DE1768426A1 - Verfahren zur Reinigung von Stoffen mit Thyrocalcitoninaktivitaet - Google Patents

Description

Yerfahren zur Reinigung ¥on Stoffen mit ThyroealaitoninaktiYität

Stoffe mit Thyrocalcitoninalctivitat werden durch Extraktion₉ Säulenchromatografie oder Gegenstroniverteilungsverfahren unter Verwendung eines Lösungamittelsysteras gereinigt, das aus n~\Buta~ nol, Wasser und Bisessig besteht« Bei manchen Modifikationen werden Mehrphasensysteme durch Zusatz von organischen flüssigen Medien, ZoBo Kohlenwasserstoffen, oder von Wasser zu dem Butanol, Wasser und Eisessig erzeugt»

Das Material wird in hoher Reinheit, nämlich mehr als 90 $ erhalten« Seine Aminosäurestruktur läßt sich wie folgt darstellen s

Cys» Ser_n/sn. LeU₀ Ser, Thr-, GySo VaIo Leu» Ser-. AIa , Tyr ο Try oArgo Asn ,> Lew-1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 i3 14 15 16

17 18 19 20 21 22 33 24 25 . 26 .'2? 28 29 30 31 32

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Die Formel bezieht sich auf das gereinigte Material und gibt nicht notwendigerweise das Protein wieder, wie es im Säugetiergewebe vorkommt oder wie es im Körper umgewandelt wird* wenn es als Medikament verwendet wird. Die Aktivität dieses Protein liegt in der Größenordnung von 60 000 Rattenainheiten pro Milligramm,- wenn es mit optimalen Mengen an inertem Trä~ gerp^otein geprüft wird*

Thyrocaltionin3₉die Hormone vom Polypeptidtyp sind, kommen in den Schilddrüsen von Säugetieren, z.B,Schweinen, und in menschlichen Schilddrüsen vor, und wirken als Mittel zur Senkung des Plasmacalciums durch Inhibierung der Knochenresorption. Das Molekulargewicht der Thyrooaloitonine wurde bisher nicht bestimmt, es scheint jedoch mehrere mit -verschiedenen Molekulargewichten zu geben.

Stoffe mit Thyroealcitoninaktivität wurden bisher durch Fällungsverfahren und anschließende Säulenfraktionierungsrer™ fahren gereinigt und konzentriert. Zwei typische Verfahren sind in den früheren Anmeldungen beschrieben, auf die oben feingewiesen wurde ο Eine beträchtliche Zunahme der Reinheit und der Aktivität pro Gewischtseinheit wird dabei erhielt, die Wirksamkeit des Verfahrens und die Endrei&heit und damit die Aktivität lassen jedoah nach zu wünschen übrig*

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Gegenstand der Erfindung ei,nü sowohl Verfahren zur Reinigung τοπ Thyroealeitonin. "bis zu einem hohen Reinheitsgrad, als auch, das Produkt selbst, v/ie es dusroh seine gekennzeichnet ist, die in Figur 1 <2er "beigefügten nungen - darg³⁸^!!* is*» Bas erfiädungsgeiaäße Verfahren "beruht darauf, daß vorzugsweise einphasige Lösungsmittel aus Mischungen niederer Alkenole, niederer Alkyl-ester von niederes; Alkensäuren, Ketonen und niederen Alkansäuren und Wasser in ^ einer Reihe von Verfahren_p darunter in Kolonnen angewandt werden»- Zu den Alkanolen gehören beispielsweise Methanol-Äthanol_s n-Propanol und n-Butanol*. Das letztgenannte Alka---ncvl xtfir beTorsugt, Beispiele fur die Ester sind ÄthyXaoetat und für die Ketone Methyläthy!keton* Die "bevorzugte nieder«? ■ Alkansäure ist Eisessig? jedoch kann man andere Säuren_s ssim Beispiel 2-Propionsäure und Buttersäure verwenden,, Das "bevorzugte !.ösungsmittelsystem enthält etwa 5 Teile n-Butanol,-3 Teile V/asser und 2 Teile Eisessig„. Me Verhältnisse können abgeändert werden $ solange e5,n einphasiges LösungsmitteloysteE! erhalten wird. Mit einigen der organischen Bestandteile» sum-Beispiel Methanol und Äthanol „ die in- Vfesser in allan Verhältnissen löslich sind, können nur einphasige Systeme erseugt werden*

Die Ausgangsstoffe für die erfindungsgeisäßen Zweske könne« mit Aceton entfetteteu^d dann gepulverte Säiigetiersehildilrlisen zum Beispiel Sckweiii^eohilddrüsen ode:« p^yHeIl ge;?ü:Ur>gt« Mate'riali-en sein. So v/ir<3 bei *?pi 3? s\-;e" a~ ('au

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material mit heißer Säure«, beispielsweise verdünnter Salzsäure oder verdünnter Essigsäure, extrahiert, die die Thyro** calcitonine löst«. Nach Filtrieren stellt man das Filtrat auf etwa pH 3 ein, adsorbiert die Thyrooalfliitonine an Oxycellulose und eluiert dann mit verdünnter Salzsäure. Das Eluat kann dann mit Ionenaustauscherharze^ die /.cetationen gegen

Ohlorlonen auszutauschen vermögen_P falls Salaeäure als Eluier-mittel verwendet wurde, auf pH 3 eingestellt werden«. Durch Lyophllisieren wird dann ein festes Produkt erhaltenο

formen Bei den Terschiedenen Ausführungs/ der Erfindung wird

das entfettete Thyroidmaterial mit heißer Essigsäure_? zum Beispiel 40 #~iger Essigsäure, gelöst und dann wird Butanol umgesetztρ um eine Endmischung aus Butanol, Wasser und Eisessig im Verhältnis von etwa 5 : 3 s 2 zu erhalten. Man wendet vorzugsweise eine Temperatur von etwa 40 - 60⁰C an_F und wenn die Auflösung vollständig ist, enthält der Extrakt das thyrocalcitoniaakliTe Material;, während ein beträchtlicher weiterer Anteil an inaktiven protainartigen Verunreinigungen zurückbleibt» Man kann die Extraktion mit dem unlöslichen Material wiederholen und das schließlich erhaltene feste Material verwerfen« {

Der Extrakt kann dann auf verschiedene Weine weiter verarbeitet werden- Mau Irann ihn direkt auf eine Celluloseeäule

_{-ÄÄ Λ} BADOPHGfNAL

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aufgeben ©der mit einem organischen Lösuwgsmittelo sum Baispiel Heptan_P versetzen, wodurch eine Abscheidung der wässrigen Phase5 die das thyrooalcitoninsktive Material enthält» reranlaßt wird* Man kann andere Kohlenwasserstofflösungsmittel verwenden9 die gegenseitig® löslichkeit mit dem organischen Bestandteils Alkohol,, Ester oder Kaiton_β und nur sehr geringe LöalichkQiten in Wasser aufweisen« Typische Kohlenwasser« stoffe außer Heptan sind Cyclohexane Benssol und Toluol-. Es ist ferner möglieh» durch Zugabe eines WaeserUbe^sehussas eine Trennung τοη organischer und Wassers chi ent ssu bewirken» wenn das organische -Material nicht in allen Verhältnissen in Wasser löslich ist» GewUnsohtenfalla kann man die organische Phase nach Abtrennung von der wässrigen Phase mit Wasser waschen und die wässrigen Phasen ■?ereinigen« wodurch die Ausbeute an Thyrooaloltonin etwas erhöht wird ο Aus der wässrigen Phase kann durch Lyophilisierung ei« partiell gereinigter feststoff erhalten werden,» Diese Arbeitsweise fuhrt dazu, d-aß das zu verarbeitende Volumen ohne merkliche Aktivitäts-= Verluste um etwa das 5«-fs ehe -vermindert wird-

Man kann partiell gereinigtes thyrocalciitnninaktinrea Material als Ausgangsstoff oder ,stattdessen Tergleichbare gerataigte Produkte verwenden. Wenn ein partiell gereinigtes Material verwendet wird, wirö es yorzügswaisü in einer Mischung der wäaerigsn Säure, zum Beispiel 40 ^iRer Essigsäure₉ direkt gelöst odar suspendiert. Dann wird der Alkohol» zum Beispiel

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nur in solcher; Menge »ugesetstj. daß sich eine Io suiigSHiittelmischung bildet, in der ein reichlicher Uifüar schlag entsteht. Me Zugabe wird abgebrochen bsm? eine rztarkliehe Abscheidung von Shyreoaluitonin erfolgt. Falle sich eine geringe untere Phase abscheidet_ρ wie es manchmal je nach den in dem Auegangsmaterial enthaltenen Terunreinigungen vorkommt, wird diese zusammen mit <2sm Niederschlag verworfen* Die leichtere Phase, die die Thyrocalsitoninaktivität enthält,, wirfl dann durch Zusatz von Kohlenwasserstoff oder Überschüssigem Wasser in zwei Phasen übergeführt, die Phasen werden getrennt, und die wässrige Phase wird lyophtlisiert.

Das so erhaltene Produkt kann zur weiteren Reinigung in einer Cellulosekolonne). eingesetzt werden= Ih einem aolchen Fall knnn der Zusatz τοη Kohlenwasserstoff und Wasser und die Lyophylisierung unterbleiben, und die erhaltene organische Phase wird direkt zur Speisung äer Oellulosesäule eingesetzt» Zur Verwendung in der Säule kann man Cellulose verschiedener Arten einsetzen, vorzugsweise faserigesWhatman-PulTer oder ähnliche Produkte, die bei der Pilterpapierherstellung erhalten werden. Die Cellulose wird Tor der Verwendung in der Säule durch Waschen mir mehreren Voluaenteilen eines Lösungsmittels aus 5 : 3 : 2 ButanoX-o '«fusee? und Bisessig und anschließende Luftrocknung behandelt. Thyroci-Ucitoninalrtlvee Material ₉ das nach den oben beschriebenen .Jtafen erhalten wird, wird in

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dem Lösungsmittel aus organischer PlUssigkeit, Wasser unfi Säure, aum Beispiel eines lösungsmittel© aus 5 : 3 s 2 a-Butanol, Wasser und Eisessig gelöst, und in das untere Ende einer mit der vorbehandelten Cellulose trocken gefüllten Säule gepumpt» Die Säule wird mit weiterem 5 ι 5 i 2-üöetangemlttel entwickelt, und Eluatfraktioaen aus dem oberen Ende der Säule werden getrennt aufgefangen. Geeignete Aktivität enthaltende Fraktionen werden vereinigt. Dttrch Zusatz τοπ Heptan % wird eine wässrige Phase erhalten und lyophysiliertj um gereinigtes thyrocalöitoninaktivea Material zu gewinnen« Im allgemeinen enthält das erste Proteinhauptmaximum des Eluats den Hauptteil der Aktivität. Die Säulenreiniguug ftthrt zu einer etwa 10-faqhen Zunahme der spezifischen Aktivität gegenüber dem Produkt, das durch Behandlung mit Oxycellulose erhalten wird»

Das gereinigte ^rodukt aiis der Cellulosssäule kann hierauf ■ « durch Molekulai-siebung in einer Kolonne weiter behände?·^ werden* die mit Epichlorhydrin Teynetgtes Dextran enthalt« Ein besonders wirksames mit Epichlorhydrin vernetzten Dextran ist unter der BezeichnungSepheäex G<»5o Im Handel erhältlich, Die Säule wird im allgemsinen nach öer Arbeitsweise, die in

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der Patentanmeldung der Erfinder Paul, Bell und Coluoci be schrieben ietp zubereitet, indem man zunächst das Gel Über Nacht in Wasser bei Zimmertemperatur quellen und denn in O_f1 a ) Essigsäure bei 4°C ins Gleichgewicht kommen läßt_e Die folgenden mit Hilfe run Säulen durchgeführten Arbeitsgänge werden ebenfalls vorzugsweise bei der gleichen niederen Temperatur durchgeführte Das tliyrocalcitoninaktire Material aus der Cellulosesäule wird in 0,1 a. Essigsäure gelöst, in die vorbereitete Säule eingeführt, und die Säule wird dann mit Op1 η Essigsäure entwickelt. Man überwacht das Eluat auf

