DE60319093T2

DE60319093T2 - Verfahren zur isolierung eines intestilanen cholesterin bindenproteins

Info

Publication number: DE60319093T2
Application number: DE60319093T
Authority: DE
Inventors: Werner Kramer; Wendelin Frick
Original assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 2002-08-06
Filing date: 2003-07-28
Publication date: 2009-02-05
Anticipated expiration: 2023-07-29
Also published as: JP2006512054A; US7786103B2; CA2493487A1; CA2493487C; NO20051169L; IL199409A; RU2345089C2; KR101095288B1; BR0313217A; ATE386053T1; RU2005106238A; WO2004014947A1; EP1529061A1; KR20060015443A; NO333437B1; US20040126812A1; US20080167451A1; CN1668642A; IL166492A0; AU2003253341C1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung eines intestinalen Proteins, das an der Resorption von Cholesterin im Darm beteiligt ist, und die Fähigkeit zum Binden von Hemmstoffen der Cholesterinabsorption.
Beim Menschen liegen durchschnittlich etwa 50% des Cholesterins im Darmlumen vor. Das intraluminale Cholesterin stammt vorwiegend aus der Nahrung sowie der Gallenflüssigkeit. Aus der Gallenflüssigkeit wird pro Tag ca. 2 g Cholesterin abgesondert. Die intestinale Cholesterinabsorption hängt stark vom Vorliegen von Gallensalzen ab. So bewirkt eine Verabreichung von Inhibitoren der Gallensalzwiederaufnahme bzw. von Gallensalz-Sequestriermitteln eine Inhibierung der intestinalen Cholesterinabsorption.
Bei der Behandlung von Lipidstörungen, Artherosklerose und Herzkreislauferkrankungen ist die Inhibierung der intestinalen Cholesterinabsorption ein wichtiges Ziel. Nach der vorherrschenden Meinung in der Fachwelt erfolgt die intestinale Cholesterinabsorption durch physikochemische Diffusion
Bekannt sind eine Reihe von Beobachtungen im Zusammenhang mit dem Cholesterintransport, die für die Beteiligung eines Proteins sprechen. Die intestinale Cholesterinabsorption unterliegt einer großen individuellen Variabilität. Biochemische Daten aus In-vitro-Versuchen sprechen für eine Beteiligung von Protein beim Cholesterinaustausch zwischen kleinen unilamellaren Vesikeln und den Bürstensaumvesikeln des Darms. Bei der intestinalen Absorption von Pflanzensterinen wie dem β-Sitosterin und Campesterin, die sich lediglich hinsichtlich einer Methylgruppe (β-Sitosterin) bzw. einer Ethylgruppe (Campesterin) unterscheiden, konnten große Unterschiede beobachtet werden. Unter anderem beim Menschen zeigte β-Sitosterin eine Inhibierung der Cholesterinabsorption. Es gibt zwei hochwirksame Verbindungsklassen, welche die intestinale Cholesterinabsorption inhibieren, wenn eine luminale Verabreichung erfolgt. Die Verbindungen sind zum einen von Saponin abgeleitete Verbindungen wie Tiquesid und Pamaquesid, zum anderen bestimmte Derivate von 2-Azetidinonen. Derivate von 2-Azetidinonen als Inhibitoren der Cholesterinabsorption sind beschrieben in Clader et al., J. Med. Chem. 39, 3684–3693, 1996. Absorption im Sinne dieser Erfindung soll Anlagerung eines Stoffes an ein Protein und Transport dieses Stoffes mit Hilfe dieses Proteins bedeuten.
Die intestinale Absorption von Cholesterin trägt beträchtlich zur Serumcholesterinhomeostase bei. Inhibitoren der intestinalen Cholesterinabsorption wie Ezetimib oder Pamaquesid haben ihre Wirksamkeit als neue cholesterinsenkende Mittel in klinischen Versuchen unter Beweis gestellt. Trotz enormer wissenschaftlicher Anstrengungen sind ihre molekulare Wirkungsweise sowie die Mechanismen der intestinalen Cholesterinabsorption immer noch unbekannt, und sie werden kontrovers diskutiert. Im allgemeinen geht man davon aus, daß Cholesterin passiv durch Plasmamembranen und die Membranen der intestinalen Bürstensaumzellen diffundiert, es gibt jedoch zunehmend Hinweise auf ein proteinvermitteltes Verfahren der intestinalen Cholesterinabsorption: die Cholesterinabsorption zeigt starke Unterschiede zwischen Spezies, und strukturverwandte Pflanzensterine wie β-Sitosterin oder Campesterin mit vergleichbaren physikochemischen Eigenschaften werden im Gegensatz zu Cholesterin nur schlecht absorbiert, wodurch ein einfaches Diffusionsverfahren unwahrscheinlich wird. Das Vorhandensein spezifischer Transportinhibitoren für Cholesterin, die 2-Azetidinone und Steringlykoside mit sehr deutlichen Struktur-Aktivitäts-Beziehungen deutet stark auf ein proteinvermitteltes Verfahren der intestinalen Cholesterinabsorption hin.
Cholesterin ist eine vielseitige Verbindung, die (in kleinen Mengen) lebenswichtig für das Funktionieren des menschlichen Körpers ist. Es wird ausschließlich von Tieren produziert; kein Pflanzenprodukt enthält Cholesterin, wenn nicht während der Verarbeitung ein tierisches Produkt wie Schmalz zugesetzt wurde. Beim Menschen hat Cholesterin drei Hauptfunktionen. Es wird von bestimmten Drüsen zur Herstellung von steroid- oder cortisonähnlichen Hormonen einschließlich Sexualhormonen verwendet. Es unterstützt die Leber bei der Produktion von Gallensäuren, die wesentlich sind für die Verdauung von Fetten. Last but not least ist es eine Hauptkomponente von Zellmembranen und -strukturen, eine Art Baustein für Körpergewebe. Ohne Cholesterin würde es keine Säugetiere geben.
Zu Problemen mit Cholesterin kommt es, wenn der Körper über zu viel davon verfügt oder es an den falschen Stellen ablagert. Herzkreislauferkrankungen treten auf, wenn Cholesterin an der Innenseite der Wände der Koronararterien des Herzens, den Hauptadern für die Versorgung des Herzmuskelgewebes mit Sauerstoff, abgelagert wird. Dort trägt es zur Bildung fettiger, verhärteter Blockierungen bei, die als Plaque bezeichnet werden. Diese Plaque-Bildung wird verschiedentlich als Arteriosklerose, Verhärtung der Arterien und Arteriosklerose bezeichnet. Cholesterin kann auch an anderen Stellen des Körpers in den Arterien abgelagert werden, wo es zum Auftreten von Schlaganfällen (aufgrund blockierter Arterien im Hirn) und peripherer Verschlußkrankheit (aufgrund einer Arterienblockade in den Beinen) beitragen kann.
Für den Transport durch den Körper muß das Cholesterin in speziellen, als Lipoproteine bezeichneten Molekülen verpackt sein. Die Lipide, beziehungsweise die fettigen Cholesterinkomponenten, sind in einem wasserlöslichen Proteinmantel verpackt. Verschiedene Arten von Lipoproteinen mit verschiedenen Lipoproteinen aus einer dynamischen Ökonomie im Körper transportieren Cholesterin zu einigen Geweben und entfernen es von anderen. Die wichtigste cholesterintragende Verbindung im Körper ist Lipoprotein niedriger Dichte („Low-Density Lipoprotein"), bzw. LDL-Cholesterin. LDL wird häufig als das „schlechte Cholesterin" bezeichnet, da es eine Schlüsselrolle bei der Ablagerung von Cholesterin in den Arterien zu spielen scheint. Es wird als „Low-Density" bezeichnet, da es sehr wenig Protein, den dichtesten Bestandteil des Moleküls, aufweist und hauptsächlich aus Fetten besteht. Hohe Spiegel an LDL werden mit einem erhöhten Risiko an koronarer Herzkrankheit in Verbindung gebracht. Lipoprotein hoher Dichte („High-Density Lipoprotein"), bzw. HDL, wird häufig als „gutes Cholesterin" bezeichnet, da es dazu beizutragen scheint, Cholesterin von den Arterienwänden zu entfernen und es für die Ausscheidung zur Leber zu transportieren. Im Gegensatz zu LDL-Cholesterin sind niedrige Spiegel an HDL mit einem erhöhten Risiko an koronarer Herzkrankheit assoziiert, während höhere Spiegel an HDL gegen die Krankheit zu schützen scheinen.
Andere Subtypen von Cholesterinpartikeln schließen Chylomikronen ein, die bei der Verdauung von Fett von den Darmzellen produziert werden, sowie Lipoprotein sehr niedriger Dichte („Very-Low-Density Lipoprotein") (VLDL), das von der Leber als wichtige Vorstufe für die LDL-Cholesterin-Produktion hergestellt wird. VLDL ist das wichtigste Lipoprotein für den Transport von in der Leber produzierten Triglyceriden.
Für die Bestimmung des Risikos einer Herzkrankheit sind LDL und HDL der Schlüssel.
Angesichts all der Belege dafür, daß eine fettreiche, cholesterinreiche Ernährung zu erhöhten Spiegeln an Cholesterin im Blut beiträgt, und daß ein hoher Cholesterinspiegel im Blut ein definitiver Risikofaktor für Herzkrankheit ist, könnte es natürlich erscheinen, anzunehmen, daß dieses Risiko durch eine Absenkung des Cholesterinspiegels im Blut über die Ernährung oder auf eine andere Weise vermindert wird.
Kramer et al. haben nun Bindungsproteine für die Cholesterinabsorption zum Identifizieren von Inhibitoren des intestinalen Cholesterintransporters offenbart ( WO 02/18432 ; Kramer et al. (2000) FERS LETTERS, 487, 293–297, Nr. 2).
Die vorliegende Beschreibung offenbart ein Verfahren zum Isolieren eines Proteins, das an der intestinalen Cholesterinabsorption beteiligt ist und bei dem es sich um das molekulare Proteintarget für Cholesterinabsorptionsinhibitoren handelt. Es ist anzunehmen, daß ein solches Verfahren einen großen Nutzen bei therapeutischen Anstrengungen zur Kontrolle erhöhter Cholesterinspiegel hat.
Dieses Verfahren betrifft ein Verfahren zur Isolierung eines Proteins, bei dem

