JPH09278797A - サソリ毒素関連ペプチド - Google Patents
サソリ毒素関連ペプチドInfo
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- JPH09278797A JPH09278797A JP8118129A JP11812996A JPH09278797A JP H09278797 A JPH09278797 A JP H09278797A JP 8118129 A JP8118129 A JP 8118129A JP 11812996 A JP11812996 A JP 11812996A JP H09278797 A JPH09278797 A JP H09278797A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 新たなサソリ毒素関連ペプチドを提供し、サ
ソリ毒素の医薬等に対する応用に寄与する。 【解決手段】 中国産サソリ（Ｂｕｔｈｕｓ ｍａｒｔ
ｅｎｓｉ）の毒腺からＡｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ
−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−
Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａ
ｌａ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｙ
ｓ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ
で示され、分子内に３個のジスルフィド結合を有するペ
プチド他、計８種類のペプチドを単離した。 【効果】 本発明のペプチドは、Ｋ＋チャンネルに対す
る活性を、致死毒性から分離する可能性を示唆するもの
であり、サソリ毒素の医薬等に対する応用に寄与すると
考えられる。
ソリ毒素の医薬等に対する応用に寄与する。 【解決手段】 中国産サソリ（Ｂｕｔｈｕｓ ｍａｒｔ
ｅｎｓｉ）の毒腺からＡｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ
−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−
Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａ
ｌａ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｙ
ｓ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ
で示され、分子内に３個のジスルフィド結合を有するペ
プチド他、計８種類のペプチドを単離した。 【効果】 本発明のペプチドは、Ｋ＋チャンネルに対す
る活性を、致死毒性から分離する可能性を示唆するもの
であり、サソリ毒素の医薬等に対する応用に寄与すると
考えられる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は新規なペプチド性毒
素に関し、さらに詳細には、中国産サソリ（Ｂｕｔｈｕ
ｓ ｍａｒｔｅｎｓｉ）の毒腺から得られるサソリ毒素
関連ペプチドに関する。
素に関し、さらに詳細には、中国産サソリ（Ｂｕｔｈｕ
ｓ ｍａｒｔｅｎｓｉ）の毒腺から得られるサソリ毒素
関連ペプチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】サソリは蛛形綱サソリ目に属する節足動
物の総称であり、全世界に約６００種が生息する。サソ
リは一般に猛毒の動物であると考えられているが、実際
には致命的な毒素を持つサソリは種類が限られており、
例えば、アフリカの砂漠に生息するＢｕｔｈｕｓ ｕｓ
ｔｒａｌｉｓ，メキシコ産のＣｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓ
ｅｘｉｌｉｃａｕｄａや，南ヨーロッパ産のＢ．ｏｃｃ
ｉｔａｕｄａ等、数種にすぎない。また、現在までに、
種々のサソリ毒素が単離されており（Ｄｒｅｙｅｒ．
Ｆ． Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈ
ａｒｍａｃｏｌ．，１５巻 ９４−１２８頁 １９９０
年）、それらは神経毒であると考えられている。
物の総称であり、全世界に約６００種が生息する。サソ
リは一般に猛毒の動物であると考えられているが、実際
には致命的な毒素を持つサソリは種類が限られており、
例えば、アフリカの砂漠に生息するＢｕｔｈｕｓ ｕｓ
ｔｒａｌｉｓ，メキシコ産のＣｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓ
ｅｘｉｌｉｃａｕｄａや，南ヨーロッパ産のＢ．ｏｃｃ
ｉｔａｕｄａ等、数種にすぎない。また、現在までに、
種々のサソリ毒素が単離されており（Ｄｒｅｙｅｒ．
Ｆ． Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈ
ａｒｍａｃｏｌ．，１５巻 ９４−１２８頁 １９９０
年）、それらは神経毒であると考えられている。
【０００３】現在までに、単離構造決定されたサソリ毒
素の例としては、Ｃｈａｒｙｂｄｏｔｏｘｉｎｌ（Ｃｈ
ＴＸ，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃ．ら Ｎａｔｕｒｅ，３１３巻
３１６−３１８頁，１９８５年），Ｉｂｅｒｉｏｔｏ
ｘｉｎ（ＩｂＴＸ，Ｇａｌｖｅｚ．Ａ．ら，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５巻 １９号 １１０８３−１１
０９０頁， １９９０年），Ｋａｌｉｏｔｏｘｉｎ（Ｋ
ＴＸ，Ｒｏｍｉ．Ｒ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，
２６８巻 ３５号 ２６３０２−２６３０９頁， １９
９３年）およびＭａｒｇａｔｏｘｉｎ（ＭｇＴＸ，Ｂｅ
ｎｄｎａｒｒｅｋ．Ｍ．ら，ＢＢＲＣ，１９８巻 ６１
９頁 １９９４年）等が知られており、これらの毒素の
生理作用として、特にＫ＋チャンネルに対する作用が注
目されている。
素の例としては、Ｃｈａｒｙｂｄｏｔｏｘｉｎｌ（Ｃｈ
ＴＸ，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃ．ら Ｎａｔｕｒｅ，３１３巻
３１６−３１８頁，１９８５年），Ｉｂｅｒｉｏｔｏ
ｘｉｎ（ＩｂＴＸ，Ｇａｌｖｅｚ．Ａ．ら，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５巻 １９号 １１０８３−１１
０９０頁， １９９０年），Ｋａｌｉｏｔｏｘｉｎ（Ｋ
ＴＸ，Ｒｏｍｉ．Ｒ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，
２６８巻 ３５号 ２６３０２−２６３０９頁， １９
９３年）およびＭａｒｇａｔｏｘｉｎ（ＭｇＴＸ，Ｂｅ
ｎｄｎａｒｒｅｋ．Ｍ．ら，ＢＢＲＣ，１９８巻 ６１
９頁 １９９４年）等が知られており、これらの毒素の
生理作用として、特にＫ＋チャンネルに対する作用が注
目されている。
【０００４】これらのペプチド毒素は、一次構造に高い
相同性を示すにも係わらず、Ｋ＋チャンネルに対して全
く異なった作用を示すものもあり、これらのペプチド毒
素を医薬等に応用するには、より多くのペプチド毒素を
単離し、構造活性相関を研究する必要があった。このよ
うな現状に鑑み、新たなサソリ毒素関連ペプチドを提供
し、サソリ毒素の医薬等に対する応用に寄与すること
が、本発明が解決すべき課題である。
