JP2008528681A - 心血管障害を治療及び予防するための合成ペプチド共重合体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、既知の共重合体グラチラマー(共重合体1としても知られる)及び共重合体1関連ヘテロ重合体又は規則的ペプチドを含めたランダム共重合体又は規則的共重合体の、心血管疾患及び障害を治療又は予防するための使用に関する。
Description
本発明は、既知の共重合体グラチラマー(共重合体1とも呼ばれる)及び共重合体1関連ヘテロ重合体又は規則的ペプチドを含めたランダム共重合体又は規則的共重合体の、心血管疾患及び障害を治療又は予防するための使用に関する。
(心血管疾患及び障害)
心筋虚血障害は、心臓の血流が制限されたとき(虚血)、及び/又は心筋への酸素供給が損なわれたとき(低酸素)、その結果、心臓が求める酸素の必要量が供給によって満たされない場合に起こる。動脈硬化に起因する冠動脈疾患(CAD)、特にアテローム硬化症は、虚血の最も一般的な原因である。
心筋虚血障害は、心臓の血流が制限されたとき(虚血)、及び/又は心筋への酸素供給が損なわれたとき(低酸素)、その結果、心臓が求める酸素の必要量が供給によって満たされない場合に起こる。動脈硬化に起因する冠動脈疾患(CAD)、特にアテローム硬化症は、虚血の最も一般的な原因である。
アテローム硬化症は、米国、ヨーロッパ、及びアジアの一部では、主な死因の1つとなっている。アテローム硬化症は、慢性炎症疾患の多くの特徴を有し、多数の研究において、免疫系、特にマクロファージ及びTリンパ球の活性化に関連していることが示されている。(Varadhacharyら、2001年、Cell Immunol.213(1):45−51)。動脈硬化病変中に存在するTリンパ球の主要なクラスは、mRNAレベル及びタンパク質レベルの両方において、CD4+であり、Th1誘導因子であるIL−12も共に存在する(Varadhacharyら、同上)。CD4+のTリンパ球は、Th1又はTh2系列に分化しうる。Th2誘導因子であるIL−10も存在しているが、これは、はるかにより限定的な様式で存在している(Varadhacharyら、同上)。動脈硬化病変におけるTh1リンパ球の役割の証拠として、インターフェロンγ(IFN−γ)mRNA及びタンパク質の検出によって明らかにされるものがある(Zhouら、1998年、J.Clin.Invest.101:1717−1725)。
apoE遺伝子の部位特異的遺伝子破壊を有するマウスは、大動脈弓及び上行大動脈の両方に動脈硬化病変を含む深刻なアテローム硬化症を発症する。これらのマウスは、正常な飼料では約9カ月後に、或いは高脂肪食では若干3カ月後に、動脈硬化病変を発症し、心血管疾患のモデルとして用いられている。しかし、apoE及びIFN−γに欠失を有する複合ノックアウトマウスは、apoEノックアウトマウスと比較して、動脈硬化病変の大きさの実質的な縮小を示した(Guptaら、1997年、J Clin Invest.99:2752−2761)。IFN−γ、又はIFN−γ放出因子であるIL−12及びIL−18をapoE欠失マウスに注射すると、その結果、アテローム硬化症の進行が起こる(Leeら、1999、Arterioscler Thromb Vasc Biol.19:734−742)。抗体(α−CD4+)又はサイトカイン(IL−4)によって、Th1細胞の存在比を低下させることによっても、病変サイズの著しい低減が引き起こされた。これは、Th表現型が脂肪性病変の発達に実際に重要であることを示唆している(Huberら、2001、Circulation 103:2610−2616)。
アテローム硬化症を治療するための現在利用可能な方法には、カルシウムチャネル遮断薬、β遮断薬、アンギオテンシン転換酵素(ACE)阻害剤、アンジオテンシンII受容体遮断薬、血管拡張薬、強心配糖体及び利尿剤、コレステロール低下薬、並びにアポリポタンパク質A−1(アポA1)誘導体などの、高血圧を治療するための非特異的な薬物の使用が含まれる。しかし、これらの薬物は、アテローム硬化症に対して非特異的であり、むしろ、高血圧、血管壁の破裂、及び血栓形成など、アテローム硬化症に関連した症候の軽減を目的としたものである。
(共重合体1)