a] biologisches Material bereitzustellen ist,
b] das biologische Material aus a] mit einer photoreaktiven 2-Azetidinonverbindung, die radioaktiv markiert ist und die dazu in der Lage ist, sich spezifisch an das Protein zu binden, inkubiert wird,
c] das biologische Material solubilisiert wird und die Zelltrümmer entfernt werden,
d] der Überstand in ein Gerät gegeben wird, das Weizenkeimlektin-Agarose enthält,
e] das Eluat von der Weizenkeimlektin-Agarose aus d] auf eine Hydroxylapatitsäule gegeben wird, die mit einem Phosphatpuffergradienten eluiert wird,
f] die radioaktiv markierten Fraktionen aus e] auf eine präparative SDS-PAGE gegeben werden,
g] die radioaktiv markierten Fraktionen gesammelt und möglicherweise ausgefällt werden.

Das biologische Material wird vorzugsweise aus Darmgewebe oder aus Zellen einer Kultur von Darmzellen oder idealen Bürstensaumzellen von einem Menschen, einer Ratte, einer Maus oder einem Kaninchen entnommen.
Die photoreaktiven 2-Azetidinonverbindungen weisen vorzugsweise die folgende Struktur auf (Kramer, W. et al. (2000) FERS Letters 487, 293–297) Formel I
wobei R ausgewählt wird aus einer der folgenden Gruppen a) bis e)
Die Synthese von Verbindungen der Formel I a, b und c wurde in DE 10042447 A1 , die am 28. März 2002 veröffentlicht wurde, offenbart. Die Synthese der Verbindungen der Formel I d und e ist in den folgenden Beispielen beschrieben.
Eine photolabile Gruppe in einem Molekül kann dazu verwendet werden, kovalente Bindungen zu einem in unmittelbarer Nähe befindlichen Molekül, insbesondere einem Protein, herzustellen. Zu diesem Zweck wird die Verbindung mit der photolabilen Gruppe zuerst in unmittelbare Nähe des Moleküls gebracht, zu dem die kovalente Verbindung hergestellt werden soll. Dies kann beispielsweise durch einen anderen Teil der Verbindung geschehen, der als spezifischer Inhibitor, vorzugsweise Inhibitor der Cholesterinabsorption, eines Proteins fungiert. Nach dem In-Kontakt-Bringen der Verbindung mit dem Molekül wird mit UV-Licht bestrahlt. Durch die Bestrahlung mit UV-Licht wird die photolabile Gruppe aktiviert und die Herstellung einer kovalenten Verbindung mit dem wechselwirkenden Molekül, insbesondere mit einem Protein, initiiert. Als photolabile Gruppe eignen sich zum Beispiel Diazirin-, Azido- oder Carbonylfunktionen.
Zur Bestrahlung kann eine herkömmliche UV-Lampe, wie sie zum Beispiel zum Sichtbarmachen von Polynukleotiden mit eingelagertem Ethidiumbromid oder zur Entkeimung von Laborflächen verwendet wird, oder ein photochemischer Reaktor, der unter anderem von der Firma „The Southern Ultraviolet Company, Hamden, CT" erhältlich ist, eingesetzt werden. Der Aufschluß der Zellen nach Bestrahlung mit UV-Licht erfolgt unter Anwendung herkömmlicher Methoden. Hierzu zählen beispielsweise wiederholtes Einfrieren und Wiederauftauen, die Behandlung der Zellen mit Ultraschall, die Verwendung einer French-Presse oder die Zugabe eines Detergens und von Enzymen. Die Fraktionierung der Proteine des Zellysats kann beispielsweise durch Fällung mit Ammoniumsulfat, durch differentielle Zentrifugation oder durch Anwendung von chromatographischen Techniken ausgeführt werden. Chromatographische Techniken, die sich für diesen Zweck eignen, sind beispielsweise denaturierende oder nicht denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese in einer oder zwei Dimensionen, die Hochdruckflüssigkeitschromatographie, die Ionenaustauschchromatographie oder die Affinitätschromatographie. Diese Techniken sind dem Fachmann geläufig und werden beispielsweise ausführlich in „Current Protocols in Protein Science"; John E. Caligan; Ben M. Dunn; Hidde L. Ploegh; David W. Speicher; Paul T. Wingfield; Wiley and Sons; ISBNO-471-11184-8; abgehandelt.
Der Nachweis eines Proteins nach der Fraktionierung erfolgt vorzugsweise mittels der radioaktiven Markierung der Verbindung, die einen Inhibitor der intestinalen Cholesterinabsorption und eine photolabile Gruppe enthält. Als radioaktives Isotop hierfür kann beispielsweise ³H oder ¹⁴C verwendet werden. Als Nachweismethode eignet sich zum Beispiel die Erfassung des Proteins, welches eine Verbindung kovalent gebunden enthält, mittels eines zur Röntgenphotographie verwendeten Filmmaterials, nachdem das Protein mit Hilfe einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf einem Polyacrylamidgel aufgebracht wurde. Andere geeignete Nachweismethoden sind die Flüssigkeits-Szintillationszählung und das Flachbett-Scanning.
Biologisches Material besteht vorzugsweise aus Darmzellen. Die Darmzellen können zum Beispiel durch Entnahme des Darms aus Tieren und anschließende Aufreinigung, enzymatisches Aufbrechen des Bindegewebes und Suspendieren einzelner Zellen in isotonischen Pufferlösungen bereitgestellt werden. Darmgewebe, die sich für die Bereitstellung von Darmzellen eignen, sind unter anderem die entsprechenden Teile von Tieren, die nach der Schlachtung verbleiben. Darmzellen können auch aus humanem Darmgewebe bereitgestellt werden, nachdem Teile des Darms bei einer Operation erhalten wurden. Die Darmzellen können auch aus Darmzellenkulturen bestehen, die für den Zweck der Erfindung durch die Anwendung von Zellkulturtechniken bereitgestellt wurden. Bei den Teilen von Darmzellen kann es sich um Organellen der Darmzellen handeln. Organellen sind vorzugsweise Membranen der Darmzellen. Membranen der Darmzellen lassen sich durch differentielle Zentrifugation nach dem Aufbrechen dieser Zellen erhalten. Die Teile von Darmzellen sind vorzugsweise auch Proteinfraktionen. Zur Bereitstellung von Darmzellen oder Teilen von Darmzellen können Darmzellen, die vorzugsweise aus Zellen aus dem Bürstensaum des Darmgewebes von Säuger-Organismen bestehen, verwendet werden.
Als Säuger-Organismen, aus denen diese Darmzellen gewonnen werden, können vorzugsweise Mensch, Affe, Rind, Schwein, Ratte, Maus, Kaninchen, Hamster oder eine andere Wirbeltierspezies ausgewählt werden, wobei diese Aufzählung nicht einschränkend gilt. Diese Zellen können durch Präparation von Zellsuspensionen aus dem Bürstensaumgewebe des Darms solcher Organismen bereitstellt werden. Geeignetes Material des Darms erhält man zum Beispiel durch operative Eingriffe. Andere Quellen können sich aus übriggebliebenen Teilen von Tieren nach Schlachtungen ergeben. Ebenso geeignet sind Zellen einer Darmzellinie. Das Darmgewebe kann zur Herstellung geeigneter Zellpräparationen einer Enzymbehandlung zur Freisetzung von Einzelzellen unterworfen und anschließend differentiell zentrifugiert werden. Die auf diese Wiese erhaltenen Zellen oder Organellen werden anschließend in geeigneten wäßrigen Medien aufgenommen. Diese wäßrigen Medien können Puffersubstanzen, Salze, Proteine und darüber hinaus Hilfsstoffe enthalten.
Dieses Verfahren betrifft außerdem ein Verfahren zur Isolierung eines Bindungsproteins für Cholesterinabsorptionsinhibitoren, die an der intestinalen Cholesterinabsorption beteiligt sind, bei dem

a] biologisches Material bereitzustellen ist,
b] das biologische Material aus a] mit einem photoreaktiven Inhibitor der Cholesterinaufnahme, der radioaktiv markiert ist oder mit einem Biotin-Tag versehen ist, inkubiert wird,
c] das biologische Material aus b] solubilisiert wird und die Zelltrümmer entfernt werden,
d] der Überstand chromatographischen Prozeduren unterzogen wird oder auf Streptavidin-Agarose gegeben wird,
e] das Eluat auf eine SDS-PAGE aufgetragen wird,
f] Proteine, die in einem Größenbereich von 140 bis 150 kDa laufen, ausgeschnitten, eluiert und möglicherweise rückgefaltet werden.