/licht

■Protein mit Hilfe seiner Ultraviolettabsorption bei etwö

und fängt geeignete thyroaalcitoninaktive Fraktionen auf. Bei Verwendung von Sephadex G»50 werden die Fraktionen mit einem R£~Wert «wischen 0,34 und 0_P50 aufgefangen. Es sei darauf hingewiesen_P daß der oben angegebene R^-Wert eine charakteristische Funktion des Molekulargewichts der eluierten Substanz in einem Täeotimmten Gel darstellt«

Eine v/eitere Abänderung des Verfahrens umfaßt als zueilt 81 iohe Stufe eine GegenstroniTertöilung» Das Auagangsmaterial kann entweder auo Gelfiltratitmen oder au<3 der Celluloseohromatographie oäev beiden Btammen. Eevorsugt wird die 2-Stufen-Methode _f die zu einer großem VeriulnderuKg des Geaamtproteini? dos Material« mit ßcrlngeton ^rorlunten an Thyrooaloitoninaktivität ih die ϊϊ<?ί7.«.πβ (>r vernobJudeuen proteinartigen T-U'U.f ίτ μ'..·. ₍;^f t fit'-,,,»; \-'..it*flcM ''--Tc-.!-.'/,'η «fisetfitn PUr dje

« ^:1 1* ¹ <·⁽ⁱ β BAP ORIGINAL

SegenstromTerteilung ist ein 2-Phaaensytem erforderlich.Ein bevorzugtes Sy tem besteht aus etwa 5 Seilen n-Butanol_e 4 Teilen Wasser und 1 Teil Essigsäure, Die Reinigung beruht auf einem Unterschied in den Verteilungskoaffiaienten der thyroealcitoninaktiven Stoffe und inerter Verunreinigungen.. Die Verteilungskoeffizienten K betragen fftir die calcltoninaktlven Stoffe 0,25 bis 0,6 und fUr die proteinartigen Terunreinigungen weniger ale 0*1.'RLe thyrocalßitotiinaktiven Stoffe aind im Vergleich zu den meisten Verunreinigungen nach Qiner bestimmten Anzahl "von Überführungen lascher transportiert worden»

Bei Anwendung des ßegenstroaverteilungsverfahrens kann eine Vor&erteilung in etwa 6 Kolben durchgeführt werden. Die oberen Phasen einer Reihe von Vorverteilungen werden aus dem letzten Kolben aufgefangen ₉ vereinigt und mit Heptan oder Wasser τer setzt, um die Aktivität in einer wässrigen Phase au konzentrleren, die hierauf lyophylisiert wird, um ein Trockenpulver zu erzeugen« Das Produkt der ersten Gegenstromextraktion kann dann in eine Verteilungeyorriohtung mit 250 Röhrchen oder einer ähnlichen Vorrichtung mit alner Vielsianl von Röhrchen eingeführt werden* In einem typischen Fall aind etwa 10 ml beider Phasen des lÖsungBirilttelayatsBiö In -j»?lam feilte 11 is rohr enthalten.. Die öegentitrofflextrakt-ioa, die yorzugsiireia-a bsi niederen Temperaturen, aum Beispiel «tv/a 4⁰O durchgeführt ißt in mehreren d'agen beetiü^t, ße.s Ig-ns 1;a Pv-ak'iion»«-» dit^s <lurch

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Bestimmung dee Proteinmaxisiuma und/Jder durch einen Ra der nooh beschrieben wird, festgestellt werden? enthalten Aktivitäten in der Größenordnung von etwa 40 hie 100 Haituneinhalten/mg. Die Ratteneinheit dor Thyrooaloitoninaktivität lot folgendermaßen definiert:

Eine Ratteneinheit ist als diejranjflp Menge an Thyrocyloitoninnktivität definiert, die den Ooloiumgehalt im Serum von jungen nüchternen Ratten in einer Stunde ura 10 # vermiiNle'H. JDqs hormouhaltige Material wird In die Sohwanzvene der anästhe-Meierten Ratten injiziert. Eine Stunde später injiziert man 0,0^ ml Heparin in die Schwanzνene und entommt dann in etwa IO Sekunden eine Blutprobe aus der oberen Augenvene. Man zentrifugiert die Blutprobe und bestimmt den Calciumgehalt des Plasmas mit Hilfe einer Abänderung der Murexidmethode die von William und Moser in Anal.Chenu, Bd. 25 (1936), S. 1414-1417 beschrieben wurde. Diese Ratteneinheiten werden im folgenden abgekürzt als "Einheiten" bezeichnet.

Die zur Bestimmung der Strukturformel dee erflndungsgemäßen Produkts verwendeten Methoden werden in Form eines zusätzlichen Beispiels bei der Beschreibung der bevorzugten AusfUhrungeformeη der Erfindung nooh genau erläutert. An dieser Stelle fiel jedoch darauf hingewiesen, daß bei der Aufklärung der Strukturformel der Verbindung, die in einem Balepiel als Produkt heaohriehQP lot, keineswegs festgestellt wurde»

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die genaue Strukturformel der von Thyrocalcitonin, wie es 3η Säugetiergewebe vorkömmt_p oder von ThyrocaXcitinon noch dieser Erfindung entspricht, wenn dieses in einem Säuge« tier fUr medizinische Zwecke verwendet wird. Es ist sehr unwahrscheinlich, daß die Formel des erfindungsgemüßen Produkts mit der des Materials identisch iot_P das in Säuge tiergowebe vorliegt* Bas erfindungsgeiuäße Thyrocalci^onin ist ein neues Produkt mit einer Reinheit, wie sie bisher niemals" erzielt wurde,*'und den Verfahren, durch die das hoch gereinigte Produkt erzeugt wird und von denen eine vorteilhafte Verfahrensweise hierin erläutert wird, liegen chemische Vorgänge zugrunde, die leicht zu Veränderungen im Molekül, fuhren können. Ba das Molektil ferner einige Aminosäuren enthält, die andere aktive Gruppen als die Carboxyl- und «-■ Aminogruppen, die an der Bildung der Feptidkette beteiligt sind, aufweisen, ist es leicht mögliche daß das Thyrocylci tonin im Säugetiergewebe vernetzt oder in anderer Weiss substituiert sein kann₉ wobei die BlaAngen mit den anderen reaktiven Gruppen bei der Herstellung des gereinigten Materials nach dieser Erfindung gespalten werden« Eo ist an her eine solch» Vernetzung denkbar, daß in dem Säugetier gewebe*, ^aum Beispiel etner Schweineschilddrüoe, die Thyrn caicitoninaktivität von einem Polymeren ausgeht, wöbej d Begriff in seinem allgemeinsten Sinn gebraucht wird \xn^r ei Vernetzung einschließt, die durch eine cl> ,!!''rcI« FzrhiUv unter Abspaltung von V/nueer t'^f, W;-<ßR«r t?n<' h>.yff oj < ι >.m

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entstanden sein kann. Es 1st ferner denkbar* daß Thyrncalci tonin in dem Säugetiergewebe aufgrund von Waeeeratoffbindungen und anderen Kräften ale größeres Molekül vorliegt. Jedenfalls sseigt ei« Vergleich der Aktivität von rphem Schilddrüsengewebe mit der des gereinigten Produkte nach dieser Erfindung, daß die Aktivität in dem Molekül liegt, das durch die hierin beschriebene Strukturformel wiedergegeben wird.

Soweit jedoch bisher bekannt ist, let das Molekül als ganzes fUr die Thyrocycitoninaktivität erforderlich. Bei einer Zerlegung durch Enzymepaltung und dergleichen, die zur Bestimmung der Strukturformel angewandt wurde, wurde bisher kein Fragment des Moleküle erhalten, das noch die Thyriocaioitonihaktivität aufweistr

En sei darauf hingewiesen, daß die Bestimmung der Strukturformel mehr ale ein analytisches Routine^erfahren darstellt. Das soll nicht heißen, daß bei der Bestimmung der Struktur nicht die Übliche saure Hydrolyse zur Bestimmung der Zahl von verschiedenen AmJnosäurß^eeten zu Beginn und weiterhin zur Prüfung '-on Fragmenten angewandt wird. Diese Arbeitsweise als solche wird 'η der Profeinchemie routinemäßig durchgeführte Sie wurde s?waj.· in den Fällen« in denen es nötig war, angewandt, stellt ,1(.dool>. a¹« bekannte Anolysenmethod© kein neues Merkmal dar, ii'iu di»« Frfit'rtim/i vom Stnnd der Technik unterscheidet-

Witt IM 7/ Hl ■'!

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13 »

Bei der Anwendung der analytischen HydroIysemethod β wurden die-UbILehen Vorsichtsmaßnahmen beobachtet. So wurde beispielsweise Tryptophan, das durch saure Hydrolyne aura Seil verstört wird, durch andere UbILohe Maßnahmen bestimmt,, Ferner ermöglicht die saure Hydrolyse keine Unterscheidung zwischen Asparaginsäure und Asparagin oder Glutaminsäure und Glutamin ··« ^^{a in} beiden Fällen Asparaginsäure bzwο Glutaminsäure festgestellt v/Lrd» Bei der !«taten Zubereitung wur ^f den andere Maßnahmen angewandt, wobei festgestellt wurde, daß die 4 als Asparaginsäure festgestellten Aminosäuren in Wirklichkeit aus Asparagin bestehen und daß der Glutaminsäurerest nicht in der Ami&furm vorliegt« Obgleich die saure Hydrolyse routinemäßig durchgeführt wird und Üblich ist, wird das Ergebnis» das die empirische Aminosäureformel des erfindungegemäßen Produkts liefert, erneut angegeben. Wie es in der Analyse üblich ist, werden die tatsächlichen Mengen durch das Molekulargewicht der jeweiligen Aminosäuren dividiert * und die nächstliegende ganze Zahl wird für die Aminosäure reete angegeben. Die Routineanalyse ergibt folgende empirische Aminosäureformel:

*r Thr₂ Ser^ GIx Prog GIy₅ Ala VaI Cys₂ Met LeU₅ Tyr Hi» Arg

Das erflnduiigagemäße ^rodukt 1st awar HeVr^Jn₉ -se ν/βίtifc ,)« doch als Vertuti'elin'JLguugeii i'iuin« Mangel ■,>> ,'Min «ϋη.'.'Ί, niimU<!h

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u -

Leucin und Lyain auf. Wie no oh erläutert wird, eine etwa8 stärker gereinigte Probe die beiden Verunreinigungen in verminderten Mengen auf. Sie bilden keinen Teil _t des Holeklila, da sie in Mengen vorliegen» die unter denjenigen liegen, die einen Rest in der Formel selbst ansteigen v/Urden*

Bo aei darauf hingev/iesen ₉ daß die erfindungsgemäße- Verbindung in Gegenwart von VerdUnnungnmltteln verabreicht werden kann und daß die Thyrocaloltoninaictlvität ron der Verbindung und nicht notwendigerweise von der Dosierung der Hedlein, die verwendet werden kann, abhängt.

Pig· 1 eelgt die Strukturformel dee ThyroctLoitoninprodukta mit Fragmenten dea enzymatisohen und chemischen Abbaue und

FIg, 2 stellt ein Pließdiagranim des erflndungagemäQen Ver -W fahrens dar.

Beschreibung der bevorzugten Ausführunftsformen

Bas erfindungagemäße Verfahren wird In Verbindung mit Pig.2 erläutertρ die ein Fließdiagramm darstellt, das alle Verfahrenavarianten zeigt.

