DE3587526T2

DE3587526T2 - Serinproteaseinhibitoren und isolierungsverfahren dazu.

Info

Publication number: DE3587526T2
Application number: DE86900423T
Authority: DE
Inventors: Kjell Ohlsson; Robert Thompson
Original assignee: Synergen Biologicals Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1984-12-06
Filing date: 1985-12-04
Publication date: 1993-11-25
Anticipated expiration: 2005-12-05
Also published as: EP0205555A4; DE3587526D1; EP0205555B2; DE3587526T3; AU591474B2; WO1986003497A1; ATE92935T1; EP0205555A1; AU5232886A; EP0205555B1

Description

Hintergrund der Erfindung

Endogene proteolytische Enzyme dienen dazu, eindringende Organismen, Antigen-Antikörper-Komplexe und gewisse Gewebeproteine, die für den Organismus nicht mehr notwendig oder verwendbar sind, abzubauen. In einem normal funktionierenden Organismus werden proteolytische Enzyme in begrenzter Menge produziert und zum Teil durch die Synthese von Proteaseinhibitoren reguliert.
Eine große Anzahl natürlich vorkommender Proteaseinhibitoren dienen dazu, endogene Proteasen lokal oder temporär durch Begrenzung ihrer Reaktionen zu kontrollieren. Zusätzlich können Proteaseinhibitoren Proteasen hemmen, die in den Körper durch infektiöse Agenzien eingebracht werden. Gewebe, die besonders empfänglich für proteolytische Angriffe und Infektionen sind, wie z. B. diejenigen des Respirationstrakts, sind reich an Proteaseinhibitoren.
Proteaseinhibitoren umfassen ungefähr 10 % des menschlichen Plasmaproteins. Mindestens acht Inhibitoren sind aus diesem Ausgangsmaterial isoliert und in der Literatur charakterisiert worden. Diese umfassen α&sub2;-Macroglobulin (α&sub2;M), α&sub1;-Proteaseinhibitor (α&sub1;PI), α&sub1;-Antichymotrypsin (α&sub1;Achy), β&sub1;-Anticollagenase (β&sub1;-Ac), und Inter-α-Trypsininhibitor (IαI).
Eine Störung des Protease/Proteaseinhibitor-Gleichgewichts kann zu einer Protease-vermittelten Gewebezerstörung, umfassend Emphysem, Arthritis, Glomerulonephritis, Periodontitis, Muskeldystropie, Tumorinvasion und verschiedene andere pathologische Konditionen, führen. In gewissen Situationen, z. B. schweren pathologischen Prozessen, wie Sepsis oder akuter Leukämie, steigt die Menge an vorhandenen, freien, proteolytischen Enzymen aufgrund der Enzymfreisetzung aus sekretorischen Zellen an. Zusätzlich, oder in anderen Situationen getrennt davon, kann eine verminderte Befähigung des Organismus, regulierend zu hemmen, Veränderungen im Protease/Proteaseinhibitor-Gleichgewicht verursachen. Ein Beispiel einer solchen verminderten Befähigung, regulierend zu hemmen, ist eine Defizienz an α&sub1;-Proteaseinhibitor, welche stark mit der Entwicklung des pulmonalen Emphysems korreliert.
In Organismen, in denen solche aberranten Konditionen vorkommen, können, falls keine Maßnahmen unternommen werden, die proteolytischen Enzyme zu kontrollieren, für den Organismus ernste Schäden entstehen. Daher sind Proteaseinhibitoren gesucht worden, die einem Organismus verabreicht werden können, um proteolytische Enzyme zu kontrollieren.
Eine Protease, die von besonderem pharmakologischen Interesse ist, ist Leukozyten-Elastase. Leukozyten-Elastase baut, wenn sie extrazellulär freigesetzt wird, Bindegewebe und andere nützliche Proteine ab. Während es für einen normal funktionierenden Organismus wichtig ist, daß eine gewisse Menge Bindegewebe und andere Proteine abgebaut werden, ist das Vorhandensein einer exzessiven Menge an Leukozyten-Elastase mit verschiedenen pathologischen Zuständen in Verbindung gebracht worden, wie z. B. dem Emphysem und der rheumatoiden Arthritis. Um den Wirkungen der Leukozyten-Elastase entgegenzuwirken, wenn diese in größeren Mengen als normal vorhanden ist, ist ein Proteaseinhibitor gesucht worden, der spezifisch für Leukozyten-Elastase ist. Solch ein Proteaseinhibitor wäre besonders brauchbar, wenn er in gereinigter Form und in ausreichenden Mengen isoliert und präpariert werden könnte, um so pharmazeutisch verwendbar zu sein.
In der Vergangenheit sind mindestens zwei Leukozyten-Elastaseinhibitoren in der Literatur beschrieben worden. Ein Protein, das in Schiessler et al., "Acid-Stable Inhibitors of Granulocyte Neutral Proteases in Human Mucous Secretions: Biochemistry and Possible Biological Function", in Neutral Proteases of Human Polymorphonuclear Leucocytes, Havemann et al. (Herausgeber), Urban und Schwarzenberg, Inc. (1978) beschrieben ist, wurde aus menschlichem Samenplasma und Sputum isoliert und gekennzeichnet durch eine Größe von ungefähr 11 Kda mit einem Tyrosin als N-terminale Aminosäure. Die Literaturberichte über dieses Protein sind zwar nur mit einer partiellen Aminosäuresequenz versehen, jedoch zeigt sogar diese partielle Sequenz, daß sich dieses Protein wesentlich von den erfindungsgemäßen Proteinen unterscheidet. Die Berichte über die Sequenz dieses Proteins in Verbindung mit den vollständigen Aminosäuresequenzdaten für die erfindungsgemäßen Proteine sind ein Hinweis für die Erfinder, daß das von Schiessler et al. sequenzierte Produkt ein abgebautes Protein gewesen sein könnte, welches nicht eine einzelne, unfragmentierte Polypeptidkette war.
Ein zweites Protein, das in einem Fall aus menschlichem Plasma isoliert wurde, ist als α&sub1;-Proteaseinhibitor bezeichnet worden. Arbeiten über dieses Protein sind in einer Übersicht von Travis und Salvesen, Annual Review of Biochemistry 52 : 655-709 (1983) zusammengefaßt worden. Die Berichte über die Aminosäuresequenz dieses Proteins zeigen, daß sich auch dieses wesentlich von den erfindungsgemäßen Proteinen unterscheidet.
Aufgrund der wesentlichen Unterschiede in der Struktur zwischen den erfindungsgemäßen Proteinen, bestehend aus einer einzelnen unfragmentierten Polypeptidkette, und den Serinprotease-Inhibitoren des Standes der Technik, die aus einer einzelnen Polypeptidkette bestehen, sind die Serinprotease-Inhibitoren aus einer einzelnen Polypeptidkette des Standes der Technik nicht "wesentlich homolog" zu den erfindungsgemäßen Proteinen.
Trypsin ist eine weitere Protease von besonderem Interesse aus pharmakologischem Gesichtspunkt. Trypsin initiiert bekanntermaßen den Abbau von bestimmten, weichen Organgeweben, wie z. B. pankreatischem Gewebe, während verschiedenen akuten Konditionen, wie z. B. Pankreatitis. Verschiedene Anstrengungen sind ohne deutlichen Erfolg unter Verwendung von Proteinen, die die Wirkung von Trypsin hemmen sollten, auf die Behandlung dieser Konditionen gerichtet worden. Diese Anstrengungen veranschaulichen Versuche, exogene Rindertrypsin-Inhibitoren bei der Behandlung von menschlicher Pankreatitis zu verwenden. Während solche Techniken in Europa versucht worden sind, sind sie nicht durch die US-Food and Drug Administration als wirkungsvoll nachgewiesen worden. Folglich bestand ein Bedarf für einen Proteaseinhibitor, der überschüssiges Trypsin bei verschiedenen akuten und chronischen Konditionen zu neutralisieren vermag. Wie im Fall des vorstehend diskutierten Leukozyten-Elastaseinhibitors wäre ein Trypsininhibitor besonders brauchbar, wenn er in gereinigter Form und in ausreichenden Mengen isoliert und hergestellt werden könnte, um pharmazeutisch verwendbar zu sein.
