FR2769226A1 - Utilisation des bloqueurs des canaux potassium dans le traitement des maladies neurologiques - Google Patents
Utilisation des bloqueurs des canaux potassium dans le traitement des maladies neurologiques Download PDFInfo
- Publication number
- FR2769226A1 FR2769226A1 FR9712421A FR9712421A FR2769226A1 FR 2769226 A1 FR2769226 A1 FR 2769226A1 FR 9712421 A FR9712421 A FR 9712421A FR 9712421 A FR9712421 A FR 9712421A FR 2769226 A1 FR2769226 A1 FR 2769226A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- cys
- lys
- amino acid
- gly
- abu
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43513—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae
- C07K14/43522—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae from scorpions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Neurology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
La présente invention concerne l'utilisation de bloqueurs des canaux potassium pour la préparation de médicaments destinés au traitement de maladies neurologiques chez l'homme ou l'animal dans lesquelles se produit un blocage de la conduction nerveuse, lesdites maladies étant le cas échéant d'origine immunitaire.L'invention a également pour objet de nouvelles compositions pharmaceutiques, ainsi que de nouveaux bloqueurs des canaux potassium, et leurs utilisations dans le cadre du traitement des pathologies susmentionnées.
Description
UTILISATION DES BLOQUEURS DES CANAUX POTASSIUM DANS LE
TRAITEMENT DES MALADIES NEUROLOGIQUES
La présente invention concerne l'utilisation de bloqueurs des canaux potassium comme agents thérapeutiques des maladies neurologiques dans lesquelles se produit un blocage de la conduction nerveuse, et en particulier la sclérose en plaque (SEP).
TRAITEMENT DES MALADIES NEUROLOGIQUES
La présente invention concerne l'utilisation de bloqueurs des canaux potassium comme agents thérapeutiques des maladies neurologiques dans lesquelles se produit un blocage de la conduction nerveuse, et en particulier la sclérose en plaque (SEP).
La kaliotoxine (KTX) est un peptide de 38 acides aminés, dont la séquence en acides aminés est la suivante
GVEINVKCSGSPQCLKPCKDAGMRFGKCMNRKCHCTPK
Cette séquence a été pour la première fois publiée en 1992 dans l'article,
Crest et al, 1992, J. of Biological Chemistry, vol. 267, p1640-1647.
GVEINVKCSGSPQCLKPCKDAGMRFGKCMNRKCHCTPK
Cette séquence a été pour la première fois publiée en 1992 dans l'article,
Crest et al, 1992, J. of Biological Chemistry, vol. 267, p1640-1647.
La sclérose en plaque (SEP) est la plus fréquente des maladies humaines démyélinisantes du système nerveux avec une prévalence moyenne de 5 à 300/100 000 habitants. Elle atteint l'adulte jeune et 1,5 à 2 fois plus souvent les femmes. La répartition géographique de la SEP n'est pas uniforme puisque sa prévalence augmente avec la latitude, selon trois zones de risque faible, moyen et fort. Le pic de prévalence se situe dans les régions comprises entre 45" et 60 de latitude nord, donc en particulier en Europe du Nord.
L'évolution de la maladie se fait en poussées, avec apparition de lésions neuronales pouvant altérer des fonctions motrices et sensitives, la vision, l'équilibre et le contrôle des sphincters. Dans 50 à 60% des cas, une phase progressive de plus en plus invalidante s'installe au bout d'une dizaine d'années mais ces formes progressives apparaissent aussi d'emblée dans 15% des cas.
La prévalence relativement élevée de cette maladie, associée à son caractère progressif pénible et invalidant, expliquent les efforts de la communauté scientifique pour améliorer la vie des patients. Ainsi entre 1993 et 1996, 2400 références relatives à la SEP ont été publiées par des journaux spécialises.
Les données cliniques et anatomo-pathologiques de la SEP sont les suivantes.
La SEP est due à une destruction progressive des gaines de myéline des axones du système nerveux central, sans dégénérescence axonale, accompagnée d'une cicatrice gliale, I'ensemble formant la plaque de sclérose. La myéline lésée n'est pas ou peu reconstituée par les cellules gliales (oligodendrocytes), ce qui accentue l'évolution de la maladie. L'examen histopathologique révèle l'existence d'infiltrats inflammatoires dans la substance blanche et la dissémination des lésions rend compte du polymorphisme des symptômes. Ces inflammations s'accompagnent de troubles de la conduction nerveuse, les blocs de conduction, qui sont à l'origine de la perte des fonctions nerveuses.
Lors des phases actives de la maladie, on observe dans le liquide céphalorachidien : la présence d'un nombre anormal de lymphocytes T et à un degré moindre, de lymphocytes B, une élévation de la concentration des immunoglobulines (IgG) dirigées contre différents antigènes viraux, et surtout dans certains cas des anticorps dirigés contre les oligodendrocytes et contre la protéine basique myélinique. Aucun agent infectieux n'a pu être, à ce jour, formellement et systématiquement impliqué.
Les lésions sont formées par des infiltrations de monocytes, de lymphocytes B et T (majoritaires) et par des plaques de démyélinisation. Les lymphocytes T expriment majoritairement des récepteurs pour 1 interleukine 2 et des molécules HLA, témoins d'une prolifération cellulaire. Les cellules résidentes, astrocytes, cellules microgliales et les cellules endothéliales des capillaires, expriment aussi les molécules HLA de classe II, ce qui témoigne d'une réaction inflammatoire dans le cerveau.
L'inflammation est particulièrement nocive dans le système nerveux central, en générant des compressions, des lésions de démyélinisation, des perturbations de l'influx nerveux. L'une des conséquences aggravantes de la démyélinisation est l'apparition de blocs de conduction dus au dérèglement de l'activité des canaux ioniques responsables de l'influx nerveux dans les axones.
Les thérapies actuelles de la SEP sont les suivantes.
Les thérapies de la SEP dérivent de traitements appliqués à diverses formes d'encéphalomyélites allergiques expérimentales (EAE) qui sont devenues le modèle essentiel de la SEP, et de médicaments anti-inflammatoires, immunosuppresseurs ou immunomodulateurs utilisés dans les cancers, les transplantations d'organes et d'autres processus inflammatoires. Elles sont basées sur l'hypothèse que la SEP est une maladie autoimmune dirigée contre la myéline du SNC. De ce fait, ces thérapies impliquent des traitements, avec l'interféron ou des corticostéroïdes par exemple, qui interfèrent en priorité avec le système immunitaire pour limiter ou prévenir les processus inflammatoires dans le SNC (Revue par Jacobs et coll., 1994). Les traitements symptomatiques visant à rétablir ou améliorer les fonctions neurologiques déficientes sont peu développés et peu efficaces. A l'exception des aminopyridines, ces traitements ne prennent pas en considération le rôle des canaux potassium dans les blocs de conduction des nerfs démyélinisés, causes majeures des insuffisances sensorielles et motrices.
Utilisation clinique de bloqueurs de canaux potassium dans la SEP
Des effets cliniques bénéfiques de bloqueurs des canaux potassium et en particulier des aminopyridines (4-AP et 3,4-DAP) dans la sclérose en plaque ont été décrits dès 1983 (voir pour revues: Noseworthy, 1993; Polman et Hartung, 1995). L'utilisation des aminopyridines est justifiée par leur capacité à bloquer les canaux potassium neuronaux et ainsi à faciliter la conduction axonale. De fait, les essais cliniques ont montré que la 4-AP et surtout la 3,4-DAP améliorent significativement les symptômes chez certains patients.
Des effets cliniques bénéfiques de bloqueurs des canaux potassium et en particulier des aminopyridines (4-AP et 3,4-DAP) dans la sclérose en plaque ont été décrits dès 1983 (voir pour revues: Noseworthy, 1993; Polman et Hartung, 1995). L'utilisation des aminopyridines est justifiée par leur capacité à bloquer les canaux potassium neuronaux et ainsi à faciliter la conduction axonale. De fait, les essais cliniques ont montré que la 4-AP et surtout la 3,4-DAP améliorent significativement les symptômes chez certains patients.
Cependant, les aminopyridines sont peu sélectives et touchent un grand nombre de canaux potassium voltage-dépendants et entre autres, ceux présents dans les terminaisons synaptiques (Sherrat, Bostock et Sears, 1980). Il s'agit des canaux Kv de type Kvl.l, Kv1.2, Kv1.3, Kv1.4, Kv1.5 mais aussi des canaux d'une autre famille génétique, les canaux Kv3.1 et Kv3.4. Le blocage de ces canaux facilite la libération de neuromédiateurs excitateurs et induit de nombreux effets annexes périphériques et centraux (Bever, 1994).
L'administration soutenue de 4-AP à des patients atteints de SEP a des effets bénéfiques, mais également des effets neurologiques sérieux avec induction de décharges épileptiformes locales ou généralisées (Polman et coll., 1994). Par ailleurs, I'efficacité des aminopyridines sur les canaux Kv des lymphocytes T est relativement faible (Ic50 = 200 yM). Ceci explique que la 4-AP (ainsi que la quinidine) se soient révélées incapables d'induire des changements notables dans l'évolution de L'EAU chez le rat Lewis (Uitdehaag et coll., 1994).
Les thérapies à base d'aminopyridines ont pour but de traiter les symptômes neurologiques. Aux concentrations utilisées et du fait de la durée des traitements, elles induisent des effets secondaires dus à leur manque de spécificité.
Par ailleurs, la margatoxine, molécule issue du venin de scorpion, est décrite en tant qu' immunosuppresseur susceptible de pouvoir être utilisée dans le cadre du traitement de maladies autoimmunes, ou de la prévention du rejet de greffes (Brevet US 5,494,895). Cet effet immunosuppresseur de la margatoxine résulte de son action de blocage des canaux Kv1.3 des lymphocytes. Cependant, aucun effet de blocage des canaux Kv neuronaux n'est décrit ni suggéré dans ce brevet US.
La présente invention a pour but de fournir des composés agissant sur un nombre limité de canaux Kv neuronaux, tout en assurant une grande efficacité sur les pathologies dans lesquelles interviennent un blocage de conduction nerveuse, sans pour autant engendrer les effets secondaires observés dans le cadre des essais thérapeutiques des composés de l'art antérieur.