共重合体1(Cop1、酢酸グラチラマーという慣用的化学名でも知られている)は、L−Glu、L−Lys、L−Ala、及びL−Tyrの4種類のアミノ酸で構成された合成ランダム共重合体であり(以下「Cop1」)、多発性硬化症治療用に、COPAXONE(登録商標)という名称で認可されている(Shoenfeld Y編集の「The Decade in Autoimmunity」、Elsevier社、183、1998年における、Teitelbaumら)。共重合体1は、Th細胞に関連した免疫調節効果を有することが実証されている。
共重合体1(Cop1、酢酸グラチラマーという慣用的化学名でも知られている)は、L−Glu、L−Lys、L−Ala、及びL−Tyrの4種類のアミノ酸で構成された合成ランダム共重合体であり(以下「Cop1」)、多発性硬化症治療用に、COPAXONE(登録商標)という名称で認可されている(Shoenfeld Y編集の「The Decade in Autoimmunity」、Elsevier社、183、1998年における、Teitelbaumら)。共重合体1は、Th細胞に関連した免疫調節効果を有することが実証されている。
Cop1は、L−Ala、L−Glu、L−Lys、及びL−Tyr残基からなり、ほぼAla6部分、Glu2部分、Lys4.5部分、Tyr1部分というモル比を有する高分子量塩基性合成ランダム共重合体であり、最初に、米国特許第3,849,550号明細書に、実験的アレルギー性脳脊髄炎(EAE)を治療又は予防するための薬剤として記載された。EAEは、感受性の動物で誘導できる多発性硬化症(MS)に類似した疾患である。D−共重合体1、すなわちD−Cop1も記載されており、これは、上記4種類のアミノ酸がD−配置を有するもの、すなわち、D−Ala、D−Glu、D−Lys、及びD−Tyr残基を含有するランダム共重合体である(Webbら、1976年、Immunochemistry、13:333−337)。
さらに別のいくつかの障害にもCop1が有益な効果を与えることが、最近、動物モデルで見出された。Cop1は、骨髄移植の場合には、米国特許第5,858,964号明細書に開示されている通り、移植片宿主相関病(GVHD)に現れる免疫拒絶反応を抑制し、実質臓器移植の場合には、国際公開第00/27417号パンフレットに開示されている通り、移植拒絶反応を抑制する。国際公開第2005/009333号パンフレットは、免疫抑制剤と併せて、共重合体1及び共重合体1関連ランダムヘテロ重合体を含む、移植拒絶反応を予防及び治療するための組成物及び方法を開示する。
国際公開第01/52878号及び第01/93893号パンフレットは、Cop1、Cop1関連ペプチド及びポリペプチド、並びにそれによって活性化されたT細胞が、グルタミン酸塩の毒性からCNSの細胞を保護し、中枢神経系(CNS)及び末梢神経系(PNS)で、ニューロン変性の予防若しくは抑制、又は神経再生の促進を行うことを開示するものである。Kipnisらは、視神経症及び緑内障などの神経変性疾患におけるCop1の治療効果について記載している(Kipnisら、2002年、Trends Mol Med、8(7):319−23)。
自己免疫疾患の治療のためのCop1並びに関連の共重合体及びペプチドは、本発明と同じ譲受人が指定されている国際公開第00/05250号パンフレットに開示されており、この開示を、参照により、本明細書に完全に開示されているのと同様に、全体として本明細書に組み込む。
背景技術のいかなる部分においても、Cop1及び関連共重合体が心血管疾患及び障害の治療に適しているかもしれないとは、開示も示唆もしていない。
アテローム硬化症を含めた心血管疾患及び障害を予防する特異的な手段及びそれを治療する特異的な手段の必要性が存在し、長い間感じられていた。本発明は、この必要性を満たし、さらに、それに関連した有用性を提供する。
本発明は、免疫調節剤を用いて心血管疾患及び障害を治療する方法を提供する。詳細には、本発明の方法は、限定されるものではないがアテローム硬化症及び心筋炎を含めた心血管疾患及び障害を治療するための、共重合体1及び共重合体1関連ヘテロ重合体又はペプチドを含めた、ランダム共重合体又は規則的共重合体を初めて開示するものである。