相同性を示すにも係わらず、Ｋ＋チャンネルに対して全
く異なった作用を示すものもあり、これらのペプチド毒
素を医薬等に応用するには、より多くのペプチド毒素を
単離し、構造活性相関を研究する必要があった。このよ
うな現状に鑑み、新たなサソリ毒素関連ペプチドを提供
し、サソリ毒素の医薬等に対する応用に寄与すること
が、本発明が解決すべき課題である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、中国産サ
ソリ（Ｂ．ｍａｒｔｅｎｓｉ）の毒腺から、新たなサソ
リ毒素関連ペプチドを単離すべく鋭意研究を行い、ＢＭ
Ｐ（Ｂｕｔｈｕｓ ｍａｒｔｅｎｓｉ ｐｅｐｔｉｄ
ｅ）１〜８と命名した、配列番号１〜７で表されるペプ
チドを単離・精製し、その構造を決定して本発明を完成
した。すなわち、本発明によれば、配列番号１〜７で表
されるペプチドをサソリ毒素関連ペプチドとして提供す
ることができる。
ソリ（Ｂ．ｍａｒｔｅｎｓｉ）の毒腺から、新たなサソ
リ毒素関連ペプチドを単離すべく鋭意研究を行い、ＢＭ
Ｐ（Ｂｕｔｈｕｓ ｍａｒｔｅｎｓｉ ｐｅｐｔｉｄ
ｅ）１〜８と命名した、配列番号１〜７で表されるペプ
チドを単離・精製し、その構造を決定して本発明を完成
した。すなわち、本発明によれば、配列番号１〜７で表
されるペプチドをサソリ毒素関連ペプチドとして提供す
ることができる。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明のペプチドは、例えば、中
国産サソリ（Ｂ．ｍａｒｔｅｎｓｉ）をはじめ、本発明
のペプチドを含有するサソリから毒腺を摘出し、これを
例えば０．５Ｍ程度の酢酸でペプチドを抽出して粗抽出
物を得る。この粗抽出物から、通常、ペプチド精製に用
いられるイオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマト
グラフィー等を用いて分離・精製することにより得るこ
とができる。
国産サソリ（Ｂ．ｍａｒｔｅｎｓｉ）をはじめ、本発明
のペプチドを含有するサソリから毒腺を摘出し、これを
例えば０．５Ｍ程度の酢酸でペプチドを抽出して粗抽出
物を得る。この粗抽出物から、通常、ペプチド精製に用
いられるイオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマト
グラフィー等を用いて分離・精製することにより得るこ
とができる。
【０００７】本発明のペプチドには、（１）アミノ酸配
列から、分子内に６個のＣｙｓ残基が存在すること。
（２）質量分析のデータから、ペプチドが単量体で存在
すること。（３）得られた分子量のデータが、分子内に
３個のジスルフィド結合が存在するとして計算した分子
量のデータと一致すること。以上の３点から、分子内に
３個のジスルフィド結合が存在することが明らかであ
る。
列から、分子内に６個のＣｙｓ残基が存在すること。
（２）質量分析のデータから、ペプチドが単量体で存在
すること。（３）得られた分子量のデータが、分子内に
３個のジスルフィド結合が存在するとして計算した分子
量のデータと一致すること。以上の３点から、分子内に
３個のジスルフィド結合が存在することが明らかであ
る。
【０００８】本発明のペプチドにおける３個のジスルフ
ィド結合の存在箇所は、未だ同定されていない。しか
し、本発明のペプチドは、ジスルフィド結合を含まない
ペプチドを合成した後、酸化反応により無作為に３個の
ジスルフィド結合を導入し、これらのペプチドから、天
然体と一致するペプチドを精製することにより得ること
ができる。
ィド結合の存在箇所は、未だ同定されていない。しか
し、本発明のペプチドは、ジスルフィド結合を含まない
ペプチドを合成した後、酸化反応により無作為に３個の
ジスルフィド結合を導入し、これらのペプチドから、天
然体と一致するペプチドを精製することにより得ること
ができる。
【０００９】ジスルフィド結合を含まないペプチドの合
成には、通常のペプチド合成機（例えばパーキン・エル
マー社製ペプチド合成機４３１Ａ型）を用いる固相法に
よるのが簡便であり、ジスルフィド結合の導入には、空
気酸化、フェリシアン化カリウムによる酸化（Ｈｏｐｅ
ら Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３７巻 １５６３−１
５６６頁 １９６２年）等の酸化反応を用いることがで
きる。また、ジスルフィド結合を導入したペプチドか
ら、天然体と一致するペプチドを精製するには、例えば
Ｃ−１８逆相高速液体クロマトグラフィー（Ｃ−１８Ｈ
ＰＬＣ）で、保持時間が天然体と一致する画分を単離す
る方法を用いることができる。
成には、通常のペプチド合成機（例えばパーキン・エル
マー社製ペプチド合成機４３１Ａ型）を用いる固相法に
よるのが簡便であり、ジスルフィド結合の導入には、空
気酸化、フェリシアン化カリウムによる酸化（Ｈｏｐｅ
ら Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３７巻 １５６３−１
５６６頁 １９６２年）等の酸化反応を用いることがで
きる。また、ジスルフィド結合を導入したペプチドか
ら、天然体と一致するペプチドを精製するには、例えば
Ｃ−１８逆相高速液体クロマトグラフィー（Ｃ−１８Ｈ
ＰＬＣ）で、保持時間が天然体と一致する画分を単離す
る方法を用いることができる。
【００１０】上記の合成法によれば、一次構造が同一で
ありながら、ジスルフィド結合の数および様式が、天然
体とは異なるペプチドも得ることができる。しかし、こ
れらのペプチドも、本発明のペプチドと同様の生理活性
を有する限りにおいて、本発明に使用することができ
る。
ありながら、ジスルフィド結合の数および様式が、天然
体とは異なるペプチドも得ることができる。しかし、こ
れらのペプチドも、本発明のペプチドと同様の生理活性
を有する限りにおいて、本発明に使用することができ
る。
【００１１】
【作用】本発明のペプチドの内、ＢＭＰ１〜４は、Ｌｅ
ｉＩ（Ａｕｇｕｓｔｅら Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
６５巻 ４７５３−４７５９頁 １９９０年）との相同
性から、アパミン感受性の低コンダクタンス性カルシウ
ム活性化Ｋ＋チャンネルに作用するものと考えられる。
また、ＢＭＰ５〜７は、ＣｈＴＸおよびＩｂＴＸ（文献
既出）との関連性から、高コンダクタンス性カルシウム
活性化Ｋ＋チャンネルまたは、電圧開閉性Ｋ＋チャンネ
ルに作用するものと考えられる。
ｉＩ（Ａｕｇｕｓｔｅら Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
６５巻 ４７５３−４７５９頁 １９９０年）との相同
性から、アパミン感受性の低コンダクタンス性カルシウ
ム活性化Ｋ＋チャンネルに作用するものと考えられる。
また、ＢＭＰ５〜７は、ＣｈＴＸおよびＩｂＴＸ（文献
既出）との関連性から、高コンダクタンス性カルシウム
活性化Ｋ＋チャンネルまたは、電圧開閉性Ｋ＋チャンネ
ルに作用するものと考えられる。
【００１２】本発明のペプチドの毒性は意外に低く、後
記評価例に示すように、１μｇ／マウスの大脳脳室内投
与で、ＢＭＰ１，ＢＭＰ２およびＢＭＰ３は、何ら毒性
を示さなかった。またＢＭＰ５は、この投与量で僅かな
毒性しか示さなかった。さらにＢＭＰ６およびＢＭＰ８
は、２５０ｎｇ／マウスの投与量で、何ら毒性を示さな
かった。これに対して、ＢＭＰ４およびＢＭＰ７は、３
０ｎｇ／マウスの投与量で、神経興奮症状と致死活性を
示し、これらのペプチドの毒性は、先に本発明者らによ
って報告されたＫＴＸ（Ｒ．Ｒｏｍｉら，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．文献前出）の毒性とほぼ同様であった。