BAD ORIGINAL j «9a 37/ Hi B 9 ~~

- 15 -Beispiel 1

4,0 g ait Aceton entfettete und gepulverte Schweindesohild» drüse wurden Bit einer Mischung aus 6 ml Eisessig und 9 ml Wasser bei etwa 50°0 extrahiert. Eine gleiche Volumenmenge (15 ml) n-Butanol wurde sugesetzt, und nach 10 Hinuten "bei etwa 50⁰C wurde der BUokstand abgetrennt und in gleicher Weise mit 25 ml des Systems aus 5:3:2 n-Butanol/Wasser und Eisessig erneut extrahiert. Die überstehenden Flüssigkeiten aus dieser Extraktion wurden vereinigt und mit 50 ml Wasser versetzt, so daß sich eine wässrige Phase abschied. Die organische Phase und eine kleine Menge Niederschlag (inagesamt weniger als 1000 Einheiten Thyrocalcitonlnaktivität) wurden Terworfen. Die wässrige Phase lieferte nach Lyophilieierung 0,57 g trockenes Produkt, das etwa 20 000 Einheiten enthielt.

Beispiel 2

20 g rohes thyrocaloitoninaktiveo Material, das aus dem oben beschriebenen Oxyoelluloseverfahren erhalten wurde, wurden in 80 ml 40 jt-iger Essigsäure bei Zimmertemperatur gelöot. Die hochviskose bräunlich gefärbte Lösung wurde mit 100 ml n-Butanol versetrfc. Nach kräftigem Schütteln trennten sich ein- beträchtlicher niederschlag sowie eine wässrige PUase

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ab. Eine große Menge der mit dem Material verbundenen Farbe war in der geringen wässrigen Phase angereichert,, Die Mi-βchung wurde bei 2500 U/ff 15 Minuten lang bei Zimmertemperatur zentrifugiert, und die organische Phase wurde entfernt, Die wässrige Phase und der Niederschlag wurden in 15 ml des 5:3t 2-Systems suspendiert, und die nach dem Zentrifugieren erhaltene überstehende Flüssigkeit wurde mit der ersten Überstehenden Flüssigkeit« die abgetrennt worden war« vereinigt. Der Niederschlag und die wässrige Phase wurden lyophilisiert und zu Inforraationsewecken biologisch getestet. Aus dieser Fraktion wurden 10,24 g Feststoff mit geringer biologischer Aktivität erhalten und verworfen.

Die vereinigten organischen Phasen (180 ml) wurden mit 400 ml Heptan versetzt. Die wässrige und die organische Phase, die so erhalten wurden, wurden getrennt. Die organische Phase (Heptan, n~Butanol und etwas Essigsäure) wurde mit 70 ml Wasser extrahiert. Der Wasserextrakt wurde mit der ersten wässrigen Phase vereinigt,'und die wässrigen Phasen (116 ml} wurden lyophilisiert. Es wurden 10,3 g thyrooalcitonlnaktives Material_β das 2 500 000 Einheiten enthielt erhalten«

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Beispiel 3

3«37gpartiell gereinigtes Material mit Thyrocaloitoninakti vität (417 000 Einheiten oder 220 Einheiten/mg) wurden in einer Mischung aus 12 ml Eisessig und 18 ml Wasser gelöst.

Mach Zugabe von 30 ml n~Butanol wurde die Mischung gertihrt und

dann etwa 10 Minuten lang stehen gelassene Nach dieser Zeit wurde durch Zentrifugieren der Mischung eine obere organische M

Phase von einer Zwischenphase, die einen Niederschlag enthielt

wässrigen . und der unteren/Phase getrennt_o Der Niederschlag und die wässrige Phase wurden mit etwa 10 ml einerMischung aus 5 Teilen n~Butanol, 3 Teilen Wasser und 2 Teilen Eisessig (5:3:2) gewaschen. Die bei der Waschbehandlung erhaltene · organische Phase wurde mit der vorher abgetrennten organischen Phase vereinigt (Gesamtvolumen 34 ml). Der gewaschene Niederschlag und die untere wägerige Phase, die nahezu frei von Thyrocylcitoninaktivität waren, wurden verworfen. J

Öle organischen Phasen wurden in das untere Ende einer Säule (5oe Durchmesser und 80 cm Höhe) mit 575 g trocken eingeflillter Cellulose gepUMpt«, die wie oben beschrieben vorbehandelt worden war. Die Säule wurde mit Cellulose trocken unter solchen Druok gefüllt, daß die gefüllte Säule eine Cellulosedlohte aufwies, wie sie ungefähr bei Papiarehromatogwphiepapieren vorliegt. Denn wurde die organische Phase durch

..^ρΐί". ίι ¹JfJ^T¹, .■ ; .

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Einpunpen eine· lösungsmittelβ (5:3:2) Mit einer Strömungsgeschwindigkeit yon etwa 52 ml/Stunde nach oben entwickelt. Nachdem das obere Ende der Säule erneIcht war, wurden Eluatfraktion«η in Mengen von 13 bis 15 ml pro Traktion aufgefangen. Die Fraktionen wurden mit Hilfe des Rattentests auf Thyrooaloitoninaktivität analysiert. Ferner wurde das Protein-Peptid-Profil duroh alkalische hydrolyse und Nlnhydrinentwicklung nach der Methode von Hire, Morre und Stein,wie sie in J. Biol. Chem. 219 623 (1956) beschrieben ist, erhalten. Unter diesen Frlifbedingungen wurde festgestellt, daß die Thyrocaloi toninaktivltät mit dem ersten Froteln-Faptid-Maximum verbunden war_f(dieees Maximum 1st nur etwas langsamer als die Löeungemittelfront). Die Fraktionen 8 bis 17t die die Bhyrocalcitonin aktivität (entsprechend dem ersten.Frotelnmaxlmum) enthielten, wurden vereinigt und lyophilisiert.

Bei diesem Versuch wurden 368 mg gereinigtes Material, das 410 000 Einheiten enthielt, aus 3370 mg eines alt Oxycellulose behandelten Materials erhalten, das 417 000 Einheiten enthielt. Die Ausbeute betrug also mehr als 90 £ und die spezifischen Aktivität wurde von etwa 120 Einheiten/mg auf 1120 Einheiten/mg erhöht.

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- 19 -Beispiel 4-

Un festzustellen, ob andere Lösungsmittel und organische Säuren bei einer ähnlichen Arbeitsweise unter Verwendung der trocken gefüllten Cellulosesäule verwendet werden können, wurde eine Reihe von Standardversuchen durchgeführt, wobei gleiche Säulen nit CellulocefUllungen verwendet und die organische Säure und das Lösungsmittel abgeändert wurden. In sämtlichen Fällen

wurde dae Verhältnis von organischem Lösungsmittel, Wasser und Säure so eingestellt, das für die Entwicklung ein 1-Phasen«-System verwendet wurde. Bei diesen Versuchen wurden jeweils 25 bis 30 ag eines in einem einzigen Ansatz mit Oxycellulose gereinigten

in Materials mit fhyrocylcitoninaktivität in Verbindung mit jedem/der folgenden Tabelle I angegebenei Lösungsmittelsystem verwendet. Für die FUllung, Beschickung und Entwicklung der Kurve wurde im wesentlichen die Arbeitsweise von Beispiel 3 angewandt. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der folgenden Tabelle zug aminen gefaßt:

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	Wasser	Säure	als Feststoff beim Aktiv!täte maximum gewonne nes Material
Tabelle I	(3)	Essig~(2)	3«8 mg.
	(2)	(2)	0,8 mg.
LösungBiaittelejrotem (Volumenteile)	(3)	(2)	18,0 mg.
Organisches Lösungs« mittel	(3)	(2)	5»4 mg.
n=Butanol (5)	(3)	(2)	3;6 mg.
n-Butanol (5!)	(3)	(2)	5,5 mg.
Methanol (5)	(2) 2	-Propion- (2)	0,8 mg.
Äthanol (5)	(2)	Essig- (2)	0„1 mg.
n-Propanol (5)
Methyläthy!keton (5)
n-ßutanol (5)
Äthylacetat (5)

BeJ ;)<■(*ein d«r oben bßuohrt ebenen Verouohe war die biologiache Aktivität mit ei non! Mr: si mum -verbunden· Der relative Relnigungs grad wird durnh (*.U^!. mit dieser Aktivität verbundenen Gewichtsverminderung angc/,βΐ^ί, Bn kann angenommen werde η ^ daß eine beträchtliche Ho-<ni(;ung mit all!en angegebenen Kombinationen außer

T ^s t⁽n H';tiionol err.ielt wird λ BADOBIQINAt.

- 2ϊ ■ Beispiel 5

Die GegenetroBiVörsrer teilung mn thyrooaloifconinhalfcigBtn Mntei'ial in Kolben wurde in einem Arbeltetag bei. Zimmerfceraparatür durch,; geführt» Die Vorrichtung file¹ dleäon Yersuah benfcuml aus eetohs 250 ml Kolben, Daa Lösungsral tfceloyufcfim basi;u id min ti Teilen η-Bu ta no I» 4 Teilen Waaeer und i Teil ISiuooü.Lg« Juri «λ' Kolben enthielt ursprünglich 100 inL eier unseren Phiiuu <\>m buarAwlebinien LöeungBrnitteleyatema,,

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4_fl29g mit 3ephadex»5O gerelnlgtea thyromiiti.Uonnkfclsren HüterinL

wurden In 100 ml der iintei'sn Phon» üen nca^n-i Ko ^

100 ml der oberen Phase dun T.thjungoia.lfc hälay:ifeema v/urtliiii In einem uegenstromextraktionoirerfahren flii' di. · 6 l'lniioh^ii verwendet. Die 15 oberen Phasen, dl a ami dom lebut.m Kolben (Ni¹,6) abgetrennt wurden, wurden vereinigt und durch fiep tan·» κ Fraktion aufgearbeitet. Ea wurden 0>262 g trockenen ^roduJci »rhnlfcfni, Durch Analyse wurde fesögeute Il t, duß dloueu prnkttiich din ge eamte Aktivität dee Auugun^diiui türiola tinlhf,;lt, |il;-it) L¹Ir ^u Un I n.j Btlramen mit den Auebeutebnrechntin^en outiituül um- / 'i'leHungn knefflelenten Ubereln, die nun aminen OttgBuüt i-oiiif» .·*■>*} IJunßa ■ ▼ereuohen erhalten wurden« i-atJ ^l'rodukk nun ili.enav KoΓ'ΐΛ^/',ίί^βπ atromver teilung weist ain filuLmum nti Hmiiiit: ·, ι ·; ι <!ιυ μη um) irnOglloht die Yetwendung oln«r \i.]\.t f₍köii r t ;; ιΐίίαιη,ζ <m aktivem Material in '/erhlr» Inni; ni Ir* -^; ijj.· ί »; > o_!t ,? -{"littim; iii' 2$0 Rühren,

^ßAD0RIG"«i.

- 22 Beispiel 6

Die Ln diesem Verßuch verwendete Vorrichtung enthielt 250 verbundene Extraktionaröhren (sa'nifcliche auo Glas), dlu mit einem automatischen Antrieb versehen waren« Dieäe'VorrLchtung Ißt ao konstruiert,, duß öle im "Kreiolaufba trieb", wobei, dos Material , dan Ln da« letzte Rohx· (Nr. 250) gelang!;, Ln daß »rate Rohr zurflolrgafUhrt wird, oder nltern.itlr itn "Abnohmebe trieb¹¹ verwendet werden kann, wobei aast Material (lau Ln dfjfi letzte Rohr gelangt, abgenonunen und unnchLLeßencJ mLfc fintieren ähnlichen Fraktionen vereinigt vilrd.