La présente invention a également pour but de fournir de nouvelles compositions pharmaceutiques susceptibles d'être utilisées dans le cadre du traitement des pathologies associées à un blocage de la conduction nerveuse, notamment de la SEP.
La présente invention a pour objet l'utilisation de composés bloquant les canaux potassium neuronaux de type Kvl.1, Kv1.2, et, le cas échéant Kv1.3, pour la préparation de médicaments destinés au traitement de maladies neurologiques chez l'homme ou l'animal dans lesquelles se produit un blocage de la conduction nerveuse, lesdites maladies étant le cas échéant d'origine immunitaire.
Avantageusement, les composés utilisés dans le cadre de la présente invention, sont des bloqueurs des canaux potassium voltage-dépendants des noeuds de Ranvier, et plus particulièrement des canaux Kvl. 1 et Kv1.2 (McNamara et coll., 1996 ; Wang et coll., 1994)
De préférence, dans le cadre du traitement de pathologies neurologiques d'origine immunitaire, notamment autoimmune, les composés susmentionnés utilisés dans le cadre de la présente invention sont aussi des bloqueurs des canaux potassium voltage-dépendants Kv1.3 des noeuds de Ranvier, et des lymphocytes.
De préférence, dans le cadre du traitement de pathologies neurologiques d'origine immunitaire, notamment autoimmune, les composés susmentionnés utilisés dans le cadre de la présente invention sont aussi des bloqueurs des canaux potassium voltage-dépendants Kv1.3 des noeuds de Ranvier, et des lymphocytes.
Par canaux potassium voltage-dépendants, dans ce qui précède et ce qui suit, on entend des protéines membranaires sélectivement perméables aux ions potassium et dont la perméabilité à cet ion dépend du potentiel de la cellule. Le flux d'ions potassium à travers le canal constitue un courant potassium. Les caractéristiques de la relation entre le courant potassium et le potentiel de la cellule ont été décrites par Stühmer et coll. (1989) pour les courants Kvl.l, Kv 1.2 et Kv1.3. La séquence de la sous-unité protéique principale (sous-unité a ) constitutive des canaux potassium Ka1.1, Kv 1.2 et Kv 1.3 est également décrite dans cet article. La classification des canaux potassium voltage-dépendants est par ailleurs explicitée dans la revue de synthèse de Chandy et Gutman (1994).
Par bloqueurs des canaux potassium voltage-dépendants, dans ce qui précède et ce qui suit, on entend toute molécule capable de limiter le courant potassium à travers un canal potassium par une action directe sur le canal. Dans le cas particulier de la kaliotoxine, et des autres composés peptidiques (ou pseudopeptidiques) décrits ci-après, le blocage s'effectue par obturation de la partie externe du canal. La mesure du blocage des canaux potassium par les composés de l'invention peut être effectuée par la méthode du potentiel imposé telle que celle décrite dans l'article Crest et al., 1992, susmentionné.
Parmi les pathologies neurologiques, notamment d'origine immunitaire, susceptibles d'être traitées dans le cadre de la présente invention, on peut citer
- les pathologies neurologiques centrales inflammatoires à localisation cérébrale et médullaire, notamment
la sclérose en plaque et maladies apparentées (Balo, Devic, encéphalite aiguë disséminée et hémorragiques, neuropathies optiques isolées);
les complications centrales des maladies de système: Beheet,
Sarcoïdose, autres vascularites,
- les pathologies périphériques inflammatoires ou apparentées, notamment
les polyradiculonévrites aiguës et chroniques,
les neuropathies liées à des atteintes infectieuses et à des collagénoses,
- les pathologies neurologiques dégénératives, notamment la sclérose latérale amyotrophique, les neuropathies avec bloc de conduction,
- les autres atteintes centrales cérébrales et médullaires, notamment les pathologies d'origine métabolique, les pathologies vasculaires ischémiques artérielles et veineuses et hémorragiques, les pathologies tumorales primitives et secondaires, les pathologies traumatiques.
- les pathologies neurologiques centrales inflammatoires à localisation cérébrale et médullaire, notamment
la sclérose en plaque et maladies apparentées (Balo, Devic, encéphalite aiguë disséminée et hémorragiques, neuropathies optiques isolées);
les complications centrales des maladies de système: Beheet,
Sarcoïdose, autres vascularites,
- les pathologies périphériques inflammatoires ou apparentées, notamment
les polyradiculonévrites aiguës et chroniques,
les neuropathies liées à des atteintes infectieuses et à des collagénoses,
- les pathologies neurologiques dégénératives, notamment la sclérose latérale amyotrophique, les neuropathies avec bloc de conduction,
- les autres atteintes centrales cérébrales et médullaires, notamment les pathologies d'origine métabolique, les pathologies vasculaires ischémiques artérielles et veineuses et hémorragiques, les pathologies tumorales primitives et secondaires, les pathologies traumatiques.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation de composés peptidiques tels que décrits ci-dessus, bloquant les canaux potassium neuronaux, avantageusement les canaux de type Kv1.1, Kv 1.2 et, le cas échéant, le canal neuronal et lymphocytaire Kv1.3, lesdits composés étant issus de venins de scorpion ou d'anémones de mer, pour la préparation de médicaments destinés au traitement des maladies neurologiques mentionnées ci-dessus, à l'exclusion de l'utilisation de la margatoxine dans le cadre du traitement de maladies neurologiques d'origine immunitaire, telle que la SEP.
L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée de composés peptidiques issus de venins de scorpion, ou de composés dérivés de ces derniers, ces composés ou dérivés comprenant la séquence en acides aminés répondant à la formule générale suivante (I) suivante
Cys-AA9-AA10-AA1 1-AA12-AA 3-Cys-AA 1 5-AA 16-AA 17-Cys-AA 1 g-AA20- AA21 ~(AA22-)nl-AA23-AA24-(AA25)n2-AA26-AA27-AA28-Lys-cys-AA3 1 AA32-AA33-Lys-Cys-AA36-Cys (I) dans laquelle
- nl, et n2, indépendamment l'un de l'autre, représentent zéro ou 1,
- AA9 à AA13, AA15 à AA17, AA19 à AA28, AA31 à AA33, et
AA36, indépendamment les uns des autres, représentent un acide aminé quelconque, naturel ou non.
Cys-AA9-AA10-AA1 1-AA12-AA 3-Cys-AA 1 5-AA 16-AA 17-Cys-AA 1 g-AA20- AA21 ~(AA22-)nl-AA23-AA24-(AA25)n2-AA26-AA27-AA28-Lys-cys-AA3 1 AA32-AA33-Lys-Cys-AA36-Cys (I) dans laquelle
- nl, et n2, indépendamment l'un de l'autre, représentent zéro ou 1,
- AA9 à AA13, AA15 à AA17, AA19 à AA28, AA31 à AA33, et
AA36, indépendamment les uns des autres, représentent un acide aminé quelconque, naturel ou non.
Des composés particulièrement avantageux, comprenant la séquence en acides aminés de formule (I), sont représentés par les composés peptidiques de formule (II) suivante:
AA2-AA3-Ile-Asn-Val-Lys-Cys-Thr-Ser-Pro-AA 1 2-Gln-Cys-AA 15 -AA 1 6-Pro-
Cy s-Lys-AA20-AA2 1 -AA22-Gly-AA24-AA25 -Ala-Gly-AA2g-Lys-Cys-AA3 1-
Asn-Gly-Lys-Cys-Lys-Cys-Tyr-AA39-AA40 (II)
dans laquelle AA2, AA3, AA12, AA15, AA16, AA20 à AA22, AA24,
AA25, AA281 AA31 AA39, et AA40, indépendamment les uns des autres représentent un acide aminé quelconque naturel ou non.
AA2-AA3-Ile-Asn-Val-Lys-Cys-Thr-Ser-Pro-AA 1 2-Gln-Cys-AA 15 -AA 1 6-Pro-
Cy s-Lys-AA20-AA2 1 -AA22-Gly-AA24-AA25 -Ala-Gly-AA2g-Lys-Cys-AA3 1-
Asn-Gly-Lys-Cys-Lys-Cys-Tyr-AA39-AA40 (II)
dans laquelle AA2, AA3, AA12, AA15, AA16, AA20 à AA22, AA24,
AA25, AA281 AA31 AA39, et AA40, indépendamment les uns des autres représentent un acide aminé quelconque naturel ou non.
Un composé de formule (II) particulièrement préféré est la noxiustoxine (telle qu'issue du venin de scorpion dénommé Centrudoides noxius) correspondant à la séquence en acides aminés SEQ ID NO 1.
D'autres composés, comprenant la séquence en acides aminés de formule (I), dans laquelle n2 = 0, particulièrement avantageux, sont représentés par les composés peptidiques de formule (III) suivante:
AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-Cys-AA9-AA10-Ser-AA12-Gln-Cys
AA15-Lys-AA17-Cys-Lys-Asp-Ala-(AA22)n1-Gly-AA24-Arg-Phe-Gly-Lys Cys-AA3 1-Asn-AA33-Lys-Cys-AA36-Cys-AA38-AA39-AA40 (III)
dans laquelle
- AA1 à AA7, AA9, AA10, AA12, AA15, AA17, AA22, AA24, AA31,
AA33, AA36, et AA38 à AA40, indépendamment les uns des autres représentent un acide aminé quelconque naturel ou non,
- nl représente zéro ou 1.
AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-Cys-AA9-AA10-Ser-AA12-Gln-Cys
AA15-Lys-AA17-Cys-Lys-Asp-Ala-(AA22)n1-Gly-AA24-Arg-Phe-Gly-Lys Cys-AA3 1-Asn-AA33-Lys-Cys-AA36-Cys-AA38-AA39-AA40 (III)
dans laquelle
- AA1 à AA7, AA9, AA10, AA12, AA15, AA17, AA22, AA24, AA31,
AA33, AA36, et AA38 à AA40, indépendamment les uns des autres représentent un acide aminé quelconque naturel ou non,
- nl représente zéro ou 1.
Parmi les composés de formule (III) susmentionnée, dans laquelle nl=0, l'invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée de composés peptidiques de formule (IV) suivante:
AA 1 -Val-AA3 -Ile-AA5 -Val-AArl-Cys-AAg-AA 0-Ser-AA 1 2-Gln-Cys-AA 15- Lys-Pro-Cys-Lys-Asp-Ala-Gly-Met-Arg-Phe-Gly-Lys-Cys-AA31 -Asn-AA33 -
Lys-Cys-His-Cys-Thr-Pro-Lys (IV)
dans laquelle AA3, AA5, AA7, AA9, AA10 AA12, AA15, AA3l, et
AA33, indépendamment les uns des autres, représentent un acide aminé quelconque naturel ou non.