記評価例に示すように、１μｇ／マウスの大脳脳室内投
与で、ＢＭＰ１，ＢＭＰ２およびＢＭＰ３は、何ら毒性
を示さなかった。またＢＭＰ５は、この投与量で僅かな
毒性しか示さなかった。さらにＢＭＰ６およびＢＭＰ８
は、２５０ｎｇ／マウスの投与量で、何ら毒性を示さな
かった。これに対して、ＢＭＰ４およびＢＭＰ７は、３
０ｎｇ／マウスの投与量で、神経興奮症状と致死活性を
示し、これらのペプチドの毒性は、先に本発明者らによ
って報告されたＫＴＸ（Ｒ．Ｒｏｍｉら，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．文献前出）の毒性とほぼ同様であった。
【００１３】これらのデータは、本発明のサソリ毒素関
連ペプチドが、Ｋ＋チャンネルに対する活性と、致死毒
性とを分離できる可能性を示唆するものであり、サソリ
毒素関連ペプチドの神経生理学における生化学試薬とし
ての用途のみならず、医薬、動物薬への応用も示唆する
ものと考えられる。
連ペプチドが、Ｋ＋チャンネルに対する活性と、致死毒
性とを分離できる可能性を示唆するものであり、サソリ
毒素関連ペプチドの神経生理学における生化学試薬とし
ての用途のみならず、医薬、動物薬への応用も示唆する
ものと考えられる。
【００１４】
【実施例】次に実施例によって本発明をさらに説明する
が、本発明の範囲はこれらのみに限定されるものではな
い。
が、本発明の範囲はこれらのみに限定されるものではな
い。
【００１５】実施例１．ＢＭＰ１の精製 ａ．粗抽出 中国産サソリの毒腺の凍結乾燥物３００ｍｇを約１５ｍ
１の０．５Ｍ酢酸でホモジナイズし、３，０００×ｇで
２０分間遠心分離した。沈殿は同様にホモジナイズ後遠
心分離する操作を３回繰り返し、得られた上清を孔径
０．４５μｍのフィルターで濾過して、粗抽出液を得
た。
１の０．５Ｍ酢酸でホモジナイズし、３，０００×ｇで
２０分間遠心分離した。沈殿は同様にホモジナイズ後遠
心分離する操作を３回繰り返し、得られた上清を孔径
０．４５μｍのフィルターで濾過して、粗抽出液を得
た。
【００１６】ｂ．逆相カラムクロマトグラフィー（１） ａ．で得られた粗抽出液の原料換算６０ｍｇ分を１バッ
チとして、Ｃａｐｃｅ１１ ｐａｋ Ｃ１８ ＳＧ−１
２０（資生堂，φ１０×２５０ｍｍ）を用いるＣ−１８
ＨＰＬＣに付し、流速３ｍｌ／ｍｉｎで、０．１％ＴＦ
Ａ（ｐＨ２．２）中、１０２分間で０％から４５％のア
セトニトリルの直線濃度勾配で溶出した。２３０ｎｍの
ＵＶ吸収でモニターしながら、ピークを示す画分を３６
フラクションを分画した。
チとして、Ｃａｐｃｅ１１ ｐａｋ Ｃ１８ ＳＧ−１
２０（資生堂，φ１０×２５０ｍｍ）を用いるＣ−１８
ＨＰＬＣに付し、流速３ｍｌ／ｍｉｎで、０．１％ＴＦ
Ａ（ｐＨ２．２）中、１０２分間で０％から４５％のア
セトニトリルの直線濃度勾配で溶出した。２３０ｎｍの
ＵＶ吸収でモニターしながら、ピークを示す画分を３６
フラクションを分画した。
【００１７】ｃ．陽イオン交換カラムクロマトグラフィ
ー ｂ．で得られた保持時間３７分の画分を、をＴＳＫ−ｇ
ｅｌ ＳＰ−５ＰＷ（東ソー，φ７．５×７５ｍｍ）を
用いる陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに付し、
流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで、１０ｍＭリン酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ６．８）中、２０分間で０Ｍから０．６５
ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出した。２３０ｎｍの
ＵＶ吸収でモニターしながら分画し、ＮａＣｌ濃度１６
２ｍＭで溶出される画分を得た。
ー ｂ．で得られた保持時間３７分の画分を、をＴＳＫ−ｇ
ｅｌ ＳＰ−５ＰＷ（東ソー，φ７．５×７５ｍｍ）を
用いる陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに付し、
流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで、１０ｍＭリン酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ６．８）中、２０分間で０Ｍから０．６５
ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出した。２３０ｎｍの
ＵＶ吸収でモニターしながら分画し、ＮａＣｌ濃度１６
２ｍＭで溶出される画分を得た。
【００１８】ｄ．逆相カラムクロマトグラフィー（２） ｃ．で得られた画分を、１００Ａ Ｃ１８逆相ＨＰＬＣ
カラム（メルク，φ４×１２５ｍｍ）を用いるＣ−１８
ＨＰＬＣに付し、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで、０．１％
ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中、２０分間で０％から４０％の
アセトニトリルの直線濃度勾配で、２３０ｎｍのＵＶ吸
収でモニターしながら溶出した。ＢＭＰ１はアセトニト
リル３０％の箇所にシングルピークとして溶出された。
この分画を集めて凍結乾燥し、０．８ｍｇのＢＭＰ１を
得た。
カラム（メルク，φ４×１２５ｍｍ）を用いるＣ−１８
ＨＰＬＣに付し、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで、０．１％
ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中、２０分間で０％から４０％の
アセトニトリルの直線濃度勾配で、２３０ｎｍのＵＶ吸
収でモニターしながら溶出した。ＢＭＰ１はアセトニト
リル３０％の箇所にシングルピークとして溶出された。
この分画を集めて凍結乾燥し、０．８ｍｇのＢＭＰ１を
得た。
【００１９】実施例２．ＢＭＰ２の精製 実施例１のステップｂ．で得られた保持時間３９．６分
の画分を、実施例１のｃと同様にＴＳＫ−ｇｅｌ ＳＰ
−５ＰＷを用いる陽イオン交換カラムクロマトグラフィ
ーに付し、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで、１０ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）中、８０分間で０Ｍか
ら０．８０ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出した。２
３０ｎｍのＵＶ吸収でモニターしながら分画し、ＮａＣ
ｌ濃度４５ｍＭで溶出される画分を得た。
の画分を、実施例１のｃと同様にＴＳＫ−ｇｅｌ ＳＰ
−５ＰＷを用いる陽イオン交換カラムクロマトグラフィ
ーに付し、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで、１０ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）中、８０分間で０Ｍか
ら０．８０ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出した。２
３０ｎｍのＵＶ吸収でモニターしながら分画し、ＮａＣ
ｌ濃度４５ｍＭで溶出される画分を得た。
【００２０】この画分を、実施例１のステップｄ．と同
様に、１００Ａ Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラムを用いるＣ
−１８ＨＰＬＣに付し、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで、