Kathepsin G ist eine weitere Protease, die in großen Mengen in Leukozyten vorhanden ist. Von Kathepsin G ist bekannt, daß es zum in vitro-Abbau verschiedener nützlicher Proteine, einschließlich derjenigen des Komplement-Weges, fähig ist. Pankreatische Elastase ist eine weitere Protease, die bei der Pankreatitis eine Rolle spielen kann. Folglich sind Inhibitoren dieser Proteasen ebenso von potentiellem pharmazeutischen Wert.
Leukozyten-Elastase, Trypsin, Kathepsin G und pankreatische Elastase sind Beispiele einer Klasse von Proteasen, die als Serinproteasen bekannt sind, und die Elemente einer gemeinsamen Struktur und eines gemeinsamen Mechanismus haben. Man glaubt, daß ihre Wirkung gegenüber verschiedenen Substraten und ihre Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen Inhibitoren das Ergebnis von Unterschieden in nur wenigen Aminosäureresten sind. Analog ist es möglich, sich eine Klasse von Serinprotease-Inhibitoren auszudenken, die ebenso gemeinsame Elemente der Struktur und des Mechanismus haben und bei denen Veränderungen von relativ wenigen Aminosäuren in der Hemmung verschiedener Proteasen resultieren, und daß wenigstens ein Mitglied dieser Klasse alle Serinproteasen der vorstehenden Klasse hemmt. Die Klasse von Serinprotease-Inhibitoren würde dann von besonderem Wert sein.
Überraschenderweise haben die Erfinder einen 12 Kda-Proteaseinhibitor gefunden, der in gereinigter Form aus Parotis-Sekreten isoliert wurde und dessen Aminosäuresequenz stark von den beschriebenen Sequenzen der Serinprotease-Inhibitoren, die aus einer einzelnen Polypeptidkette bestehen, variiert. Der erfindungsgemäße Proteaseinhibitor besitzt vermutlich mindestens zwei aktive Stellen. Eine Stelle weist Leukozyten-Elastase-hemmende Eigenschaften auf, während eine zweite Stelle Aktivität gegenüber Trypsin aufweist. Die Erfinder haben die gesamte Länge des neuen Proteaseinhibitors genau sequenziert. Die Sequenz wird nachstehend genauer dargestellt.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung betrifft im allgemeinen Proteaseinhibitoren und spezieller Inhibitoren, die gegen Proteasen humaner polymorphkerniger (PMN) Granulozyten gerichtet sind. Insbesondere betrifft diese Erfindung Inhibitoren für Serinproteasen, umfassend menschliche Leukozyten-Elastase und Trypsin. Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung biologisch aktive Analoga dieser Inhibitoren.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, gereinigte Formen der Proteaseinhibitoren bereitzustellen, die wirksam gegenüber einer oder einer Kombination von verschiedenen Serinproteasen sind.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bestimmung der Aminosäuresequenz solcher Proteaseinhibitoren. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung umfaßt das Bereitstellen gereinigter Formen der Proteaseinhibitoren, die als pharmazeutische Verbindungen, welche eine Wirksamkeit gegenüber Leukozyten-Elastase und andere Serinproteasen aufweisen, nützlich sein würden. Weiterhin ist die Identifizierung von biologisch aktiven Analoga solcher Proteaseinhibitoren mit verstärkten oder äquivalenten Eigenschaften ebenso eine der Aufgaben der Erfindung.
Zusätzliche Aufgaben und Vorteile der Erfindung werden zum Teil in der folgenden Beschreibung erwähnt und werden zum Teil durch die Beschreibung nahegelegt sein, oder können aus der Durchführung der Erfindung erkannt werden. Die Aufgaben und Vorteile können mittels der besonders in den anliegenden Ansprüchen hervorgehobenen Ausführungsformen und Kombinationen verwirklicht und erreicht werden.
Um die Aufgaben auszuführen und in Übereinstimmung mit den erfindungsgemäßen Zielen wird ein Proteaseinhibitor offenbart, der hemmende Aktivität auf Serinproteasen, besonders Elastasen, wie Leukozyten-Elastase, ausübt. Die bevorzugten Inhibitoren sind in gereinigter Form aus Parotis-Sekreten isoliert worden. Die Proteaseinhibitoren haben die Fähigkeit, nachdem sie vollständig denaturiert worden sind, Disulfidbindungen zu bilden oder wieder auszubilden und geeignete nicht-kovalente Wechselwirkungen einzugehen, die notwendig sind, um eine aktive Tertiärstruktur einzunehmen oder wieder einzunehmen, die fähig ist, die gewünschte Serinprotease-hemmende Aktivität in der Abwesenheit biochemischer Stimuli auszuüben.
Der erfindungsgemäße Inhibitor ist ein gereinigtes Serinprotease-Inhibitorprotein, das aus einer einzelnen unfragmentierten Polypeptidkette besteht, wobei der Inhibitor fähig zur Hemmung der Proteaseaktivität wenigstens einer Serinprotease und mindestens 40 % homolog zu einem nativen, aus Parotis-Sekreten isolierten Serinprotease-Inhibitor ist. Vorzugsweise ist die an der aktiven Stelle ausgeübte Serinprotease-Inhibitoraktivität biologisch äquivalent zu derjenigen des aus Parotis-Sekreten isolierten, nativen Inhibitors. Folglich haben besonders bevorzugte erfindungsgemäße Inhibitoren die Aminosäuresequenz:
R&sub1;-Gly-Lys-Ser-Phe-Lys-Ala-Gly-Val-Cys-Pro- Pro-Lys-Lys-Ser-Ala-Gln-Cys-Leu-R&sub2;-Tyr-Lys- Lys-Pro-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Trp-Gln-Cys-Pro- Gly-Lys-Lys-Arg-Cys-Cys-Pro-Asp-Thr-Cys-Gly- Ile-Lys-Cys-Leu-Asp-Pro-Val-Asp-Thr-ProAsn- Pro-Thr-Arg-Arg-Lys-Pro-Gly-Lys-Cys-Pro-Val- Thr-Tyr-Gly-Gln-Cys-R&sub8;-R&sub3;-R&sub9;-Asn-Pro-Pro- Asn-Phe-Cys-Glu-R&sub4;-Asp-Gly-Gln-Cys-Lys-Arg- Asp-Leu-Lys-Cys-Cys-R&sub5;-Gly-R&sub6;-Cys-Gly-Lys- Ser-Cys-Val-Ser-Pro-Val-Lys-R&sub7;,
worin R&sub1; und R&sub7; gleich oder verschieden sind und ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus substituierten oder unsubstituierten Aminosäureresten oder Derivaten davon; und
R&sub2;, R&sub3;, R&sub4;, R&sub5;, R&sub6;, R&sub8; und R&sub9; gleich oder verschieden sind und ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Methionin, Valin, Alanin, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan, Lysin, Glycin und Arginin.
Die durch die vorstehenden Abkürzungen dargestellten Aminosäuren werden bei der Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform erklärt.
Weiterhin können andere, biologisch aktive, verbesserte Analoga der erfindungsgemäßen Proteaseinhibitoren durch das Ersetzen verschiedener anderer Aminosäuren in der Inhibitoraminosäuresequenz erhalten werden.
Zusätzlich werden, um die Aufgaben zu erfüllen und in Übereinstimmung mit den erfindungsgemäßen Zielen, pharmazeutische Zusammensetzungen, enthaltend als mindestens einen aktiven Bestandteil einen erfindungsgemäßen Proteaseinhibitor oder dessen hierin beschriebene biologisch aktive Analoga, offenbart.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform

Im Detail wird jetzt Bezug auf die derzeit bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen genommen, die, zusammen mit den folgenden Beispielen, dazu dienen, die Prinzipien der Erfindung zu erklären.
Wie vorstehend bemerkt, betrifft die vorliegende Erfindung Proteaseinhibitoren, die in gereinigter Form isoliert worden sind. Vorzugsweise sind die erfindungsgemäßen Serinprotease-Inhibitoren Proteine aus einer einzelnen, unfragmentierten Polypeptidkette, die wesentlich homolog zu, und meist bevorzugt biologisch äquivalent zu aus menschlichen Parotis-Sekreten isolierten, nativen Serinprotease-Inhibitoren sind. Mit dem Ausdruck "biologisch äquivalent", wie er in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendet wird, ist gemeint, daß die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen fähig zum Verhindern einer durch eine Protease induzierten Gewebeschädigung desselben Typs, aber nicht notwendigerweise im selben Ausmaß wie der native Proteaseinhibitor sind. Mit dem Ausdruck "wesentlich homolog", wie er in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen verwendet wird, ist ein Homologiegrad zu dem nativen Parotis-Inhibitor gemeint, der höher als derjenige ist, der für früher beschriebene Serinprotease-Inhibitorproteine, die aus einer einzelnen Polypeptidkette bestehen, offenbart ist. Vorzugsweise ist der Homologiegrad größer als 40 %, noch bevorzugter größer als 50 %, mit einer besonders bevorzugten Gruppe an Proteinen, die mehr als 60 % homolog zu dem nativen Parotis-Inhibitor sind. Der vorstehend beschriebene Homologieprozentsatz ist berechnet als der Prozentsatz der, in der kürzeren zweier Sequenzen gefundenen Komponenten, die auch in der längeren zweier Sequenzen ermittelt werden können, wobei als Komponente eine Sequenz aus einer benachbarten Aminosäure verstanden wird.
Die erfindungsgemäßen Proteaseinhibitoren sind bemerkenswert resistent gegenüber einer Denaturierung durch Hitze und Säuren und resistent gegenüber einem Aktivitätsverlust, wenn sie verschiedenen proteolytischen Enzymen, umfassend Chymotrypsin, Maus-Submaxillarprotease und Clostripain, ausgesetzt werden. Diese Inhibitoren haben auch die Fähigkeit, die notwendigen Disulfidbindungen zu bilden und geeignete nicht-kovalente Wechselwirkungen einzugehen, um eine aktive Tertiärstruktur einzunehmen, die fähig zur Ausübung der Serinprotease-Inhibitoraktivität in der Abwesenheit eines biochemischen Stimulus ist oder, wenn die Disulfidbindungen gelöst und die nicht-kovalenten Wechselwirkungen zerstört worden sind, solche Bindungen und Wechselwirkungen wieder auszubilden, um eine solche aktive Tertiärstruktur in der Abwesenheit des biochemischen Stimulus wiederzugewinnen.
Die bevorzugten erfindungsgemäßen Proteaseinhibitoren sind in Parotis-Sekreten entdeckt und zum ersten Mal in gereinigter Form isoliert worden. Zum Zweck der vorliegenden Anmeldung sollen die Ausdrücke "reine Form" oder "gereinigte Form", wenn diese verwendet werden, um auf die hierin offenbarten Proteaseinhibitoren Bezug zu nehmen, wesentlich frei von anderen Proteinen, die keine Serinprotease-Inhibitorproteine sind, bedeuten. Vorzugsweise sind die erfindungsgemäßen Proteaseinhibitoren wenigstens 90 % rein und vorzugsweise 95 % rein.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform werden die Parotis-Sekrete von Menschen erhalten. Jedoch ist zu erwägen, daß von anderen Säugern erhaltene Parotis-Sekrete für die Herstellung von Proteaseinhibitoren mit äquivalenter Aktivität zu derjenigen der erfindungsgemäßen verwendbar sein könnten.
Die erfindungsgemäßen Proteaseinhibitoren können in reiner Form von Parotis-Sekreten durch das Verfahren isoliert werden, welches umfaßt:
(a) Sammeln von Parotis-Sekreten aus Säugern;
(b) Isolieren des Inhibitors aus den Parotis-Sekreten durch Fraktionieren des proteinhaltigen Materials in den Sekreten;
(c) Identifizieren- der Fraktionen, die Serinprotease-hemmende Aktivität, vorzugsweise Leukozyten-Elastase-hemmende Aktivität besitzen; und
(d) Konzentrieren der Fraktionen, die Serinprotease-hemmende Aktivität ausüben.
Bei diesen Verfahren können die Parotis-Sekrete aus Säugern auf bekannte Weise gesammelt werden. Es ist bevorzugt, sie unter Verwendung eines Saugapparates, der über den Parotis- Drüsenkanal paßt, zu sammeln, um das Eindringen anderer oraler Flüssigkeiten, die Enzyme enthalten können, welche den Inhibitor wesentlich modifizieren würden, in die gesammelte Probe zu verhindern.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird, das in den Parotis-Sekreten vorhandene proteinhaltige Material durch Trennung des Materials hinsichtlich seiner Fähigkeit, an Kationenaustauschmaterialien im Vorhandensein von verschiedenen Konzentrationen an Salzlösungen gebunden zu werden, fraktioniert. Es ist generell festgestellt worden, daß der erfindungsgemäße Proteaseinhibitor von einem, in einer Chromatographiesäule vorhandenen starken Kationenaustauschmaterial durch eine Fraktion eines Natriumchlorid-Elutionsmittels, dessen Konzentration im Bereich von 0,005 M bis 1,0 M und spezifischer von 0,4 M bis 0,8 M liegt, eluiert werden wird. Andere Salzlösungskonzentrationen können jedoch benötigt werden, den Proteaseinhibitor in Abhängigkeit von den Eigenschaften der besonderen Kationenaustauschsäule zu eluieren.
Die so erhaltenen Fraktionen werden auf das Vorhandensein der Serinprotease-hemmenden, vorzugsweise Leukozyten-Elastase-hemmenden, Aktivität getestet. Vorzugsweise wird dies durch Mischen der Fraktionen mit einer bekannten Konzentration der Protease, vorzugsweise Leukozyten-Elastase, erreicht und durch Testen des restlichen, aktiven Enzyms hinsichtlich seiner Fähigkeit, Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilid zu hydrolysieren, wie in einem Spektralphotometer zu beobachten. Die proteinhaltigen Materialien der identifizierten Fraktionen werden dann gemäß der Größe, vorzugsweise durch Gelfiltration, aufgetrennt. Wenn Gelfiltrationstrennung verwendet wird, ist ein bevorzugtes Elutionsmittel eine 0,5 M Natriumchloridlösung. Fraktionen, die eine solche Aktivität ausüben, werden danach mittels z. B. Ultrafiltration konzentriert, um eine gereinigte und konzentrierte Form des Proteaseinhibitors zu erhalten.
Durch das vorstehende Verfahren isolierte Proteaseinhibitoren üben gewöhnlich bezüglich der Serinprotease, wie Leukozyten-Elastase, stöchiometrische Aktivität aus. Mit dem Ausdruck "stöchiometrische Aktivität" ist gemeint, daß jedes Molekül des Proteaseinhibitors mit einem Molekül Leukozyten-Elastase reagiert und dadurch deren Aktivität wesentlich erniedrigt. In einer Lösung des bevorzugten, erfindungsgemäßen Inhibitors, in der der Inhibitor und Leukozyten-Elastase in einer Konzentration, die größer oder gleich 10&supmin;&sup8; M ist, vorhanden sind, würde ein solcher Inhibitor mit mindestens 90 % einer äquivalenten molekularen Menge der Leukozyten-Elastase reagieren.
Wie vorstehend bemerkt, ist den Erfindern die Isolierung eines Serinprotease-Inhibitors aus Parotis-Sekreten in einer bisher nicht erhältlichen gereinigten Form gelungen. Die Isolierung dieses Enzyms in einer gereinigten Form war eine Voraussetzung für das korrekte Sequenzieren des Inhibitors und für die Entwicklung pharmazeutischer Zusammensetzungen, die den Proteaseinhibitor und seine Analoga enthält.
Ein bevorzugter erfindungsgemäßer Proteaseinhibitor hat die folgende Aminosäuresequenz:
Ser-Gly-Lys-Ser-phe-Lys-Ala-Gly-Val-Cys-Pro- Pro-Lys-Lys-Ser-Ala-Gln-Cys-Leu-Arg-Tyr-Lys- Lys-Pro-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Trp-Gln-Cys-Pro- Gly-Lys-Lys-Arg-Cys-Cys-Pro-Asp-Thr-Cys-Gly- Ile-Lys-Cys-Leu-Asp-Pro-Val-Asp-Thr-Pr o-Asn- Pro-Thr-Arg-Arg-Lys-pro-Gly-Lys-Cys-Pro-Val- Thr-Tyr-Gly-Gln-Cys-Leu-Met-Leu-Asn-Pro-Pro- Asp-Leu-Lys-Cys-Cys-Met-Gly-Met-Cys-Gly-Lys- Ser-Cys-Val-Ser-Pro-Val-Lys-Ala.
Die vorstehenden Abkürzungen entsprechen den Aminosäureresten in dem Polypeptid wie folgt:
Aminosäure Abkürzung
Alanin Ala
Valin Val
Leucin Leu
Isoleucin Ile
Prolin Pro
Phenylalanin Phe
Tryptophan Trp
Methionin Met
Glycin Gly
Serin Ser
Threonin Thr
Cystein Cys
Tyrosin Tyr
Asparagin Asn
Glutamin Gln
Asparaginsäure Asp
Glutaminsäure Glu
Lysin Lys
Arginin Arg
Histidin His
Es ist gefunden worden, daß diese Proteaseinhibitoren mehr als eine unterscheidbare Domäne haben. Mit dem Ausdruck "mehr als eine unterscheidbare Domäne" ist gemeint, daß das Protein mehrere aktive Stellen hat, die gegenüber verschiedenen Enzymen funktionell sind. Das Vorhandensein und die Lokalisierung dieser Stellen sind durch die Entdeckung einer wesentlichen Homologie zwischen wenigstens zwei Teilen des Proteaseinhibitors bestimmt worden. Vermutlich verleiht das Vorhandensein getrennter Domänen den Proteaseinhibitoren die Fähigkeit, verschiedene Serinproteasen, umfassend sowohl Leukozyten-Elastase als auch Trypsin, zu hemmen.
Es ist weiterhin bemerkt worden, daß aufgrund der Vielzahl getrennter Domänen dieser Proteaseinhibitoren diese als Netzwerk dienen können, auf dem verschiedene andere aktive Stellen konstruiert werden können, um Proteaseinhibitoren mit zusätzlichen Eigenschaften zu schaffen. Die bevorzugte, erfindungsgemäße Ausführungsform ist ein Proteaseinhibitor, der Leukozyten-Elastase, Kathepsin G und Trypsin hemmt. Diese Enzyme sind alle Mitglieder einer Klasse von, als Serinproteasen bekannte, Proteasen, die einen gemeinsamen Mechanismus und viele strukturelle Eigenschaften teilen. Es wird geglaubt, daß durch Manipulation weniger Aminosäureseitenketten auf den erfindungsgemäßen Proteaseinhibitoren eine Vielzahl von Inhibitoren geschaffen werden können, die jeweils zur Hemmung mindestens eines Mitgliedes der ganzen Klasse der Serinproteasen fähig sind. Weiterhin kann erwartet werden, daß solche Seitenkettenmodifikationen zu einer Vielzahl an Inhibitoren mit verbesserten, hemmenden Eigenschaften hinsichtlich bestimmter Mitglieder der Klasse der vorstehend beschriebenen Serinproteasen führen.
Die Aminosäureseitenkettenaustausche, die zum Erreichen dieser Ziele notwendig sind, werden durch gewisse Elemente struktureller Ähnlichkeit zwischen dem bevorzugten, erfindungsgemäßen Inhibitor und anderen Serinprotease-Inhibitoren, für die der wichtige funktionelle Teil des Inhibitors durch Röntgenkristallographie aufgedeckt worden ist, angedeutet. Diese Elemente struktureller Ähnlichkeit umfassen die Aminosäuren 17 bis 29 und die Aminosäuren 70 bis 83 des bevorzugten erfindungsgemäßen, vorstehend beschriebenen, Serinproteaseinhibitors. Die zur Verbesserung der Aktivität des Inhibitors gegenüber Trypsin-ähnlichen Serinproteasen entweder hinsichtlich der Quantität oder der Qualität in Frage kommenden Austausche umfassen das Austauschen mindestens einer der Aminosäuren 20 von Arg zu Lys, 72 oder 74 von Leu zu Lys oder Arg, und 73 von Met zu Lys oder Arg.