本発明は、部分的に、共重合体1がアテローム硬化症の初期発達に予期されていなかった抑制効果を示すという驚くべき発見に基づいている。アテローム硬化症を治療するために現在使用されている薬物の適用は、既に確立されている疾患の治療に限定されており、疾患の発症前若しくは発達の初期に、この疾患を予防するのには使用できないが、本発明に記載のCop1及びCop1関連ヘテロ重合体の活性は、アテローム硬化症の初期に、その発達を抑制する。さらに、Cop1及びCop1関連ヘテロ重合体又は規則的ペプチドの活性は、MHCの阻害及びTh1からTh2へのサイトカインシフトに関連しており、Th1細胞が高レベルであることは、とりわけアテローム硬化症を含めた様々な心血管疾患の存在及び発達に関連していることが当技術分野で知られている。したがって、いかなる特定の理論にも、作用機序にも拘泥するものではないが、Cop1の活性はアテローム硬化症の症候に依存せず、血液中のTh1細胞の相対的な量又は存在に影響を与えるので、Cop1は、アテローム硬化症を予防するのに使用できる。
一態様によれば、本発明は、それを必要とする対象の心血管疾患及び障害を治療又は予防する方法を提供し、上記方法は、治療有効量の、少なくとも1種類の共重合体を投与するステップを含み、上記共重合体は、共重合体1及び共重合体1関連ヘテロ重合体から選択され、上記共重合体は、以下の群、すなわち、
(a)リジン及びアルギニン;
(b)グルタミン酸及びアスパラギン酸;
(c)アラニン、グリシン、及びバリン;
(d)チロシン、トリプトファン、及びフェニルアラニン
のうちの少なくとも3つから選択された少なくとも3種類のアミノ酸を含む。
(a)リジン及びアルギニン;
(b)グルタミン酸及びアスパラギン酸;
(c)アラニン、グリシン、及びバリン;
(d)チロシン、トリプトファン、及びフェニルアラニン
のうちの少なくとも3つから選択された少なくとも3種類のアミノ酸を含む。
一実施形態によれば、少なくとも1種類の共重合体が、ランダム共重合体、規則的共重合体、及び規則的ペプチドからなる群から選択される。
本発明の様々な実施形態によれば、本発明の方法で使用されるランダム共重合体又は規則的共重合体及びペプチドは、リジン又はアルギニンなどの正電荷を有する、適当な量のアミノ酸を含み、グルタミン酸又はアスパラギン酸などの負電荷を有するアミノ酸を併せて(好ましくはより少ない量で)含み、任意選択で、充填物として働くアラニン、グリシン、又はバリンなどの電気的に中性なアミノ酸を併せ含み、任意選択で、フェニルアラニン、チロシン、又はトリプトファンを共に含み、上記任意選択のアミノ酸は、上記共重合体に免疫原特性を与えるように適合されている。
別の実施形態によれば、上記少なくとも1種類の共重合体は、4種類の異なったアミノ酸を含有し、上記アミノ酸の各々が群(a)から(d)までのうちの1つから選択されている。さらに別の実施形態によれば、上記少なくとも1種類の共重合体は、アラニン、グルタミン酸、リジン、及びチロシンを含み、正味で正の全体的電荷を有し、約2から40キロダルトンの分子量を有する。代替の実施形態によれば、上記分子量が約13から18キロダルトンである。
さらなる実施形態によれば、上記少なくとも1種類の共重合体がは、アラニン、グルタミン酸、リジン、及びチロシンを含み、グルタミン酸約0.14、アラニン約0.43、チロシン約0.10、及びリジン約0.33というモル比を有する。好ましい実施形態によれば、上記アミノ酸残基のモル比には、グルタミン酸0.17、リジン0.38、アラニン0.49、チロシン0.1という相対的モル比が含まれる。別の好ましい実施形態によれば、前記相対的モル比は、グルタミン酸0.19、リジン0.4、アラニン0.6、チロシン0.1である。
なおさらなる実施形態によれば、本発明の共重合体の平均分子量が約2000〜40000Daである。様々な実施形態によれば、本発明の共重合体の平均分子量が約2000〜18000Daである。特定の実施形態によれば、本発明の共重合体の平均分子量が約4500〜17000Daである。一部の実施形態によれば、上記共重合体は、約5000〜9000Daの平均分子量を有する酢酸グラチラマーである。様々な実施形態によれば、上記共重合体は、約6000〜8000Daの平均分子量を有する酢酸グラチラマーである。
好ましい実施形態によれば、本発明の共重合体の平均分子量は、約13000〜18000Daである。別の好ましい実施形態によれば、本発明の共重合体の平均分子量は、約15000Daである。
以上の実施形態が、例示としてのみ提示されていること、そして、上記共重合体及びそれを含む組成物は、第1の態様で定義された上述の一般的な規準が守られるならば、成分及び成分の相対的割合の両方に関して変化しうることは明らかである。