０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中、４０分間で１０％か
ら２０％のアセトニトリルの直線濃度勾配で、２３０ｎ
ｍのＵＶ吸収でモニターしながら溶出した。ＢＭＰ２は
アセトニトリル１５％の箇所にシングルピークとして溶
出された。この分画を集めて凍結乾燥し、０．３ｍｇの
ＢＭＰ２を得た。
様に、１００Ａ Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラムを用いるＣ
−１８ＨＰＬＣに付し、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで、
０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中、４０分間で１０％か
ら２０％のアセトニトリルの直線濃度勾配で、２３０ｎ
ｍのＵＶ吸収でモニターしながら溶出した。ＢＭＰ２は
アセトニトリル１５％の箇所にシングルピークとして溶
出された。この分画を集めて凍結乾燥し、０．３ｍｇの
ＢＭＰ２を得た。
【００２１】実施例３．ＢＭＰ３の精製 実施例１のステップｂ．で得られた保持時間４１．６分
の画分を、実施例１のｃと同様にＴＳＫ−ｇｅｌ ＳＰ
−５ＰＷを用いる陽イオン交換カラムクロマトグラフィ
ーに付し、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで、１０ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）中、８０分間で０Ｍか
ら０．８０ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出した。２
３０ｎｍのＵＶ吸収でモニターしながら分画し、ＮａＣ
ｌ濃度１８０ｍＭで溶出される画分を得た。
の画分を、実施例１のｃと同様にＴＳＫ−ｇｅｌ ＳＰ
−５ＰＷを用いる陽イオン交換カラムクロマトグラフィ
ーに付し、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで、１０ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）中、８０分間で０Ｍか
ら０．８０ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出した。２
３０ｎｍのＵＶ吸収でモニターしながら分画し、ＮａＣ
ｌ濃度１８０ｍＭで溶出される画分を得た。
【００２２】この画分を、実施例１のステップｄ．と同
様に、１００Ａ Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラムを用いるＣ
−１８ＨＰＬＣに付し、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで、
０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中、２０分間で５％から
４０％のアセトニトリルの直線濃度勾配で、２３０ｎｍ
のＵＶ吸収でモニターしながら溶出した。ＢＭＰ３はア
セトニトリル２４．５％の箇所にシングルピークとして
溶出された。この分画を集めて凍結乾燥し、０．２７ｍ
ｇのＢＭＰ３を得た。
様に、１００Ａ Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラムを用いるＣ
−１８ＨＰＬＣに付し、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで、
０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中、２０分間で５％から
４０％のアセトニトリルの直線濃度勾配で、２３０ｎｍ
のＵＶ吸収でモニターしながら溶出した。ＢＭＰ３はア
セトニトリル２４．５％の箇所にシングルピークとして
溶出された。この分画を集めて凍結乾燥し、０．２７ｍ
ｇのＢＭＰ３を得た。
【００２３】実施例４．ＢＭＰ４の精製 実施例１のステップｂ．で得られた保持時間４４．６〜
４６分の画分を、実施例１のｃと同様にＴＳＫ−ｇｅｌ
ＳＰ−５ＰＷを用いる陽イオン交換カラムクロマトグ
ラフィーに付し、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで、１０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）中、８０分間で
０Ｍから０．６４Ｍ（７）ＮａＣｌの直線濃度勾配で溶
出した。２３０ｎｍｎのＵＶ吸収でモニターしながら分
画し、ＮａＣｌ濃度５１０ｍＭで溶出される画分を得
た。
４６分の画分を、実施例１のｃと同様にＴＳＫ−ｇｅｌ
ＳＰ−５ＰＷを用いる陽イオン交換カラムクロマトグ
ラフィーに付し、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで、１０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）中、８０分間で
０Ｍから０．６４Ｍ（７）ＮａＣｌの直線濃度勾配で溶
出した。２３０ｎｍｎのＵＶ吸収でモニターしながら分
画し、ＮａＣｌ濃度５１０ｍＭで溶出される画分を得
た。
【００２４】この画分を、実施例１のステップｄ．と同
様に、１００Ａ Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラムを用いるＣ
−１８ＨＰＬＣに付し、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで、
０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中、２０分間で５％から
４０％のアセトニトリルの直線濃度勾配で、２３０ｎｍ
のＵＶ吸収でモニターしながら溶出した。ＢＭＰ４はア
セトニトリル２３％の箇所にシングルピークとして溶出
された。この分画を集めて凍結乾燥し、３０μｇのＢＭ
Ｐ４を得た。
様に、１００Ａ Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラムを用いるＣ
−１８ＨＰＬＣに付し、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで、
０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中、２０分間で５％から
４０％のアセトニトリルの直線濃度勾配で、２３０ｎｍ
のＵＶ吸収でモニターしながら溶出した。ＢＭＰ４はア
セトニトリル２３％の箇所にシングルピークとして溶出
された。この分画を集めて凍結乾燥し、３０μｇのＢＭ
Ｐ４を得た。
【００２５】実施例５．ＢＭＰ５の精製 実施例１のステップｂ．で得られた保持時間４６〜４８
分の画分を、実施例１のｃと同様にＴＳＫ−ｇｅｌ Ｓ
Ｐ−５ＰＷを用いる陽イオン交換カラムクロマトグラフ
ィーに付し、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで、１０ｍＭリン
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）中、８０分間で０Ｍ
から０．８０ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出した。
２３０ｎｍのＵＶ吸収でモニターしながら分画し、Ｎａ
Ｃｌ濃度１８０ｍＭで溶出される画分を得た。
分の画分を、実施例１のｃと同様にＴＳＫ−ｇｅｌ Ｓ
Ｐ−５ＰＷを用いる陽イオン交換カラムクロマトグラフ