Alle Oegenatromverauche dieaer Vorrichtung mit 250 Rühren wurden bei 4-⁰C durohgefUhrtp um Akti'/ltäfcaverluote auf ein ?ii ilmum zu b enhi'Hnkeki«

IiUr clLßnen Verauch wurdö da» Synbfim aua 5 ' 4 s in Bn Waßnnr/B'iHooeig verwendet- J«üaa Röhrr?hen dar Galann",, . vLi;htung mit ?.^r)0 Röhrchen uiißer d-;in Rühiuhen Nv. J inul 2 wu ,-ila mit .niariilah jvul.-m Wangen d iv unteren Phnue (i 1 ml ) büji;hlokt; , h\ ji.üh in dienern i»yu olmii ba lui Jteiian w« ;hiie !,kU» Herden Hu t / laß« tn ' ijlLdiM, vnn'iJa üxa Lw Gleichgewicht; be ?.\i\ft\\ <;h*j •M5.,uii_;;-jin.l ;^.;! 1. iyufc !μ MitUO-fr} Tag;·: ι,'/ii· iitjgina Φ·.*ϋ ϊ)2·>-πιοΐυ her ««of;!.''! Lt. H ■ '/"<»; .· rn ι ή.,!Mil j,;r i'lir ?Ηβ /orrl i,hb.ing wurdfj wie

d i iiiif!^ :ν-;ι>: ';>> ° 1'.- -. ■ l ΐί-'/ϊο./^ i liirtO IrJ JOtliakt.

BAD ORIGINAL

260 ng partielle gereinigtes thyrncalcitoninaktives Material, das nach der Arbeltswelse vrin Beispiel 5 erhalten wurde, wurden in 22 ml der unteren Phase des Lösungsmlttelsystems gelöst und in die Röhrchen Nr. 1 und 2 der Vorrichtung eingefüllt. In die RShrohen Tor den Röhrchen Nr. 1 und 2 wurden genügende Mengen Im Gleichgewicht befindlicher oberer und unterer Phase gegeben, um des Phasengleiohgewicht wieder herzustellen. Der mechanische Antrieb der Vorrichtung wurde auf 4 Überführungen/Stunde eingestellt. Mit der Vorrichtung wurde ein Fraktionssammler verbunden, der die oberen Phasen aus Röhrchen Nr* 250 auf-» nahm. Die Verteilung wurde nach 1175 Überführungen beendet und alt den gesammelten Fraktionen sowie den in den Röhrchen der Vorrichtung verbleibenden Fraktionen wurden Test= auf biologische Aktivität und Protein durchgeführt. Die biologischen Testwerte ergaben eine hochaktive Fraktion in den aufgefangenen Fraktionen mit einem Aktivitätszentrum bei Fraktion Nr. 750, d.h. er oberen Phase aus Röhrchen Nr. 250 bei 750-ten Überführung. Dieses Aktivitätemaximum erstreckte sich von Röhrchen Vr. 650 bis zu Röhrchen Nr. 850 und entsprach genau einem Proteinmaximum, das nach der Methode der alkalischen Hydrolyse und Ninhydrinfarbentwlcklung festgelegt wurde. Die berechnete Bandbreite entsprach der theoretischen Bandbreite. Der ^NBttrlebs^Mvertellung8koeffisient wurde aufgrund dieser Werte Mit 0,49 berechnet. Die Gewichtsaubeute bei diesem

betrug 17p1 mg (TCT-I). Weitere UnterBuchungen der in dem Gerät verbleibenden Höhrohen ergaben ein zweites MaMimum biologischer Aktivität, das eioh von dem Röhrchen Nr- 175 bis Nr« 250 erstreckte. Der berechnete Verteilungekoeffizient für das zweite thyrocalcitoninaktive Material betrug O₀23. Die Gewichtsausbeute bei diesem Maximum betrug 11,1 mg.

Dieser GegenstromverteilungSTersuoh wurde mit einem im Gleichgewicht befindlichen System aus n-Butanol, Wasser und Eisessig durchgeführt. Bei Verwendung von frisch hergestellten Systemen wurde die biologische Aktivität nech dem gleichen Muster aufgetrennt, in diesen Fällen betrugen jedoch die Verteilungs Koeffizienten 0,66 und 0_Γ33« Bei diesen Versuchen konnte ferner ein kleiner Anteil an Thyrocylciltoninaktivität mit einem Verteilungskoeffizienten von 0_r14 nachgewiesen werden, der von konta minierenden Proteinen und anderen Verunreinigungen nicht völlig abgetrennt wurde»

Das oben beschriebene TOT-I Material wieo eine Aktivität von etwa 60 000 Ratteneinheiten/mg Protein auf, wenn es in einer optimalen Menge an inertem Iräßorprotein getestet wurde, und entsprach der oben angegebenen empirischen Aminosäureformel sowie der Strukturformel von Figo 1.

10 9 8 3 7/1669 B^AD ORIGINAL

25 -Beispiel 7

■s -—ττίί τ ίιγτ -τγ- -,mn -!«man; ^nr— -r ■■ . fc*

Dieses Verfahren bildet zwar keinen Teil dar Erfindung, kann jedoch zur Herstellung γοη partiell gereinigtem Rohmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren angewandt werden»

100 1 auf 75⁰G erwärmte 2rt Essigsäure wurden unter Rühren mit 10 000 g Schweineechilddrlisen versetztj die mit Aceton entfettet und gepulvert worden waren» Die Mischung wards 1 Stunde gerührt (Temperaturabfall auf 60⁰C)_F nach dieser Zeit mit einem gleichen Volumen kalten destillierten Weasers versetzt, gut gerührt und dann 1 Stunde lang absitzen gelaasen» Man trennte die überstehen de Flüssigkeit von den Feststoffen ab und wjjdsrhor'ce M* Extraktion dreimal mit weiteren Mengen Wasser« Der Niederschlag wurde verworfen« Die Überstehenden Flüssigkeiten (300 X) wurden vereinigt und auf etwa 8⁰O gekühlt.

8000 g (Trockengewicht) gepulverte oxydierte Cellulose; die durch Waschen mit 0,2 η Salzsäure und zweimaliges Waschen ■it 10 Seiger Essigsäure vorbehandelt und filtriert wurde» wurden su der gekühlten Flüssigkeit gegeben, und die Mischung wurde 12 Stunden lang gerührt und dann 5 Stunden laug absitzen gelansen.

Man verwirft die Überstehende Flüssigkeit und wäa>ht dbi Oxycellulose absatzweise zweimal mit AbsltaKBl ttm voi\ i und 1/2 Stunde mit insgesamt 130 1 iO Ά -lg»! ρ faHiilgniiuro. 1)1«

1 0 9 8 -T/ / 1 Π 6 3

zum Waschen verwendete Essigsäure wird verworfen* Dann wird die Oxycellulose in 0,2 η Salzsäure aufgeschlämmt_Ί in eine Säule gefüllt und dann mit etwa 50 1 0,2 η Salzsäure eluiert, Bas Eluieren wird beendet, wenn die optische Dichte des Abflusses auf O„.2O oder weniger absinkt. Der Abfluß wird mit soviel Amberlite IRA-400 /cetat-Anionenaus tauscherharz versetzt, daß sich ein pH-Wert von etwa 3₉0 einstellt. Der Abfluß wird von den ^warz abgetrennt und lyoptiiliaiert, wodurch man 76,4 g gereinigtes Material mit Thyro oylcitoninaktivität erhält.

DaB in Pig, 2 dargestellte Fließschema zeigt die verschiedenen Abänderungen des erfindungsgemäßen Verfahrens, die in den vor. stehenden Beispielen beschrieben sind. Wenn man das Verfahren in der vollständigen Form durchfuhrt, wird eine Ge samt reinigung der Größenordnung von 250 000 erzielt«, Dieser Reinigungsgrad 1st erheblich höher als der nach bekannten Verfahren erzielbare Reinigungegrad.

Beispiel 8 \

Rohes thyrooaolitoninaktives Material wurde bei diesem Verteilung8chromatographieversuch unter Verwendung des 2-phaeigen Lösungamittelsysteme n- Butanol, Wasser und Essigsäure im Verhältnis 5:4:1 eingesetzt. PUr den Versuch wurde ein Streifen Whatman-Kapler Nr, 1 raLt den Abmessungen 15 om χ 96 cm (6"x22")

1 OUUlI/ 1663 BAD ORIGINAL

1768A26

verwendet. Das rohe Oxycellulosematerial wurde auf das Papier an 2 Stellen im Abstand von etwa 10 cm (4") vom oberen Ende des Papierstreifens aufgetragen. FUr jeden Fleck wurden 2 mg des Materials in 0,1 ml Wasser gelöst verwendet. Nachdem die aufgetragene Lösung getrocknet war, wurde der ^'jpierstreifen in den Chromatographierbehälter gehängt und mit den Dämpfen der wässrigen Phase des Systems 2 bis 3 Stunden ins Gleichgewicht gebrachtλ Dann wurde di_e organisohe Phase des Lösungsmittelsystems zur Entwick M lung des Steifens während einer Zeit von 18 Stunden verwendet« Die Lösungemittelfront bewegte sich auf dem Papier über eine Strecke von 45 cm (17 3/4") von der Auftragstelle nach unten« Ein Teil des Papierstreifen8, der eine der Auftragsatellen enthielt, wurde mit Ninhydrin entwickelt, um die Aminosäuren und Proteine sichtbar zu machen. Diese Entwicklung wurde durch Aufsprühen einer

mit

0,5 #-igen Lösung in n-Butanol, das/O_fO5 m Phosphatpuffer gesättigt war, pH 7 „und Enwicklung der Farbe durch Erwärmen des feuchten Streifens in einem Ofen fUr chromatographische Zwecke M während 20 Minuten bei 85⁰C erreicht. Der andere Streifen, der nicht mit Ninhydrin entwickelt wurde, wurde in Teile zerschnitten und mit 0,1 η Ameisensäure eluiert. Mit den Eluate.i wurde der bllogisohe Rattentest durchgeführt. Die Ihyronylnit>njn aktivität befand eich in einem Gebiet im Abstand von 23-.^{( l}'^^B 30,2 cm (9»1 bis 11,5") von der Auftragsatelle- Der Ii₁- Wert der Thyrooaloitoninaktivjtat beträgt alno eiwa 0,59* Aus diesem unerwartet hohen Rf-Wart ergib* sich, daß die Thyroxin oitonln aktivität in der orßoniij*?f.'?n Phn«« den LÖHungnmi.ttelsystems

1 0 9 8 3 7 / 11? 6 9

gut löslich ist. Proteine und die meisten Peptide sind im allgemeinen in diesem Lösungsmittelsystem nicht in diesem Ausmaß löslieh.

Beispiel 9

Reinigung der Thycooalcitoninaktlvität durch Gegenstromextraktion unter Verwendung einer ganz aus Glas bestehenden Extraktionsvorrichtung

7Ur diesen Versuch wurde eine automatisch angetriebene Gegenetromextraktionevorricheung mit 200 Röhrchen verwendet, die mit 2 ml unterer Phase betrieben wurde und bei der bei jeder überführung 2 ml obere Phase Übertragen wurden« Als Beschickung wurden 100 mg Thyrocalcitoninmaterial, das nach der Arbeitsweise von Beispiel 8 hergestellt wurde, verwendet. Dieses Auegangematerial enthielt aufgrund der Analyse etwa 35 Gew.-^ Protein und etwa 250 Lederle-Einheiten Tyrocalcitoninaktivität pro mg. Protein. Ee wurde das gleiche 2-PhasenlöBungsmittelsyetem wie für die Papierverteilungs-Orhomatographie von Beispiel θ verwendet. Das System bestand aus n-Butanol, Wasser und Essigsäure im Volumenverhältnis 5:4*1 Die im Gleichgewicht befindliche wässrige Phase wurde als untere Phase in der Vorrichtung verwendet, und die Entwicklung wurde nit / der organischen Phase durchgeführt. Dieser Verteilungsverauoh \ wurde bei 25⁰C durchgeführt. Die ^xroteinbtSchickung wurde in ( 4 ml der unteren Phoee gelöst und in die Röhrchen 1 und 2 4er Vorrichtung eingefüllt. Nach 154 Überführungen wurden Proben

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und jedes t Unfte Rohr wurde mit Hilfe der optischen Dichte bei 280 Btu und der biologiechen Aktivität auf Protein geprüft. Daβ Protein verteilte sich auf die Röhrchen 5 bis 60 und die blologiache Aktivität auf die Röhcen 30 bis 60. Diese Aktivit äs verteilung ist breiter ale die theoretische Kurve für eine einzelne Subetanz und legt nahe, daß mehr ale eine aktive Komponente von der Hauptmenge des Proteine abgetrennt wurde. Die Betriebsverteilungskoeffizienten liegen im Bereich von 0,3 bis 0,5. Haoh 154 Überführungen wurde etwa die 3~fache Reinigung ersielt.