なお別の実施形態によれば、上記少なくとも1種類の共重合体は、3種類の異なったアミノ酸を含有し、上記アミノ酸の各々が群(a)から(d)までから選択されている。これらの共重合体は、ランダム共重合体でも、規則的共重合体でもよく、本明細書ではターポリマーと呼ばれる。一実施形態によれば、上記少なくとも1種類の共重合体は、3種類の異なったアミノ酸からなるランダムターポリマー又は規則的ターポリマーを含み、上記アミノ酸の各々が、以下の群、すなわち、
(a)リジン及びアルギニン;
(b)グルタミン酸及びアスパラギン酸;
(c)フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン
のうちの異なった1つから選択されている。
(a)リジン及びアルギニン;
(b)グルタミン酸及びアスパラギン酸;
(c)フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン
のうちの異なった1つから選択されている。
別の実施形態によれば、前記共重合体は、グルタミン酸約0.005から約0.300、チロシン約0.005から約0.250、及びリジン約0.3から約0.7のモル比の、グルタミン酸、チロシン、及びリジンと、薬学的に許容される担体とを含有する。このターポリマーは、以下ではYEKと呼ばれるが、アラニンを実質的に含まないことが好ましい。
さらなる実施形態では、グルタミン酸、チロシン、及びリジンのモル比が、それぞれ約0.26対、約0.16対、約0.58である。特定の実施形態によれば、YEKの平均分子量が約2000〜40000Daである。他の実施形態によれば、YEKの平均分子量が約3000〜35000Daである。なお他の実施形態によれば、YEKの平均分子量が約5000〜25000Daである。好ましい実施形態によれば、YEKの平均分子量が約13000〜18000Daである。別の好ましい実施形態によれば、YEKの平均分子量が約15000Daである。
アルギニンをリジンの代わりに、アスパラギン酸をグルタミン酸の代わりに、或いはフェニルアラニン又はトリプトファンをチロシンの代わりに用いることが可能である。
代替の実施形態によれば、上記ターポリマーは、3種類の異なったアミノ酸からなり、上記アミノ酸の各々が、以下の群、すなわち、
(a)リジン及びアルギニン;
(b)アラニン、グリシン、及びバリン;
(c)フェニルアラニン、チロシン、又はトリプトファン
のうちの異なった1つから選択されている。
(a)リジン及びアルギニン;
(b)アラニン、グリシン、及びバリン;
(c)フェニルアラニン、チロシン、又はトリプトファン
のうちの異なった1つから選択されている。
この代替の実施形態によれば、上記少なくとも1種類のターポリマーが、薬学的に許容される担体と共に、チロシン、アラニン、及びリジンを含有し、チロシン約0.005から約0.25、アラニン約0.3から約0.6、及びリジン約0.1から約0.5のモル比を有する。このターポリマーは、以下ではYAKと呼ばれるが、グルタミン酸を実質的に含まないことが好ましい。
この代替の実施形態によれば、チロシン、アラニン、及びリジンのモル比が、それぞれ約0.10対、約0.54対、約0.35である。特定の実施形態によれば、YAKの平均分子量が約2000〜40000Daである。他の実施形態によれば、YAKの平均分子量が約3000〜35000Daである。なお他の実施形態によれば、YAKの平均分子量が約5000〜25000Daである。好ましい実施形態によれば、YAKの平均分子量が約13000〜18000Daである。別の好ましい実施形態によれば、YAKの平均分子量が約15000Daである。
特定の実施形態によれば、アルギニンをリジンの代わりに、グリシン又はバリンをアラニン又はフェニルアラニンの代わりに、或いはトリプトファンをチロシンの代わりに用いることが可能である。
なお別の代替の実施形態によれば、上記少なくとも1種類の共重合体は、3種類の異なったアミノ酸からなるターポリマーを含有し、上記アミノ酸の各々が、以下の群、すなわち、
(a)グルタミン酸及びアスパラギン酸;
(b)アラニン、グリシン、及びバリン;
(c)フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン
のうちの異なったメンバーから選択されている。
(a)グルタミン酸及びアスパラギン酸;
(b)アラニン、グリシン、及びバリン;