ィーに付し、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで、１０ｍＭリン
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）中、８０分間で０Ｍ
から０．８０ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出した。
２３０ｎｍのＵＶ吸収でモニターしながら分画し、Ｎａ
Ｃｌ濃度１８０ｍＭで溶出される画分を得た。
【００２６】この画分を、実施例１のステップｄ．と同
様に、１００Ａ Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラムを用いるＣ
−１８ＨＰＬＣに付し、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで、
０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中、３５分間で５％から
４０％のアセトニトリルの直線濃度勾配で、２３０ｎｍ
のＵＶ吸収でモニターしながら溶出した。ＢＭＰ５はア
セトニトリル２５．２％の箇所にシングルピークとして
溶出された。この分画を集めて凍結乾燥し、０．１６ｍ
ｇのＢＭＰ５を得た。
様に、１００Ａ Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラムを用いるＣ
−１８ＨＰＬＣに付し、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで、
０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中、３５分間で５％から
４０％のアセトニトリルの直線濃度勾配で、２３０ｎｍ
のＵＶ吸収でモニターしながら溶出した。ＢＭＰ５はア
セトニトリル２５．２％の箇所にシングルピークとして
溶出された。この分画を集めて凍結乾燥し、０．１６ｍ
ｇのＢＭＰ５を得た。
【００２７】実施例６．ＢＭＰ６の精製 実施例１のステップｂ．で得られた保持時間４８〜５
０．５分の画分を、実施例１のｃと同様にＴＳＫ−ｇｅ
ｌ ＳＰ−５ＰＷを用いる陽イオン交換カラムクロマト
グラフィーに付し、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで、１０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）中、８０分間
で０Ｍから０．８０ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出
した。２３０ｎｍｎのＵＶ吸収でモニターしながら分画
し、ＮａＣｌ濃度４９０ｍＭで溶出される画分を得た。
０．５分の画分を、実施例１のｃと同様にＴＳＫ−ｇｅ
ｌ ＳＰ−５ＰＷを用いる陽イオン交換カラムクロマト
グラフィーに付し、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで、１０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）中、８０分間
で０Ｍから０．８０ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出
した。２３０ｎｍｎのＵＶ吸収でモニターしながら分画
し、ＮａＣｌ濃度４９０ｍＭで溶出される画分を得た。
【００２８】この画分を、実施例１のステップｄ．と同
様に、１００Ａ Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラムを用いるＣ
−１８ＨＰＬＣに付し、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで、
０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中、２０分間で５％から
４０％のアセトニトリルの直線濃度勾配で、２３０ｎｍ
のＵＶ吸収でモニターしながら溶出した。ＢＭＰ６はア
セトニトリル３１．３％の箇所にシングルピークとして
溶出された。この分画を集めて凍結乾燥し、０．１６ｍ
ｇのＢＭＰ６を得た。
様に、１００Ａ Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラムを用いるＣ
−１８ＨＰＬＣに付し、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで、
０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中、２０分間で５％から
４０％のアセトニトリルの直線濃度勾配で、２３０ｎｍ
のＵＶ吸収でモニターしながら溶出した。ＢＭＰ６はア
セトニトリル３１．３％の箇所にシングルピークとして
溶出された。この分画を集めて凍結乾燥し、０．１６ｍ
ｇのＢＭＰ６を得た。
【００２９】実施例７．ＢＭＰ７の精製 実施例１のステップｂ．で得られた保持時間４２〜４
４．６分の画分を、実施例１のｃと同様にＴＳＫ−ｇｅ
ｌ ＳＰ−５ＰＷを用いる陽イオン交換カラムクロマト
グラフィーに付し、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで、１０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）中、８０分間
で０Ｍから０．８０ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出
した。２３０ｎｍのＵＶ吸収でモニターしながら分画
し、ＮａＣｌ濃度５７０ｍＭで溶出される画分を得た。
４．６分の画分を、実施例１のｃと同様にＴＳＫ−ｇｅ
ｌ ＳＰ−５ＰＷを用いる陽イオン交換カラムクロマト
グラフィーに付し、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで、１０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）中、８０分間
で０Ｍから０．８０ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出
した。２３０ｎｍのＵＶ吸収でモニターしながら分画
し、ＮａＣｌ濃度５７０ｍＭで溶出される画分を得た。
【００３０】この画分を、実施例１のステップｄ．と同
様に、１００Ａ Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラムを用いるＣ
−１８ＨＰＬＣに付し、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで、
０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中、２０分間で５％から
４０％のアセトニトリルの直線濃度勾配で、２３０ｎｍ
のＵＶ吸収でモニターしながら溶出した。ＢＭＰ７はア
セトニトリル２５．２％の箇所にシングルピークとして
溶出された。この分画を集めて凍結乾燥し、６０μｇの
ＢＭＰ７を得た。
様に、１００Ａ Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラムを用いるＣ
−１８ＨＰＬＣに付し、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで、
０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中、２０分間で５％から
４０％のアセトニトリルの直線濃度勾配で、２３０ｎｍ
のＵＶ吸収でモニターしながら溶出した。ＢＭＰ７はア
セトニトリル２５．２％の箇所にシングルピークとして