AA 1 -Val-AA3 -Ile-AA5 -Val-AArl-Cys-AAg-AA 0-Ser-AA 1 2-Gln-Cys-AA 15- Lys-Pro-Cys-Lys-Asp-Ala-Gly-Met-Arg-Phe-Gly-Lys-Cys-AA31 -Asn-AA33 -
Lys-Cys-His-Cys-Thr-Pro-Lys (IV)
dans laquelle AA3, AA5, AA7, AA9, AA10 AA12, AA15, AA3l, et
AA33, indépendamment les uns des autres, représentent un acide aminé quelconque naturel ou non.
Des composés de formule (IV) particulièrement préférés, sont représentés par les composés peptidiques suivants - la kaliotoxine correspondant à la séquence en acides aminés SEQ ID NO 2, - la kaliotoxine 2 correspondant à la séquence en acides aminés SEQ ID NO 3, - la kaliotoxine 3 correspondant à la séquence en acides aminés SEQ ID NO 4, - I'agitoxine 2 correspondant à la séquence en acides aminés SEQ ID NO 5.
L'invention a également pour objet l'utilisation susmentionnée de composés peptidiques de formule (III) dans laquelle
- AA12 représente l'acide aminobutyrique (Abu) ou la lysine, et/ou
- AA17 représente l'acide aminobutyrique (Abu) ou la valine, et/ou
- lorsque n représente 1, AA22 représente la phénylalanine, et/ou
- AA24 et AA31 représentent, indépendamment l'un de l'autre, la méthionine ou la norleucine.
- AA12 représente l'acide aminobutyrique (Abu) ou la lysine, et/ou
- AA17 représente l'acide aminobutyrique (Abu) ou la valine, et/ou
- lorsque n représente 1, AA22 représente la phénylalanine, et/ou
- AA24 et AA31 représentent, indépendamment l'un de l'autre, la méthionine ou la norleucine.
A ce titre, l'invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée des composés peptidiques suivants
- (P12/Abu, P17/Abu) KTX correspondant à la séquence en acides aminés
SEQ ID NO 6,
- (P12/K, P17/V, F22) KTX correspondant à la séquence en acides aminés
SEQ ID NO 7.
- (P12/Abu, P17/Abu) KTX correspondant à la séquence en acides aminés
SEQ ID NO 6,
- (P12/K, P17/V, F22) KTX correspondant à la séquence en acides aminés
SEQ ID NO 7.
D'autres composés de formule (III), dans laquelle nl=0, particulièrement préférés sont représentés par les composés peptidiques de formule (V) suivante:
AA 1 -AA2-AA3-AA4-AAs-AA6-AA7-Cys-AAg-AA 10-Ser-Abu-Gln-Cys-AA 15-
Lys-Abu-Cys-Lys-Asp-Ala-Gly-Nle-Arg-Phe-Gly-Lys-Cys-Nle-Asn-AA33-Lys-
Cys-AA36-cys-AA38-AA39-AA40 (V) dans laquelle AA1 à AA7, AA9, AA1o, AA15, AA33, AA36, et AA38 à AA40, indépendamment les uns des autres, représentent un acide aminé quelconque naturel ou non.
AA 1 -AA2-AA3-AA4-AAs-AA6-AA7-Cys-AAg-AA 10-Ser-Abu-Gln-Cys-AA 15-
Lys-Abu-Cys-Lys-Asp-Ala-Gly-Nle-Arg-Phe-Gly-Lys-Cys-Nle-Asn-AA33-Lys-
Cys-AA36-cys-AA38-AA39-AA40 (V) dans laquelle AA1 à AA7, AA9, AA1o, AA15, AA33, AA36, et AA38 à AA40, indépendamment les uns des autres, représentent un acide aminé quelconque naturel ou non.
L'invention concerne également l'utilisation susmentionnée de composés peptidiques issus d'anémones de mer, ou de composés dérivés de ces derniers, ces composés ou dérivés comprenant la séquence en acides aminés répondant à la formule générale suivante (VI) suivante (AA1 )n 1 -(AA2)n2-Cys-AA4-Asp-AA6-AA7-AAg-AAg-AAl o-AAl 1 -Cys (AA1 3)n3-AA14-(AA15)n4-AA16-(AA17)n5-AA1 8-(AA1 9)n6-AA20-Cys-
AA22-(AA23)n-Ser-AA25-Lys-Tyr-AA28-(AA29)n8-AA30-Cys-AA32-Lys Thr-Cys-AA36-AA37-Cys (VI) dans laquelle
- nl à n8, indépendamment les uns des autres, représentent zéro ou 1,
- AA2, AA2, AAq, AA6 à AA11, AA22, AA23, AA25, AA28 à
AA30, AA32, AA36 et AA37, indépendamment les uns des autres, représentent un acide aminé quelconque naturel ou non.
AA22-(AA23)n-Ser-AA25-Lys-Tyr-AA28-(AA29)n8-AA30-Cys-AA32-Lys Thr-Cys-AA36-AA37-Cys (VI) dans laquelle
- nl à n8, indépendamment les uns des autres, représentent zéro ou 1,
- AA2, AA2, AAq, AA6 à AA11, AA22, AA23, AA25, AA28 à
AA30, AA32, AA36 et AA37, indépendamment les uns des autres, représentent un acide aminé quelconque naturel ou non.
Des composés peptidiques de formule (IV) préférés, sont les suivants - la BgK correspondant à la séquence en acides aminés SEQ ID NO 8 (telle qu'issue de l'anémone de mer désignée Bunodosoma granulifera), - la ShK correspondant à la séquence en acides aminés SEQ ID NO 9 (telle qu'issue de l'anémone de mer désignée Stichodaclyla helianthus), - la kaliseptine correspondant à la séquence en acides aminés SEQ ID NO 10 (telle qu'issue de l'anémone de mer désignée Anemonia sulcata).
L'invention a également pour objet toute composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend un ou plusieurs composés peptidiques tels que définis dessus, en association avec un véhicule pharmaceutique acceptable.
Avantageusement, les compositions pharmaceutiques de l'invention se présentent sous une forme administrable par voies intraveineuse, intramusculaire, anale ou sous-cutanée, notamment à raison d'environ 0.05 à environ 1 mg/kg, ou d'environ 0.5 mg/kg à environ 1 mg/kg, à raison de 1 à 3 prises par jour.
Des compositions pharmaceutiques préférées sont celles contenant la kaliotoxine ou ses dérivés, notamment la kaliotoxine 3, dans le cadre du traitement de la SEP.
D'autres compositions pharmaceutiques préférées sont celles contenant le composé (P12/Abu, P17/Abu) KTX, dans le cadre du traitement de la SEP.
L'invention concerne également la kaliotoxine 3 correspondant à la séquence en acides aminés SEQ ID NO 4, ainsi que la séquence nucléotidique codant pour cette protéine.
L'invention a également pour objet les composés peptidiques de formule (III) suivante AA 1 -AA2-AA3 -AA4-AAs -AA6-AA7-Cys-AAg-AA 1 0-Ser-AA 1 12-Gln-Cys-
AA15-Lys-AA17-Cys-Lys-Asp-Ala-(AA22)n1-Gly-AA24-Arg-Phe-Gly-Lys
Cys-AA31-Asn-AA33-Lys-Cys-AA36-Cys-AA38-AA39-AA40 (III)
dans laquelle
- AA1 à AA7, AA9, AA10, AA12, AA15, AA17, AA22, AA24, AA31,
AA33, AA36, et AA38 à AA40, indépendamment les uns des autres représentent un acide aminé quelconque naturel ou non,
- AA12 représente l'acide aminobutyrique (Abu) ou la lysine, et/ou
- AA17 représente l'acide aminobutyrique (Abu) ou la valine, et/ou
- nl représente zéro ou 1, et lorsque n représente 1, AA22 représente la phénylalanine, et/ou
- AA24 et AA31 représentent, indépendamment l'un de l'autre, la méthionine ou la norleucine.
AA15-Lys-AA17-Cys-Lys-Asp-Ala-(AA22)n1-Gly-AA24-Arg-Phe-Gly-Lys
Cys-AA31-Asn-AA33-Lys-Cys-AA36-Cys-AA38-AA39-AA40 (III)
dans laquelle
- AA1 à AA7, AA9, AA10, AA12, AA15, AA17, AA22, AA24, AA31,
AA33, AA36, et AA38 à AA40, indépendamment les uns des autres représentent un acide aminé quelconque naturel ou non,
- AA12 représente l'acide aminobutyrique (Abu) ou la lysine, et/ou
- AA17 représente l'acide aminobutyrique (Abu) ou la valine, et/ou
- nl représente zéro ou 1, et lorsque n représente 1, AA22 représente la phénylalanine, et/ou
- AA24 et AA31 représentent, indépendamment l'un de l'autre, la méthionine ou la norleucine.
L'invention a également pour objet les composés peptidiques de formule (III) susmentionnée, correspondant aux analogues suivants de la kaliotoxine
- (P12/Abu, P17/Abu) KTX correspondant à la séquence en acides aminés
SEQ ID NO 6,
- (P12/K, P17/V, F22) KTX correspondant à la séquence en acides aminés
SEQ ID NO 7.
- (P12/Abu, P17/Abu) KTX correspondant à la séquence en acides aminés
SEQ ID NO 6,
- (P12/K, P17/V, F22) KTX correspondant à la séquence en acides aminés
SEQ ID NO 7.
L'invention concerne également les composés peptidiques, correspondant aux dérivés de formule (V) susmentionnée suivante
AA -AA2-AA3-AA4-AAs-AA6-AA7-Cys-AAg-AA 1 0-Ser-Abu-Gln-Cys-AA 15 -
Lys-Abu-Cys-Lys-Asp-Ala-Gly-Nle-Arg-Phe-Gly-Lys-Cys-Nle-Asn-AA33-Lys Cys-AA36-Cys-AA38-AA39-AA4O (V) dans laquelle AA1 à AA7, AA9, AA10, AA15, AA33, AA36, et AA38 à
AA40, indépendamment les uns des autres, représentent un acide aminé quelconque naturel ou non.