(c)フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン
のうちの異なったメンバーから選択されている。
この代替の実施形態によれば、上記少なくとも1種類の共重合体は、チロシン、グルタミン酸、及びアラニンを、チロシン約0.005から約0.25、グルタミン酸約0.005から約0.3、及びアラニン約0.005から約0.8のモル比で含有するターポリマーと、薬学的に許容される担体とを含む。このターポリマーは、以下ではYEAと呼ばれるが、リジンを実質的に含まないことが好ましい。
この代替の実施形態によれば、グルタミン酸、アラニン、及びチロシンのモル比は、それぞれ約0.21対、約0.65対、約0.14である。YEAの平均分子量は約2000〜40000である。特定の実施形態によれば、YEAの平均分子量が約3000〜35000Daである。他の実施形態によれば、YEAの平均分子量が約5000〜25000Daである。好ましい実施形態によれば、YEAの平均分子量が約13000〜18000Daである。別の好ましい実施形態によれば、YEAの平均分子量が約15000Daである。アスパラギン酸をグルタミン酸の代わりに、グリシンをアラニンの代わりに、そしてフェニルアラニン又はトリプトファンをチロシンの代わりに用いることが可能である。
本発明の方法で使用される少なくとも1種類の共重合体は、L−アミノ酸、D−アミノ酸、又はそれらの混合物で構成されたものでありうる。当業者に公知の通り、ほとんどの天然タンパク質にはL−アミノ酸が存在している。しかし、D−アミノ酸は市販されており、本発明で用いられる共重合体を作製するのに使用される一部又は全てのアミノ酸の代わりに用いることができる。本発明では、D−アミノ酸及びL−アミノ酸の両方を含有する共重合体の使用、並びに本質的にはL−アミノ酸又はD−アミノ酸のいずれかからなる共重合体の使用が企図されている。
本発明の様々な実施形態によれば、上記少なくとも1種類の共重合体は、約15から約100アミノ酸までのランダムポリペプチドでありうる。特定の実施形態によれば、上記少なくとも1種類の共重合体は、長さが約40から約80アミノ酸までのランダムポリペプチドでありうる。様々な代替の実施形態によれば、上記少なくとも1種類の共重合体は、6から25アミノ酸の規則的合成ペプチドである。様々な代替の実施形態によれば、上記少なくとも1種類の共重合体は、10から20アミノ酸の規則的合成ペプチドである。なお他の実施形態によれば、本発明の方法で、長さが約15から約100アミノ酸、或いは約40から約80のアミノ酸までのオリゴマーの形態にある上記ペプチドを用いることができる。
一実施形態によれば、本発明の方法は、少なくとも1種類の共重合体を、少なくとも1種類の免疫調節剤と併せて投与するステップをさらに含み、上記少なくとも1種類の免疫調節剤は、Th1リンパ球の活性又は存在を減弱できる。別の実施形態によれば、上記少なくとも1種類の免疫調節剤は、α−IL−4、α−IL−12、α−IL−18、α−IFN−γ、α−インテグリン、及びα−CD4+からなる群から選択された抗体である。なお別の実施形態によれば、上記免疫調節剤は、IL−12、IL−18、インテグリン、及びIFN−γからなる群から選択された分子の発現を減少させることができる。さらに別の実施形態によれば、上記免疫調節剤は、アンチセンスヌクレオチド配列、センスヌクレオチド配列、リボザイム、干渉RNA、及びアプタマーからなる群から選択される。
上記の組合せの薬物は、共に投与してもよく、また、順次に投与してもよい。本発明は、これらの薬剤を実質的に同時に併用投与することを包含し、上記薬剤は、これらの活性物質を固定された比率で有する、経口投与又は非経口投与に適した単一単位剤形であるか、或いは、それぞれが独立的に経口投与又は非経口注射に適した形態でありうる各薬剤用の複数且つ個別の単位剤形であることが明確に理解されよう。さらに、本発明は、別々の投与計画又は交互の投与計画さえ含めた別々の投与も明確に包含することが明確に理解されよう。
本発明の様々な実施形態によれば、上記少なくとも1種類の共重合体の治療有効量が、約1.0mgから約500.0mg/日までの範囲である。別法では、上記少なくとも1種類の共重合体のそのような治療有効量が、約20.0mgから約100.0mg/日までの範囲である。
一実施形態によれば、上記心血管疾患及び障害は、アテローム硬化症、及び心筋炎からなる群から選択される。