Die zur Verbesserung der Aktivität des Inhibitors gegenüber Chymotrypsin-ähnlichen Serinproteasen, umfassend Kathepsin G, entweder hinsichtlich der Quantität oder Qualität in Frage kommenden Austausche umfassen das Austauschen mindestens einer der Aminosäuren 20 von Arg zu Phe, Tyr oder Trp, Aminosäure 72 oder 74 von Leu zu Phe, Tyr oder Trp, und Aminosäure 73 von Met zu Phe, Tyr oder Trp.
Die für die Verbesserung der Aktivität des Inhibitors gegenüber zu pankreatischer Elastase ähnlichen Serinproteasen entweder hinsichtlich der Quantität oder Qualität in Frage kommenden Austausche umfassen das Austauschen mindestens einer der Aminosäuren 20 von Arg zu Ala, 72 oder 74 von-Leu zu Ala, und 73 von Met zu Ala.
Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung muß immer bedacht werden, daß die Veränderung der Aminosäuresequenzen mit dem Ziel, neue Protease-hemmende Eigenschaften auf das vorliegende Protein zu übertragen, die Aktivität des Inhibitors gegenüber Leukozyten-Elastase oder gegenüber Trypsin zerstören kann. Solche Effekte können durch experimentelle Routinearbeiten gemäß der Lehre der vorliegenden Erfindung bestimmt werden.
Weiterhin wird bedacht, daß die Substitution einzelner Aminosäuren oder einzelner Sequenzen an Aminosäuren, wie vorstehend erklärt, entweder die Leukozyten-Elastase-hemmenden Eigenschaften oder die Trypsin-hemmenden Eigenschaften des vorliegenden Proteaseinhibitors auf Kosten einiger Aktivität der nicht verbesserten Domäne verstärken können. Tatsächlich kann die Aktivität jeder Domäne innerhalb des Inhibitorproteins vollständig durch geeignete Aminosäuresubstitutionen desaktiviert werden, wodurch Inhibitorproteine geschaffen werden, die spezifisch für mindestens eine Untergruppe an Enzymen sind, gegen die das Protein-normalerweise aktiv ist. Z.B. desaktiviert eine Substitution von Gly für Arg an Position 20 die Trypsin-hemmende Domäne, während eine Substitution von Gly für Met an der Position 73 oder für Leu an der Position 72 oder 74 die Leukozyten-hemmende Domäne desaktiviert. Die Domänen können auch auf getrennte Proteine unterteilt werden, wobei jede eine gewünschte hemmende Funktion beibehält. Die vorliegenden Ansprüche umfassen weitere Inhibitoren, die auf diese Weise hergestellt werden.
Während die vorstehend angeführte Aminosäuresequenz einen Leukozyten-Elastaseinhibitor ergibt, der bevorzugt ist und die vorstehend aufgezählten Merkmale besitzt, stellt die vorliegende Erfindung auch gewisse Analoga dieses Inhibitors bereit, die Merkmale, umfassend die Leukozyten-Elastase-hemmende Aktivität, ausüben und die vom pharmazeutischen Standpunkt ebenso wünschenswert sind. Demgemäß sind solche Analoga ebenso bevorzugte erfindungsgemäße Verbindungen. Insbesondere würde, wenn die Aminosäure Methionin durch die Aminosäure Valin ersetzt würde, der resultierende Inhibitor eine verbesserte Resistenz gegenüber oxidativer Inaktivierung ausüben und daher verbesserte Leukozyten-Elastase- und Kathepsin G- hemmende Eigenschaften ausüben. Ähnliche Austausche können vorgenommen werden, um die Resistenz des Inhibitors gegenüber einer Inaktivierung durch Zigarettenteer zu verbessern.
Möglicherweise werden zusätzliche Substitutionen Durchschnittsfachleuten durch die Ausführung der vorliegenden Erfindung offensichtlich werden, die weitere verschiedene Eigenschaften des beanspruchten Proteaseinhibitors verstärken werden und die dazu dienen werden, das resultierende Protein noch nützlicher als Inhibitor für proteolytische Enzyme zu machen. Es wird vorweggenommen, daß solche weiteren Substitutionen innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung sind.
Weiterhin wird durch Fachleute anerkannt, daß kleinere Variationen in der Aminosäuresequenz eines Proteins, selbst wenn sie nicht die Funktion des Proteins verstärken, Analoga erzeugen, die keine wesentlich verminderte Aktivität haben. Es wird deshalb vorweggenommen, daß Analoga der vorstehend diskutierten Proteaseinhibitoren, deren Sequenzen kleinere Variationen von der vorstehend erwähnten bevorzugten Sequenz enthalten, von der vorliegenden Erfindung mitumfaßt sind. Insbesondere wird geglaubt, daß kleinere Veränderungen der Aminosäuresequenz an den C- und N-Termini die Aktivität der offenbarten Proteaseinhibitoren nicht wesentlich verändern. Speziell führt die Substitution am C- oder N-Terminus mit einer zyklischen Aminosäure, wie z. B. Prolin, vermutlich zu einem Proteaseinhibitor mit der gewünschten Serinprotease-hemmenden Aktivität. Weiterhin sind Analoga der offenbarten Proteaseinhibitoren, die Abweichungen am C- oder N-Terminus haben, wobei die Abweichungen nicht die Serinprotease-hemmenden Eigenschaften des analogen Proteins zerstören, von der vorliegenden Erfindung umfaßt.
Es ist ebenso beabsichtigt, daß zusätzliche Polypeptidketten am C- oder N-Terminus des vorliegenden Proteaseinhibitors von der Erfindung umfaßt sind. Insbesondere können Polypeptidketten durch Proteinfusionstechniken an beide Termini angehängt werden. Diese zusätzlichen Polypeptide können dazu dienen, die pharmakologische Wirksamkeit des vorliegenden Proteaseinhibitors zu steigern. Z.B. kann dem Polypeptid durch die Fusion mit anderen Proteinen die Fähigkeit verliehen werden, an Schleimhäute anzuhaften, damit der Proteaseinhibitor an einem bestimmten Ort, wie der Lunge, verbleibt.
Bei diesen Analoga sollte die Veränderung an der Aminosäuresequenz nicht in einer solchen Weise vorgenommen werden, daß in dem Organismus, dem der Proteaseinhibitor appliziert wird, eine ungünstige Immunantwort hervorgerufen wird. Die Methoden zur Bestimmung, ob ein biologisches Molekül eine ungünstige Immunantwort hervorrufen wird, sind Fachleuten bekannt.
Die vorbeschriebenen Substitutionen können durch verschiedene Methoden bewirkt werden. Z.B. können die genetischen Instruktionen, die verwendet werden, um den Inhibitor mittels rekombinanter DNA-Methoden herzustellen, verändert werden, so daß ein transformierter Mikroorganismus das gewünschte Analogon synthetisiert. Solche rekombinanten Methoden sind in der US-A-678 822 von Pradip K. Bandyopadhyay et al. mit dem Titel "Recombinant Methods for Isolation of Serine Protease Inhibitors and DNA Sequences Useful for Same", eingereicht am 6. Dezember 1984, beschrieben. Andere Methoden zur biochemischen Synthese von Proteinanaloga sind Fachleuten bekannt und es ist beabsichtigt, daß diese für die Herstellung dieser und anderer Analoga von der Erfindung mitumfaßt sind.
Der erfindungsgemäße Proteaseinhibitor und seine Analoga sind in der Form pharmazeutischer Produkte, die Serinprotease-hemmende Aktivität, insbesondere Leukozyten-Elastase-hemmende Aktivität, besitzen, für die human- und tiermedizinische Verwendung gedacht. Es wird erwartet, daß pharmazeutische Präparate, die als mindestens einen aktiven Bestandteil einen der vorliegenden Serinprotease-Inhibitoren enthalten, auch geeignete, pharmazeutisch akzeptierbare Träger, Verdünnungsmittel, Füllmittel, Bindemittel und andere Exzipientien in Abhängigkeit von der beabsichtigten Dosierungsform enthalten würden. Für eine orale Verabreichung müssen Schritte unternommen werden, um den Abbau des aktiven Proteins im Verdauungstrakt zu verhindern. Enterisch beschichtete Dosierungsformen werden als eine geeignete Form für die orale Verabreichung angesehen. Wenn parenterale Verabreichung gewählt wird, kann die Präparation eine Wasser- oder Salzlösung oder ein anderes pharmazeutisch akzeptierbares Suspendierungsagens enthalten. Im allgemeinen würde es bevorzugt sein, daß eine für die parenterale Verabreichung gedachte Präparation Natriumchlorid in einer ausreichenden Konzentration enthält, um die gesamte Präparation isotonisch zu den Körperflüssigkeiten zu machen. Es ist ebenso beabsichtigt, daß pharmazeutische Präparationen, die die Serinprotease-Inhibitoren, insbesondere Leukozyten-Elastase-Inhibitorproteine der vorliegenden Erfindung enthalten, lokal verabreicht werden können, wie durch Injektion oder topische Applikation zur Behandlung von lokalisierten Enzymkonzentrationsgleichgewichten. Die vorliegenden Inhibitoren, insbesondere Leukozyten-Elastase-Inhibitor, können auch als Aerosol verabreicht werden, insbesondere wenn sie der Lunge, wie bei der Behandlung von Emphysem, zugeführt werden sollen. In diesen Situationen würden geeignete Träger, Verdünnungsmittel und Treibmittel verwendet werden.
Die zu verabreichende Menge an Proteaseinhibitor würde bei jeder Dosierungssituation von der Menge am, im Organismus vorhandenen, Überschuß an proteolytischen Enzymen abhängig sein. Um die geeignete Dosis zu bestimmen, würde man die vorhandene übermäßige Menge an proteolytischen Enzymen quantifizieren und würde auf der Grundlage der Aktivität der speziellen Art des zu verabreichenden Proteaseinhibitors oder Mischungen davon die Gesamtmenge an Proteaseinhibitor bestimmen, die notwendig ist, den Überschuß an proteolytischen Enzymen zu neutralisieren. Solche Bestimmungen werden routinemäßig von Fachleuten bei der Bestimmung therapeutischer Dosen für die Behandlung von Immunkrankheiten ausgeführt und gehören zu dem Aufgabenbereich, der von diesen routinemäßig ohne unangemessene Experimentierung durchgeführt wird, besonders mit Blick auf die Standardversuche und die hierin beschriebenen Versuche. Jedoch sollte bemerkt werden, daß vermutlich große Überschüsse an Proteaseinhibitoren der vorliegenden Erfindung nicht toxisch sein würden oder eine ungünstige Reaktion verursachen, wenn sie einem Organismus mit einem Überschuß an proteolytischen Enzymen verabreicht werden. Als solches ist es bevorzugt, daß eher eine Menge über der optimalen Menge an Proteaseinhibitor verabreicht wird als eine geringere Menge als das Optimum.
Durchschnittsfachleute sollten mit Blick auf die hierin enthaltenen Lehren fähig zur Anwendung der erfindungsgemäßen Lehre auf ein spezifisches Problem oder Gebiet fähig sein. Beispiele der erfindungsgemäßen Produkte und repräsentative Verfahren zu ihrer Isolierung und Herstellung erscheinen in folgenden Beispielen.