AA -AA2-AA3-AA4-AAs-AA6-AA7-Cys-AAg-AA 1 0-Ser-Abu-Gln-Cys-AA 15 -
Lys-Abu-Cys-Lys-Asp-Ala-Gly-Nle-Arg-Phe-Gly-Lys-Cys-Nle-Asn-AA33-Lys Cys-AA36-Cys-AA38-AA39-AA4O (V) dans laquelle AA1 à AA7, AA9, AA10, AA15, AA33, AA36, et AA38 à
AA40, indépendamment les uns des autres, représentent un acide aminé quelconque naturel ou non.
L'invention concerne également tout peptide dérivé de ceux décrits cidessus, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ou tout fragment des peptides décrits ci-dessus, lesdits peptides dérivés ou fragments étant capables de bloquer les canaux Kv neuronaux, et, le cas échéant, lymphocytaires susmentionnés.
L'invention a également pour objet les compositions pharmaceutiques contenant lesdits peptides dérivés ou fragments susmentionnés, ainsi que leur utilisation dans le cadre du traitement des pathologies décrites ci-dessus.
L'invention concerne également les séquences nucléotidiques codant pour les peptides, ou peptides dérivés, ou fragments de ces derniers, décrits cidessus, ainsi que leur utilisation dans le cadre de la préparation desdits peptides, peptides dérivés, ou fragments, par transformation de cellules hôtes avec des vecteurs contenant lesdites séquences nucléotidiques, mise en culture des cellules hôtes ainsi transformées, et récupération des peptides, peptides dérivés produits.
L'invention sera davantage illustrée à l'aide des exemples de synthèse des composés de l'invention, et de leurs effets sur un modèle expérimental animal de la SEP.
I - Techniques de synthèse
La kaliotoxine et ses différents analogues ont été synthétisés par la méthode de synthèse en phase solide en utilisant, pour la protection des acides aminés, soit la chimie Boc selon le protocole explicité dans l'article Romi et coll., 1993, J. of Biological Chemistry, vol. 268, p 26302-26309, soit la chimie
Fmoc selon le protocole explicité pour des peptides comparables dans l'article
Kharrat et coll., 1996, Eur. J. of Biochemistry 42, p 491498. Les résines utilisées sont à base de polystyrène 1% divinyl-benzène dérivatisé en PAMrésine, paraméthyl-BHA résine, résine HMB, ou résine RINK. Les chaînes protectrices des acides aminés sont : cyclohéxyl ou t-butyl pour Asp et Glu, benzyl ou t-butyl pour Ser et Thr, carbobenzoxy, tosyl ou trityl pour His, pméthylbenzyl, Acm, ou trityl pour Cys, xantyl ou trityl pour Asn et Gln, tosyl ou Pmc pour Arg et 2CI-CbZ ou Boc pour Lys. L'assemblage des amino-acides a été réalisé sous forme de HOBt-ester ou par couplage avec le réactif HBTU.
La kaliotoxine et ses différents analogues ont été synthétisés par la méthode de synthèse en phase solide en utilisant, pour la protection des acides aminés, soit la chimie Boc selon le protocole explicité dans l'article Romi et coll., 1993, J. of Biological Chemistry, vol. 268, p 26302-26309, soit la chimie
Fmoc selon le protocole explicité pour des peptides comparables dans l'article
Kharrat et coll., 1996, Eur. J. of Biochemistry 42, p 491498. Les résines utilisées sont à base de polystyrène 1% divinyl-benzène dérivatisé en PAMrésine, paraméthyl-BHA résine, résine HMB, ou résine RINK. Les chaînes protectrices des acides aminés sont : cyclohéxyl ou t-butyl pour Asp et Glu, benzyl ou t-butyl pour Ser et Thr, carbobenzoxy, tosyl ou trityl pour His, pméthylbenzyl, Acm, ou trityl pour Cys, xantyl ou trityl pour Asn et Gln, tosyl ou Pmc pour Arg et 2CI-CbZ ou Boc pour Lys. L'assemblage des amino-acides a été réalisé sous forme de HOBt-ester ou par couplage avec le réactif HBTU.
Le clivage et la déprotection des chaînes latérales des amino-acides ont été réalisés soit en milieu HF, soit en présence de TFA avec différents pièges à radicaux : p-crésol, éthanedithiol, thioanisole ou phénol. Les peptides ont été placés en réoxydation en présence d'un tampon Tris-HCl au contact de l'air. La constitution des ponts disulfures et la restructuration des molécules ont été suivies par HPLC. Les peptides oxydés ont été purifiés par HPLC préparative et caractérisés par : HPLC analytique, analyse d'acides aminés, spectrométrie de masse, et par différents tests biologiques: électrophysiologie, toxicité chez la souris, fixation sur leurs récepteurs.
Les caractéristiques physicochimiques sont les suivantes : poudre lyophilisée blanche amorphe, de grande solubilité dans l'eau ( > 10 mg/ml), conservation à 4"C à l'état lyophilisé et à -20 C en solution dans l'eau.
Dégradation rapide en milieux oxydant et réducteur, dégradation rapide en milieu basique et acide extrême ( < 1).
II- Etude de l'effet des composés de l'invention sur un modèle animal de SEP
A) Méthodologie
1) Affinité de la kaliotoxine pour les canaux potassium de type Kv
L'affinité de la kaliotoxine (KTX) pour les canaux potassium de type Kv a été déterminée par électrophysiologie (voltage-imposé) après expression d'ARN dans l'ovocyte de xénope (Kushner er coll., 1989).
A) Méthodologie
1) Affinité de la kaliotoxine pour les canaux potassium de type Kv
L'affinité de la kaliotoxine (KTX) pour les canaux potassium de type Kv a été déterminée par électrophysiologie (voltage-imposé) après expression d'ARN dans l'ovocyte de xénope (Kushner er coll., 1989).
2) Blocage des canaux Kv lymphocytaires par la KTX
L'activité des canaux potassium est déterminé en enregistrant le courant global d'un lymphocyte à l'aide de la technique de patchclamp dans la configuration cellule entière.
L'activité des canaux potassium est déterminé en enregistrant le courant global d'un lymphocyte à l'aide de la technique de patchclamp dans la configuration cellule entière.
3) Effets in vitro de la kaliotoxine sur la prolifération d'une lignée lymphocytaire T
Des lymphocytes T sont maintenus en culture en alternant des cycles d'activation antigénique et des cycles d'amplification dans du milieu de croissance contenant 10% de "T cell growth factors" (TCGF). L'activation antigénique est réalisée en cultivant 3x104 LcT avec 2x106 cellules présentatrices de l'antigène, la protéine basique de la myéline (PBM) (10 mg/ml) /200 ml milieu de stimulation/puits de microplaque. Au bout de 48 hrs, un précurseur radioactif du DNA (H3-Tdr, lmCi/puits) est ajouté ; 18 hrs plus tard, les cellules sont récoltées, lysées et le matériel radioactif incorporé dans 1'ADN est compté.
Des lymphocytes T sont maintenus en culture en alternant des cycles d'activation antigénique et des cycles d'amplification dans du milieu de croissance contenant 10% de "T cell growth factors" (TCGF). L'activation antigénique est réalisée en cultivant 3x104 LcT avec 2x106 cellules présentatrices de l'antigène, la protéine basique de la myéline (PBM) (10 mg/ml) /200 ml milieu de stimulation/puits de microplaque. Au bout de 48 hrs, un précurseur radioactif du DNA (H3-Tdr, lmCi/puits) est ajouté ; 18 hrs plus tard, les cellules sont récoltées, lysées et le matériel radioactif incorporé dans 1'ADN est compté.
Les bloqueurs sont ajoutés au début de l'activation antigénique, pour la durée totale de la culture. Chaque concentration de bloqueur est testée en quadreplicat. Les résultats sont exprimés en moyenne de cpm des 4 échantillons + écart-type.
4) Effets de la kaliotoxine sur un modèle animal de SEP,
I'encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE) induite chez le rat
Cinq groupes (A à E) de 5 rates Lewis âgées de 10 semaines, 200 gr (Charles River) reçoivent 4 millions de LcT (lignée T PAS) spécifiques de la protéine basique myélinique PBM par voie intra-péritonéale au jour 0 (JO).
I'encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE) induite chez le rat
Cinq groupes (A à E) de 5 rates Lewis âgées de 10 semaines, 200 gr (Charles River) reçoivent 4 millions de LcT (lignée T PAS) spécifiques de la protéine basique myélinique PBM par voie intra-péritonéale au jour 0 (JO).
Dans les groupes B et C, la KTX (0,8 et 8 jg /0,1 ml PBS/rat) (PBS, tampon phosphate) est injectée par voie sous cutanée le même jour et quotidiennement jusqu'au 6" jour (J6). Un groupe contrôle (groupe A) reçoit en lieu et place de
KTX, 1 mol de PBS. Les rats du groupe D reçoivent 8 yg de KTX après l'apparition des signes cliniques d'EAE. Les rats du groupe E reçoivent au jour 0 des LcT prétraités par KTX in vitro (100 ng/ml) et quotidiennement 8 ,ug de
KTX jusqu'à J6. Les rats du sixième groupe (F) reçoivent uniquement KTX (8 ,ug) de JO à J6.
KTX, 1 mol de PBS. Les rats du groupe D reçoivent 8 yg de KTX après l'apparition des signes cliniques d'EAE. Les rats du groupe E reçoivent au jour 0 des LcT prétraités par KTX in vitro (100 ng/ml) et quotidiennement 8 ,ug de
KTX jusqu'à J6. Les rats du sixième groupe (F) reçoivent uniquement KTX (8 ,ug) de JO à J6.
Les rats sont observés et pesés quotidiennement. Les signes cliniques de l'EAE (identiques à ceux obtenus par induction active) sont notés de 0 à 4, comme suit (d'après Bourdoulous et coll., 1995):
0 = absence de signes neurologiques,
1 = queue flaccide,
2 = parésie des membres postérieurs pouvant s'accompagner de tremblements,
3= paralysie flasque des membres postérieurs pouvant s'accompagner d'incontinence, d'hémorragies oculaires et nasales,
4 = état moribond (paralysie des membres supérieurs; troubles respiratoires).