溶出された。この分画を集めて凍結乾燥し、６０μｇの
ＢＭＰ７を得た。
【００３１】実施例８．ＢＭＰ８の精製 実施例１のステップｂ．で得られた保持時間４８〜５
０．５分の画分を、実施例１のｃと同様にＴＳＫ−ｇｅ
ｌ ＳＰ−５ＰＷを用いる陽イオン交換カラムクロマト
グラフィーに付し、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで、１０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）中、８０分間
で０Ｍから０．８０ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出
した。２３０ｎｍのＵＶ吸収でモニターしながら分画
し、ＮａＣｌ濃度６０ｍＭで溶出される画分を得た。
０．５分の画分を、実施例１のｃと同様にＴＳＫ−ｇｅ
ｌ ＳＰ−５ＰＷを用いる陽イオン交換カラムクロマト
グラフィーに付し、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで、１０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）中、８０分間
で０Ｍから０．８０ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出
した。２３０ｎｍのＵＶ吸収でモニターしながら分画
し、ＮａＣｌ濃度６０ｍＭで溶出される画分を得た。
【００３２】この画分を、実施例１のステップｄ．と同
様に、１００Ａ Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラムを用いるＣ
−１８ＨＰＬＣに付し、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで、
０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中、２０分間で５％から
４０％のアセトニトリルの直線濃度勾配で、２３０ｎｍ
のＵＶ吸収でモニターしながら溶出した。ＢＭＰ８はア
セトニトリル２５．５％の箇所にシングルピークとして
溶出された。この分画を集めて凍結乾燥し、８０μｇの
ＢＭＰ８を得た。
様に、１００Ａ Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラムを用いるＣ
−１８ＨＰＬＣに付し、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで、
０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中、２０分間で５％から
４０％のアセトニトリルの直線濃度勾配で、２３０ｎｍ
のＵＶ吸収でモニターしながら溶出した。ＢＭＰ８はア
セトニトリル２５．５％の箇所にシングルピークとして
溶出された。この分画を集めて凍結乾燥し、８０μｇの
ＢＭＰ８を得た。
【００３３】実施例９．アミノ酸組成の決定 得られたＢＭＰ１〜８をそれぞれ、減圧下封管中に定沸
点６Ｎ−ＨＣｌを用いて１１０℃，２０時間処理して加
水分解し、アミノ酸分析器を用いてアミノ酸組成を測定
した。得られたＣｙｓ残基を除くアミノ酸組成を、〔表
１〕および〔表２〕に示す。
点６Ｎ−ＨＣｌを用いて１１０℃，２０時間処理して加
水分解し、アミノ酸分析器を用いてアミノ酸組成を測定
した。得られたＣｙｓ残基を除くアミノ酸組成を、〔表
１〕および〔表２〕に示す。
【００３４】
【表１】
【００３５】
【表２】
【００３６】実施例１０．アミノ酸配列の決定 ａ．ジスルフィド結合の還元と修飾 ＢＭＰ１〜５およびＢＭＰ７は、２０％のｎ−プロパノ
ールを含む０．５Ｍ重炭酸バッファー（ｐＨ８．３）
中、ジスルフィド結合に対して５当量のトリブチルホス
フィンと、トリブチルホスフィンに対して２当量の４−
ビニルピリジンを用いて、窒素気流中、３７℃で遮光下
に２時間反応させて、Ｃｙｓ残基をＳ−ピリジルエチル
化（ＰＥ化と略記する）した。得られたＰＥ化ペプチド
は、Ｃ−１８ＨＰＬＣで精製した。
ールを含む０．５Ｍ重炭酸バッファー（ｐＨ８．３）
中、ジスルフィド結合に対して５当量のトリブチルホス
フィンと、トリブチルホスフィンに対して２当量の４−
ビニルピリジンを用いて、窒素気流中、３７℃で遮光下
に２時間反応させて、Ｃｙｓ残基をＳ−ピリジルエチル
化（ＰＥ化と略記する）した。得られたＰＥ化ペプチド
は、Ｃ−１８ＨＰＬＣで精製した。
【００３７】ＢＭＰ６および８は、５Ｍ塩酸グアニジン
を含む２５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）
中、スルフィド結合に対して６０当量のジチオスレイト
ールで窒素気流下に３７℃で１６時間還元した後、ジチ
オスレイトールに対して１．５当量のヨード酢酸ナトリ
ウムと、室温で２０分反応させて、Ｃｙｓ残基をＳ−カ
ルボキシメチル化（ＣＭ化と略記する）した。得られた
ＣＭ化ペプチドは、同様にＣ−１８ＨＰＬＣで精製し
た。
を含む２５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）
中、スルフィド結合に対して６０当量のジチオスレイト
ールで窒素気流下に３７℃で１６時間還元した後、ジチ
オスレイトールに対して１．５当量のヨード酢酸ナトリ
ウムと、室温で２０分反応させて、Ｃｙｓ残基をＳ−カ
ルボキシメチル化（ＣＭ化と略記する）した。得られた
ＣＭ化ペプチドは、同様にＣ−１８ＨＰＬＣで精製し
た。
【００３８】ｂ．アミノ酸配列の決定 ステップａ．で得られたＰＥ化ペプチドおよびＣＭ化ペ
プチドは、島津ＰＳＱ１０型アミノ酸シーケンサー（島
津製作所）を用いてアミノ酸配列を決定した。その結
果、ＢＭＰ１は配列番号１のアミノ酸配列で示されるペ
プチド、ＢＭＰ２は配列番号２のアミノ酸配列におい
て、ＸａａがＬｙｓ残基であるペプチド、ＢＭＰ３は配
列番号２のアミノ酸配列において、ＸａａがＡｓｎ残基
であるペプチド、ＢＭＰ４は配列番号３のアミノ酸配列
で示されるペプチド、ＢＭＰ５は配列番号４のアミノ酸
配列で示されるペプチド、ＢＭＰ７は配列番号６のアミ
ノ酸配列で示されるペプチド、ＢＭＰ８は配列番号７の
アミノ酸配列で示されるペプチドであることが判明し
た。
プチドは、島津ＰＳＱ１０型アミノ酸シーケンサー（島
津製作所）を用いてアミノ酸配列を決定した。その結
果、ＢＭＰ１は配列番号１のアミノ酸配列で示されるペ
プチド、ＢＭＰ２は配列番号２のアミノ酸配列におい
て、ＸａａがＬｙｓ残基であるペプチド、ＢＭＰ３は配
列番号２のアミノ酸配列において、ＸａａがＡｓｎ残基
であるペプチド、ＢＭＰ４は配列番号３のアミノ酸配列
で示されるペプチド、ＢＭＰ５は配列番号４のアミノ酸
配列で示されるペプチド、ＢＭＰ７は配列番号６のアミ
ノ酸配列で示されるペプチド、ＢＭＰ８は配列番号７の
アミノ酸配列で示されるペプチドであることが判明し
た。
【００３９】ｃ．ピログルタミン酸アミノペプチダーゼ
処理 しかし、ＣＭ化ＢＭＰ６は通常のエドマン分解に抵抗性
であった。未処理のＢＭＰ６の質量値は、ＭＳ−ＭＡＬ
ＤＩ−ＴＯＦによれば、３７５０．０１Ｄａであり、こ
のデータは、表２に示すアミノ酸組成に６個のＣｙｓ残
基と３個のジスルフィド結合を仮定して計算した質量
値、３７６８．３Ｄａより、１８Ｄａ少なかった。これ
らのデータから、ＢＭＰ６のＮ末端はピログルタミル化
されていると想定されたので、ギムネ・ガレゴら（Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５巻
３３２９−３３３３頁，１９８８年）の方法に従って、
ピログルタミン酸アミノペプチダーゼ処理を行った。
処理 しかし、ＣＭ化ＢＭＰ６は通常のエドマン分解に抵抗性