BEISPIEL 1

Reinigung eines humanen Leukozyten-Elastase-Inhibitors aus Parotis-Sekreten

Parotis-Sekrete wurden mittels einer über den Ausgang des Parotis-Kanals angebrachte Saugvorrichtung von Freiwilligen gesammelt. Die Sekretion wurde durch Lutschen eines sauren Bonbons stimuliert. Zwei bis drei Liter vereinigte Parotis-Sekrete wurden mit einer Natriumhydroxidlösung auf pH 6,0 gebracht und zentrifugiert, um das Präzipitat zu entfernen. Der Überstand wurde auf eine 2,5·40,0 cm-Säule Sephadex C50, die mit 0,05 M Natriumacetat, pH 6,0, und 0,005 M Natriumchlorid äquilibriert war, aufgetragen. Die Säule wurde mit einem linearen Gradienten von 0,005 bis 1 M Natriumchlorid eluiert. Die erhaltenen Fraktionen wurden auf das Vorhandensein des Inhibitors durch Immunassay getestet. Die Fraktionen, die dem Aktivitätspeak entsprachen, waren diejenigen, die nahe 0,6 M erhalten worden sind. Diese Fraktionen wurden auf 3 ml durch Ultrafiltration durch ein Amicon UM2-Filter konzentriert und das Konzentrat wurde auf eine 1,6·100 cm-Säule Sephadex G50, die mit 0,05 M Tris-HCl, pH 7,4, und 0,5 M Natriumchlorid äquilibriert war, aufgetragen. Die Säule wurde dann mit diesem Puffer eluiert und die Fraktionen durch Immunassay getestet. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt und durch Ultrafiltration, wie oben beschrieben, konzentriert. Zwischen 2 und 4 mg Inhibitor wurden gewonnen, die im wesentlichen 100 % aktiv waren.

Beispiel 2

Reinigung eines humanen Leukozyten-Elastase- Inhibitors aus purulentem Bronchialschleim

Bronchialschleim wurde von an Lungenkrankheiten leidenden Krankenhauspatienten gesammelt und vereinigt. Die Pools wurden gefroren und lyophilisiert. Das lyophilisierte Pulver wurde in einer kalten Lösung aus 5 % Perchlorsäure suspendiert und die Mischung wurde 2 Stunden lang heftig gerührt und durch die Zugabe von 4 M Kaliumhydroxid neutralisiert. Die Mischung wurde mit 12 000 g 30 Minuten lang bei 0ºC zentrifugiert, um das unlösliche Material zu entfernen.
Die rohe Proteinlösung wurde durch Ultrafiltration durch Membranen, die darauf ausgerichtet waren, sämtliches Material mit einem Molekulargewicht größer als 100 000 und kleiner als 10 000 Dalton zu entfernen, fraktioniert. In einem ersten Schritt wurde die Lösung über eine Amicon XM100A-Membran in einem Ultrafiltrationsapparat mit einem dünnen Kanal umgepumpt. Das durch die Membran hindurchtretende Material wurde dann durch denselben Apparat, wobei die XM100A-Membran durch eine YM10-Membran ersetzt worden war, hindurchtreten gelassen. Es war auch möglich, das Material durch ein anfängliches Umpumpen über eine Millipore 100K-Membran in einem Minitan-Apparat zu fraktionieren. In diesem Fall wurde, das durch das Filter hindurchtretende, Material danach durch denselben Apparat mit einer 10K-Membran hindurchtreten gelassen. In beiden Fällen wurde das von den Membranen zurückgehaltene Material für eine weitere Behandlung gewonnen.
Die Ultrafiltrate wurden über eine Umkehrphasen-Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC)-Säule chromatographiert. Ungefähr 1 ml, enthaltend ungefähr 20 mg Gesamtprotein und ungefähr 0,6 mg Inhibitor, wurden auf eine RP8-Säule (erhalten von Synchrom Inc., Linden, Indiana) bei einer Fließrate von 1 ml pro Minute geladen. Die Proteine wurden mit einer 0,05 %-igen Lösung Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser und danach mit einem linearen Gradienten einer 0 bis 50 %-igen Lösung von 0,05 %-iger Trifluoressigsäure in Acetonitril eluiert. Fraktionen wurden gesammelt und auf Proteaseinhibitoraktivität durch Mischen mit einer bekannten Menge an Chymotrypsin und nachfolgendem Bestimmen des restlichen aktiven Chymotrypsins unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Standardverfahren getestet. Aktives Material wurde mit zwischen 25 % und 30 %-iger Acetonitrillösung eluiert. Diese Fraktionen wurden zur weiteren Behandlung vereinigt.
Die vereinigten Fraktionen von der RP8-Säule wurden lyophilisiert und in 0,05 M Natriumphosphat, pH 6,0, gelöst und auf eine Brownlee CX300-Kationenaustauschsäule aufgetragen, die mit demselben Puffer äquilibriert war. Die Säule wurde mit einem linearen Gradienten von 0 bis 100 % 0,5 M Natriumphosphat, pH 6,0 eluiert. Aktive Fraktionen wurden wiederum detektiert durch ihre Fähigkeit, Chymotrypsin zu hemmen. Drei Aktivitätspeaks wurden detektiert, die bei 0,24 M, 0,26 M und 0,28 M Phosphat eluierten. Drei Pools aktiven Materials wurden hergestellt und diese wurden entsalzt und in einem Amicon-Apparat mit einer YM10-Membran vor dem Einfrieren zur Aufbewahrung konzentriert.
Die Aktivität jeder Fraktion wurde durch einen Assay mit Chymotrypsin bestimmt und die Proteinkonzentration wurde durch Bradford-Assay (Analytical Biochem. 72 : 248 (1976)) bestimmt. Jeder Peak hatte eine Aktivität gegenüber Chymotrypsin, die ungefähr 80 % derjenigen entsprach, die für den aus den Parotis-Sekreten des Beispiels 1 gereinigten Inhibitor beobachtet worden war.