Das biologische Material wird vorzugsweise aus Darmgewebe oder aus Zellen einer Kultur von Darmzellen oder idealen Bürstensaumzellen von einem Menschen, einer Ratte, einer Maus oder einem Kaninchen entnommen.
Der Inhibitor der Cholesterinaufnahme, der mit einem Biotin-Tag versehen ist, hat vorzugsweise die folgende Struktur:
Die Erfindung betrifft nun ein aufgereinigtes 145-kDa-Protein, erhältlich durch ein Verfahren, bei dem

a] Darmzellen bereitzustellen sind,
b] die Darmzellen aus a] mit einer photoreaktiven 2-Azetidinonverbindung, die radioaktiv markiert ist und die dazu in der Lage ist, sich spezifisch an das Protein zu binden, inkubiert werden,
c] die Darmzellen solubilisiert werden und die Zelltrümmer entfernt werden,
d] der Überstand in ein Gerät gegeben wird, das Weizenkeimlektin-Agarose enthält,
e] das Eluat von der Weizenkeimlektin-Agarose aus d] auf eine Hydroxylapatitsäule gegeben wird,
f] die radioaktiv markierten Fraktionen aus e] auf eine präparative SDS-PAGE gegeben werden,
g] die radioaktiv markierten Fraktionen gesammelt und möglicherweise ausgefällt werden;

a] Darmzellen bereitzustellen sind,
b] die Darmzellen aus a] mit einem photoreaktiven Inhibitor der Cholesterinaufnahme, der radioaktiv markiert ist oder mit einem Biotin-Tag versehen ist, inkubiert werden,
c] die Darmzellen aus b] solubilisiert werden und die Zelltrümmer entfernt werden,
d] der Überstand auf Streptavidin-Agarose gegeben wird,
e] das Eluat auf eine SDS-PAGE aufgetragen wird,
f] Proteine, die in einem Größenbereich von 140 bis 150 kDa laufen, ausgeschnitten, eluiert und möglicherweise rückgefaltet werden,

Das Protein ist möglicherweise glykosyliert.
Die Molekulargewichte der Proteine werden mit einem bestimmten Ungenauigkeitsbereich angegeben, was auf das angewendete SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophoreseverfahren zurückzuführen ist, jedoch auch bei anderen, entsprechenden Verfahren bekannt ist. Die Schwankungen bei den Molekulargewichten liegen im Bereich von bis zu +/– 10%. Die angegebenen Werte stellen den Mittelwert mehrerer Experimente dar. In dem Fall des Proteins mit dem angegebenen Molekulargewicht von 145 kDa erfolgte die Bestimmung des Molekulargewichts in 10 unabhängig voneinander ausgeführten Experimenten durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, wodurch man einen Mittelwert von 145,3 kDa mit einer Standardabweichung von +/– 7,55 kDa erhielt.
Geeignete Verfahren zum Überprüfen der Glykosylierung findet der Fachmann ausführlich in „Carbohydrate Biotechnology Protocols, Methods in Biotechnology, 10 (1999) Humana Press, ISBN 0-89603-563-8, Herausgeber C. Gucke" beschrieben.
Die Erfindung betrifft weiterhin einen von einem erfindungsgemäßen Protein und einer Verbindung mit der folgenden Struktur gebildeten Komplex.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Aufreinigung eines 145-kDA-Proteins, bei dem

a] Darmzellen bereitzustellen sind,
b] die Darmzellen aus a] mit einer photoreaktiven 2-Azetidinonverbindung, die radioaktiv markiert ist und die dazu in der Lage ist, sich spezifisch an das Protein zu binden, inkubiert werden,
c] die Darmzellen solubilisiert werden und die Zelltrümmer entfernt werden,
d] der Überstand in ein Gerät gegeben wird, das Weizenkeimlektin-Agarose enthält,
e] das Eluat von der Weizenkeimlektin-Agarose aus d] auf eine Hydroxylapatitsäule gegeben wird,
f] die radioaktiv markierten Fraktionen aus e] auf eine präparative SDS-PAGE gegeben werden,
g] die radioaktiv markierten Fraktionen gesammelt und möglicherweise ausgefällt werden,

Die Erfindung betrifft weiterhin eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein erfindungsgemäßes Protein und pharmazeutisch unbedenkliche Verbindungen und/oder Exzipienten zur Formulierung eines Medikaments. Solche Substanzen sind allgemein bekannt und werden beispielsweise in Remingtons Pharmaceutical Sciences, fünfte Auflage, von Mack Publishing Company, beschrieben.
Die Erfindung schließt auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Proteins zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer Krankheit, die mit erhöhten Cholesterinspiegeln in Zusammenhang steht, ein. Solche Krankheiten sind zum Beispiel Obesitas, Arteriosklerose, Bluthochdruck, Herzversagen und andere. Ein Cholesterinspiegel von 199 mg/dL wird als erhöht betrachtet.
Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung eines erfindungsgemäßen Proteins zum Identifizieren einer die Cholesterinwiederaufnahme inhibierenden Verbindung, bei der

a] biologisches Material bereitzustellen ist, das das erfindungsgemäße Protein enthält,
b] eine Verbindung bereitgestellt wird,
c] das Protein aus a] und die Verbindung aus b] miteinander in Kontakt gebracht werden,
d] die Menge an von dem biologischen Material aus c] aufgenommenem Cholesterin bestimmt wird,
e] das Ergebnis aus d] mit dem Ergebnis aus einem Kontrollexperiment, bei dem die Cholesterinaufnahme von biologischem Material der gleichen Spezies und/oder Gewebespezifität wie das Protein aus a], das jedoch nicht mit einer Verbindung von b] in Kontakt gebracht wurde, verglichen wird,
f] die Ergebnisse aus e] auf eine Verbindung weisen, die die Cholesterinaufnahme inhibiert, wenn eine reduzierte Cholesterinaufnahme von Zellen, die mit einer Verbindung aus b] in Kontakt gebracht wurden, bestimmt wird.