であった。未処理のＢＭＰ６の質量値は、ＭＳ−ＭＡＬ
ＤＩ−ＴＯＦによれば、３７５０．０１Ｄａであり、こ
のデータは、表２に示すアミノ酸組成に６個のＣｙｓ残
基と３個のジスルフィド結合を仮定して計算した質量
値、３７６８．３Ｄａより、１８Ｄａ少なかった。これ
らのデータから、ＢＭＰ６のＮ末端はピログルタミル化
されていると想定されたので、ギムネ・ガレゴら（Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５巻
３３２９−３３３３頁，１９８８年）の方法に従って、
ピログルタミン酸アミノペプチダーゼ処理を行った。
【００４０】ｄ．アミノ酸配列の決定 ステップｃ．で得られた処理ペプチドを、ステップｂと
同様に分析し、配列番号５のアミノ酸配列の２番目のア
ミノ酸以下の配列が決定された。これらのことから、Ｂ
ＭＰ６は配列番号５のアミノ酸配列で示されるペプチド
であることが判明した。
同様に分析し、配列番号５のアミノ酸配列の２番目のア
ミノ酸以下の配列が決定された。これらのことから、Ｂ
ＭＰ６は配列番号５のアミノ酸配列で示されるペプチド
であることが判明した。
【００４１】ｅ．分子量の測定 未処理ＢＭＰの分子量は、ＭＳ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦに
より測定した。結果を〔表３〕に示すが、これらの分子
量は、上記で決定されたアミノ酸配列から計算された分
子量と良く一致した。これらのデータは、配列番号１〜
７の配列を支持するものである。
より測定した。結果を〔表３〕に示すが、これらの分子
量は、上記で決定されたアミノ酸配列から計算された分
子量と良く一致した。これらのデータは、配列番号１〜
７の配列を支持するものである。
【００４２】
【表３】
【００４３】実施例１１．固相法によるペプチドの合成 ＢＭＰ４およびＢＭＰ７の合成は、それぞれ配列番号３
および配列番号６のアミノ酸配列に従って、パーキン・
エルマー社の全自動ペプチド合成機４３３Ａ型を用い
て、ＦａｓｔＭｏｃＴＭの固相法により合成した。ペプ
チド樹脂からのペプチドの切り放しと粗ペプチドの脱保
護は、ＴＦＡ／チオアニソール／１，２−エタンジオー
ル（９０／５／５，ｖ／ｖ）混合液を、ペプチド樹脂１
ｍｇ当たり１０ｍｌ加えた後、室温で２．５時間処理す
ることにより行った。反応液を濾過し、濾液にエーテル
を加えてペプチドを沈澱させた後、沈澱をエーテルで３
回洗浄した。次いで得られた沈殿をＴＦＡに再溶解し、
再びエーテルで沈澱させて粗ペプチドを得た。
および配列番号６のアミノ酸配列に従って、パーキン・
エルマー社の全自動ペプチド合成機４３３Ａ型を用い
て、ＦａｓｔＭｏｃＴＭの固相法により合成した。ペプ
チド樹脂からのペプチドの切り放しと粗ペプチドの脱保
護は、ＴＦＡ／チオアニソール／１，２−エタンジオー
ル（９０／５／５，ｖ／ｖ）混合液を、ペプチド樹脂１
ｍｇ当たり１０ｍｌ加えた後、室温で２．５時間処理す
ることにより行った。反応液を濾過し、濾液にエーテル
を加えてペプチドを沈澱させた後、沈澱をエーテルで３
回洗浄した。次いで得られた沈殿をＴＦＡに再溶解し、
再びエーテルで沈澱させて粗ペプチドを得た。
【００４４】得られた粗ペプチドは、蒸留水に１．７ｍ
Ｍの濃度に溶解し、室温で４８時間空気酸化して、分子
内にジスルフィド結合を導入した後、Ｃ１８−ＨＰＬＣ
で精製した。このステップにおける収率は、ＢＭＰ４で
１２．３％，ＢＭＰ７で１１．４％であった。また、合
成ペプチドは、上記Ｃ−１８ＨＰＬＣで、天然品と同一
の保持時間を示し、天然品と同一のアミノ酸組成および
分子量を示した。さらに、合成ペプチドは、天然品と同
一の生理活性を示した。
Ｍの濃度に溶解し、室温で４８時間空気酸化して、分子
内にジスルフィド結合を導入した後、Ｃ１８−ＨＰＬＣ
で精製した。このステップにおける収率は、ＢＭＰ４で
１２．３％，ＢＭＰ７で１１．４％であった。また、合
成ペプチドは、上記Ｃ−１８ＨＰＬＣで、天然品と同一
の保持時間を示し、天然品と同一のアミノ酸組成および
分子量を示した。さらに、合成ペプチドは、天然品と同
一の生理活性を示した。
【００４５】評価例１．ネズミに対する毒性試験 本発明のペプチドのネズミに対する毒性は、Ｍａｒｔｉ
ｎら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２巻 ４４５２−
４４５９頁 １９８７年）の方法に準じて実施した。す
なわち、体重２０±３ｇのＣ５７／Ｂ１６雄性マウスを
用い、０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含
む、種々の濃度の試料溶液を５μｌ／マウスを大脳脳室
内に投与し、神経興奮により惹起される神経毒の症状を
観察した。
ｎら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２巻 ４４５２−
４４５９頁 １９８７年）の方法に準じて実施した。す
なわち、体重２０±３ｇのＣ５７／Ｂ１６雄性マウスを
用い、０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含
む、種々の濃度の試料溶液を５μｌ／マウスを大脳脳室
内に投与し、神経興奮により惹起される神経毒の症状を
観察した。
【００４６】その結果、ＢＭＰ１，ＢＭＰ２およびＢＭ
Ｐ３は、１μｇ／マウスの投与量で何ら毒性を示さなか
った。またＢＭＰ５は、この投与量で僅かな毒性しか示
さなかった。さらにＢＭＰ６およびＢＭＰ８は、２５０
ｎｇ／マウスの投与量で何ら毒性を示さなかった。これ
に対して、ＢＭＰ４およびＢＭＰ７は、３０ｎｇ／マウ
スの投与量で、神経興奮症状と致死活性を示し、これら
のペプチドの毒性は、先に本発明者らによって報告され
たＫＴＸ（Ｒ．Ｒｏｍｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
文献前出）の毒性とほぼ同様であった。
Ｐ３は、１μｇ／マウスの投与量で何ら毒性を示さなか
った。またＢＭＰ５は、この投与量で僅かな毒性しか示
さなかった。さらにＢＭＰ６およびＢＭＰ８は、２５０
ｎｇ／マウスの投与量で何ら毒性を示さなかった。これ
に対して、ＢＭＰ４およびＢＭＰ７は、３０ｎｇ／マウ
スの投与量で、神経興奮症状と致死活性を示し、これら
のペプチドの毒性は、先に本発明者らによって報告され
たＫＴＸ（Ｒ．Ｒｏｍｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
文献前出）の毒性とほぼ同様であった。
【００４７】
【発明の効果】本発明によれば、配列番号１〜７で示さ
れるペプチドを、サソリ毒素関連ペプチドとして提供す
ることができる。これらのペプチドは、既知サソリ毒素
ペプチドとの相同性から、種々のＫ＋チャンネルに作用
するものと考えられる。また、本発明のペプチドには、
毒性を殆ど示さないものもあり、このことは、Ｋ＋チャ
ンネルに対する活性と、致死毒性とを分離できる可能性
を示唆するものである。即ち、本発明は、サソリ毒素関
連ペプチドの神経生理学領域における生化学試薬として
の用途に加えて、医薬、動物薬としての用途を強く示唆
するものであり、サソリ毒素関連ペプチドの応用の糸口
となるものである。
れるペプチドを、サソリ毒素関連ペプチドとして提供す
ることができる。これらのペプチドは、既知サソリ毒素
ペプチドとの相同性から、種々のＫ＋チャンネルに作用
するものと考えられる。また、本発明のペプチドには、
毒性を殆ど示さないものもあり、このことは、Ｋ＋チャ
ンネルに対する活性と、致死毒性とを分離できる可能性
を示唆するものである。即ち、本発明は、サソリ毒素関
連ペプチドの神経生理学領域における生化学試薬として