Die aktiven Röhrchen, nämlich ITr. 31 - 49c wurden einzeln aus dSem Gerät entnommen und der verbleibende Inhalt der Vorrichtung wurde verworfen· Die aktiven Röhrchen wurden dann wieder in der gleichen Reihenfolge in die Stellungen 33 bis 48 eingesetzt, und die Übrigen Röhrchen wurden mit beiden Phasen in der entsprechenden Menge versorgt. Dann wurde die Vorrichtung auf *reielaufbetrieb umgeeohaltet und es wurden 846 weitere Überführungen durchge fUhrt.

Die Wiederholung des Proteinteeta und dee biologischen Ratten teste ergab, daß die Spitenaktivitäfcen bei den Röhrchen 50 und 155 logen und mit nur sehr kleinen Ment^n l'iOtaLn der An fangsbeschickung verbunden wuren»

109837/1669 BAOoriginwl

1768Λ26

Diese Stellungen entsprechen den Röhrchen 250 und 355 in einer größeren Vorrichtung und stimmen mit denjenigen Überein, die sich aus dem nach 154 Überführungen berechneten Verteilungekoeffizientenbereioh ergeben₉

Beispiel 10 .

Daβ Produkt des vorhergehenden Beispiels wurde mit Carboxymethylcellulose (CMC) nach einer Modifikation der Methode Dedman₆ M. L*, et al», Bioohem. J₉ 78, 348 (1961) weiter gereinigt. Etwa 30 g Cellex-Cm, (Bio-Rad Laboratories, Richmond, California) mit einer Austauechkapazität von 0.69 m-Äquivolenten wurden unter gelindem Rühren in etwa 200 ml 1 #-igem Pyridin aue pendlert. Man ließ die Suspension etwa 20 Minuten lang absitzen und dekantiert danach die Überstehende Flüssigkeit ab. Suspendieren in 1 £-lgem Pyridin und Abdekandieren wurde wiederholt,

Dann wurde die CMC-Paste ih. 100 ml 0,067 m Fyridinaoetat rom pH 4,4 suspendiert, etwa 1 Stunde lang stehen gelaasen und dann filtriert. Der CMC-Kuchen wurde noch zweimal unter den gleichen Bedingungen suspendiert, gewaschen und filtriert.

Bine enge Glaskolonne (0,6 cm Durchmesser) wird bis au einer Höhe von etwa 60 cm mit einer Aufschlämmung des gewaschenei CMC in 0,067 m Pyridiaaoetat in Abschnitten von etwa 10 cm ge fULlt. 2,6 mg durch Gegenakromverteilung gereinigtes Material

109837/1669 BAD original

werden In 0,2 ml 0,067 m Fyridinaoetat mm _ph 4,4 gelöst und oben auf die CMC-Säule aufgegeben. Die Raule wird zunächst durch langameee Perkolleren (6 ml pro Stunde) von etwa einer SäulenfUllung Fyridinaoetat entwickelt. Unter diesen Bedingungen werden beatlmte proteinartige Verunreinigungen eluiert, während das TCT-I in oberen Abschnitt der Säule zurückbleibt. Das TCT-1 wird aus der Säule durch Gradientenelutlon mit 0,06t ι Pyridinaoetat tob pH 4?4 und einem Puffer aus 15 #-igem Fyridin und 3,5 jC-lgem Eieeeeig (Volumen/Volumen) vom pH 5»7 ale Eluiernittel gewonnen. Baisu wurde dae HiaohgefäB mit 200 ml 0,067 m Pyridinacetat rom pH 4,4 and das Torrategefäfi mit 200 ml 15 £-lgem Pyridin und 3,5 Jt Eieeeaig (Volumen/Vblumen) rom pH 5»7 gefUllt. Die Gradientenelution begann mit 10° £~igem 0,067 m Pyrldinacetat und erreichte allmählich die Konsentration der Misohung aue 15 ?6-lgea Pyridin und 3,5 £-igem Eieesaig. Bas Auftreten des eluierten TCT-1 im Abfluß wurde sowohl biologisch durch den Rattentest, als auch oolorimetriech durch die Methode der alkalischen Hydrolyse und anschließende Entwicklung mit Hinhydrin festgestellt, wie sie von Hirs, Moore und Stein in J. Biöl. Chem.«. 219, 623 (1956) beschrieben wurde. Es wurde festgestellt, daß reineβ TCT-I etwa beim Mittelwert des Gradienten bei etwa pH 4 eluiert wurde. Die aufgefangenen Eluattraktionen, die das reine Material enthielten, wurden vereinigt und lyophilleiert. Die Reinigung des als Auegangematerial verwendeten TCT-I₀ de« durch Gegenetroererteilung erhalten wurde, bestand in der

109837/1669

Entfernung von etwa 10 $> proteinartigen Verunreinigungen.

Hit aliquoten Proben dee Produkte dieses Beispiele und von Beispiel 6 wurde eine Säurehydrolyse durchgeführt und die AminoeäureEUBüinmenseteung bestimmt, wobei die Tryptphanbestimmung wie üblich getrennt durchgeführt wurde. Ee wurde die gleiche empirische Aminoeäureformel erhalten» jeodch wurde eine gewisse Busätzliche Reinigung erzielt,» wie sich daraus ergabm daß die als Verunreinigungen nachgewiesenen Aminoeäurenm nämlich Isoleucin und Lysin wie oben angegeben wurde, in kleineren Mengen auftraten* wobei der Ieoleucingehalt von 0,6 auf 0,1 Mol-jC und der lysingehalt von 0,7 auf 0_p4 Mol-jS vermindert wurde. Dagegen war die Strukturformel die gleiche wie die für TCT-1 von Beispiel 6„

Beispiel 11

Die MolekÜlstrukturformel wurde durch folgende Methoden bestimmt: Zunächst wurde das Protein auf die endständige H-Oruppe untersucht, die in Figur 1 auf der linken Seite angegeben 1st, wie dies bei der Angabe von Strukturformeln von Proteinen üblich ist« Es wurde eine Kupplung mit 5-Dimethy3aminonapthalin 1-sulfonylohlorid nach einem bekannten in Blechern.. J. 89« 59 (1963) beschriebenen Verfahren durchgeführt _r das gewöhnlich aLsDonsylierung beeeiohnet wird. Das dauayllerte TCT-1 wurde vollständig mit Säure hydra« Iyeiert und dl*j froißRnetaie dnrinyl.ierte Aminosäure mit end-

N (»riipjn ν π.■"'!#» dor ■■ h JHiimncl)1 chtchroroatographie nach d «ο» Vc.i.'T·.· «-M,f ViMM?, JHi^iiGirHinphye,, Aota 133, ?6i-37O

Kl Mil 37/ 1M <i BAD ORIGINAL

(1967) Identifiziert, die nachstehend beschrieben ist. Die dansylierte Aminosäure mit endständiger N-Gruppe die ao erhalten wurde, war mit dem Produkt Identisch, daa durch Säurehydtolyae von Biadanayloyatin erhalten wird· Baraus kann geschlossen werden, daß die Aminosäure von TCT-I mit endständiger H~Gruppe Cystin ist,und daß die a-Aminogruppe dieses Cysteinrests nicht substituiert ist·

Das intakte TCT-I und ein andstandigeβ Fragment T5_P das im folgenden beschrieben wird, wurden mit Carboxyρeptidase A oder Carboxyρfptidase B behandelt. Diese Enzyme, die Prolin oder C-endatändige Aminosäuren denen eine freie Carboxylgruppe fehlt, aus Feptiden und Protein nicht abspalten, waren nicht wirksam, woraus sich ergibt, daß die carboxylendständlge Aminosäure entweder aus Prolin oder einer Aminosäure besteht, der eine freie Carboxylgruppe fehlt. Biese Enzyme haben eine gewisse ohymotryotisohe Aktivität und deshalb geht bei längerer Einwirkung die Aktivität vom TCT-1 verloren, was mit den Ergebnissen Übereinstimmt, die nachstehend flir die durch Einwirkung von Chymotryosin erzeugten fragaente angegeben sind.

1 mg TCT-I wurde in 0_f1 bla 0,2 »1 Wasser oder 0,001 η wässrige** SulstEiäure gelöst. T>nnn wurde Ammnnlumbto puffer mit pH 8 bis zu einmal Volumen van otv.a 1 ml

Gereinigtee Hindertrypein wurde in einer Menge von etwa de« Proteins zugegeben und bei 37⁰C 4 Stunden iricubiert. Nach Einwirkung dea Trypsin· wurde die Lösung lyophiliaiert. Diea* Einwirkung apaltet daa Protein in eine Reihe von Fragmenten auf, die in Fig. 1 durch daa Prefix T_c z.B. ΤΘ beseiohnot sind.

Die Spaltung mit gereinigtem Chymotrypain wurde in ähnlicher Weise wie oben beschrieben durchgeführt, ea wurde jedoch Über Nacht anstelle von 4 Stunden einwirken gelassen. Dadurch wurde das Protein in Fragmente gespalten, die in Fig. 1 mit dem Prefex C versehen alnd.

Die durch Spaltung alt Trypsin und Chymotrypsin erhaltenen Fragmente überlappen sich,, da bekanntlich Trypein und Chymotrypsin ein Protein an den Carboxyfcindungen verschiedener Aminosäuren spalten.

Fragment T8 wurde dann mit Chymotrypsin gespalten, wodurch wie in Fig. 1 angegeben, die Fragmente T8„ C1 und TB₉ C4 erhalten wurdenο ΤΘ wurde zur Unterscheidung zwischen Aapariginsäure und Asparigln ferner mit L/P behandelt. Es zeigte »ich, daß alle 3 Aminosäuren in diesem Fragment, die als Asparaginsäure nnge

BAD ORIGINAL

gegeben wurden, In Wirklichkeit aus Asparagin bestanden. Die folgende Tabelle se igt die Amino&äurtpreste für jede Fraktion;

Tabelle II Aninoaäurereate

Aninoaäure	T5	T8	1	T6	1	T8,C1 T8.C4-	1	1	1	T8
Asparagineaure		3	1			3		1
Asparagin	*		1
Threonin	1		1		1
8erin	1		1
Olutanineäure	1
Prolin	2			1
Glycin	3
Alanin
Methionin.	1
Leucin		1
Tyrosin
Phenylalanin
Histidin
Arginin
Tryptophan

109837/10*9

tn

Die Speltung/ait IAP, die oben erwähnt wurdeο,wurden bei pH 8,3, einer Temperatur von 3??0 und einer Zeit von 16 Stunden ■it gereinigtem Eneya durchgeführt. Das Verhältnis τοπ Enzym BU Substrat betrug etwa 1 : 10.

Ee eei darauf hingewiesen» daß von diesen Fragmenten die folgenden Beste nicht erfaßt werden? Asp, Thr» SCr₂P VaI, Leugp CyB₂^ Die folgende Tabelle zeigt die Aminosäureverteilung der Ohymotrypsinfragmentes.