Die Verbindung wird zum Beispiel durch chemische Synthese bereitgestellt. Die Verbindung kann Teil einer Kollektion chemischer Verbindungen sein, wie die, die aus der Lagerung und Katalogisierung der chemischen Verbindungen von abgeschlossenen Syntheseprogrammen („Verbindungsbibliotheken") hervorgeht. Die Verbindung kann in anderen Fällen durch einen Mikroorganismus, insbesondere ein Bakterium, einen Pilz oder eine Tier- oder Pflanzenspezies, produziert worden sein (Naturstoffe). Bei den Naturstoffen kann die Bereitstellung auch durch Isolieren aus dem entsprechenden Organismus erfolgen. Das In-Kontakt-Bringen eines Proteins mit einer Verbindung findet in den meisten Fällen in wäßrigen Lösungen statt, denen ein gewisser Anteil eines Lösungsmittels wie zum Beispiel Dimethylsulfoxid oder Ethanol zugemischt wurde. Die wäßrigen Lösungen können auch Puffersubstanzen, Ionen oder stabilisierende Zusätze wie Proteine, Glycerin oder andere enthalten. Bestimmte konstante Bedingungen, zum Beispiel hinsichtlich der Temperatur, des pH-Wertes, der ionischen Bedingungen, der Konzentration des Proteins oder der Verbindung, oder des Volumens, können vorteilhaft für das In-Kontakt-Bringen sein. So kann es beispielsweise bevorzugt sein, die Temperatur während des In-Kontakt- Bringens konstant auf 37°C zu halten. Die Bestimmung der Bindung der Verbindung an das Protein nach der Durchführung des In-Kontakt-Bringens erfolgt zum Beispiel durch in Wechselwirkung mit Cholesterin oder Cholesterinadsorptionsinhibitoren, die auf andere Weise radioaktiv markiert sind, wobei man die Verdrängung des Cholesterins oder der Cholesterinabsorptionsinhibitoren als Maß für die Affinität der Verbindung für das Protein nimmt.
Beispiele
Synthese von 5-(2-Oxohexahydrothieno[3,4-d]imidazol-6-yl)pentansäre-[2-(4-azidophenyl)-1-(4-{4-[3-(3-hydroxy-3-phenylpropyl)-2-(4-methoxyphenyl)-4-oxo-azetidin-1-yl]phenylcarbamoyl}butylcarbamoyl)ethyl]amid
Die Zahlen 1 bis 14 in der folgenden Passage beziehen sich auf das allgemeine Reaktionsschema von 1
Synthese des mit einem Biotin-Tag versehenen photoreaktiven Cholesterininhibitors 5-(2-Oxohexahydrothieno[3,4-d]imidazol-6-yl)pentansäre-[2-(4-azidophenyl)-1-(4-{4-[3-(3-hydroxy-3-phenylpropyl)-2-(4-methoxyphenyl)-4-oxoazetidin-1-yl]phenyloarbamoyl}butylcarbamoyl)ethyl]amid
Die Zahlen 1 bis 14 in der folgenden Passage, die die Synthese des mit einem Biotin-Tag versehenen photoreaktiven Cholesterininhibitors betrifft, beziehen sich auf die Reaktionsschemata von 1 und 2. 3-[5-(tert.-Butyldimethylsilanyloxy)-5-phenylpentanoyl]-4-phenyloxazolidin-2-on (1)
30 g 3-(5-Hydroxy-5-phenylpentanoyl)-4-phenyloxazolidin-2-on werden in 50 ml DMF gelöst. Nach der Zugabe von 14,3 g Imidazol und 19 g tert.-Butyldimethylsilylchlorid in 25 ml DMF wird der Ansatz bei Raumtemperatur gerührt, bis alle Komponenten in Lösung gegangen sind (2–4 h). Die Reaktionslösung wird eingedampft, und nach Zugabe von Wasser wird mit Essigsäureethylester extrahiert. Nach dem Trocknen der organischen Phase über Magnesiumsulfat und Eindampfen erhält man Verbindung 1: C₂₆H₃₅NO₄Si (453,6) MS (ESI⁺) 476 (M+Na⁺).
(4-Methoxybenzyliden)-(4-nitrophenyl)amin (2)
50 g (370 mmol) Anisaldehyd in 160 ml Isopropanol werden mit 51 g (370 mmol) para-Nitroanilin versetzt. Nach 2 h bei 80°C fällt das Produkt aus. Die Reaktionsmischung wird auf Raumtemperatur abgekühlt und filtriert. Der Rückstand wird mit Isopropanol gewaschen. Nach dem Trocknen erhält man 62,9 g an Produkt 2 (Ausbeute 66%) in Form von gelben Kristallen: C₁₄H₁₃N₂O₃ (257,27). 3-{5-(tert.-Butyldimethylsilanyloxy)-2-[(4-methoxyphenyl)-(4-nitrophenylamino)methyl]-5-phenylpentanoyl}-4-phenyloxazolidin-2-on (3)
5,4 g (12,0 mmol) an Produkt 1 und 6,2 g (24 mmol) an Produkt 2 in 135 ml Methylenchlorid werden bei 10°C mit 8 ml Diisopropylethylamin versetzt, und 4,8 ml Trimethylsilylchlorid werden tropfenweise zugegeben. Nach 1 h werden bei –10°C 14 ml einer einmolaren Lösung von Titantetrachlorid in Methylenchlorid zugetropft. Es wird 3 h bei –10°C gerührt und weitere 12 h bei –30°C ohne Rühren stehengelassen. Anschließend werden 8 ml Essigsäureethylester und 140 ml einer 7%igen wäßrigen Lösung von Weinsäure zugesetzt, und es wird weitere 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von 50 ml einer 20%igen wäßrigen Lösung von Natriumhydrogensulfid wird eine weitere Stunde lang gerührt und mit Methylenchlorid extrahiert. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet, eingedampft und durch Chromatographie an Kieselgel/Essigsäureethylester/Heptan = 1/3 → 1/1 aufgereinigt. Man erhält 6,3 g (74%) an Produkt 3 in Form einer hellgelben, festen Verbindung: C₄₀H₄₇N₃O₇Si (709,92) MS (ESI⁺) 710 (M+H⁺). 3-[3-(tert.-Butyldimethylsilanyloxy)-3-phenylpropyl]-4-(3-methoxyphenyl)-1-(4-nitrophenyl)azetidin-2-on (4)
Eine 6,1 g (8,6 mmol) an Produkt 3, 7,3 ml Bistrimethylsilylacetamid, 0,5 g Tetrabutylammoniumchlorid und 100 ml tert.-Butylmethylether enthaltende Mischung wird unter einer Argonatmosphäre 10 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Ende der Umsetzung werden 5 ml Essigsäure unter Kühlen mit Eis langsam zugesetzt, und die Mischung wird eingedampft. Der Rückstand wird durch Chromatographie an Kieselgel (Essigsäureethylester/Heptan = 1/2) aufgetrennt. Man erhält 3,3 g (70%) an Produkt 4 in Form einer hellgelben Verbindung in fester Form: C₃₁H₃₈N₂O₅Si (546,74) MS (ESI⁺) 547,3 (M+H⁺). 1-(4-7minophenyl)-3-[3-(tert.-butyldimethylsilanyloxy)-3-phenylpropyl]-4-(3-methoxyphenyl)azetidin-2-on (5)
3,0 g (5,5 mmol) an Produkt 4 in 50 ml Essigsäureethylester und 1,0 g Palladium auf Aktivkohle (10%) werden unter Verwendung eines Autoklaven unter einer Wasserstoffatmosphäre von 5 bar 2 h miteinander umgesetzt. Die Reaktionslösung wird filtriert, eingedampft und durch Chromatographie an Kieselgel (Methylenchlorid/Methanol = 10/1) aufgetrennt. Man erhält 2,4 g (86%) an Produkt 5 in Form einer farblosen Verbindung in fester Form: C₃₁H₄₀N₂O₃Si (516,76) MS (ESI⁺) 517,4 (M+H⁺). 1-(4-Aminophenyl)-3-(3-hydroxy-3-phenylpropyl)-4-(3-methoxyphenyl)azetidin-2-on (6)
15 ml einer 2 N wäßrigen Salzsäure werden zu 2,3 g an Produkt 5 in 20 ml Tetrahydrofuran gegeben, und es wird 2 h gerührt. Der Ansatz wird mit einer wäßrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat versetzt und mit Essigsäureethylester extrahiert. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet, eingedampft und durch Chromatographie an Kieselgel (Essigsäureethylester/Heptan = 1/1 → 1/0) aufgereinigt. Man erhält 1,1 g an Produkt 6 in Form einer farblosen Verbindung in fester Form: C₂₅H₂₆N₂O₃ (402,50) MS (ESI⁺) 403,2 (M+H⁺). (4-{4-[3-(3-Hydroxy-3-phenylpropyl)-2-(4-methoxyphenyl)-4-oxoazetidin-1-yl]phenylcarbamoyl}butyl)carbaminsäure-9H-fluoren-9-ylmethylester (8)
0,8 g (2,0 mmol) an Produkt 6 und 1,35 g (4,0 mmol) an 5-(Fmoc-Amino)valeriansäure 7 (Fluka) werden in 15 ml DMF (Dimethylformamid) gelöst. Schrittweise wird folgendes zugesetzt: 4,8 g an TOTU (Fluka), 1,6 g an Oxim (Hydroxyiminocyanoessigsäureethylester; Fluka) und 5,5 ml an NEM (4-Ethylmorpholin). Nach 1 h bei Raumtemperatur wird der Ansatz mit 100 ml Essigsäureethylester verdünnt und dreimal mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wird über MgSO4 getrocknet, filtriert und eingedampft. Der Rückstand wird durch Flash-Chromatographie (Essigsäureethylester/n-Heptan 2:1) aufgereinigt. Man erhält 0,58 g (41%) an Produkt 8 in Form einer amorphen, festen Verbindung: C₄₅H₄₅N₃O₆ (723,8) MS (ESI⁺) 724,4 (M+H⁺). 5-Aminopentansäure-{4-[3-(3-hydroxy-3-phenylpropyl)-2-(4-methoxyphenyl)-4-oxoazetidin-1-yl]phenyl}amid (9)