の用途に加えて、医薬、動物薬としての用途を強く示唆
するものであり、サソリ毒素関連ペプチドの応用の糸口
となるものである。
【００４８】配列番号：１ 配列の長さ：２９ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 起源： 生物名：中国産サソリ（Ｂｕｔｈｕｓ ｍａｒｔｅｎｓ
ｉ） 配列：
ｉ） 配列：
【００４９】配列番号：２ 配列の長さ：２８ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 起源： 生物名：中国産サソリ（Ｂｕｔｈｕｓ ｍａｒｔｅｎｓ
ｉ） 配列の特徴： 他の特徴：ＸａａはＬｙｓまたはＡｓｎを示す 存在位置：１６ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列：
ｉ） 配列の特徴： 他の特徴：ＸａａはＬｙｓまたはＡｓｎを示す 存在位置：１６ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列：
【００５０】配列番号：３ 配列の長さ：３１ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 起源： 生物名：中国産サソリ（Ｂｕｔｈｕｓ ｍａｒｔｅｎｓ
ｉ） 配列：
ｉ） 配列：
【００５１】配列番号：４ 配列の長さ：３１ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 起源： 生物名：中国産サソリ（Ｂｕｔｈｕｓ ｍａｒｔｅｎｓ
ｉ） 配列：
ｉ） 配列：
【００５２】配列番号：５ 配列の長さ：３７ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 起源： 生物名：中国産サソリ（Ｂｕｔｈｕｓ ｍａｒｔｅｎｓ
ｉ） 配列の特徴： 他の特徴：Ｎ末端のピログルタミル化 存在位置：１ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列：
ｉ） 配列の特徴： 他の特徴：Ｎ末端のピログルタミル化 存在位置：１ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列：
【００５３】配列番号：６ 配列の長さ：３７ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 起源： 生物名：中国産サソリ（Ｂｕｔｈｕｓ ｍａｒｔｅｎｓ
ｉ） 配列：
ｉ） 配列：
【００５４】配列番号：７ 配列の長さ：３８ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 起源： 生物名：中国産サソリ（Ｂｕｔｈｕｓ ｍａｒｔｅｎｓ
ｉ） 配列：
ｉ） 配列：
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 中嶋 暉躬 大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１号 財団法人サントリー生物有機科学研究所 内
Claims (7)
- 【請求項１】配列番号１のアミノ酸配列で示され、分子
内に３個以内のジスルフィド結合を有するペプチド - 【請求項２】配列番号２のアミノ酸配列で示され、分子
内に３個以内のジスルフィド結合を有するペプチド - 【請求項３】配列番号３のアミノ酸配列で示され、分子
内に３個以内のジスルフィド結合を有するペプチド - 【請求項４】配列番号４のアミノ酸配列で示され、分子
内に３個以内のジスルフィド結合を有するペプチド - 【請求項５】配列番号５のアミノ酸配列で示され、分子
内に３個以内のジスルフィド結合を有するペプチド - 【請求項６】配列番号６のアミノ酸配列で示され、分子
内に３個以内のジスルフィド結合を有するペプチド - 【請求項７】配列番号７のアミノ酸配列で示され、分子
内に３個以内のジスルフィド結合を有するペプチド
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8118129A JPH09278797A (ja) | 1996-04-05 | 1996-04-05 | サソリ毒素関連ペプチド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8118129A JPH09278797A (ja) | 1996-04-05 | 1996-04-05 | サソリ毒素関連ペプチド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09278797A true JPH09278797A (ja) | 1997-10-28 |
Family
ID=14728768
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8118129A Pending JPH09278797A (ja) | 1996-04-05 | 1996-04-05 | サソリ毒素関連ペプチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09278797A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2769226A1 (fr) * | 1997-10-06 | 1999-04-09 | Centre Nat Rech Scient | Utilisation des bloqueurs des canaux potassium dans le traitement des maladies neurologiques |
| CN107501403A (zh) * | 2017-10-09 | 2017-12-22 | 南京图艾生物医药科技有限公司 | 一种蝎毒素的提取和纯化工艺 |
| CN108552118A (zh) * | 2018-03-26 | 2018-09-21 | 商丘豫商智能机器人科技有限公司 | 一种蝎子提毒机 |
-
1996
- 1996-04-05 JP JP8118129A patent/JPH09278797A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2769226A1 (fr) * | 1997-10-06 | 1999-04-09 | Centre Nat Rech Scient | Utilisation des bloqueurs des canaux potassium dans le traitement des maladies neurologiques |
| CN107501403A (zh) * | 2017-10-09 | 2017-12-22 | 南京图艾生物医药科技有限公司 | 一种蝎毒素的提取和纯化工艺 |
| CN108552118A (zh) * | 2018-03-26 | 2018-09-21 | 商丘豫商智能机器人科技有限公司 | 一种蝎子提毒机 |
| CN108552118B (zh) * | 2018-03-26 | 2021-09-14 | 商丘豫商智能机器人科技有限公司 | 一种蝎子提毒机 |
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| A131 | Notification of reasons for refusal |
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| A02 | Decision of refusal |
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