Tabelle III Aminosäurereste

Aminosäure	Cl	C2
Asparaginsäure
Threonin		1
Serin	1
Glutaminsäure		1
Prolin		2
Glycin	2	1
Alanin
Methionin	1
Leucin
Tyrosin
Phenylalanin.	1
Histidin
Arginin		1
Tryptophan

C3

C5

C11

C13

1 1

η fi :r/ /1 π r <i

Di· Aminosäuren von Peptid CH 3 wurden durch vollständige Spaltung ■it LAF bee tieeat. Bei 03 wurde keine Spaltung mit LAp durchgeführt und deshalb wurde nioht beetimat, ob eeeioh bei der Asparaginsäure um Asparaginsäure oder Asparagin handelt». Ba eei ferner darauf hingewiesen, daS diese Asparaginsäurereste in Wirklichkeit die gleichen Reste wie in T8 sind und aus Asparagin bestehen.

Die Abtrennung und Isolierung von Peptidfragmenten» mit denen die Werte in den vorstehenden Tabellen erhalten wurden» wurde durch sweidimensionaleAuftrennung jeder Komponente duroh Papier-Chromatographie in einer Dimension und anschließende Elektrophorese in einer Richtung von 90° au der Richtung der Chromatographie erreioht.

Btwa 1 mg der eu trennenden Peptidmiechung wurde in Wasser oder verdünnter Essigsäure gelöst und als Fleck an einer Stelle «it dm Koordinaten 9*0 om, 9#5 cm (x»y), aufgetragen. Als Harkieruhg wurde eine Mischung aus Leucin und Lysin an einer Stelle mit den Koordinaten 2,0 cm und 9»5 cm aufgetragen· Ate aufgetragenen Flecken wurden getrocknet. Das Blatt wurde über "acht entlang der Y-Achse (der Schmalseite des Blatts) absteigend chromatographiert entwickelt. Zur Entwicklung des Chromatogranune wurde ein 1-Phasensytem aus 90 Teilen n-Butanol, 60 feilen Pyridin, 18 Teilen Bisessig und 72 Teilen Wasser (VoIu-■en/Volumen). verwendet. Mach den Entwickeln wurde das Blatt au,s

Ι0ΠΒ37/

der Chromatographiekammer entnommen und 30 Minuten bei Zimmertemperatur und dann weitere 30 Minuten In einen Ofen bei 75°C getrocknet.

Entlang öer Y-Aohee wurde ein Streifen van 3 om abgeschnitten*

f ■ .

um die Leucin- und Lyainnmarkierung su entfernen. Eine zweite Markierung aus Leucin und Lysin wurde für den Elektrophoreseabschnitt des Versuche an der Stelle mit den Koordinaten 9p5 cm , 8p0 cm aufgetragen (diese Koordinaten entsprechen dem ursprunglichen Blatt). Bas trockene Papierblatt, das die chromatographierte Mischung und die neue Markierung enthielt, wurde dann mit dem Pyridinacetat-Puffersystem besptetiht, das von Katz ot al., J. Biol. Chem» 234 2897, (1959) beschrieben wurde. Dann wurde die Elketrophorese entlang der !-Koordinate und zur Kathode (negative Elektrode) in den gleichen Pyridinecetatpuffer und in einer Vorrichtung durchgeführt, wie sie von Kate et al. beschrieben wurde.

Sie Elektrophorese wurde etwa 0105 Minuten mit einem Spannungsabfall von 2000 bis 2500 Volt durchgeführt. Der Anfangetrom durch daβ Papier während des Versuchs betrug 40 bis 90 nA. Die Temperatur betrug su Beginn O⁰C und stieg während des Verlaufs der Elektrophorese auf etwa 4⁰C^

Nachdem die Elektrophorese beendet war, wurde das Papierblatt herausgenommen und gründlich getrocknet und sur Entfernung

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τοπ Anaoniakepuren Mil; Py rid in beffprUht· Die Lage der Peptid flecken und der Leucin- und Lysinmarklerungstn wurde durch

Besprühen mit einer Lösung von 0,5 # Ninhydrin in n-Butanol, die

vorher mit 0,05 η Phosphatpuffer von pH 7 gesättigt worden war, sichtbar gemacht. Sann wurde das feuchte Blatt in einem

Ofen fUr Chronatographlerswecke bei etwa 80⁰C 15 Hinuten lang

getrocknet.

Die Lage der betreffenden Peptide wurde durch ihre relativen Abstände su dem ^uoitt in dem Chromatographiesyeten und dem Lysin in der Elektröphoreserlchtung gekennzeichnet. Die relative Lage der verschiedenen Peptld£ragmente 1st in d er folgenden Tabelle angegeben:

Tabelle IY

Peptidfragment	Elektrophorese (LVS=IOO)	Chromatographie (LeU=IOO) .
T5	44	113
T8	74	72
T6	54	91 -
Cl	32	iOO
02	52	61
C3	69	49
05	95	71
011	33	62
01,2	45	83

1 ti ii η:? ν /

Die eineelnen Peptide wurden aue dem Peptidblatt duich Aueschneiden der ninhydrinpositiven Flecken, Entfernen dee Überschüssigen Ninhydrinreagenses durch Waschen mit wasserfreiem ,ceton und schließlich dursrh Eluieren des Peptide aus dem Papier mit einem geeigneten Lösungsmittel isoliert. Die eluierten Peptide wurden dann in der Üblichen Weise auf ihren Amino-Säuregehalt durch die beschriebenen Routineverfahren analysiert. Die Aminosäuresequensen der verschiedenen Fragmente wurden durch stufenweiBen /bbau und Dansylierung bestimmt. Dieses Verfahren ermöglicht . die Ermittlung der Seque:e, wobei in jeder Stufe eine Aminosäure, beginnend von der N-endstandigen Aminosäure eines Ieptids bestimmt wird. Zunächst wird die etundige a«/rainogruppe eines Peptide dansyliert. Noch der Dansylierung wird das Fragment einer Üblichen vollständigen Säurehydrolyse unterworfen. Die dansylierte Aminosäure wird als DNS-A abgekürzt. Die Hydrolyseprodukt werden als Fleck auf Dünnschichtchromatographleblätteraaus Polyamid aufgetragen und für eine gegebene Zelt entwickelt. Dann wird das Blatt luftgetrocknet, um 90° gedreht und in einem anderen System während einer gegebenen Zeit welter entwickelt. Schließlich wird das Blatt getrocknet und mit kurzwelligem UV-Licht geprüft» Die gekuppelte Aminosäure (DNS-A) erscheint als stark fluoreszierender gelber Fleok, und Ihre Lagp wird dann alt Literaturangaben verglichen, die die Lage verschiedener Aminosäuren, die

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~ 41 -

unter identischen Bedingungen behandelt und chromatographiert wurden angegeben. Auf diese,7eise kann die Aminosäure A positiv identifiziert werden.

Nachdem die N-endatändige .Aminosäure j» Identifiziert ist, besteht die nächste Stufe darin', eine andere aliquote Probe des untersuchten Fragments zu verwenden und daraus die (nunmehr identifizierte) N-endstandige Aminosäure A abzuspalten* was durch Behandlung der Probe mit Phenylieothiocyanat geschieht» Die . aminosäure A wird nach der Behandlung rait PTH-A bezeichnete Dann wird dine Hydrolyse mit Trifluroessigaäure durchgeführt, die die Bindusag zwischen PTH-A und der nächsten Aminosäure des Peptide selektiv spaltet. Dann wird die Trifluoressigsäurs verdampft, der RUokatand wird mit Säure behandelt und PTII-A wird mit Benzol extrahiert und verworfen. Diese wässrige Phase enthält das verkürzte Peptid. Das Verfahren wird wiederholt, bis sämtliche Aminosäuren der Sequenz identifiziert sind.

DieAminoeäurepequenz in dem Fragment TO, 04 in Flg. 1 wurde folgendermaßen bestimmt! Die Probe, die etwa 0_?2 «Mol Peptid enthielt und durch Chymotrypsinspaltung eines Fragments erhalten wurde, das aus einer Trypeinapaltung isoliert wurde, (für das vorher nachgewiesen wurde , daß es aus 5 Aminosäureeinheiten, nämlich 3 Mol /opnragin und jeweils 1 Mol Leucin

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und Phenylalanin besteht), wurde in 500 al zweimal glasdestillierten Wassere gelöst. Eine 20 JUl Probe der lösung wurde in eine 3 ml-AmpulIe gefüllt und mit 20 Hikroliter 0,1 η Hatriumbioarbonat versetzt» um die Reaktionelösung auf pH 8,2 abzupuffern. Sine Vorratslüa ung von DNS-Cl wurde mit /ceton auf eine Konzentration von etwa 3 ng DNS-Cl pro ml lösung verdünnt, 20 Mikroliter DNS-Cl-Reagens wurden der gepufferten Proben« lösung in der Ampulle zugesetzt, und die Mischung wurde etwa 2 Stunden bei Zimmertemperatur belassen. Dann wurde die LÖBung unter einem Strom aus reinem Stickstoffgas zur Trockne eingedampft. Um die Peptidbindungen zu hydrolysieren, wurde der Klicket and mit 8 Tropfen 6n Salzsäure versetzt, und durch die Lö -sung wurde 5 Minuten lang Stioketoffgas geleitet. Die Ampulle wurde in der Flamme zugeechmolzen und bei 105⁰C über Nacht₉ gewöhnlich 12 bis 16 Stunden, erwärmt, (falls Glycin als N-end ständige Aminosäure vermutet wird, wird w< gen der bekannten relativen Unbeständigkeit von DNS-GIyoiη stattdessen eine kürzere Hydrolysedauer von 6 Stunden angewandt).

Nach beendeter Hydrolyse wird die Ampulle geöffnet, und die Salzsäure wird unter vermindertem Druck über NatrAumhydroxyd-Plätzchen entfernt. Dan Rückstand löst man in 1 Tropfen einer Mischung aus Aceton, Essigsäure und Wasser ( 1 t 1 t 1,Volumen/ Volumen) und trägt die gesamte Lösung auf eine Polyamidblatt-DUnneohLohfcohromutograrhie auf (Produkt der Qailard~3ohlQslnger Chemical Mfg. Corp*, Onrle Plane, Long Island¹, New York).

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See Chromatogramn wurde in einem geschlossenen Tank durch einen aufsteigenden Lösungsmittelstrom in 2 Richtungen entwickelt: Zuerst in der einen Richtung unter Verwendung eines Systems aus Wasser, und 90 '/ί-iger Ameisensäure (200 : 3_P Volumen/Volumen) und nach Luftrocknen in einem Winkel von 90° BU der ersten Richtung unter Verwendung einer Mischung aus Benzol und Essigsäure (90 : 10 Volumen/Volumen}. Dae Chromatogramm wird erneut an der Luft getrocknet und mit kurzwelliger Strahlung geprüft. Ein gelber fluoreszierender Fleck zeigt die Lage der gekuppelten N-endständigen .Aminosäure an. Als Nebenprodukt der Reaktion entstandenes Dansylsulfonamid und Daηsy1-sulfonsäure fluoreszieren weiß bi.w. blau und dienen als R^-Mar-Iderungen auf dem Chromatogramm. Die Lage des gelben fluoreszierenden Flecke wird notiert und aufgrund der Angaben von Woods und Wang, Biochem. Biophye. Acta, 133 369 - 370 (1967) als Asparaginsäure identifiziert. Baraus wurde geschlossen, daß die H-endständige Aminosäure des Peptide T8„C4 entweder aus Asparaginsäure oder aus Asparagin besteht* Da Asaparagin unter den Heaktionsbedingungen in Asparaginsäure Übergeht, wurde durch andere Kriterien bestimmt, ob die N-endständige .Aminosäure aus Asparaginsäure oder sparegin bestand.