0 = absence de signes neurologiques,
1 = queue flaccide,
2 = parésie des membres postérieurs pouvant s'accompagner de tremblements,
3= paralysie flasque des membres postérieurs pouvant s'accompagner d'incontinence, d'hémorragies oculaires et nasales,
4 = état moribond (paralysie des membres supérieurs; troubles respiratoires).
L'EAE clinique moyenne est obtenue en totalisant les signes cliniques d'intensité maximale de chaque rat; les rats ne présentant pas de signes sont inclus et notés 0. La perte pondérale tient compte du poids minimal et maximal de chaque rat au cours des 6 jours de traitement.
5) Levée des blocs de conduction par la kaliotoxine
Deux tests ont été retenus
Nerf optique de rat in vitro
C'est un nerf du système nerveux central, myélinisé par des oligodendrocytes couplés à des astrocytes. Le nerf optique est prélevé chez des rats Lewis et placé dans une chambre perfusée, oxygénée et thermostatée à 36"C. L'enregistrement de l'activité globale des axones est réalisé à l'aide d'une électrode de succion servant de contention à une extrémité du nerf. Une s électrode identique, placée à l'autre extrémité, sert à stimuler le nerf (stimulation donnant une réponse maximale : 0.1 ms, 10 à 30 V). Les contrôles effectués, la préparation est mise en présence de lymphocytes réactifs contre la protéine basique de la myéline (2 105 cellules/ ml) maintenus dans un milieu de culture DMEM.
Deux tests ont été retenus
Nerf optique de rat in vitro
C'est un nerf du système nerveux central, myélinisé par des oligodendrocytes couplés à des astrocytes. Le nerf optique est prélevé chez des rats Lewis et placé dans une chambre perfusée, oxygénée et thermostatée à 36"C. L'enregistrement de l'activité globale des axones est réalisé à l'aide d'une électrode de succion servant de contention à une extrémité du nerf. Une s électrode identique, placée à l'autre extrémité, sert à stimuler le nerf (stimulation donnant une réponse maximale : 0.1 ms, 10 à 30 V). Les contrôles effectués, la préparation est mise en présence de lymphocytes réactifs contre la protéine basique de la myéline (2 105 cellules/ ml) maintenus dans un milieu de culture DMEM.
Potentiels évoqués
La détection dans le SNC des potentiels évoqués par une stimulation appliquée à une patte arrière d'un rat permet d'évaluer l'état fonctionnel des fibres ascendantes du tronc cérébral. La détection se fait au niveau thalamique. Les électrodes métalliques sont implantées à demeure sous contrôle stéréotaxique, deux dans le noyau thalamique ventro-postero-lateral et deux autres sur le scalp. L'animal étant anesthésié au chlorai (0,1 g/rat), la stimulation de la patte arrière droite est réalisée à l'aide d'un bracelet ceinturant la jambe et contenant deux conducteurs. La stimulation seuil (2ms, 25 à 60V) est détectée visuellement par une contraction réflexe. Les potentiels évoqués sont obtenus en moyennant une cinquantaine de stimulations répétées toutes les 5s.
La détection dans le SNC des potentiels évoqués par une stimulation appliquée à une patte arrière d'un rat permet d'évaluer l'état fonctionnel des fibres ascendantes du tronc cérébral. La détection se fait au niveau thalamique. Les électrodes métalliques sont implantées à demeure sous contrôle stéréotaxique, deux dans le noyau thalamique ventro-postero-lateral et deux autres sur le scalp. L'animal étant anesthésié au chlorai (0,1 g/rat), la stimulation de la patte arrière droite est réalisée à l'aide d'un bracelet ceinturant la jambe et contenant deux conducteurs. La stimulation seuil (2ms, 25 à 60V) est détectée visuellement par une contraction réflexe. Les potentiels évoqués sont obtenus en moyennant une cinquantaine de stimulations répétées toutes les 5s.
B) Résultats
l) Affinité de la kaliotoxine pour les canaux Kv
Les courbes doses-réponses montrent une sensibilité élevée des canaux Kv1.1 (IC50 = 1.5 nM), Kv1.2 (il50 = 24 nM) et Kv1.3 (IC50 = 0.1 nM) à la KTX. Le canal Kv3.1 est insensible (ICso > 1 ,uM). Par ailleurs, d'autres auteurs ont montré que les canaux neuronaux Kv1.5 et Kv 3.1 sont insensibles à la KTX (Grissmer et coll, 1994).
l) Affinité de la kaliotoxine pour les canaux Kv
Les courbes doses-réponses montrent une sensibilité élevée des canaux Kv1.1 (IC50 = 1.5 nM), Kv1.2 (il50 = 24 nM) et Kv1.3 (IC50 = 0.1 nM) à la KTX. Le canal Kv3.1 est insensible (ICso > 1 ,uM). Par ailleurs, d'autres auteurs ont montré que les canaux neuronaux Kv1.5 et Kv 3.1 sont insensibles à la KTX (Grissmer et coll, 1994).
Conclusion : Ce profil d'activité correspond idéalement au plan de charge fixé dans le cadre de la présente invention : affinité élevée pour le canal Kv1.3 lymphocytaire; affinité élevée et sélective pour les canaux Kv axonaux Kv1.1 et Kv1.2, par rapport aux autres canaux neuronaux.
Ce profil d'activité est idéal pour combiner un effet immunosuppresseur efficace et un effet neurologique orienté sur la conduction axonale susceptible de permettre d'éviter les effets épileptogènes des aminopyridines.
2) Blocage des canaux Kv lymphocytaires par la kaliotoxine
Résultats : Sur les diverses lignées lymphocytaires testées, la sensibilité des canaux Kv endogènes s'exprimant constitutivement ou après activation antigénique est caractérisée par un coefficient de dissociation Kd de 1 à 2 nM.
Résultats : Sur les diverses lignées lymphocytaires testées, la sensibilité des canaux Kv endogènes s'exprimant constitutivement ou après activation antigénique est caractérisée par un coefficient de dissociation Kd de 1 à 2 nM.
Conclusion : Bien que plus faible, cette sensibilité est en accord avec les données obtenues sur les canaux Kvl .3 exogènes exprimés dans
I'ovocyte de xénope.
I'ovocyte de xénope.
3) Effets in vitro de la kaliotoxine sur la prolifération d'une lignée lymphocytaire T encéphalitogène.
Résultats : Ceux d'une expérience type sont présentés dans l'annexe 1. Quatre séries d'expériences indiquent que 1 à 5 nM de KTX inhibe à 60% I'incorporation du précurseur radioactif de l'ADN et donc, la prolifération cellulaire.
Conclusion : Ces données confirment le rôle majeur des canaux Kv1.3 dans les phases prolifératives des lymphocytes T et l'efficacité de l'effet immuno-suppresseur de la KTX.
4) Effets de la KTX sur l'EAE induite chez le rat
Résultats : L'analyse montre que, du point de vue clinique, le traitement des rats par voie systémique avec la KTX (8 et 0.8 yg) du jour 0 au jour 6 réduit considérablement la sévérité de la maladie et abolit la mortalité. La rémission est totale en moins de 10 jours. Plus significatifs encore sont les résultats du groupe D traité après l'apparition des signes cliniques avec 8 llg de
KTX et seulement pendant 2 jours. Les signes cliniques ne dépassent pas une sévérité moyenne de 1.1 et régressent rapidement.
Résultats : L'analyse montre que, du point de vue clinique, le traitement des rats par voie systémique avec la KTX (8 et 0.8 yg) du jour 0 au jour 6 réduit considérablement la sévérité de la maladie et abolit la mortalité. La rémission est totale en moins de 10 jours. Plus significatifs encore sont les résultats du groupe D traité après l'apparition des signes cliniques avec 8 llg de
KTX et seulement pendant 2 jours. Les signes cliniques ne dépassent pas une sévérité moyenne de 1.1 et régressent rapidement.
Conclusion : Ces données sont une confirmation, sur un modèle animal reconnu représentatif de la sclérose en plaques, de l'action antiinflammatoire et immunosuppressive de la kaliotoxine. De plus, la guérison des animaux du groupe D traité tardivement est un argument indirect en faveur d'une action symptomatique de la KTX sur les canaux Kv du SNC. Cette conclusion est confirmée par les deux tests suivants.
5) Levée des blocs de conduction par la kaliotoxine
Nerf optique de rat in vitro
Résultats : En accord avec les données de Yarom et coll. (1983),
I'incubation d'un nerf optique de rat avec des lymphocytes T pré-activés contre la protéine basique de la myéline entraîne, en lh30-2h, un bloc quasi-total du potentiel global dérivé par une électrode de succion. Une restauration partielle de l'activité contrôle peut alors être obtenue 2 à 3 heures après avoir enlevé les lymphocytes. Par contre, I'addition de KTX (100 nM) restaure rapidement (1520 min) la capacité de conduction du nerf même en présence des lymphocytes.
Nerf optique de rat in vitro
Résultats : En accord avec les données de Yarom et coll. (1983),
I'incubation d'un nerf optique de rat avec des lymphocytes T pré-activés contre la protéine basique de la myéline entraîne, en lh30-2h, un bloc quasi-total du potentiel global dérivé par une électrode de succion. Une restauration partielle de l'activité contrôle peut alors être obtenue 2 à 3 heures après avoir enlevé les lymphocytes. Par contre, I'addition de KTX (100 nM) restaure rapidement (1520 min) la capacité de conduction du nerf même en présence des lymphocytes.
Conclusion : Ces expériences valident l'hypothèse que les blocs de conduction dans les fibres centrales démyélinisées peuvent être levés en agissant sur les canaux potassium neuronaux. Elles montrent également que la kaliotoxine, par sa spécificité, exerce cet effet à des concentrations nanomolaires.
Potentiels évoqués
Résultats : Sur un animal dont les signes cliniques d'EAE atteignent le niveau 2 (paralysie du train postérieur), les potentiels évoqués par une stimulation électrique de la patte arrière sont retardés et déprimés de 80 à 90% par rapport aux enregistrements contrôle effectués avant l'induction de l'EAE. Une injection sous-cutanée de KTX (10 yg) est suivie d'une récupération progressive de l'amplitude et de la latence des potentiels évoqués. La récupération devient totale en 90 minutes.