Beispiel 3

Die Bestimmung der Aminosäuresequenz des aus Parotis-Sekreten isolierten Leukozyten-Elastase-Inhibitors

Der native Inhibitor wurde durch Standardverfahren reduziert und carboxymethyliert. 1,0 mg (80 nMol) Inhibitor wurden in 600 ul einer Lösung von 6 M Guanidiniumhydrochlorid in 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, enthaltend 1,32 Mol Dithiothreitol und Tris-Puffer, pH 8,0, gelöst. Nach 1 Stunde bei 37ºC wurden 3,32 nMol (2-³H) Jodessigsäure zugefügt und die Inkubation wurde bei 37ºC für eine weitere Stunde fortgesetzt. Danach wurden 0,66 nMol Dithiothreitol und nach 1 Stunde Inkubation bei 37ºC weitere 1,36 nMol (2-³H) Jodessigsäure zugefügt. Nach 1 Stunde Inkubation bei 37ºC wurde die Reaktionsmischung extensiv gegen Tris-Puffer, pH 8,0, enthaltend 0,1 M Natriumchlorid, dialysiert. Die resultierende Lösung wurde auf eine Synchrom RP8 HPLC-Säule aufgetragen und die Produkte wurden von der Säule mit 0,05 % TFA in Wasser und dann mit einem linearen Gradienten von 0,05 % TFA in Acetonitril eluiert. Das reduzierte carboxymethylierte Protein eluierte bei 22 %-iger Acetonitrillösung, bestimmt durch Absorption bei 215 und 280 nm und durch den (³H)-Gehalt dieser Fraktionen. Dieses Material wurden zur weiteren Verwendung unter Vakuum getrocknet.
Das reduzierte carboxymethylierte Protein wurde durch automatischen Edman-Abbau sequenziert, wodurch sich die Identifikation der Reste 1 bis 41 der Aminosäuresequenz ergab. Diese lauten wie folgt:
Ser-Gly-Lys-Ser-Phe-Lys-Ala-Gly-Val-Cys-Pro- Pro-Lys-Lys-Ser-Ala-Gln-Cys-Leu-Arg-Tyr-Lys- Lys-Pro-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Trp-Gln-Cys-Pro- Gly-Lys-Lys-Arg-Cys-Cys-Pro-Asp-Cys-Gly- Ile-Lys-Cys-Leu-Asp-(Pro)-Val-Asp- Das reduzierte carboxymethylierte Protein wurde einem Verdau durch Maus-Submaxillarprotease ausgesetzt und die resultierenden Peptide wurden durch Umkehrphasen-HPLC über eine Synchrom RP8-Säule unter Verwendung derselben Lösungen und Gradienten, wie vorstehend beschrieben, getrennt. Eines dieser Peptide, welches bei 20 %-iger Acetonitrillösung eluierte, wurde durch automatisierten Edman-Abbau sequenziert und es ergab sich die folgende Sequenz:
Tyr-Lys-Lys-Pro-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Trp-Gln- Cys-Pro-Gly-Lys-Lys-Arg-Cys-Cys-Pro-Asp-Thr- Cys-Gly
Dasselbe Peptid wurde einem Verdau durch Chymotrypsin ausgesetzt, wodurch sich zwei neue Peptide ergaben, die durch Umkehrphasen-HPLC über eine Synchrom RP8-Säule, wieder wie vorstehend erklärt, getrennt wurden. Eines von diesen, welches bei 17 %-igem MeCN-Acetonitril eluierte, wurde durch automatisierten Edman-Abbau sequenziert und es ergab sich die folgende Sequenz:
Gln-Cys-Pro-Gly-Lys-Lys-Arg-Cys-Cys-Pro-Asp- Thr-Cys-Gly-Ile-Lys-Cys-Leu-Asp-Pro-Val-Asp- Thr-Pro-Asn-Pro-(Thr-Arg)
Das reduzierte carboxymethylierte Protein wurde mit Lys-C-Protease verdaut und die resultierenden Peptide wurden durch Umkehrphasen-HPLC über eine Synchrom RP8-Säule getrennt. Ein Peak (³H) enthaltenden Materials, welcher zwischen 13 % und 15 %-igem Acetonitril eluierte, wurde einem Edman-Abbau ausgesetzt, wodurch sich die folgende Sequenz ergab:
Cys-Leu-Asp-Pro-Val-Thr-Asp-Pro-Asn-Pro- Thr-Arg-Arg-Lys-Pro-Gly-Lys.
Die Peptide, die durch den Verdau mit Maus-Submaxillarprotease erhalten wurden und zwischen 26 % und 28 %-igem Acetonitril eluierten, wurden durch automatisierten Edman-Abbau sequenziert und es ergab sich folgende Sequenz:
Arg-Lys-Pro-Gly-Lys-Cys-Pro-Val-Thr-Tyr-Gly- Gln-Cys-Leu-Met-Leu-Asn-Pro-Pro-Asn-Phe-Cys- Glu-Met-Asp-Gly-Gln-Cys-Lys-Arg-Asp-Leu-Lys- Cys-Cys-Met . . .
Der reduzierte, carboxymethylierte Inhibitor wurde mit V8-Protease verdaut und die Peptide wurden durch Umkehrphasen-HPLC über eine synchrom RP8-Säule getrennt. Das bei 19 %-igem Acetonitril eluierte Peptid wurde durch automatisierten Edman-Abbau sequenziert und es ergab sich die folgende Sequenz:
Met-Asp-Gly-Gln-Cys-Lys-Arg-Asp-Leu-Lys-Cys- Cys-Met-Gly-Met-Cys-Gly-Lys-Ser-Cys-Val-Ser- Pro-Val-Lys
Das Peptid, das sich durch den Verdau des reduzierten, carboxymethylierten Inhibitors mit Submaxillarprotease ergab und von einer Synchrom RP8-Säule zwischen 26 % und 28 %-igem Acetonitril eluierte, wurde mit Trypsin weiterverdaut. Die resultierenden Peptide wurden durch Umkehrphasen-HPLC über dieselbe Säule getrennt und das bei 9 %-igem Acetonitril eluierte Peptid wurde durch manuellen Edman-Abbau sequenziert, wobei sich die folgende Sequenz ergab:
Ser-Cys-Val-Ser-Pro-Val-Lys-Ala
Ein Peptid derselben Zusammensetzung und Sequenz kann nach einem Verdau des Proteins mit Lys-C-Protease isoliert werden. Dieses Peptid eluiert zwischen 8 und 10 %-igem Acetonitril von einer Synchrom RP8-Säule.
Das reduzierte, carboxymethylierte Protein wurde durch Erhitzen in 6 M-Salzsäure hydrolysiert und seine Aminosäurebestandteile wurden auf der Grundlage eines ungefähren Molekulargewichts von 14 000 auf SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestimmt:
Ala 3,5 Arg 5,8 Asp 8,5 Cys 15,7 Glu 5,2 Gly 10,6 His 0,0 Ile 1,0 Leu 5,0 Lys 16,2 Met 4,0 Phe 2,1 Pro 14,8 Ser 3,7 Thr 2,4 Tyr 2,1 Val 4,7
Es wurde erkannt, daß die vorstehenden Daten ein Set überlappender Peptide definierten, die von dem reduzierten, carboxymethylierten Inhibitor erhalten wurden. Die vollständige Sequenz des Inhibitors lautet daher wie folgt:
Ser-Gly-Lys-Ser-Phe-Lys-Ala-Gly-Val-Cys-Pro- Pro-Lys-Lys-Ser-Ala-Gln-Cys-Leu-Arg-Tyr-Lys- Lys-Pro-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Trp-Gln-Cys-Pro- Gly-Lys-Lys-Arg-Cys-Cys-Pro-Asp-Thr-Cys-Gly- Ile-Lys-Cys-Leu-Asp-Pro-Val-Asp-Thr-Pro-Asn- ProThr-Arg-Arg-Lys-Pro-Gly-Lys-Cys-Pro-Val- Thr-Tyr-Gly-Gln-Cys-Leu-Met-Leu-Asn-Pro-Pro- Asn-Phe-Cys-Glu-Met-Asp-Gly-Gln-Cys-Lys-Arg- Asp-Leu-Lys-Cys-Cys-Met-Gly-Met-Cys-Gly-Lys- Ser-Cys-Val-Ser-Pro-Val-Lys-Ala
Die vorausgesagte Aminosäurezusammensetzung eines Salzsäure-Hydrolysats dieses Proteins würde wie folgt lauten:
Ala 3 Arg 5 Asp 9 Cys 16 Gly 9 Glu 7 His 0 Ile 1 Leu 5 Lys 15 Met 4 Phe 2 Pro 13 Ser 6 Thr 4 Tyr 2 Trp 1 Val 5
Weiterhin sind vermutlich alle Cys-Reste miteinander verknüpft, um Disulfidbindungen zu bilden.