Die verbleibenden 480 al der Peptidlösung wurden in einen 10 ml Erlenneyerkolben gegeben und tilt 500 Ail 50 ^-igem und mit 500^1 2,4_i6-Trimethylpyrj.din(2_l4_f6--

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BA ORIGINAL

versetzt und vermischt. Diese Lösung wurde mit 60 ill

Phenylisothiocyanatreagens versetzt* Der Kolben wurde mit Sticket off ga β gespult und verschlossen. Die Lösung wurde auf einer Dubnoff-Schüttelvorrichtung 1 Stunde bei 40^pC inkubiertο Nach dieser Zeit wurde die Lösung in ein kleines Reagensglas umgefüllt und viermal, mit jeweils 2 ml Benzol extrahiert. Das Benzol wurde nach jeder Extraktion abgezogen und verworfen. Restliches Benzol in der wässrigen Schicht wurde in einem Rinco-Rotationsverdampfer entfernt. Die wässrige Schicht wurde Über Nacht im Hochvakuum Über Fhosphorpentoxyd gefriergetrocknet. Am nächsten Morgen wurde das Reagensglas mit Stickstoffgas gespUlt, mit 0,2 ml waeeerfreier Trifluoreselgsäure versetzt, erneut gespUlt, verschlossen und in einem Wasserbad 20 Hinuten auf 40⁰C erwärmt. Dann wurde üie Trifluoressigsaure in einem Strom aus Stickstoffgas verdampft. Der Rückstand wurde in 1 Tropfen Benzol gelöst, und die Lösung wurde im Stickstoffstrom eingedampft. Der RUckstend wurde mit 500/υ1 von zweimal in einer Gießvorrichtung destilliertem Wasser versetzt und zweimal mit je 1 ml Benzol extrahiert. Die Benzolextrakte wurden verworfen, und Benzolepuren in der Probenlöoung wurden in dem Rinco-Rotatlonsverdampfer verdampft.

Mit 20 All der Probe wurde die oben beschriebene Danayl-Kupplungsreftktlon durchgeführt, um dl« N-endstandige Aminosäure des verkürzten Peptldfragmends, nämlich Leucin, nachzuweisen.

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Mit dem verbleibenden Teil der Probe wurde der eben beschriebene stufenweise Abbau weitergeführt.

Beide Verfahren wurden abwechselnd fortgesetzt, bis alle Aminosäuren in dem Fragment identifiziert waren»

Die Ergebnisse dieses besonderen Verfahrens für eine Reihe der in Pig, 1 angegebenen Peptldfragmente sind in der folgenden

Tabelle dargestellt:

St- .

109837/1669 '

ORIGINAL INSPECTED

Reihenfolde de?

O

Aminoaäureaeauenz

TB9 04

der

Tabelle

V

Fragment

T8

?

C2

016,A9Tl

i

Subtraktiver- Abbau

m O» 1

Verfahren

Apa oder

einzelnen

Aap oder Aen

GIy

VaI

I

^a 2

Identifi zierung der H-endatändi- gen Aminosäure

Leu

Peptidfräumente

Leu

Pro?

Leu

1

Ape oder

Aan

T6

Aap oder Aen

SIu f\A AM

S 3 4

2

Ser

T5

GIn

CD CO

5

3

Aap oder Phe

Aan

AIa

Phe

od-Asp od. Aan

Ihr Pro?

CD

6

Tyr

Ser

U

7

5

Aen

GIy

ί

a 9

6

te- ί*

10

7

Met GIy

oder

β

Phe

9 10

GIy

"f.

11

Pm

r

GIu GIn Thr

Es eel darauf hingewiesen, daß die Zahlen der angegebenen Amino-■äurepoeitiontn eich auf jedes frage»nt und nicht auf das ganee Molekül beeiehen. Eb ist ferner bu bemerken, daß bei dieser besonderen Methode keine LAP-Spaltung durchgeführt wurde und daß deshalb keine Unterscheidung zwischen Asparaginsäure und Asparagin erfolgt, obgleloh diese in einigen vorhergehenden Tabellen gemacht wurde.

Mit Hilfe der Werte der Tabellen II, IXI und Y in Verbindung alt der bekannten ensymatischen Spesifleität von Trypsin und Chymotrypsin ist es möglich, fUr jedes Peptidfragment folgende Partialetrukturen aneugebent

T5 H«Fhe,Ser«Gly.Het.aiy.Phe.Gly.Fro.01z.ThroFro. t8 H.Aen.Leu.Aen.Aanr(Phe,Hie).Arg.OH T6 H.Ser.Ala.Tyr.Try.Arg.OH

T8_f04 H

01 H. (Ser_<,Oly_pMet,Oly)cPhe.0H

02 H. aiy«, Pro. QIx. Thr. Pro r

03 H.(ArgcA8p,Leu₍Ä8p).0R 05 H.(Hls_cArg).Phe,OH

011 H.Asp.Phe.OK

013 H.(Ser.Ala.Tyr)Try.OH od H.(8er.Ale.Try)Tyr.OH.

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Die Reihenfolge der in Klammern angegebenen Aminosäuren kann aus den Werten der Tabelle II, III und V nicht abgeleitet werden. Um diese Unsicherheit zu beseitigen und zu der in Fig. 1 angegebenen Reihenfolge zu gelangen, ist es notwendig,, das Problem nie ganzes zu betrachten und bestimmte weitere Versuche durchzuführen«.

Jedes durch Trypsinspaltung erhaltene Peptid, das kein Arginin enthält, sollte das C-endständige Peptid des GesamtmolekUls sein« Ferner sollte die Zahl der durch Trypsinepaltung erhaltenen Peptide um 1 mehr als die Zahl der Argininreste im Molekül, in diesem Fall 3« betragen. Dieser Vorhersage entsprechend sind 3 Peptide, nämlich T5« ΤΘ und T6 angegeben. Von diesen werden nicht sämtliche Aminosäuren des Moleküls oder das H endständige Cystein erfaßt. Daraus kann man ableiten, daß sich das fehlende Peptid Im K- endständigen Teil des Moleküle befindet. Die fehlenden Aminosäuren sind Ser_2P Thr, LeU₂C Cysgr Aep, Vai'«Dae fehlende Peptid enthält keine basische Aminosäure und kann daher aus den oben vorgebrachten Gründen als R-endständiger Anteil in Frage kommen. Man ist zu dem Schluß gezwungen, daß das fehlende Peptid durch Unterabbau infolge von Chymotrypsinspuren in dem Trypsinenzyir enetanden ist. Eine Betrachtung der Ausbeuten" der betreffenden Peptide legt nahen daß TG das C- endatündige Ende den fehlenden Trypainnpaltprodukts (TX nach Fig. 1) 1st und aus

das einem solchen Chymotrypsin- Uuternbbau stammt. Itaß/fehbnde Peptid

bei dfin pypi «rnhiMi . ι (ißraplrt nohon Untersuchimgen nJohl erkannt

BAD ORIGINAL

1 0 9 0 3 7 / 1 G Γ 9

werden konnte, let dadurch bedingt, daS das H-endständige Cystein mit dam Ninhydrlnreagens eine verhältnismäßig schwache Farbe bildet.

Das fehlende Trypsinpeptid wurde mit TX bezeichnet. Aufgrund der Speziflaität τηη Trypsin ist es nunmehr möglich, die Reihenfolge der TrypainpeptLde γ»η der Arainogruppe bis zur Carboxylgruppe mit TXnT8ol!5 oder T(X»6).T6,T8.T5 anzugeben»

Wie erwähnt, zeigte der N-endstand ige Heat des gesamten Moleküls nur eine geringe oder keine Parbblldung mit ßsagentten für frei? Aminogruppen, zum Beispiel Ninhydrln» Dies weist darauf hin, daß dna fehlende Peptid (T(X-6)) tatsächlich der Reut dau gesamten Moleküls ist. Um dieses fehlende Peptid auf dem Papier mit Nlnhydrin nachzuweisen, wurden Amlnoäthylgruppen (-CH₂CH₂HN₁,) chemisch an die oulfhydrylgruppesi (SII) na CyateLnen nach der Methode von Raftery und Cole, J. BloL.Chem 2C1p 3457, (1966) gebunden. Das erhaltene Peptid, das S-B-Amlnoäthyloystein (AJBCya) enthält, ist nunmehr infolge der e Inge führ f.» η Aminogruppen deutlich ninhydrlnpoaitlv und wurde aus der Renk tionemiachung durch Paplerelektrophoreae beL pH I₁H luoiiert. Una neue mit GI6,A bezeichnete Peptid ergab bei der Üäurnhyürol/ue die in PaböLle 71 mit C16A btreeLchnete Amlnosäufaasusainmnrui ii;7.urig und entiprioht T(X-6),

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Die Anwesenheit dee AECy8 in Peptid 016A macht dieses nunmehr fllr eine spezifische Trypsinspaltung empfindlich. Eine solche Spaltung ftlhrt zu den Paptiden 016»A« Tl und C16₉A,'f2. Die Amlnnsäureanalysen dieser Peptide sind In Tabelle VI ange geben. Die Werte, die die Sequenz von 016,A«, Tl festlegen, sind in Tabelle V oben angegeben.

Q Um die Klammern bei (Phe,His) vom Peptid T8 zu beseitigen, sind folgende Überlegungen erforderlicht

(a) Das TCT 1 Molekül enthält nur einen Histidinrest,

(b) Dieser Histidinrest tritt in den Peptiden ΤΘ und 05 auf. (o) Die C-endstandigen Aminosäuren dieser Peptide haben wegen der Spezifizität der zu ihrer Herstellung Terwendeten Enzyme die angegebene Stellung.

fe Diesen Tatsachen genügt nur die einzige Reihenfolge, die in

Pig. I fur die Aminosäuren in Stellungen 19? 2O₉ 21 und 22 angegeben Ist. Das Phenylalanin in Stellung 22 überlappt mit P;ptld T5"

DLe Analyaenwerte und Pnrtlalstrukturwerte für die Peptid« 0Π; C5i Uli; iJ5i CL,2; 01 und 02 stimmen TOIlLg mit der Sequenz UburaLn, dia Ln Pig. I fUr die Stellungen 10 bis 32 Eingegeben IaI_n Durch Dl und 02 zusammen mit dem UberLnppenden Phenylalanin von 05 wird die gesamte Zustnmeneetzung iron T5 erfuUt. C2 enthäLt Prolin, das nicht mit der Carboiypeptidatie A und

10 9 8 3 7/1669 BAD ORIGINAL

Τ.Γ*■'..'■ *'"J/vC*

B reagiert, waa mit "der fehlenden Wirkung dieeer Enzyme auf das

Intakte Molekül übereinstimmt* Wenn CT der C-end stand ige wäre, w*re TCT-1

Beet in TCT-1/durch die Carboxypeptidase angegriffen worden« Deshalb befindet eich C1 linke ron 02«, Diese Tataachen stimmen mit den Werten fUr Peptid T5 in Tabelle Y Uberein.

Von den Feptiden C3 und 011 werden die 3 in TB vorhandenen Aaparaginaäurereete sowie das Leucin und das Phenylalanin erfaßt. Der Chymotrypsinahbau von TB liefert die beiden Peptide T8„ C4 und T8, C1 und bestätigt ferner die abgeleiteten Überlappungen zwischen T8 und den Feptiden C3_P 011 und C5.

T6 enthält den verbleibenden Argininreat und keine der Aminosäuren, die in dem Peptid T8 vorkommen; das Arginin von T6 ist daher von dem Arginin von T8 verschieden und bildet das N- endständige Arginin von C3.

FUr die Strukturuntersuchungen von Peptid C16 wurden das reine Peptid, das in Form seines ü B AminoäthylCeriTate C16_yA isoliert wurde, und seine beiden Trypsinepaltprodukte O16,A?T1 und C16_eA,T2 (siehe oben) eingesetzt. Die bei der Spaltung von Feptiden mit Carboxypeptidaae A oder B freigesetzten Aminosäuren können Angaben über die Π endetändige Sequenz liefern.

nicht

wenn eine solche Zeit gewählt wird, in der die Spaltung/voll ■tändig ist. Peptid C16,A wurde 3 6 Stunden mit Carboxypeptidaee B gespalten, und die f 'eißGectttan ^mJnnufinrereete wurden bo

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stimmt. Die Ergebnisse dieser Versuohe sind in Tabelle YI angegeben.