570 mg (0,78 mmol) an Produkt 8 und 0,8 ml Diethylamin werden in 5 ml DMF (Dimethylformamid) gelöst. Nach 1 h bei Raumtemperatur wird eingedampft. Der Rückstand wird durch Flash-Chromatogräphie (Methylenchlorid/Methanol/konz. Ammoniak 30:10:3) aufgereinigt. Man erhält 220 mg (56%) an Produkt 9 in Form einer amorphen, festen Verbindung: C₃₀H₃₅N₃O₄ (501,63) MS (ESI⁺) 502,3 (M+H⁺). [2-(4-Azidophenyl)-1-(4-{4-[3-(3-hydroxy-3-phenylpropyl)-2-(4-methoxyphenyl)-4-oxoazetidin-l-yl]phenylcarbamoyl}butylcarbamoyl)ethyl]carbaminsäure-9H-fluoren-9-ylmethylester (11)
200 mg (0,40 mmol) an Produkt 9 und 340 mg (0,79 mmol) an Fmoc-p-Azido-Phe-OH 10 (Bachem) werden in 4 ml DMF (Dimethylformamid) gelöst und gemäß der Darstellung von Produkt 8 umgesetzt. Man erhält 300 mg (82%) an Produkt 11 in Form einer amorphen, festen Verbindung: C₅₄H₅₃N₇O₇ (912,07) MS (ESI⁺) 912,5 (M+H⁺) 5-[2-Amino-3-(4-azidophenyl)propionylamino]pentansäure{4-[3-(3-hydroxy-3-phenylpropyl)-2-(4-methoxyphenyl)-4-oxoazetidin-1-yl]phenyl}amid (12)
300 mg (0,33 mmol) an Produkt 11 und 0,8 ml Diethylamin werden in 4 ml DMF (Dimethylformamid) gelöst und gemäß der Darstellung von Verbindung 9 umgesetzt. Man erhält 42 mg (19%) an Verbindung 12 in Form einer amorphen, festen Verbindung: C₃₉H₄₃N₇O₅ (689,82) MS (ESI⁺) 690,3 (M+H⁺). 5-(2-Oxohexahydrothieno[3,4-d]imidazol-6-yl)pentansäure-[2-(4-azidophenyl)-1-(4-{4-[3-(3-hydroxy-3-phenylpropyl)-2-(4-methoxyphenyl)-4-oxoazetidin-1-yl]phenylcarbamoyl}butylcarbamoyl)ethyl]amid (14)
40 mg (0,058 mmol) an Verbindung 12 und 60 mg D-biotinyl-N-hydroxysuccinimid 13 (Bachem) werden in 0,5 ml DMF (Dimethylformamid) gelöst. Nach 1 h bei Raumtemperatur wird eingedampft. Der Rückstand wird durch Flash-Chromatographie (Methylenchlorid/Methanol/konz. Ammoniak 30:5:1) aufgereinigt. Man erhält 29 mg (55%) an Verbindung 14 in Form einer amorphen, festen Verbindung: C₄₉H₅₇N₉O₇S (912,12) MS (ESI⁺) 916,6 (M+H⁺).
Photoaffinitätsmarkierung und Bindungsstudien:
Vesikel aus dem Bürstensaumgewebe des Dünndarms von Kaninchen wurden mittels dem Fachmann bekannten Methoden isoliert (Kramer et al. J. Biol. Chem. 268, 18035–18046 (1993)). Die Photoaffinitätsmarkierung unter Verwendung einer radioaktiv markierten Verbindung der Formel I a), oder der Formel I b) oder Formel I c) oder der Formel I d) oder der Formel I e) der vorliegenden Erfindung wurde in einem photochemischen Reaktor des Typs Rayonet RPR-100 (erhältlich von der Firma „The Southern Ultraviolet Company, Hamden, CT") durchgeführt. Die Bürstensaummembranvesikel davon (100 bis 200 μg Protein) wurden 5 min mit einer der Verbindungen bei 20°C im Dunkeln in einem Volumen von 200 μl in 10 mM Tris/Hepes-Puffer (pH-Wert 7,4), 100 mM NaCl, 100 mM Mannit inkubiert. Anstelle der Bürstensaumvesikel können auch Organellen, insbesondere Membranen, aus diesen verwendet werden. Für diese gilt das im folgenden ausgeführte entsprechend. Nach der Inkubation im Dunkeln wurde 20 Sekunden lang bzw. 60 Sekunden lang mit UV-Licht von 254 nm bestrahlt. Die Bürstensaumvesikel wurden anschließend zweimal mit dem genannten Puffer gewaschen. Die Proteine wurden mittels üblicher Techniken wie beispielsweise Versetzen mit Ethanol, Zugabe eines Salzes oder Detergens, Erhitzen, wiederholtes Einfrieren und Wiederauftauen oder einer anderen geeigneten und dem Fachmann bekannten Methode gefällt und durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt. Die radioaktiv markierten Proteine konnten durch LSC oder Fluorgraphie nachgewiesen werden. Die Affinität der markierten Proteine aus dem Bürstensaumgewebe für die Verbindungen lag in einem Bereich von 1 bis 100 nM.
Tiere und Membranpräparationen:
Männliche, weiße New Zealand-Kaninchen mit einem Gewicht von 4–5 kg (Harlem Winkelmann, Borchem, Deutschland) wurden auf Altronin^®-Standarddiät C 2023 (Altronin^®, Lage, Deutschland) ad libitum gehalten. Bürstensaummembranvesikel aus dem Magen, Duodenum, Jejunum, Ileum, Cecum, Colon, Rectum und der Niere wurden nach dem Mg²⁺-Ausfällungsverfahren gewonnen. Rattenlebermikrosomen und Rattenadipocytenmembranen wurden nach Standardverfahren erhalten.
Inhibierung der Cholesterinabsorption:
Die intestinale Cholesterinabsorption wurde gemäß einer Modifikation des Zilversmit/Hughes-Verfahrens bestimmt. Männliche NMRI-Mäuse (Charles River Deutschland GmbH, Salzfeld, Deutschland), die regelmäßig Futter (Altronin^®, Lage, Deutschland) erhielten, wurden 12 h nüchtern gehalten. 0,5 ml einer Lösung von 0,5% Methylcellulose/5% Solutol (BASF, Ludwigshafen, Deutschland) als Vesikel mit oder ohne 3 mg des betreffenden Cholesterinabsorptionsinhibitors wurden den Tieren jeweils mittels einer Schlundsonde zugeführt, gefolgt von 0,25 ml einer Intralipid^®-Lösung (Pharmacia & Upjohn, Erlangen, Deutschland), die 0,24 μCi [¹⁴C]Cholesterin und 0,25 μCi [³H]Sitosterol enthielt. Die Tiere (fünf Mäuse pro Gruppe) wurden in Stoffwechselkäfigen gehalten, und die Fäzes wurden gesammelt. Nach 24 h wurden die Tiere getötet, und die Radioaktivität in den Fäzes und der Leber wurde durch Verbrennungsanalyse bestimmt.
Solubilisierung des 145-kDa-Bindungsproteins für Cholesterinabsorptionsinhibitoren:
Bürstensaummembranvesikel aus dem Dünndarm von Kaninchen wurden nach der Photoaffinitätsmarkierung mehrmals mit 10 mM Tris/Hepes-Puffer (pH-Wert 7,4)/300 mM Mannit gewaschen. Das auf diese Weise erhaltene Pellet wurde zu einer Proteinkonzentration von 1 mg/ml 60 min bei 4°C in 10 mM Tris/Hepes-Puffer (pH-Wert 7,4)/75 mM KCl/5 mM MgCl₂/1 mM EGTA/1 mM DTT/1% (w/v) n-Octylglucosid/1% Triton X-100/1% (w/v) („Solubilisierungspuffer") gelöst. Alternativ dazu konnten die Membranproteine zu einer Proteinkonzentration von 10 mg/ml mit 1% SDS in 10 mM Tris/Hepes-Puffer (pH-Wert 7,4) bei 4°C 10 min solubilisiert werden, gefolgt von einer 1:10-Verdünnung mit 10 mM Tris/Hepes-Puffer (pH-Wert 7,4)/1% n-Octylglucosid. Nach dem Zentrifugieren wurden die die solubilisierten Membranproteine enthaltenden Überstände gemischt und mit den entsprechenden Puffern für die Chromatographie, die 1% n-Octylglucosid als Detergens enthielten, verdünnt.
Aufreinigung des radioaktiv markierten 145-kDa-Bindungsproteins für Cholesterinabsorptionsinhibitoren nach der Photoaffinitätsmarkierung mit dem photoreaktiven 2-Azetidinon C-1:
Photoaffinitätsmarkierung
8 Proben von Bürstensaummembranvesikeln aus dem Ileum von Kaninchen (250 μg Protein) wurden im Dunkeln bei 20°C 30 min mit 66 nM (0,3 μCi) [³H]C-1 in 10 mM Tris/Hepes-Puffer (pH-Wert 7,4)/100 mM NaCl/100 mM Mannit inkubiert. Nach 30 s Bestrahlen bei 254 nm in einem mit 4 RPR 2537 Å-Lampen ausgestatteten photochemischen Rayonet RPR 100-Reaktor (The Southern Ultraviolet Company, Hamden, CT, USA) wurden die Proben gesammelt, und nach dem Zentrifugieren wurden die Membranvesikel in 2 ml 10 mM Tris/Hepes-Puffer (pH-Wert 7,4)/300 mM Mannit resuspendiert und 20 min bei 20°C zentrifugiert. Diese Vorschrift wurde dreimal wiederholt. Das auf diese Weise erhaltene Pellet wurde mit 2 ml „Solubilisierungspuffer" solubilisiert. Nach dem Zentrifugieren wurde ein 40-μl-Aliquot des Überstands abgenommen und durch SDS-PAGE und anschließendes Slicing des Gels auf Einbau von Radioaktivität in Membranproteine analysiert.
Weizenkeimlectin-Affinitätschromatographie