Beispiel 4

Die Identität des Elastaseinhibitors aus Bronchialschleim mit demjenigen aus Parotis-Sekreten

Der von der Brownlee CX300-Säule bei 0,28 M Phosphat eluierte Inhibitor wurde wie folgt charakterisiert:
(a) Eine Probe des Inhibitors wurde unter Standardbedingungen durch Erhitzen in 6 M Salzsäure hydrolysiert. Die Aminosäurezusammensetzung des Inhibitors ist
Ala 3,8 Arg 5,0 Asp 8,8 Gly 11,3 Glu 6,3 His 0 Ile 1,3 Leu 5,0 Lys 13,8 Met 3,8 Phe 2,5 Pro 12,5 Ser 6,3 Thr 3,8 Tyr 1,3 Val 5,0
Diese ist nicht signifikant unterschiedlich von der Aminosäurezusammensetzung des Inhibitors aus Parotis oder von derjenigen, die von der vorstehend beschriebenen Sequenz berechnet worden war.
(b) Der Inhibitor wurde unter den, für den Inhibitor aus Parotis vorstehend beschriebenen Bedingungen reduziert und carboxymethyliert. Dieses Protein wurde dann durch Maus-Submaxillarprotease verdaut, und die Produkte wurden durch Umkehrphasen-HPLC über eine Synchrom RP8-Säule analysiert. Das Spaltmuster sieht ununterscheidbar aus im Vergleich zu demjenigen des reduzierten, carboxymethylierten Inhibitors aus Parotis, welcher zur selben Zeit laufengelassen wurde, mit der Ausnahme der Form des Peaks, der zwischen 31 und 35 %-igem Acetonitril eluiert, wobei der Peak hinsichtlich der Elutionsposition sogar zwischen verschiedenen Proben des Parotis-Inhibitors variiert. Dies kommt wahrscheinlich von chemischen Modifikationen eines einzelnen Peptids.
(c) Der Inhibitor wurde automatisiertem Edman-Abbau ausgesetzt, und es ergab sich die folgende Aminosäuresequenz für die ersten 14 Aminosäuren:
X-Gly-Lys-Y-Phe-Lys-Ala-Gly-Val-Z-Pro-Pro-Lys-Lys
worin X, Y und Z Aminosäuren sind, die in einer Rate gewonnen wurden, die zu gering ist, als daß sie identifiziert werden könnten.
Die ausgeprägte Ähnlichkeit zwischen dem aus Bronchialschleim isolierten Inhibitor und demjenigen, der aus Parotis-Sekreten isoliert wurde, zusammen mit dem Fehlen eines jeden Hinweises für einen Unterschied zwischen diesen beiden Proteinen zeigen an, daß sie identisch oder nahezu identisch sind.

Beispiel 5

Identifizierung von Eigenschaften des Inhibitors zur klinischen Verwendung als Inhibitor der Leukozyten-Elastase

(a) Eine Lösung des Parotis-Inhibitors aus Beispiel 1 wurde zu einer Lösung von Leukozyten-Elastase im Vorhandensein eines Puffers mit pH 8,0 und humanem Serumalbumin zugefügt und das restliche freie Enzym wurde durch Testen seiner Fähigkeit, Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilid zu hydrolysieren, bestimmt. Die Daten passen zu einem Standardmodell einer Enzym-Inhibitor-Wechselwirkung, in der ein Inhibitor ein Enzym inaktiviert und die Dissoziationskonstante des Enzym-Inhibitor-Komplexes ist 5·10&supmin;¹&sup0; M.
In analogen Experimenten wurde die Fähigkeit des Inhibitors, mehrere andere menschliche Proteasen zu hemmen, bestimmt. Diese Dissoziationskonstanten sind in der nachstehenden Tabelle aufgeführt. Serinprotease Dissoziationskonstante des Komplexes mit Inhibitor aus Beispiel 1 bei 25ºC und pH 7,8 humane Leukozyten-Elastase Kathepsin G Trypsin Chymotrypsin pankreatische Elastase
(b) Eine Lösung des Parotis-Inhibitors in 0,2 M Tris-HCl, pH 7,8, wurde in einem verschlossenen Reaktionsgefäß auf 700 c erhitzt und Proben wurden zu verschiedenen Zeiten für den Test entnommen. Die Ergebnisse zeigten, daß der Inhibitor mit ungefähr einer Kinetik erster Ordnung die Aktivität verlor und eine Halbwertszeit von ungefähr 10 Stunden hatte. Dieser Stabilitätsgrad ist außergewöhnlich für ein Protein in Lösung und schafft einen wesentlichen Vorteil für die Formulierung des Proteins zur klinischen Verwendung als Elastase-Inhibitor.
(c) Eine Lösung des Inhibitors in 70 %-iger Ameisensäure wurde 40 Stunden lang bei 37ºC gehalten und nach Tests wurde gefunden, daß sie wenigstens 80 % ihrer ursprünglichen Aktivität beibehalten hat.
(d) Eine Lösung des Inhibitors wurde mit Maus-Submaxillarprotease, Clostripain und Thermolysin behandelt. Nur das letzte Enzym führte innerhalb einer dreistündigen Zeitdauer bei 37ºC zu einem signifikanten Verlust der inhibitorischen Aktivität. Diese Resistenz gegenüber Abbau durch Enzymen schafft einen wesentlichen Vorteil für die Verwendung dieses Proteins als Leukozyten-Elastaseinhibitor in vivo, da sie allgemeine Resistenz des Inhibitors gegenüber anderen Enzymen einer Art, die in Bronchialschleim vorhanden sein könnte, anzeigt.
(e) Eine Lösung des Inhibitors in 6 M Guanidiniumhydrochlorid und 30 mM Dithiothreitol, wodurch aufgrund von Analogie mit anderen Proteinen davon ausgegangen werden kann, daß die gesamte definierte Struktur verlorengegangen ist, gewann mindestens 90 % ihrer nativen inhibitorischen Aktivität zurück, nachdem oxidiertes Glutathion in zehnfachem Überschuß hinsichtlich des verwendeten Dithiothreitols zugefügt und die Lösung zehnfach mit 25 mM Tris-HCl, pH 9,0, verdünnt worden war. Dieses Ergebnis zeigt, daß die aktive Struktur des Proteins eine stabile Struktur der Polypeptidkette ist. Das Ergebnis bedeutet weiterhin, daß das Protein bei verschiedenen rohen Behandlungen aktiv bleiben wird und selbst unter einigen Bedingungen, die die Aktivität zerstören, die Fähigkeit behalten wird, die Aktivität wiederzugewinnen, nachdem diese Bedingungen aufgehoben worden sind.
Es wird Fachleuten offensichtlich sein, daß verschiedene Modifikationen und Variationen in den Verfahren und Produkten der vorliegenden Erfindung gemacht werden können. Folglich ist beabsichtigt, daß die vorliegende Erfindung Modifikationen und Variationen dieser Erfindung mitumfassen, vorausgesetzt, daß sie innerhalb des Umfangs der anhängenden Ansprüche und ihrer Äquivalente liegen.