Tabelle YI

C16-Peptld

Aminosäuren	durch Säurehydrolyse erhaltene	C16,APT1 C16„A,T2	1 oder 2	durch 16 stlindige
	Stoeamtsahl an Einheiten	1 1	1	Spaltung mit COB freigesetzte Reste C16PA
	Ci6fA	1	2	2
Leuοin	2	1	1
Yalin	1	1
AE-Oystein	2	Spuren
Threonin	1	Spuren
Serin	2
Asparaginsäure	1

T1 Durch die Werte von Tabelle Y wird fur ^peptid Ci6_PA/dle

Sequens H.Yal.LeUnOH festgelegt. Dieses Peptid 1st an die

T2 Carboxylgruppe (ines der AE-Cyateine von Peptid C16,A/gebunden« Die Ergebnisse der Spaltung von Peptid C16_rA alt Oarboxypeptidase B etimmen mit dieser Ableitung überein Durch die Speelfizität von Trypain wird Ae Cystein als 0 endständiger Rest von P ptld

T2

C16,A/festgelegt (Stellung 7 in Pig. 1). Bel weniger vollständiger Spaltung von Peptid 016,A nit (tarboxypeptldase B (0 ag En r j m/mg Peptid, Spaltung nur 16 Stunden be j 37' C) werdet] nur ein AK-Cystein-liest, das gesamte YaIIn, mehr als tin Leuuln*

'109837/1R69

BAD

rest und etwas Threonin und Serin no;He a hu Haine v rarwandten Peptiden fifeigaaatsfc, Dies) Peptide lacnea aich leicht durch sswa id iraamii anale PnpierChromatographLa, wie sie oben beschrieben wurde, abtrannsn, Die Warte der iihroüiaiogrophiachüti unA ArainonUureiiniilyasn für tile Peptide sind in Tabelle VII angegaben«

A₉BI
A₉ B2

A,B4

TabelleJTII

Peptide, aus der Spaltung von

mit

Peptide Elektrophorese (l)

76 73 67

42

Trann-Werte

Chromatographie¹¹- Aminoeäureresba (Leu=100)

10 54 39

42

AE-Oys, Ser, Asx AE-UyS₉ Ser, Aax, Leu /SE Oya, 3er_2? Aax, Leu

Ser, Thr

n-Butanol,

Baeigeäure, 5:4:1

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Die Werte von Tabelle VII fordern die verhältnismäßig spazifl· eohe Aminosäurereihenfolge H. AE Cy8*(Ser_?Asx)oLeu<.Ser.Thr. für die Stellung 1 bia 6 in FIg_n 1. Die Freisetzung den zweiten Leuoinrests, die in Tabelle VI angegeben ist, »rglbb sich aus einer Chymotryosinspaltung dar Peptldblndung 4 5» die ein» frühzeitige Freisetzung des Leucine in Stellung 4 ermöglicht, Dieser Unkerabbau fllhrt zu einem Peptid mit Serin als H- end ständigem Best, das bei Abbau mit Carboxypeptidaae B das Peptid A,B4 liefert.

Der stufenweise Abbau von Peptid A,Bi bestätigt AK-Cystein als !»endständigen Rest und Serin in Stellung 2. Nach der zweiten Spaltstufe zur Entfernung des PTH-Rests von Serin wird die Lösung einer Danaylerung unterworfen« und das Dansylderivat von Asparagin wird durch BUnneohichtechromatographie identifiziert. Die Anwesenheit von freiem Asparagin wird durch 2 dimensionalβ ^apierohromatographie bestätigt. Die positiv« Identifizierung von Serin in Stellung 2 von Peptid A»B1 und die Anwesenheit von Asparagin vervollständig die Struktur bestimmung dieses Peptide.

Ue festzustellen, ob in Stellung 50 Glutaminsäure oder Glutamin vorliegt, wurde TCT-1 am C-andetand Igen Ende von Methionin duroh Bromoyan ge spalten» (B» Gross and B. Wltkop,, J. Biol*Chem. 237, 1856 (1962). Ein mit ONBr-1 bezeichnetes

109837/1669 badoriginal

Peptid wurde durch CMC-Chromatographie nafih der bereite beschriebenen Arbeisweise isoliert. Hit diesem ^eptidCNBr 1 wurde eine LAP Spaltung durchgeführt. Die Analyse der erhaltenen Spaltungamiechung zeigte, daß Glutaminsäure alB freie Säure und licht als freies Amid freigesetzt wurde.

Es wurde festgestellt, daß das C-endständige Prolin (Stellung 32) in der Amidform vorliegt, indem Peptid CHBr-I einem schrittweisen subtraktiven Abbau unterworfen wurde, bis die C endaätndige Aminosäure (oder das Aminosäureamid) freigesetzt wurde. Eine Probe der schließlich erhaltenen Mischung wurde wie oben beschrieben daneyüert und das erhaltene Produkt chromatographiert. Bei der Chromatographie wurde ein fleck erhalten, der sich als identisch mit einer authentischen ^probe von daneyllertem Prolinamid erwies. Hit einer weiteren Prob« der schließlich erhaltenen Mischung wurde eine Papierelektrophorese bei pH 1,8 und eine Chromatographie in n-Butanol-Wasser-EßBigsäure (5:4:1) durchgeführt. Nach Entwicklung ait Hinhydrin wurde ein Fleck erhalten_f der Prolinamid entsprach. Es wurde kein freies Prolin nachgewiesen. Daraus wurde geschlossen, daß TCT-I in Stellung 32 Prolinamid und nicht Prolin enthält.

TCT-1 reagiert bei pH 4,6 nicht mit dem spezifischen Mercaptoreogena ρ -Mercuribenannt (PMB) nach der Boyer Methode

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BA ORlGj_NAL

die ausführlich τοπ Beneeoh und Beneeoh_f Methode of Biochemical Analysis, Bd_n 10_t Π» 58 beschrieben wurde. Mach Reduktion zur Meroaptoform mit 2-Nercaptoäthanol reagiert dieser Schwefel leicht mit Äthylenimin. Aue diesen Ergebnissen muß geschlossen werden« daß die Sobwefelvolenzen der Cysteine von TOT-1 in Form von Sieulf ldbrtiokeh vorliegen.

Es sei darauf hingewiesen, daß das erfindungsgemäße Produkt., wie 6ß durch die oben beschriebenen Verfahren (Beispiele 1 -10) isoliert und gereinigt wird, der Strukturformel von Flg. entspricht. Es 1st ferner zu beachten, daß das Hörmnη in modifizierten Formen vorliegen kann_p von denen eine oder mehrere oder sämtliche ebenfalls Thyrocalcitoninaktivittit aufweisen können. Zu solchen modifizierten Formen können beispielsweise Formen des grundlegenden Polypeptide mit 32 Aminoeäureeinheiten gehOren, die aber verschledne Subetituenten an den funktio nellen Gruppen_f dob. der N-endetändigen und C-endständigen Gruppe und den funktionellen Gruppen der inneren basischen Buuren Amlnosüurereste aufweisen. So kann beiepielsweiso die R-endständlge Clyntelnamlnogruppe acyliert Bein, oder die Cysteine kUnnen In einem anderen Oxyäatione&uetand vorliegen oder der GlutamlnsilurereBt knnn stattdessen dl· Glutamlnform haben und dergleichen« Solche modifleierten Formen können In chlrri·. d«n> Hormon «ntsprecheu₍ wie es In iiüugetlergevorJicgt oder wie eo im Körper bei Verwendung ale Medi kament wap ν wände3 t worden kann, Soüohe modifleierten Formen o5»ih fernvr t\le 1*0]ge andern) lon]ίorunßfl- odor Heini

BAO ORIGINAL 109837/16C9

glngsferfahren ergeben. Alls diase Porman den sugrundsi legen

den Hormtuia können in aLlgemlnar Form wls foJ.gb wardens

■ f' ί

. Gya„8er„ Asje* Ium,Ser„Thr _n öya , VuI -. Tm)U«Sa ρ, ΑΙ α,

9 iO i

12 i5 »4 15 16 17 18 19 20 21 22

Ser.QIy.Met.GIy.Phe.GIy,Pro^iküu Ihr.Pro, 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32

Wenn die ThymoaltLconlne fUr humanmddlr.iniuuhe '^

rerw endet werden, werden sie natUrLLch Ln Porm der UbI.Lohen

Zubereitungen, sua Beispiel, in FArm von Lnjlzierbaren Zuaammeti

•etsungen» die ProfceinaohutKkollolda enfehnLten können, einge-

die sefcat. Die Zubereitungen »nthnlten ferner

In form ihrer physiologisch annehmbaren Hai za..

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Claims (1)

1. P .A₁-JlJLiI-JLIl-HLgL„EL-g U -SlA-JI

   ThyroouLoLtonlriaktlve Profcolnverblrulungen, gekennzalrshne δ durch die iiminnoäureBtiuikturforniel

   «Aax.Leu.Ser.Thr~Cyβ, YnULeu.,Ser»aLa_n

   I 2 3 4 5 6 7 β 91011

   12 15 U 15 16 17 J8 19 20 21 22

   üar.GIy.Met, aiyoPhe*GIy, Pro ,UlTtη rhr, Pro» 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32

   und ein« Aktivität iron etwa 60 000 Ratteneinheiten/mg bei Prüfung mit optimalen Mengen inerten Trägerproteins, und deren physiologisch annehmbare Salze.

   2 Verbindung nach Anspruch I, gekennzeichnet durch die Amino· säureformel

   BAD ORIGINAL 109837/1669 -

   S-S

   1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

   Αβη.ΑβΠοPhe.Hie,Arg.Phe.Ser»Sly.MetoGlyοPheoGly.PrOoG:U

   18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32

   Verfahren ssur Gewinnung einer ^roteinverbindung nach Anepruoh 2,-

   dadurch gekennzeichnet, daß man

   a« ein Material mit Thyrocolcitoninaktivität mit einem eine einzige Phase bildenden Lösungsmittel aus einer organischen Flüssigkeit der Gruppe der niederen Alkenole, niederen Alkyl -ester yon niederen Alkansäuren und niederen acyclischen gesättigten Ketone« Wasser und einer niederen Alkonsäure behandelt^

   br, ungelöstes Material verwirft und aus dem Piitrat konaentriertes thyrucalcltonlnaktlTes Material gewinnt*

   Verfahren nach Anspruch 3« dadurch gekennzeichnet, daß nan die Lösung durch Zusatz von Kohlenv/asserstoffen und Wasser Jn ein 2-Phaeensytem umwandelt, die Phasen trennt und reinigt und ans der wässrigen Phase thyrocalcitoninoktives Moterin]

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   BAD ORIGINAL

   5* Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Gewinnung dee thyrocalcitonlnaktiven Materialü eine Säulenchromatographiestufe anwendet ο

   6» Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Gewinnung von thyrocalcitonaktirem Material eine Molekularsiebungeatufe anwendet.

   7* Vex fahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß Ban bei der Gewinnung von thyrocalcltoninaktlvem Material eine Gegenstromvertellung zwischen organischen und wässrigen Flüssigkeiten durchfuhrt.

   8, Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als thyrocalcitoninaktives Ausgangsmaterial ein partiell gereinigtes Produkt verwendet, bei dessen Herstellung eine ßäulenchromatographiestuie angewandt wurde ο.

   9· Verfahren nach Anspruch 3_f dadurch gekennzeichnet, daß nan thyrocalcitoninaktires Auegangsmaterial verwendet, bei dessen Herstellung eine Molekularslebungsstufe angewandt wurde«

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   Leerseite