本発明のいくつかの好ましい実施形態を本明細書に記述するが、本発明は、本発明の定義に妥当する形態にある、文献に記載のCop1を含めた、Glu又はAsp、Lys又はArg、Ala、Gly、又はVal、及びPhe又はTyr又はTrpのうちの少なくとも3つからなり、本明細書で定義した通りの、上記アミノ酸残基の相対的モル比と、平均分子量とを有するいかなる合成ランダム共重合体又は規則的共重合体の使用も包含することが理解されるよう。
別の態様では、本発明は、心血管疾患及び障害を予防又は治療する薬物を製造するための、上述した少なくとも1種類の共重合体の使用に関する。
これらの実施形態及びさらなる実施形態は、以下の詳細な説明及び実施例から明らかとなろう。
本発明は、共重合体1及び共重合体1関連ヘテロ重合体又は規則的ペプチドを含めたランダム共重合体又は規則的共重合体の、心血管疾患及び障害を治療又は予防するための使用に関する。
(定義)
「心血管疾患の治療及び予防」という用語は、本明細書で使用される場合、心臓の治療と、心臓病などの心血管に関連した他の疾患の予防及び/又は治療とを示す。「心臓病」という用語は、本明細書で使用される場合、心臓又は心筋組織が関与するいかなるタイプの疾患、障害、外傷、又は外科的治療も指す。とりわけ対象となるのは、心筋組織の低酸素及び/又は虚血、並びに/或いは心不全に関連した心臓病である。虚血から発症しうる心臓病の1タイプが再潅流損傷であり、これは、抗凝血剤、血栓溶解剤、又は抗狭心症薬療法が治療に用いられた際、或いは血管形成手術によって、若しくは冠動脈移植によって外科的に心血管系を開く際に起こりうるものなどである。本発明が対象とする別のタイプの心臓病が冠動脈疾患(CAD)であり、これは、虚血の一般的原因である、動脈硬化、特にアテローム硬化症から発症しうる。CADは、安定又は不安定狭心症などの症候を有し、急性心筋梗塞(AMI)及び突然心臓死を引き起こすことがある。
「心血管疾患の治療及び予防」という用語は、本明細書で使用される場合、心臓の治療と、心臓病などの心血管に関連した他の疾患の予防及び/又は治療とを示す。「心臓病」という用語は、本明細書で使用される場合、心臓又は心筋組織が関与するいかなるタイプの疾患、障害、外傷、又は外科的治療も指す。とりわけ対象となるのは、心筋組織の低酸素及び/又は虚血、並びに/或いは心不全に関連した心臓病である。虚血から発症しうる心臓病の1タイプが再潅流損傷であり、これは、抗凝血剤、血栓溶解剤、又は抗狭心症薬療法が治療に用いられた際、或いは血管形成手術によって、若しくは冠動脈移植によって外科的に心血管系を開く際に起こりうるものなどである。本発明が対象とする別のタイプの心臓病が冠動脈疾患(CAD)であり、これは、虚血の一般的原因である、動脈硬化、特にアテローム硬化症から発症しうる。CADは、安定又は不安定狭心症などの症候を有し、急性心筋梗塞(AMI)及び突然心臓死を引き起こすことがある。
「アテローム硬化症」という用語は動脈硬化の1タイプであるが、本明細書で使用される場合、この用語は、アテローム硬化症(又は「動脈硬化」)と一般的に定義されるいかなる疾患も指す。「アテローム硬化症」という用語、及び「動脈硬化」という一般名は、本明細書では、動脈壁が肥厚化し、且つ弾性を失う疾患、しばしばコクサッキーウイルスBと関連しており、さらに上記ウイルスよって誘導される心筋炎を含めた多数の心血管疾患を記述するのに同義的に使用する。アテローム硬化症では、動脈壁表面に、プラークと呼ばれる沈着物の増大を引き起こす過程が起こる。通常、沈着物は、大型若しくは中型の動脈の内膜(血管の最も内側の層)で起こる。プラークは、血液中に存在する脂肪質の物質、コレステロール、細胞廃棄物、線維素、及びカルシウムを含有する。プラークは、動脈を通る血流を部分的又は完全に遮断できるくらいに大きくなりうる。プラークの増大又はプラーク内で起こる破裂によって、血餅が生じることがある。その場から外れたプラーク物質は、身体の他の部分(例えば、脳、心臓、腎臓、及び足)に移動でき、その結果主としてより小さな動脈を通る血流を遮断することによって、組織及び器官に重度の損傷を与える。
「治療有効量」という用語は、心血管疾患及び障害を治療又は予防するという目標を実現するであろう、共重合体の量を認定するものとする。
(本発明を実施するための好ましい形態)