Résultats : Sur un animal dont les signes cliniques d'EAE atteignent le niveau 2 (paralysie du train postérieur), les potentiels évoqués par une stimulation électrique de la patte arrière sont retardés et déprimés de 80 à 90% par rapport aux enregistrements contrôle effectués avant l'induction de l'EAE. Une injection sous-cutanée de KTX (10 yg) est suivie d'une récupération progressive de l'amplitude et de la latence des potentiels évoqués. La récupération devient totale en 90 minutes.
Conclusion : Cette expérience menée in vivo montre que les blocs de conduction consécutifs au processus inflammatoire des fibres situées dans la partie lombaire du tronc cérébral sont levés par une injection aiguë de
KTX. Les résultats confirment notre hypothèse d'un effet neurologique positif de la KTX. Ils montrent directement que le bloqueur peut passer lentement la barrière hémato-méningée, probablement au niveau des sites d'inflammation.
KTX. Les résultats confirment notre hypothèse d'un effet neurologique positif de la KTX. Ils montrent directement que le bloqueur peut passer lentement la barrière hémato-méningée, probablement au niveau des sites d'inflammation.
Cette dernière conclusion est d'importance quant à la possibilité de restaurer une conduction axonique satisfaisante apte à rétablir une fonction motrice altérée.
Références Bibliographiques
Bever CT, (1994), The current status of studies of aminopyridines in patients with multiple sclerosis. Ann Neurol . 36; S118-121.
Bever CT, (1994), The current status of studies of aminopyridines in patients with multiple sclerosis. Ann Neurol . 36; S118-121.
Bourdoulous et coll., (1995), Eur. J. Immunol., 25, p 1176.
Chandy K.G. et Gutman G. (1994), Voltage-gated K+ genes. In Handbook of
Receptors and Channels, A. North, ed., CRC Press, Boca Raton, FL, p 1.71.
Receptors and Channels, A. North, ed., CRC Press, Boca Raton, FL, p 1.71.
Grissmer S, Nguyen AN, Aiyar J, Hanson DC, Mather RJ, Gutman GA,
Karmilowicz MJ, Auperin DD and Chandy KG, (1994) Pharmacological characterization of five cloned voltage-gated K+ channels, types Kil.1, 1.2, 1.3, 1.5 and 3.1, stably expressed in mammalian cell lines. Molec. Pharmacol.
Karmilowicz MJ, Auperin DD and Chandy KG, (1994) Pharmacological characterization of five cloned voltage-gated K+ channels, types Kil.1, 1.2, 1.3, 1.5 and 3.1, stably expressed in mammalian cell lines. Molec. Pharmacol.
45; p. 1227.
Jacobs L, Goodkin DE, Rudick RA and Herndorn R, (1994) Advances in specific therapy for multiple sclerosis. Cur. Opin. Neurol. 7; p. 250.
Kushner L, Lerma J, Bennet MVL and Zukin RS, (1989) Using the xenopus oocyte system for expression and cloning of neuroreceptors and channels. In,
Methods in Neurosciences . Vol. 1; p. 3. Academic Press Inc.
Methods in Neurosciences . Vol. 1; p. 3. Academic Press Inc.
McNamara N.M.C., Averill S., Wilkin G.P., Dolly J.O., Priestley J.V., (1996), Ultrastructural localization of a voltage-gated K channel a subunit (Kv1.2) in the rat cerabellum, Eur. J. of Neurosciences, 8 p. 688-699.
Noseworthy JH (1993) Clinical trials in multiple sclerosis. Curr. Opin.
Neurosurg. 6; 209-215.
Polman CH, Bertelsman FW, van Loenen AC and Koetsier JC, (1994), 4aminopyridine in the treatment of patients with multiple sclerosis. Long-term efficacy and safety. Arch. Neurol. 51; p. 292.
Polman CH and Hartung HP, (1995) The treatment of multiple sclerosis: current and future. Curr .Opin. Neurol. 8; p. 200.
Sherratt RM, Bostock H and Sears TA, (1980) Effects of 4-aminopyridine on normal and demyelinated mammalian nerve fibres. Nature. 283; p. 570.
Stühmer W., Ruppesberg J.P., Schroter K.H., Sakmann B., Stocker M.,
Giese K.P., Perschke A., Baumann A., Pongs O., (1989), Molecular basis of functional diversity of voltage-gated potassium channel in mammalian brain,
The EMBO Journal, 8 : p. 3235-3244.
Giese K.P., Perschke A., Baumann A., Pongs O., (1989), Molecular basis of functional diversity of voltage-gated potassium channel in mammalian brain,
The EMBO Journal, 8 : p. 3235-3244.
Uitdehaag BM, Polman CH, de Groot CJ and Dijkstra CD, (1994), Effect of K + channel blockers on the clinical course and histological features of experimental allergic encephalomyelitis. Acta. Neurol. Scand. 90; p. 299.
Wang H., Kunkel D.D., Schwartzkroin P.A., Tempel B.L., (1994),
Localization of Kv1.1 and Kv1.2, two K channel protein, to synaptic terminals, somata, and dendrites in the mouse brain, The J. of Neuroscience, 14 : p. 45884599.
Localization of Kv1.1 and Kv1.2, two K channel protein, to synaptic terminals, somata, and dendrites in the mouse brain, The J. of Neuroscience, 14 : p. 45884599.
Yarom Y, Naparstek Y, Lev-Ram V, Holoshitz J, Ben-Nun A and Cohen
IR, (1983) Immunospecifie inhibition of nerve conduction by T lymphocytes reactive to basic protein of myelin. Nature. 303; p 246.
IR, (1983) Immunospecifie inhibition of nerve conduction by T lymphocytes reactive to basic protein of myelin. Nature. 303; p 246.
LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
(B) RUE: 3, rue Michel-Ange
(C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: F-75016
(ii) TITRE DE L' INVENTION: UTILISATION DES BLOQUEURS DES CANAUX
POTASSIUM DANS LE TRAITEMENT DES MALADIES NEUROLOGIQUES
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 10
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 39 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
Thr Ile Ile Asn Val Lys Cys Thr Ser Pro Lys Gln Cys Ser Lys Pro
1 5 10 15
Cys Lys Glu Leu Tyr Gly Ser Ser Ala Gly Ala Lys Cys Met Asn Gly
20 25 30
Lys Cys Lys Cys Tyr Asn Asn
35 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 38 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Gly Val Glu Ile Asn Val Lys Cys Ser Gly Ser Pro Gln Cys Leu Lys
1 5 10 15
Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys
20 25 30
Cys His Cys Thr Pro Lys
35 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 37 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
Val Arg île Pro Val Ser Cys Lys His Ser Gly Gln Cys Leu Lys Pro
1 5 10 15
Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys Cys
20 25 30
Asp Cys Thr Pro Lys
35 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 37 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
Val Gly Ile Pro Val Ser Cys Lys His Ser Gly Gln Cys Ile Lys Pro
1 5 10 15
Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys
20 25 30
Asp Cys Thr Pro Lys
35 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 38 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..114
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
Gly Val Pro Ile Asn Val Ser Cys Thr Gly Ser Pro Gln Cys Ile Lys
1 5 10 15
Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys
20 25 30
Cys His Cys Thr Pro Lys
35 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 38 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
Gly Val Glu Ile Asn Val Lys Cys Ser Gly Ser Abu Gln Cys Leu Lys
1 5 10 15
Abu Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys
20 25 30
Cys His Cys Thr Pro Lys
35
Abu acide aminobutyrique (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 39 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
Gly Val Glu Ile Asn Val Lys Cys Ser Gly Ser Lys Gln Cys Leu Lys
1 5 10 15
Val Cys Lys Asp Ala Phe Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Arg
20 25 30
Lys Cys His Cys Thr Pro Lys
35 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 37 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
Val Cys Arg Asp Trp Phe Lys Glu Thr Ala Cys Arg His Ala Lys Ser
1 5 10 15
Leu Gly Asn Cys Arg Thr Ser Gin Lys Tyr Arg Ala Asn Cys Ala Lys
20 25 30
Thr Cys Glu Leu Cys
35 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 35 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln
1 5 10 15
Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys
20 25 30
Gly Thr Cys
35 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 36 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:
Ala Cys Lys Asp Asn Phe Ala Ala Ala Thr Cys Lys His Thr Lys Glu
1 5 10 15
Asn Lys Asn Cys Gly Ser Gln Lys Tyr Ala Thr Asn Cys Ala Lys Thr
20 25 30
Cys Gly Leu Cys
35
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
(B) RUE: 3, rue Michel-Ange
(C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: F-75016
(ii) TITRE DE L' INVENTION: UTILISATION DES BLOQUEURS DES CANAUX
POTASSIUM DANS LE TRAITEMENT DES MALADIES NEUROLOGIQUES
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 10
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 39 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
Thr Ile Ile Asn Val Lys Cys Thr Ser Pro Lys Gln Cys Ser Lys Pro
1 5 10 15
Cys Lys Glu Leu Tyr Gly Ser Ser Ala Gly Ala Lys Cys Met Asn Gly
20 25 30
Lys Cys Lys Cys Tyr Asn Asn
35 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 38 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Gly Val Glu Ile Asn Val Lys Cys Ser Gly Ser Pro Gln Cys Leu Lys
1 5 10 15
Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys
20 25 30
Cys His Cys Thr Pro Lys
35 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 37 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
Val Arg île Pro Val Ser Cys Lys His Ser Gly Gln Cys Leu Lys Pro
1 5 10 15
Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys Cys
20 25 30
Asp Cys Thr Pro Lys
35 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 37 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
Val Gly Ile Pro Val Ser Cys Lys His Ser Gly Gln Cys Ile Lys Pro
1 5 10 15
Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys
20 25 30
Asp Cys Thr Pro Lys
35 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 38 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..114
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
Gly Val Pro Ile Asn Val Ser Cys Thr Gly Ser Pro Gln Cys Ile Lys
1 5 10 15
Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys
20 25 30
Cys His Cys Thr Pro Lys
35 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 38 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
Gly Val Glu Ile Asn Val Lys Cys Ser Gly Ser Abu Gln Cys Leu Lys
1 5 10 15
Abu Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys
20 25 30
Cys His Cys Thr Pro Lys
35
Abu acide aminobutyrique (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 39 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
Gly Val Glu Ile Asn Val Lys Cys Ser Gly Ser Lys Gln Cys Leu Lys
1 5 10 15
Val Cys Lys Asp Ala Phe Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Arg
20 25 30
Lys Cys His Cys Thr Pro Lys
35 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 37 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
Val Cys Arg Asp Trp Phe Lys Glu Thr Ala Cys Arg His Ala Lys Ser
1 5 10 15
Leu Gly Asn Cys Arg Thr Ser Gin Lys Tyr Arg Ala Asn Cys Ala Lys
20 25 30
Thr Cys Glu Leu Cys
35 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 35 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln
1 5 10 15
Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys
20 25 30
Gly Thr Cys
35 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 36 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:
Ala Cys Lys Asp Asn Phe Ala Ala Ala Thr Cys Lys His Thr Lys Glu
1 5 10 15
Asn Lys Asn Cys Gly Ser Gln Lys Tyr Ala Thr Asn Cys Ala Lys Thr
20 25 30
Cys Gly Leu Cys
35
Claims (18)
1. Utilisation de composés bloquant les canaux potassium neuronaux de type Kvl.l, Kv1.2, et, le cas échéant Kv1.3, pour la préparation de ncédicaments destinés au traitement de maladies neurologiques chez l'homme ou l'animal dans lesquelles se produit un blocage de la conduction nerveuse, lesdites maladies étant le cas échéant d'origine immunitaire.