Der Überstand mit den solubilisierten Membranproteinen wurde zu 0,5 ml Weizenkeimlektin-Agarosegel gegeben. Nach 30 min bei 20°C wurden die Perlen abzentrifugiert und dreimal mit 2 ml 10 mM Tris/Hepes-Puffer (pH-Wert 7,4)/100 mM NaCl/100 mM Mannit/1% (w/v) n-Octylglucosid gewaschen. Absorbierte Proteine wurden mit 4 Portionen von 2 ml 10 mM Tris/Hepes-Puffer (pH-Wert 7,4)/100 mM NaCl/100 mM Mannit/300 mM N-Acetyl-D-glucosamin eluiert; in allen Eluaten wurden die Aktivitäten von Aminopeptidase N und Sucrase gemessen, und aus 100-μl-Aliquots der jeweiligen Fraktionen wurde das Protein ausgefällt und durch SDS-PAGE analysiert.
Hydroxylapatit-Chromatographie
Die N-Acetylglucosamin-Eluate der Weizenkeimlektin-Chromatographie wurden 10fach mit 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 7,4)/1% (w/v) n-Octylglucosid verdünnt und auf eine Hydroxylapatitsäule (Höhe 10 cm, Durchmesser 1 cm) aufgetragen, wobei mit 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 7,4)/1% (w/v) n-Octylglucosid mit einer Geschwindigkeitskonstante von 0,25 ml/min äquilibriert und 1-ml-Fraktionen gesammelt wurden. Im Anschluß wurden die Proteine wie folgt eluiert: 10 ml 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 7,4)/1% (w/v) n-Octylglucosid gefolgt von den folgenden Phosphatgradienten: 15 ml mit 10 bis 250 mM, 15 ml mit 250 bis 700 mM und 10 ml mit 700 bis 1000 mM Phosphat. In den Fraktionen wurde jeweils die Aktivität von Aminopeptidase N und Sucrase und die Radioaktivität bestimmt. Aus den einzelnen Fraktionen wurden jeweils 100 μl abgenommen und das Protein wurde ausgefällt, worauf sich SDS-PAGE mit anschließender Bestimmung der Verteilung der radioaktiv markierten Proteine durch Schneiden des Gels in 2 mm dicke Scheiben anschloß.
Präparative SDS-Gelelektrophorese
Die das radioaktiv markierte 145-kDa-Protein enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt, und das Protein wurde mit Chloroform/Methanol ausgefüllt. Nach dem Auflösen in SDS-Probenpuffer (62,5 mM Tris/HCl (pH-Wert 6,8) 2% SDS/5%/2-Mercaptoethanol (10% Glycerin/0,001% Bromphenol Blau wurde die Probe zentrifugiert, und der klare Überstand wurde auf das Trenngel eines präparativen 7,5% SDS-Gels (Durchmesser 28 mm; Länge des Trenngels: 5 cm) aufgetragen. Die Elektrophorese wurde bei 500 V (40 mM, 6 W) durchgeführt, und das Eluat wurde in 1,5-ml-Fraktionen fraktioniert. 150-μl-Aliquots der einzelnen Fraktionen wurden für die Analyse der Proteinzusammensetzung durch SDS-PAGE verwendet.
Aufreinigung des 145-kDa-Bindungsproteins für Cholesterinabsorptionsinhibitoren durch Streptavidin-Biotin-Affinitätschromatographie:
10 Proben von Bürstensaummembranvesikeln aus dem Ileum vom Kaninchen (200 μg Protein) wurden im Dunkeln bei 20°C 30 min mit 200 μM des mit einem Biotin-Tag versehenen Cholesterininhibitors C-4 in 10 mM Tris/Hepes-Puffer (pH-Wert 7,4)/100 mM NaCl/100 mM Mannit inkubiert und anschließend in einem mit 4 RPR 2537 Å-Lampen ausgestatteten photochemischen Rayonet RPR-100-Reaktor 30 s bei 254 nm bestrahlt. Nach dem Sammeln wurden die Vesikel dreimal mit 2 ml Tris/Hepes-Puffer (pH-Wert 7,4)/300 mM Mannit gewaschen. Das letztlich erhaltene Pellet wurde bei 4°C 1 h in 2 ml „Solubilisierungspuffer” suspendiert. Nach dem Zentrifugieren wurde der klare Überstand mit 0,5 ml Streptavidin-Agaroseperlen gemischt und 2 h bei 4°C gerührt. Nach dem Zentrifugieren wurden die Perlen bei 4°C 10 min mit 2 ml 10 mM Tris/Hepes-Puffer (pH-Wert 7,4)/300 mM Mannit/1% n-Octylglucosid/4 mM PMSF/4 mM Iodacetamid/4 mM EDTA inkubiert und anschließend zentrifugiert. Diese Vorschrift wurde zweimal wiederholt, und die Proteine wurden dann mit 3 Portionen von jeweils 2 ml des obigen Puffers mit 5 mM Biotin von den Streptavidin-Agaroseperlen eluiert. Von allen Eluaten wurden Aliquots für die Bestimmung der enzymatischen Aktivität von Aminopeptidase N und Sucrase und zur Analyse durch SDS-PAGE abgenommen. Für die Endaufreinigung der das kovalent modifizierte 145-kDa-Bindungsprotein für Cholesterinabsorptionsinhibitoren enthaltenden Biotineluate wurde eine wie oben beschriebene präparative SDS-Gelelektrophorese durchgeführt.
Enzymatische Fragmentierung:
Das nach den beiden Vorschriften isolierte 145-kDa-Protein wurde mit Chloroform/Methanol ausgefällt und in 3 μl Tris/HCl-Puffer (pH-Wert 6,8)/6,2 SDS/0,5% 2-Mercaptoethanol/0,0005% Bromphenol Blau aufgenommen. Die enzymatische Fragmentierung erfolgte durch Zugabe von 5 μl einer frisch hergestellten Lösung von Chymotrypsin (35 ng/ml) in dem obigen Puffer und 1 h Inkubieren bei 30°C. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 4 mM EDTA/4 mM PMSF/4 mM Iodacetamid enthaltendem SDS-Probenpuffer und 5minütiges Erhitzen auf 95°C gestoppt, worauf sich SDS-PAGE auf Tris/Tricin-Gelen anschloß.
SDS-Gelelektrophorese
SDS-PAGE wurde in vertikalen Plattengelen (20 × 17 × 0,15 cm) mit einem LE 2/4-Elektrophorese system (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) mit Gelkonzentrationen von 7–10,5% in einem Verhältnis von 97,2% Acrylamid und 2,8% N,N-Methylenbisacrylamid oder für analytische Zwecke in vorgegossenen Novex-Gelen (4–12%, 12% oder 15%, Invitrogen (Groningen, Niederlande) unter Verwendung eines Xcell II-Elektrophoresesystems von Novex durchgeführt. Die elektrophoretische Auftrennung von Peptidfragmenten erfolgte in Tris/Tricin-Gelen (Objekt 16,5%) gemäß Schäggre & Jagow. Nach der Elektrophorese wurden die Gele in 12,5% Trichloressigsäure fixiert und anschließend mit Serva Blue R 250 angefärbt. Zur Bestimmung der Verteilung der Radioaktivität wurden individuelle Gelbahnen in 2-mm-Stücke geschnitten, das Protein wurde mit 250 μl Gewebesolubilisierer Biolute S hydrolysiert und einer Flüssigszintillationszählung unter Verwendung von 4 ml Quickszint 501-Szintillator unterzogen.
Solubilisierung des 145-kDa-Bindungsproteins für Cholesterinabsorptionsinhibitoren:
Eine Vorbedingung für die Aufreinigung des 145-kDa-Bindungsproteins für Cholesterinabsorptionshemmer ist eine ausreichende Solubilisierung dieses integralen Membranproteins in nicht-denaturiertem Zustand. Solubilisierungsexperimente mit verschiedenen Detergentien zeigten, daß mit SDS etwa 80–90% und mit Zwittergent 9–13 etwa 60% des photomarkierten Proteins solubilisiert werden konnten, während sich mit CHAPS, NP-40, Digitonin und Triton-X-114 keine signifikante Solubilisierung erzielen ließ. 1%ige Lösungen nichtionischer Detergentien wie Triton-X-100, n-Octylglucosid, Decylmaltosid, Dodecylmaltosid oder Cholesterinhemisuccinat/Dodecylmaltosid in 10 mM Tris/Hepes-Puffer (pH-Wert 7,4)/300 mM Mannit führte lediglich zu einer teilweisen Solubilisierung des 145-kDa-Proteins, wodurch seine Aufreinigung behindert wurde. Schließlich wurde gefunden, daß zwei Protokolle 60–80% Solubilisierung des 145-kDa-Proteins liefern, was eine Aufreinigungsvorschrift ermöglicht: a) Solubilisierung mit 1% SDS mit anschließendem Verdünnen mit 1% n-Octylglucosid auf einer Ausgangskonzentration von 0,1% SDS/1% n-Octylglykosid. b) Solubilisierung mit 10 mM Tris/Hepes-Puffer (pH-Wert 7,4)/75 mM KCl/5 mM MgCl₂/1 mM EGTA/1 mM DTT/1% Triton X-100/1% n-Octylglucosid („Solubilisierungspuffer"). Mit der Solubilisierungsvorschrift war eine erfolgreiche Fraktionierung der Bürstensaummembranproteine nach chromatographischen Vorschriften möglich.
Design der mit einem Biotin-Tag versehenen 2-Azatidinon-Photoaffinitätssonde:
Für eine Aufreinigung des Target-Proteins für Cholesterinabsorptionsinhibitoren in einem Schritt wurde die biotinhaltige photolabile Gruppe N-(Biotinyl)-4-azidophenylalanin über einen Spacer in der para-Position des N-Phenyl- oder Benzylaminorings der 2-Azetidinon-Cholesterinabsorptionsinhibitoren gebunden. Aus den Struktur-Aktivitäts-Beziehungen ging hervor, daß diese Position eine beträchtliche chemische Modifizierung unter Beibehaltung der in-vivo-Potenz für die Inhibierung der Cholesterinabsorption im Darm erlaubt. Nach der Verabreichung des mit einem Biotin-Tag versehenen Photoaffinitätsmarkers C-4 an NMRI-Mäuse war die Cholesterinabsorption im Darm in dosisabhängigerweise gehemmt, was auf eine biologische Wirksamkeit des mit dem Biotin-Tag versehenen photolabilen Cholesterinabsorptionsinhibitors hindeutet, welche Vorbedingung für die Identifizierung des/der an der Cholesterinabsorption im Darm beteiligten Proteins/Proteine durch diese Probe ist. Die Photoaffinitätsmarkierung von Bürstensaummembranvehikeln aus dem Dünndarm von Kaninchen mit dem Azidobenzoylderivat [³H]C-1 in Gegenwart von zunehmenden Konzentrationen des mit einem Biotin-Tag versehenen Cholesterininhibitors C-4 führte zu einer konzentrationsabhängigen Abnahme des Ausmaßes der Markierung des 145-kDa-Proteins, was auf eine spezifische Wechselwirkung von C-4 mit dem 145-kDa-Bindungsprotein für Cholesterinabsorptionsinhibitoren in der Bürstensaummembran der Enterocyten des Dünndarms hindeutet.
Aufreinigung des mit dem tritiummarkierten 2-Azetidinon-Cholesterinabsorptionsinhibitor C-1 photomarkierten 145-kDa-Bindungsproteins:
Das photomarkierte 145-kDa-Bindungsprotein befindet sich in einem Molekulargewichtsbereich, in dem in hohen Mengen vorliegende Membranproteine der Bürstensaummembranen wie der Sucrase/Isomaltase-Komplex oder Aminopeptidase N auf den SDS-Gelen wandern, weshalb eine vollständige Abtrennung von diesen Proteinen für die Sequenzbestimmung Voraussetzung ist. Durch die biochemische Untersuchung wurde das 145-kDa-Protein als ein glykosiliertes integrales Membranprotein identifiziert, bei dem die Molekülmasse bei einer Deglykosilierung mit N-Glykanase von 145 kDa auf 110 kDa fiel. Es wurden daher verschiedene Lektine als putative Liganden für die Affinitätschromatographie untersucht. Mit Weizenkeimlektin-Agarose ließ sich eine vollständige Retardierung des photomarkierten 145-kDa-Proteins erzielen, während 70–80% der enzymatischen Aktivität von Sucrase und Aminopeptidase N eluiert wurden. Mit N-Acetylglucosamin konnte die gesamte Menge an radioaktiv markiertem 145-kDa-Protein zusammen mit 30–50% der Aminopeptidase N- und der Sucrase-Aktivität eluiert werden. Insgesamt wurde eine 4–5fache Anreicherung des 145-kDa-Bindungsproteins für Cholesterinabsorptionsinhibitoren erzielt. Für eine weitere Aufreinigung wurde eine Reihe verschiedener Vorschriften ausgewertet. Ionenaustauschchromatographie auf Mono-Q- oder Mono-S-Säulen hatte eine vollständige Abtrennung von Sucrase/Isomaltase, jedoch nur eine teilweise Abtrennung von Aminopeptidase N, zur Folge, während durch metallchelatisierende Affinitätschromatographie keine klare Trennung erzielt werden konnte. Durch Hydroxylapatit-Chromatographie ließ sich eine starke Anreicherung des 145-kDa-Proteins und eine Abtrennung von Sucrase und Aminopeptidase N erzielen. Ein optimiertes Phosphatgradientprofil führte zu einer nahezu vollständigen Abtrennung des 145-kDa-Proteins von anderen Membranproteinen; das 145-kDa-Protein wurde bei hohen Phosphatkonzentrationen eluiert und war frei von signifikanten enzymatischen Aktivitäten von Sucrase oder Aminopeptidase N. Die abschließende Aufreinigung wurde durch präparative SDS-PAGE der Eluate aus der Hydroxylapatit-Chromatographie erreicht. Die geschätzte Menge an reinem 145-kDa-Protein betrug 1–3% des auf die Hydroxylapatitsäule aufgetragenen Materials, was darauf hindeutet, daß ein Anreicherungsfaktor von > 150 < 500fach bezogen auf die Bürstensaummembranen und von 2500–10 000fach bezogen auf das Enterocyten-Gesamtprotein erzielt wurde.
Aufreinigung des 145-kDa-Bindungsproteins für Cholesterinabsorptionsinhibitoren durch Streptavidin-Biotin-Affinitätschromatographie nach der Photoaffinitätsmarkierung mit einem mit einem Biotin-Tag versehenen photolabilen Cholesterinabsorptionsinhibitor
Bürstensaummembranvehikel aus dem Dünndarm von Kaninchen wurden mit 200 μM C-4 inkubiert, wobei durch Bestrahlung mit ultraviolettem Licht bei 254 nm quervernetzt wurde. Nach dem Solubilisieren wurden die die mit einem Biotin-Tag versehenen 2-Azetidinon-Cholesterinabsorptionsinhibitoren enthaltenden, kovalent modifizierten Proteine mit Streptavidinperlen extrahiert. Nach intensivem Waschen wurden gebundene Proteine mit einer 10 mM Lösung von Biotin eluiert und durch SDS-PAGE analysiert. Von den Streptavidinperlen wurde hauptsächlich ein Protein mit einem Molekulargewicht von 145 kDa zurückgehalten, während keine Proteine nachweisbar waren, wenn nicht mit ultraviolettem Licht bestrahlt wurde, was darauf hindeutet, daß ein 145-kDa-Protein das Hauptbindungsprotein für den mit einem Biotin-Tag versehenen photolabilen Cholesterinabsorptionsinhibitor C-4 ist. Die Biotinextrakte aus den Streptavidinperlen enthielten keine nachweisbaren enzymatischen Aktivitäten an Sucrase/Isomaltase oder Aminopeptidase N, was darauf hindeutet, daß das eluierte 145-kDa-Protein wahrscheinlich eine einzelne Proteineinheit darstellt, die durch die kovalente Bindung des mit einem Biotin-Tag versehenen Cholesterinabsorptionsinhibitors modifiziert wurde. Durch das Vorhandensein von 200 μM anderer Cholesterinabsorptionsinhibitoren wie Ezetimibe während der Photomarkierung mit C-4 wurde die Menge an mit Streptavidinperlen extrahierbarem 145-kDa-Protein herabgesetzt, was auf eine direkte Konkurrenz von Cholesterinabsorptionsinhibitoren mit C-4 um identische Bindungsstellen hindeutet; im Gegensatz dazu hatten Substrate für andere Nährstofftransporte aus dem Darm für Gallensäuren, Fettsäuren, Glucose, Oligopeptide oder Aminosäuren keinen Einfluß auf die Menge an extrahierbarem 145-kDa-Protein. Wurden diese Markierungsexperimente mit Zellmembranen von verschiedenen Organen durchgeführt, so zeigte sich, daß nur durch das Markieren von Bürstensaummembranvehikeln aus dem Dünndarm von Kaninchen – Duodenum, Jejunum und Ileum – ein 145-kDa-Protein extrahiert werden konnte, während nach der Markierung von Bürstensaummembranvehikeln aus dem Magen, Caecum, Kolon, Rektum, der Niere, der Leber oder Adipocyten kein 145-kDa-Protein durch Streptavidinperlen zurückgehalten wurde. Das 145-kDa-Bindungsprotein konnte also nur aus den anatomischen Stellen aufgereinigt werden, an denen eine intestinale Cholesterinabsorption stattfindet, d. h. dem Duodenum, dem Jejunum und dem Ileum. Die durch Weizenkeimlektin- und Hydroxylapatit-Chromatographie und durch Streptavidin-Biotip-Affinitätschromatographie aufgereinigten 145-kDa-Proteine sind auf SDS-Gelen ununterscheidbar. Nach der enzymatischen Fragmentierung mit Chymotrypsin wurden nahezu identische Peptidmuster mit einer Reihe von Peptiden im Molmassenbereich von 4–35 kDa erhalten, was darauf hindeutet, daß die durch die beiden Ansätze aufgereinigten 145-kDa-Proteine identisch sind und vorwiegend, wenn nicht sogar ausschließlich, nur eine Proteineinheit enthalten.
1: Teil 1 eines Reaktionsschemas für die Synthese von 5-(2-Oxohexahydrothieno[3,4-d]imidazol-o-yl)pentansäure-[2-(4-azidophenyl)-1-(4-{4-[3-(3-hydroxy-3-phenylpropyl)-2-(4-methoxyphenyl)-4-oxoazetidin-1-yl]phenylcarbamoyl}butylcarbamoyl)ethyl]amid (14)
2: Teil 2 eines Reaktionsschemas für die Synthese von 5-(2-Oxohexahydrothieno[3,4-d]imidazol-6-yl)pentansäure-[2-(4-azidophenyl)-1-(4-{4-[3-(3-hydroxy-3-phenylpropyl)-2-(4-methoxyphenyl)-4-oxoazetidin-1-yl]phenylcarbamoyl}butylcarbamoyl)ethyl]amid (14)