アテローム硬化症の早期徴候は子供でも特定されているが、アテローム硬化症は、しばしば加齢の過程と関連した進行性の複合的な疾患である。アテローム硬化症は、冠状動脈心疾患(CHD)、心筋梗塞(MI)、狭心症、脳血管疾患(CVD)、血栓性脳卒中、一過性脳虚血発作(TIA)、下肢及び足への血液の供給不足(跛行)、臓器障害、並びに糖尿病の血管合併症を含めたいくつかの状態の要因となっている。
アテローム硬化症の早期徴候は子供でも特定されているが、アテローム硬化症は、しばしば加齢の過程と関連した進行性の複合的な疾患である。アテローム硬化症は、冠状動脈心疾患(CHD)、心筋梗塞(MI)、狭心症、脳血管疾患(CVD)、血栓性脳卒中、一過性脳虚血発作(TIA)、下肢及び足への血液の供給不足(跛行)、臓器障害、並びに糖尿病の血管合併症を含めたいくつかの状態の要因となっている。
アテローム硬化症の症候は、初期には微細又は軽微でありうる。この疾患は、特に心臓病の危険性が高い個体で、何年にもわたって検出されずに進行する可能性があり、したがって、アテローム硬化症は「静かな殺人者」と呼ばれている。さらに、病気の冠動脈を有する個体の子供及び兄弟の約半分は、アテローム硬化症の徴候を示しており、この疾患の発症に遺伝的要因が重要な役割を果たしていることを示している。したがって、病気の冠動脈を有する対象の家族の一員など、この疾患を有する危険性の高い対象におけるアテローム硬化症を予防するという未達成の必要性が存在する。さらに、アテローム硬化症を治療するのに通常使用される薬物の大部分は、この疾患に伴う症候を軽減することのみを対象としているので、アテローム硬化症をその初期に治療することを対象とした治療法を求める未達成の必要性が存在する。
本発明は、Cop1、又はCop1関連ヘテロ重合体若しくは規則的ペプチドから選択された、治療有効量の共重合体を、それを必要とする対象に、単独で、若しくは免疫調節剤と併せて投与することによって、動脈硬化を予防するか、或いはその初期にこの疾患を治療する新規の方法を提供することによって、背景技術の欠点を克服するものであり、上記共重合体は、以下の共重合体のうちの1つに対応する。すなわち、
A.少なくとも3種類のアミノ酸を含む共重合体であって、上記アミノ酸が、以下の群、すなわち、
(a)リジン及びアルギニン;
(b)グルタミン酸及びアスパラギン酸;
(c)アラニン、グリシン、及びバリン;
(d)チロシン、トリプトファン、及びフェニルアラニン
のうちの少なくとも3つから選択されている共重合体;
B.少なくとも3種類の異なったアミノ酸を含む共重合体であって、上記アミノ酸がそれぞれ、
(a)リジン及びアルギニン;
(b)グルタミン酸及びアスパラギン酸;
(c)アラニン、グリシン、及びバリン;
(d)フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン
から選択された異なった群から選択されている共重合体:
C.アラニン、グルタミン酸、リジン、及びチロシンを含み、正味で正の全体的電荷を有する共重合体;
D.アラニン、グルタミン酸、リジン、及びチロシンを含み、グルタミン酸約0.14、アラニン約0.43、チロシン約0.10、及びリジン約0.34というモル比を有する共重合体1;
E.アラニン、グルタミン酸、リジン、及びチロシンを含み、グルタミン酸0.17、リジン0.38、アラニン0.49、チロシン0.10というモル比を有する共重合体1;
F.アラニン、グルタミン酸、リジン、及びチロシンを含み、グルタミン酸0.19、リジン0.4、アラニン0.6、チロシン0.1というモル比を有する共重合体1;
G.約2000〜40000Da、好ましくは約13000〜18000Daの平均分子量を有する、上述の共重合体のいずれか;
H.約5000〜9000Daの平均分子量を有する酢酸グラチラマー;
I.3種類の異なったアミノ酸を有するターポリマーであって、上記アミノ酸の各々が群(a)から(d)から選択されているターポリマー;
J.3種類の異なったアミノ酸からなる規則的ターポリマーであって、上記アミノ酸の各々が、以下の群、すなわち、
(a)リジン及びアルギニン;
(b)グルタミン酸及びアスパラギン酸;
(c)フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン
のうちの異なった1つから選択されている規則的ターポリマー;
K.アラニンを実質的に含まず、グルタミン酸、チロシン、及びリジンを含有し、グルタミン酸約0.005から約0.300、チロシン約0.005から約0.250、及びリジン約0.3から約0.7のモル比を有するターポリマーYEK;