2. Utilisation selon la revendication 1, pour la préparation de médicaments destinés au traitement des maladies neurologiques, le cas échéant d'origine immunitaires, suivantes
- les pathologies neurologiques centrales inflammatoires à localisation cérébrale et médullaire, notamment
. Ia sclérose en plaque et maladies apparentées (Balo, Devic, encéphalite aiguë disséminée et hémorragiques, neuropathies optiques isolées);
les complications centrales des maladies de système: Beheet,
Sarcoïdose, autres vascularites,
- les pathologies périphériques inflammatoires ou apparentées, notamment:
les polyradiculonévrites aiguës et chroniques,
. les neuropathies liées à des atteintes infectieuses et à des collagénoses,
- les pathologies neurologiques dégénératives, notamment la sclérose latérale amyotrophique, les neuropathies avec bloc de conduction,
- les autres atteintes centrales cérébrales et médullaires, notamment les pathologies d'origine métabolique, les pathologies vasculaires ischémiques artérielles et veineuses et hémorragiques, les pathologies tumorales primitives et secondaires, les pathologies traumatiques.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, de composés peptidiques issus de venins de scorpion, ou de composés dérivés de ces derniers, ces composés ou dérivés comprenant la séquence en acides aminés répondant à la formule générale suivante (I) suivante Cys-AA9-AA 10-AA 11-AA1 2-AA i 3-Cys-AA 15-AA 16-AA 17-Cys-AA 19-AA20
AA2 1 -(AA22-)nl -AA23-AA24-(AA25)n2-AA26-AA27-AA28-Lys-cys-AA3 1- AA32-AA33-Lys-Cys-AA36-Cys (I) dans laquelle
- nl, et n2, indépendamment l'un de l'autre, représentent zéro ou 1,
- AA9 à AA13, AA15 à AA17, AA19 à AA28, AA31 à AA33, et
AA36, indépendamment les uns des autres, représentent un acide aminé quelconque, naturel ou non.
4. Utilisation selon la revendication 3, de composés peptidiques de formule (II) suivante:
AA2-AA3-Ile-Asn-Val-Lys-Cys-Thr-Ser-Pro-AA12-Gln-Cys-AA15-AA16-Pro Cys-Lys-AA20-AA2 1 -AA22-Gly-AA24-AA25 -Ala-Gly-AA28-Lys-Cys-AA3 1-
Asn-Gly-Lys-Cys-Lys-Cys-Tyr-AA39-AA40 (II)
dans laquelle AA2, AA3, AA12, AA15, AA16, AA20 à AA22, AA24,
AA25, AA28, AA31, AA39, et AA40, indépendamment les uns des autres représentent un acide aminé quelconque naturel ou non.
5. Utilisation selon la revendication 4, de la noxiustoxine correspondant à la séquence en acides aminés SEQ ID NO 1.
6. Utilisation selon la revendication 3, de composés peptidiques de formule (III) suivante:
AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-Cys-AA9-AA10-Ser-AA12-Gln-Cys
AA15-Lys-AA17-Cys-Lys-Asp-Ala-(AA22)n1-Gly-AA24-Arg-Phe-Gly-Lys
Cys-AA31-Asn-AA33-Lys-Cys-AA36-Cys-AA38-AA39-AA40 (III)
dans laquelle
- AA1 à AA7, AA9, AA10, AA12, AA15, AA17, AA22, AA24, AA31,
AA33, AA36, et AA38 à AA40, indépendamment les uns des autres représentent un acide aminé quelconque naturel ou non,
- nl représente zéro ou 1.
7. Utilisation selon la revendication 6, de composés peptidiques de formule (IV) suivante:
AA1-Val-AA3-Ile-AA5-Val-AA7-Cys-AA9-AA10-Ser-AA12-Gln-Cys-AA15
Lys-Pro-Cys-Lys-Asp-Ala-Gly-Met-Arg-Phe-Gly-Lys-Cys-AA31-Asn-AA33
Lys-Cys-His-Cys-Thr-Pro-Lys (IV)
dans laquelle AA3, AA5, AA7, AA9, AA10, AA12 AA15, AA31, et AA33 indépendamment les uns des autres, représentent un acide aminé quelconque naturel ou non.
8. Utilisation selon la revendication 6 ou 7, des composés peptidiques suivants - la kaliotoxine correspondant à la séquence en acides aminés SEQ ID NO 2, - la kaliotoxine 2 correspondant à la séquence en acides aminés SEQ ID NO 3, - la kaliotoxine 3 correspondant à la séquence en acides aminés SEQ ID NO 4, - I'agitoxine 2 correspondant à la séquence en acides aminés SEQ ID NO 5.
9. Utilisation selon la revendication 6, de composés peptidiques de formule (III) dans laquelle
- AA12 représente l'acide aminobutyrique (Abu) ou la lysine,
- AA17 représente l'acide aminobutyrique (Abu) ou la valine,
- lorsque n représente 1, AA22 représente la phénylalanine,
- AA24 et AA31 représentent la méthionine ou la norleucine.
10. Utilisation selon la revendication 9, des composés peptidiques suivants:
- (P12/Abu, P17/Abu) KTX correspondant à la séquence en acides aminés
SEQ ID NO 6,
- (P12/K, P17/V, F22) KTX correspondant à la séquence en acides aminés
SEQ ID NO 7.
11. Utilisation selon la revendication 9, des composés peptidiques de formule (III), dans laquelle nl = 0, et correspondant à la formule (V) suivante
AA1 -AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-Cys-AA9-AA10-Ser-Abu-Gln-Cys-AA1 5
Lys-Abu-Cys-Lys-Asp-Ala-Gly-Nle-Arg-Phe-Gly-Lys-Cys-Nle-Asn-AA33-Lys-
Cys-AA36-Cys-AA38-AA39-AA40 (V) dans laquelle AA1 à AA7, AA9, AA10, AA15, AA33, AA36, et AA38 à
AA40, indépendamment les uns des autres, représentent un acide aminé quelconque naturel ou non.
12. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, de composés peptidiques issus d'anémones de mer, ou de composés dérivés de ces derniers, ces composés ou dérivés comprenant la séquence en acides aminés répondant à la formule générale suivante (VI) suivante (AA1 )n i -(AA2)n2-Cys-AAq-Asp-AA6-AA7-AA8-AA9-AA 10-AA11 -Cys (AA13)n3-AA14-(AA15)n4-AA16-(AA17)n5-AA18-(AA19)n6-AA20-Cys
AA22-(AA23)n7-Ser-AA25-Lys-Tyr-AA28-(AA29)n8-AA30-Cys-AA32-Lys
Thr-Cys-AA36-AA37-Cys (VI) dans laquelle
- nl à n8, indépendamment les uns des autres, représentent zéro ou 1,
- AA2, AA2, AA4, AA6 à AA11, AA221 AA23, AA25, AA28 à
AA30, AA32, AA36 et AA37 indépendamment les uns des autres, représentent un acide aminé quelconque naturel ou non.
13. Utilisation selon la revendication 12, des composés peptidiques suivants - la BgK correspondant à la séquence en acides aminés SEQ ID NO 8, - la ShK correspondant à la séquence en acides aminés SEQ ID NO 9, - la kaliseptine correspondant à la séquence en acides aminés SEQ ID NO 10.
14. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend un ou plusieurs composés peptidiques définis dans l'une des revendication 1 à 13, en association avec un véhicule pharmaceutique acceptable.
15. Kaliotoxine 3 correspondant à la séquence en acides aminés SEQ ID
NO 4.
16. Composés peptidiques de formule (III) suivante
AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-Cys-AA9-AA10-Ser-AA12-Gln-Cys
AA15-Lys-AA17-Cys-Lys-Asp-Ala-(AA22)n1-Gly-Aa24-Arg-Phe-Gly-Lys
Cys-AA31-Asn-AA33-Lys-Cys-AA36-Cys-AA38-AA39-AA40 (III)
dans laquelle
- AA1 à AA7, AA9, AA10, AA121 AA15, AA17, AA22, AA24, AA31,
AA33, AA36, et AA38 à AA40, indépendamment les uns des autres représentent un acide aminé quelconque naturel ou non,
- AA12 représente l'acide aminobutyrique (Abu) ou la lysine, et/ou
- AA17 représente l'acide aminobutyrique (Abu) ou la valine, et/ou
- nl représente zéro ou 1, et lorsque n représente 1, AA22 représente la phénylalanine, et/ou
- AA24 et AA31 représentent, indépendamment l'un de l'autre, la méthionine ou la norleucine.
17. Composés peptidiques selon la revendication 16, correspondant aux analogues suivants de la kaliotoxine
- (P12/Abu, P17/Abu) KTX correspondant à la séquence en acides aminés
SEQ ID NO 6,
- (P12/K, P17/V, F22) KTX correspondant à la séquence en acides aminés
SEQ ID NO 7.