Claims

1. Gereinigtes Serinprotease-Inhibitorprotein, bestehend aus einer einzelnen unfragmentierten Polypeptidkette, wobei der Inhibitor fähig zum Hemmen der Proteaseaktivität mindestens einer Serinprotease und mindestens 40 % homolog zu einem aus Parotissekreten isolierten, nativen Serinprotease-Inhibitor ist.

2. Serinprotease-Inhibitor nach Anspruch 1, worin die Serinprotease-hemmende Aktivität biologisch äquivalent zu derjenigen des nativen Serinprotease-Inhibitors ist.

3. Serinprotease-Inhibitor nach Anspruch 2, worin die Serinprotease-hemmende Aktivität ausgewählt ist aus mindestens einer Aktivität aus der Gruppe, bestehend aus der Leukozyten-Elastase-hemmenden Aktivität, Kathepsin G-hemmenden Aktivität, Trypsin-hemmenden Aktivität, pankreatische Elastase-hemmenden Aktivität und Chymotrypsin-hemmenden Aktivität.

4. Serinprotease-Inhibitor nach Anspruch 3, worin die Serinprotease-hemmende Aktivität die Leukozyten-Elastasehemmende Aktivität ist.

5. Serinprotease-Inhibitor nach Anspruch 1, worin der Serinprotease-Inhibitor die Proteaseaktivität von mindestens zwei Serinproteasen hemmt.

6. serinprotease-Inhibitor nach Anspruch 5, worin der Serinprotease-Inhibitor die Proteaseaktivitäten von Trypsin und Leukozyten-Elastase hemmt.

7. Serinprotease-Inhibitor nach Anspruch 1 mit einer oder mehreren Aminosäuresubstitution(en) im Vergleich zum nativen Serinprotease-Inhibitor, wobei die Substitutionen bei einer oder mehreren der Aminosäuren 1, 17-29, 70-83, 94, 96 oder 107 vorkommen, wodurch der Serinprotease-Inhibitor im Vergleich zum nativen Serinprotease-Inhibitor eine veränderte Protease-hemmende Aktivität ausübt.

8. Serinprotease-Inhibitor nach Anspruch 1, worin die N-terminale Aminosäure Serin ist.

9. Gereinigter Serinprotease-Inhibitor, bestehend aus einer einzelnen unfragmentierten Polypeptidkette, wobei der Serinprotease-Inhibitor die Proteaseaktivität mindestens einer Serinprotease hemmt und die Aminosäuresequenz

R&sub1;-Gly-Lys-Ser-Phe-Lys-Ala-Gly-Val-Cys-Pro- Pro-Lys-Lys-Ser-Ala-Gln-Cys-Leu-R&sub2;-Tyr-Lys- Lys-Pro-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Trp-Gln-Cys-Pro- Gly-Lys-Lys-Arg-Cys-Cys-Pro-Asp-Thr-Cys-Gly- Ile-Lys-Cys-Leu-Asp-Pro-Val-Asp-ThrPro-Asn- Pro-Thr-Arg-Arg-Lys-Pro-Gly-Lys-Cys-Pro-Val- Thr-Tyr-Gly-Gln-Cys-R&sub8;-R&sub3;-R&sub9;-Asn-Pro-Pro- Asn-Phe-Cys-Glu-R&sub4;-Asp-Gly-Gln-Cys-Lys-Arg- Asp-Leu-Lys-Cys-Cys-R&sub5;-Gly-R&sub6;-Cys-Gly-Lys- Ser-Cys-Val-Ser-Pro-Val-Lys-R&sub7;.

umfaßt,

worin R&sub1; und R&sub7; gleich oder verschieden sind und ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Aminosäureresten; und

R&sub2;, R&sub3;, R&sub4;, R&sub5;, R&sub6;, R&sub8; und R&sub9; gleich oder verschieden sind und ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Methionin, Valin, Alanin, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan, Lysin, Glycin und Arginin.

10. Serinprotease-Inhibitor nach Anspruch 9, worin R&sub1; Serin ist und R&sub7; Alanin ist.

11. Serinprotease-Inhibitor nach Anspruch 9, worin R&sub2; und R&sub3; Methionin sind.

12. Serinprotease-Inhibitor nach Anspruch 9, worin R&sub2; und R&sub3; Arginin sind.

13. Serinprotease-Inhibitor nach Anspruch 9, worin R&sub2; Arginin ist und R&sub3; Methionin ist.

14. Serinprotease-Inhibitor nach Anspruch 9, worin R&sub2;, R&sub3;, R&sub4;, R&sub5; und R&sub6; Methionin sind, und R&sub8; und R&sub9; Leucin sind.

15. Serinprotease-Inhibitor nach Anspruch 9, worin ein oder mehrere Rest(e) aus R&sub2;, R&sub3;, R&sub4;, R&sub5;, R&sub6;, R&sub8; oder R&sub9; Valin ist (sind) und der Inhibitor gegenüber oxidativer Inaktivierung resistenter ist als der native Serinprotease-Inhibitor.

16. Serinprotease-Inhibitor nach Anspruch 9, worin ein oder mehrere Rest(e) aus R&sub2;, R&sub3;, R&sub4;, R&sub5;, R&sub6;, R&sub8; oder R&sub9; Alanin ist (sind) und der Inhibitor hinsichtlich der Hemmung von pankreatischer Elastase aktiver ist als der native Serinprotease-Inhibitor.

17. Serinprotease-Inhibitor nach Anspruch 9, worin ein oder mehrere Rest(e) aus R&sub2;, R&sub3;, R&sub4;, R&sub5;, R&sub6; und R&sub8; oder R&sub9; ausgewählt ist (sind) aus der Gruppe, bestehend aus Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan und der Inhibitor hinsichtlich der Hemmung von Kathepsin G aktiver ist als der native Serinprotease-Inhibitor.

18. Serinprotease-Inhibitor nach Anspruch 9, worin ein oder mehrere Rest(e) aus R&sub2;, R&sub3;, R&sub4;, R&sub5;, R&sub6;, R&sub8; oder R&sub9; ausgewählt ist (sind) aus der Gruppe, bestehend aus Lysin oder Arginin und der Inhibitor hinsichtlich der Hemmung-von Trypsin aktiver ist als der native Serinprotease-Inhibitor.

19. Gereinigter Serinprotease-Inhibitor, bestehend aus einer einzelnen unfragmentierten Polypeptidkette, wobei der Serinprotease-Inhibitor die Proteaseaktivität mindestens einer Serinprotease hemmt und die Aminosäuresequenz

Ser-Gly-Lys-Ser-Phe-Lys-Ala-Gly-Val-Cys-Pro- Pro-Lys-Lys-Ser-Ala-Gln-Cys-Leu-Arg-Tyr-Lys- Lys-Pro-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Trp-Gln-Cys-Pro- Gly-Lys-Lys-Arg-Cys-Cys-Pro-Asp-Thr-Cys-Gly- Ile-Lys-Cys-Leu-Asp-Pro-Val-Asp-Th r-Pro-Asn- Pro-Thr-Arg-Arg-Lys-Pro-Gly-Lys-Cys-Pro-Val- Thr-Tyr-Gly-Gln-Cys-Leu-Met-Leu-Asn-Pro-Pro- Asn-Phe-Cys-Glu-Met-Asp-Gly-Gln-Cys-Lys-Arg- Asp-Leu-Lys-Cys-Cys-Met-Gly-Met-Cys-Gly-Lys- Ser-Cys-Val-Ser-Pro-Val-Lys-Ala

umfaßt.

20 . Serinprotease-Inhibitor nach Anspruch 7 mit Glycin als Aminosäurerest 20, der Leukozyten-Elastase, jedoch nicht Trypsin, hemmt.

21. Serinprotease-Inhibitor nach Anspruch 7 mit Glycin als mindestens einem der Aminosäurereste 72, 73 und 74, der Trypsin, jedoch nicht Leukozyten-Elastase, hemmt.

22. Serinprotease-Inhibitor nach Anspruch 7 mit Prolin an mindestens einer der Aminosäurepositionen 1 und 107, der mindestens eine Serinprotease hemmt.

23. Serinprotease-Inhibitor nach einem der Ansprüche 1 bis 22, weiterhin umfassend ein Polypeptid, welches an den C- oder N-Terminus des Serinprotease-Inhibitors fusioniert ist, wobei das fusionierte Polypeptid verstärkte pharmakologische Wirksamkeit des Serinprotease-Inhibitors bedingt.

24. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend den Serinprotease-Inhibitor nach einem der Ansprüche 1 bis 23 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.

25. Zusammensetzung nach Anspruch 24, die in einer Form ist, die für eine Anwendung ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus oraler Anwendung, parenteraler Anwendung, lokaler Anwendung und aerosoler Anwendung geeignet ist.

26. Verwendung des Inhibitors nach einem der Ansprüche 1 bis 23 zum Herstellen eines Medikaments für die Hemmung proteolytischer Enzyme in einem Organismus.