan a lo largo de esta solicitud, la descripción de los cuales se incorporan en la presente invención como referencia en su totalidad para todos ios propósitos.

Claims (20)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método para identificar un ligando de NPC1L1 que comprende: poner en contacto NPC1L1 de humano con una 2-azetidinona glucurónido sustituida marcada de manera detectable y un compuesto candidato; y determinar sí dicho compuesto candidato se une a NPC1 L1 de humano; en donde la unión de dicho compuesto candidato a NPC1 L1 de humano modula la unión de dicha 2-azetidinona glucurónido sustituida marcada de manera detectable a NPC1 L1 de humano, en donde la 2-azetidínona glucurónido sustituida marcada de manera detectable tiene un valor de kD de afinidad de unión para NPC1 L1 de humano que es 200 nM o menor, y en donde dicha modulación indica que el compuesto candidato es un ligando que se une a NPC1L1 de humano.

2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el valor kp es de 100 nM o menor.

3.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el valor kD es de 50 nM o menor.

4.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el valor kD es de 20 nM o menor.

5.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el valor kD es de 10 nM o menor.

6.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la 2-azetidinona-glucurónido sustituida se selecciona a partir del grupo que consiste de un compuesto de fórmula I y un compuesto de fórmula II.

7.- El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque la 2-azetidinona-glucurónido sustituida comprende una marca detectable a partir del grupo que consiste de 35S y 125l.

8.- El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque la marca detectable es 35S.

9.- El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque la 2-azetidinona-glucurónido sustituida es un compuesto de fórmula II, en donde R9 comprende un grupo -SO2-.

10.- El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque la 2-azetidinona-glucurónido sustituida de fórmula II se marca con S.

11.- Un método para identificar un ligando de NPC1 L1 que comprende: poner en contacto NPC1 L1 de humano con una 2-azetidinona glucurónido sustituida marcada de manera detectable de fórmula II y un compuesto candidato; y determinar si dicho compuesto candidato se une a NPC1L1 de humano; en donde la unión de dicho compuesto candidato a NPC1L1 de humano modula la unión de dicha 2-azetidinona glucurónido sustituida marcada de manera detectable de fórmula II a NPC1L1 de humano, y en donde dicha modulación indica que el compuesto candidato es un ligando que se une a NPC1 L1 de humano.

12.- El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque R9 de la 2-azetidinona glucurónido sustituida marcada de manera detectable de fórmula II comprende un grupo -SO2-.

13.- El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque la 2-azetidinona glucurónido sustituida marcada de manera detectable de fórmula II se marca con 35S.

14.- El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque la 2-azetidinona glucurónido sustituida marcada de manera detectable de fórmula II tiene un valor kD de afinidad de unión para NPC1L1 de humano que es 200 nM o menor.

15.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque el valor kD es de 100 nM o menor.

16.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque el valor kD es de 50 nM o menor.

17.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque el valor ko es de 20 nM o menor.

18.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque el valor kD es de 10 nM o menor.

19.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la 2-azetidinona glucurónido sustituida marcada de manera detectable se marca con 35S.

20.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la 2-azetidinona glucurónido sustituida marcada de manera detectable es el compuesto 2 marcado con 35S.