Claims

Aufgereinigtes 145-kDa-Protein, erhältlich durch ein Verfahren, bei dem a] Darmzellen bereitzustellen sind, b] die Darmzellen aus a] mit einer photoreaktiven 2-Azetidinonverbindung, die radioaktiv markiert ist und die dazu in der Lage ist, sich spezifisch an das Protein zu binden, inkubiert werden, c] die Darmzellen solubilisiert werden und die Zelttrümmer entfernt werden, d] der Überstand in ein Gerät gegeben wird, das Weizenkeimlektin-Agarose enthält, e] das Eluat von der Weizenkeimlektin-Agarose aus d] auf eine Hydroxylapatitsäule gegeben wird, f] die radioaktiv markierten Fraktionen aus e] auf eine präparative SDS-PAGE gegeben werden, g] die radioaktiv markierten Fraktionen gesammelt und möglicherweise ausgefällt werden; oder erhältlich durch ein Verfahren, bei dem a] Darmzellen bereitzustellen sind, b] die Darmzellen aus a] mit einem photoreaktiven Inhibitor der Cholesterinaufnahme, der radioaktiv markiert ist oder mit einem Biotin-Tag versehen ist, inkubiert werden, c] die Darmzellen aus b] solubilisiert werden und die Zelttrümmer entfernt werden, d] der Überstand auf Streptavidin-Agarose gegeben wird, e] das Eluat auf eine SDS-PAGE aufgetragen wird, f] Proteine, die in einem Größenbereich von 140 bis 150 kDa laufen, ausgeschnitten, eluiert und möglicherweise rückgefaltet werden.
Aufgereinigtes 145-kDa-Protein, erhältlich nach einem Verfahren von Anspruch 1, wobei es sich bei dem biologischen Material um Darmgewebe oder um Zellen aus einer Darmzellenkultur oder um Bürstensaumzellen des Ileums entweder eines Menschen, einer Ratte, einer Maus oder eines Kaninchens handelt.
Aufgereinigtes 145-kDa-Protein, erhältlich nach einem Verfahren von Anspruch 1, wobei die photoreaktive 2-Azetidinonverbindung die folgende Struktur der Formel I aufweist:
Formel I wobei R ausgewählt wird aus einer der folgenden Gruppen a) bis e):
Aufgereinigtes 145-kDa-Protein, erhältlich nach einem Verfahren von Anspruch 1, wobei der photoreaktive Inhibitor der Cholesterinaufnahme mit einem Biotin-Tag die folgende Struktur aufweist:
Komplex, gebildet von einem aufgereinigten 145-kDa-Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und einer wie in Anspruch 3 definierten Verbindung der Formel I.
Komplex, gebildet von einem aufgereinigten 145-kDa-Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und einer Verbindung mit der in Anspruch 4 definierten Struktur.
Verfahren zur Aufreinigung eines 145-kDa-Proteins, bei dem a] Darmzellen bereitzustellen sind, b] die Darmzellen aus a] mit einer photoreaktiven 2-Azetidinonverbindung, die radioaktiv markiert ist und die dazu in der Lage ist, sich spezifisch an das Protein zu binden, inkubiert werden, c] die Darmzellen solubilisiert werden und die Zelltrümmer entfernt werden, d] der Überstand in ein Gerät gegeben wird, das Weizenkeimlektin-Agarose enthält, e] das Eluat von der Weizenkeimlektin-Agarose aus d] auf eine Hydroxylapatitsäule gegeben wird, f] die radioaktiv markierten Fraktionen aus e] auf eine präparative SDS-PAGE gegeben werden, g] die radioaktiv markierten Fraktionen gesammelt und möglicherweise ausgefällt werden.
Verfahren zur Aufreinigung eines 145-kDa-Proteins, bei dem a] Darmzellen bereitzustellen sind, b] die Darmzellen aus a] mit einem photoreaktiven Inhibitor der Cholesterinaufnahme, der radioaktiv markiert ist oder mit einem Biotin-Tag versehen ist, inkubiert werden, c] die Darmzellen aus b] solubilisiert werden und die Zelltrümmer entfernt werden, d] der Überstand auf Streptavidin-Agarose gegeben wird, e] das Eluat auf eine SDS-PAGE aufgetragen wird, f] Proteine, die in einem Größenbereich von 140 bis 150 kDa laufen, ausgeschnitten, eluiert und möglicherweise rückgefaltet werden.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei es sich bei dem biologischen Material um Darmgewebe oder um Zellen aus einer Darmzellenkultur oder um Bürstensaumzellen des Ileums entweder eines Menschen, einer Ratte, einer Maus oder eines Kaninchens handelt.
Verfahren nach Anspruch 7 bis 8, wobei die photoreaktive 2-Azetidinonverbindung die wie in Anspruch 3 definierte Struktur der Formel I aufweist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der photoreaktive Inhibitor der Cholesterinaufnahme mit einem Biotin-Tag die in Anspruch 4 definierte Struktur aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein aufgereinigtes 145-kDa-Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und pharmazeutisch unbedenkliche Verbindungen für die Formulierung eines Medikaments.
Verwendung eines aufgereinigten 145-kDa-Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 12 zur Behandlung einer mit erhöhtem Cholesterinspiegel verbundenen Krankheit.
Verwendung eines aufgereinigten 145-kDa-Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zum Identifizieren einer die Cholesterinwiederaufnahme inhibierenden Verbindung, bei dem a] biologisches Material bereitzustellen ist, das das aufgereinigte 145-kDa-Protein enthält, b] eine Verbindung bereitgestellt wird, c] das aufgereinigte 145-kDa-Protein aus a] und die Verbindung aus b] miteinander in Kontakt gebracht werden, d] die Menge an von dem biologischen Material aus c] aufgenommenem Cholesterin bestimmt wird, e] das Ergebnis aus d] mit dem Ergebnis aus einem Kontrollexperiment, bei dem die Cholesterinaufnahme von biologischem Material der gleichen Spezies- und/oder Gewebespezifität wie das aufgereinigte 145-kDa-Protein aus a], das jedoch nicht mit einer Verbindung von b] in Kontakt gebracht wurde, verglichen wird, f] die Ergebnisse aus e] auf eine Verbindung weisen, die die Cholesterinaufnahme inhibiert, wenn eine reduzierte Cholesterinaufnahme von Zellen, die mit einer Verbindung aus b] in Kontakt gebracht wurden, bestimmt wird.