18. Composés peptidiques selon la revendication 17, correspondant aux dérivés de formule (V) suivante
AA1-AA2-AA3-AA-AA5-AA6-AA7-Cys-AA9-AA10-Ser-Abu-Gln-Cys-AA1-
Lys-Abu-Cys-Lys-Asp-Ala-Gly-Nle-Arg-Phe-Gly-Lys-Cys-Nle-Asn-AA33-Lys Cys-AA36-Cys-AA38-AA39-AA4O (V)
dans laquelle AA1 à AA7, AA9, AA10, AA15, AA33, AA36, et AA38 à
AA40, indépendamment les uns des autres, représentent un acide aminé quelconque naturel ou non.
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9712421A FR2769226B1 (fr) | 1997-10-06 | 1997-10-06 | Utilisation des bloqueurs des canaux potassium dans le traitement des maladies neurologiques |
| AU95442/98A AU9544298A (en) | 1997-10-06 | 1998-10-06 | Use of neuronal and lymphocytic potassium canal inhibitors for treating neurological diseases of immune origin |
| CA002305786A CA2305786A1 (fr) | 1997-10-06 | 1998-10-06 | Utilisation des bloqueurs des canaux potassium neuronaux et lymphocytaires dans le traitement des maladies neurologiques d'origine immunitaire |
| JP2000514930A JP2001519356A (ja) | 1997-10-06 | 1998-10-06 | 免疫起源の神経学上の疾患を処置するための、ニューロン及びリンパ球カリウムチャンネル阻害剤の使用 |
| PCT/FR1998/002136 WO1999018123A1 (fr) | 1997-10-06 | 1998-10-06 | Utilisation des bloqueurs des canaux potassium neuronaux et lymphocytaires dans le traitement des maladies neurologiques d'origine immunitaire |
| EP98949027A EP1021461A1 (fr) | 1997-10-06 | 1998-10-06 | Utilisation des bloqueurs des canaux potassium neuronaux et lymphocytaires dans le traitement des maladies neurologiques d'origine immunitaire |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9712421A FR2769226B1 (fr) | 1997-10-06 | 1997-10-06 | Utilisation des bloqueurs des canaux potassium dans le traitement des maladies neurologiques |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2769226A1 true FR2769226A1 (fr) | 1999-04-09 |
| FR2769226B1 FR2769226B1 (fr) | 2000-06-02 |
Family
ID=9511862
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR9712421A Expired - Fee Related FR2769226B1 (fr) | 1997-10-06 | 1997-10-06 | Utilisation des bloqueurs des canaux potassium dans le traitement des maladies neurologiques |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1021461A1 (fr) |
| JP (1) | JP2001519356A (fr) |
| AU (1) | AU9544298A (fr) |
| CA (1) | CA2305786A1 (fr) |
| FR (1) | FR2769226B1 (fr) |
| WO (1) | WO1999018123A1 (fr) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001060844A2 (fr) * | 2000-02-17 | 2001-08-23 | Sension Biologische Detektions- Und Schnelltestsysteme Gmbh | Peptide et acide nucleique codant pour ce peptide pour la determination, le diagnostic et la therapie de maladies du systeme nerveux |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB0414272D0 (en) * | 2004-06-25 | 2004-07-28 | Cellpep Sa | OsK1 derivatives |
| US8716437B2 (en) | 2007-12-07 | 2014-05-06 | Steven A. Goldstein | Identification of toxin ligands |
| CN108186976A (zh) * | 2018-04-06 | 2018-06-22 | 王建忠 | 一种治疗低钾性周期性麻痹的中药 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0063091A2 (fr) * | 1981-04-07 | 1982-10-20 | William E. Haast | Mélanges de vénins de serpents pour le traitement des troubles neurologiques et des affections apparentées |
| US5494895A (en) * | 1993-07-22 | 1996-02-27 | Merck & Co., Inc. | Scorpion peptide margatoxin with immunosuppressant activity |
| JPH09278797A (ja) * | 1996-04-05 | 1997-10-28 | Suntory Ltd | サソリ毒素関連ペプチド |
-
1997
- 1997-10-06 FR FR9712421A patent/FR2769226B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-10-06 AU AU95442/98A patent/AU9544298A/en not_active Abandoned
- 1998-10-06 EP EP98949027A patent/EP1021461A1/fr not_active Withdrawn
- 1998-10-06 CA CA002305786A patent/CA2305786A1/fr not_active Abandoned
- 1998-10-06 JP JP2000514930A patent/JP2001519356A/ja active Pending
- 1998-10-06 WO PCT/FR1998/002136 patent/WO1999018123A1/fr not_active Application Discontinuation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0063091A2 (fr) * | 1981-04-07 | 1982-10-20 | William E. Haast | Mélanges de vénins de serpents pour le traitement des troubles neurologiques et des affections apparentées |
| US5494895A (en) * | 1993-07-22 | 1996-02-27 | Merck & Co., Inc. | Scorpion peptide margatoxin with immunosuppressant activity |
| JPH09278797A (ja) * | 1996-04-05 | 1997-10-28 | Suntory Ltd | サソリ毒素関連ペプチド |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| A. HARVEY ET AL.: "Sructure-activity studies on scorpion toxins that block potassium channels", TOXICON, vol. 33, no. 4, 1995, pages 425 - 436, XP002070147 * |
| DATABASE WPI Section Ch Week 9803, Derwent World Patents Index; Class B04, AN 98-022250, XP002070151 * |
| F. LARABA-DJEBARI ET AL.: "The kaliotoxin family enlarged", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY., vol. 269, no. 52, December 1994 (1994-12-01), MD US, pages 32835 - 32843, XP002070150 * |
| M. CREST ET AL: "Kaliotoxin, a novel peptidyl inhibitor of neuronal BK-type Calcium activated K+ channels characterised from Androctonus mauretanicus mauretanicus venom", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY., vol. 267, no. 3, 1992, MD US, pages 1640 - 1647, XP002070148 * |
| M. GARCIA ET AL: "Purification and characterisation of three inhibitors of voltage dependent K+ channels from leiurus quinquestriatus var. hebraeus venom", BIOCHEMISTRY, vol. 33, 1994, pages 6834 - 6839, XP002070149 * |
| TUDOR J E ET AL: "SOLUTION STRUCTURE OF SHK TOXIN, A NOVEL POTASSIUM CHANNEL INHIBITOR FROM A SEA ANEMONE", NATURE STRUCTURAL BIOLOGY, vol. 3, no. 4, April 1996 (1996-04-01), pages 317 - 320, XP002061901 * |
| W.F. HOPKINS ET AL.: "Voltage-gated Potassium channel inhibitors", CURR. PHARM. DES., vol. 2, no. 4, 1996, pages 389 - 396, XP002070146 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001060844A2 (fr) * | 2000-02-17 | 2001-08-23 | Sension Biologische Detektions- Und Schnelltestsysteme Gmbh | Peptide et acide nucleique codant pour ce peptide pour la determination, le diagnostic et la therapie de maladies du systeme nerveux |
| WO2001060844A3 (fr) * | 2000-02-17 | 2002-04-11 | Sension Biolog Detektions Und | Peptide et acide nucleique codant pour ce peptide pour la determination, le diagnostic et la therapie de maladies du systeme nerveux |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU9544298A (en) | 1999-04-27 |
| FR2769226B1 (fr) | 2000-06-02 |
| JP2001519356A (ja) | 2001-10-23 |
| CA2305786A1 (fr) | 1999-04-15 |
| WO1999018123A1 (fr) | 1999-04-15 |
| EP1021461A1 (fr) | 2000-07-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0787741A1 (fr) | Compositions pharmaamyline isolée des cellules des ilots pancréatiques et compositions pharmaceutiques le contenant | |
| CA2184841C (fr) | Adenovirus recombinants codant pour le facteur neurotrophique des cellules gliales (gdnf) | |
| JP2011523935A (ja) | シナプス後部を標的とした化学的除神経剤およびそれらの使用方法 | |
| JP2791074B2 (ja) | 分子状デコイアント及びその使用方法 | |
| EP0485578B1 (fr) | Facteurs de croissance neurotropes comprenant un peptide homeoboite | |
| JP2003532618A (ja) | 細胞、神経系−特異的抗原およびそれらの用途 | |
| JPH09508140A (ja) | キメラｔｎｆ結合タンパク質を含有する医薬組成物 | |
| US5840689A (en) | Method for stimulating the regrowth of neurons | |
| FR2546407A1 (fr) | Medicament a activite anti-allergique pour administration locale a base d'acide n-acetyl(a,b)-aspartyl glutamique | |
| FR2769226A1 (fr) | Utilisation des bloqueurs des canaux potassium dans le traitement des maladies neurologiques | |
| CN113508126B (zh) | 新型肽及其用途 | |
| JP2008528681A (ja) | 心血管障害を治療及び予防するための合成ペプチド共重合体 | |
| JP2002509110A (ja) | ヘビ毒に由来する鎮痛薬 | |
| DE69737891T2 (de) | Verwendung von immuntherapeutischem wirkstoff auf peptidbasis | |
| DE60115475T2 (de) | VARIANTEN DES DERMATOPHAGOIDES-ALLERGENS DER p 2 | |
| JPH08511172A (ja) | 血管障害の遺伝子治療に用いるためのｄｎａ発現ベクター | |
| EP0415999B1 (fr) | Preparations utilises comme traitement du psoriasis et des deficits neuropsychiatriques | |
| WO1995025803A1 (fr) | ADENOVIRUS RECOMBINANTS CODANT POUR LE FACTEUR DE CROISSANCE DES FIBROBLASTES ACIDES (aFGF) | |
| JPH06298662A (ja) | 自己免疫疾患の予防治療剤 | |
| JPH06511241A (ja) | 自己免疫疾患の診断および治療 | |
| WO2001096564A2 (fr) | Isoforme d'hla-g (hla-g7) et ses applications | |
| EP0750676A1 (fr) | Adenovirus recombinants codant pour le facteur neurotrophique derive du cerveau (bdnf) | |
| CA2166298A1 (fr) | Famille de peptides appeles xenoxines | |
| FR2733913A1 (fr) | Sequence d'adn a titre de medicament, et compositions pharmaceutiques en contenant | |
| CA2322018A1 (fr) | Utilisation d'analogues du vip dans la prevention et le traitement des lesions cerebrales du nouveau-ne humain |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| ST | Notification of lapse |