L.実質的にアラニンを含まず、グルタミン酸、チロシン、及びリジンを、それぞれ約0.26、約0.16、約0.58というモル比で含有するターポリマーYEK;
M.上述の通りのYEKであって、約2000〜40000Da、好ましくは約13000〜18000Daの平均分子量を有し、アルギニンをリジンの代わりに、アスパラギン酸をグルタミン酸の代わりに、或いはフェニルアラニン又はトリプトファンをチロシンの代わりに用いることが可能であるYEK;
N.3種類の異なったアミノ酸からなるYAKターポリマーであって、上記アミノ酸の各々が、以下の群、すなわち、
(a)リジン及びアルギニン;
(b)アラニン、グリシン、及びバリン;
(c)フェニルアラニン、チロシン、又はトリプトファン
のうちの異なった1つから選択されているYAKターポリマー;
O.実質的にグルタミン酸を含まず、チロシン、アラニン、及びリジンを含有し、チロシン約0.005から約0.25、アラニン約0.3から約0.6、及びリジン約0.1から約0.5のモル比を有するか、或いは、チロシン、アラニン、及びリジンのモル比が、それぞれ約0.10対、約0.54対、約0.35であるYAKターポリマー;
P.上述の通りのYAKであって、約2000〜40000Da、好ましくは約13000〜18000Daの平均分子量を有し、アルギニンをリジンの代わりに、グリシン又はバリンをアラニン又はフェニルアラニンの代わりに、或いはトリプトファンをチロシンの代わりに用いることが可能であるYAK;
Q.3種類の異なったアミノ酸からなるYEAターポリマーであって、上記アミノ酸の各々が、以下の群、すなわち、
(a)グルタミン酸及びアスパラギン酸;
(b)アラニン、グリシン、及びバリン;
(c)フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン
のうちの異なるメンバーから選択されているYEAターポリマー;
R.チロシン、グルタミン酸、及びアラニンを含有し、チロシン約0.005から約0.25、グルタミン酸約0.005から約0.3、及びアラニン約0.005から約0.8のモル比を有するか、或いは、グルタミン酸、アラニン、及びチロシンのモル比が、それぞれ約0.21対、約0.65対、約0.14であるYEAターポリマー;並びに、
S.上述の通りのYEAであって、約2000〜40000Da、好ましくは約13000〜18000Daの平均分子量を有し、アスパラギン酸をグルタミン酸の代わりに、グリシンをアラニンの代わりに、そしてフェニルアラニン又はトリプトファンをチロシンの代わりに用いることが可能であるYEA。
A.少なくとも3種類のアミノ酸を含む共重合体であって、上記アミノ酸が、以下の群、すなわち、
(a)リジン及びアルギニン;
(b)グルタミン酸及びアスパラギン酸;
(c)アラニン、グリシン、及びバリン;
(d)チロシン、トリプトファン、及びフェニルアラニン
のうちの少なくとも3つから選択されている共重合体;
B.少なくとも3種類の異なったアミノ酸を含む共重合体であって、上記アミノ酸がそれぞれ、
(a)リジン及びアルギニン;
(b)グルタミン酸及びアスパラギン酸;
(c)アラニン、グリシン、及びバリン;
(d)フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン
から選択された異なった群から選択されている共重合体:
C.アラニン、グルタミン酸、リジン、及びチロシンを含み、正味で正の全体的電荷を有する共重合体;
D.アラニン、グルタミン酸、リジン、及びチロシンを含み、グルタミン酸約0.14、アラニン約0.43、チロシン約0.10、及びリジン約0.34というモル比を有する共重合体1;
E.アラニン、グルタミン酸、リジン、及びチロシンを含み、グルタミン酸0.17、リジン0.38、アラニン0.49、チロシン0.10というモル比を有する共重合体1;
F.アラニン、グルタミン酸、リジン、及びチロシンを含み、グルタミン酸0.19、リジン0.4、アラニン0.6、チロシン0.1というモル比を有する共重合体1;
G.約2000〜40000Da、好ましくは約13000〜18000Daの平均分子量を有する、上述の共重合体のいずれか;
H.約5000〜9000Daの平均分子量を有する酢酸グラチラマー;
I.3種類の異なったアミノ酸を有するターポリマーであって、上記アミノ酸の各々が群(a)から(d)から選択されているターポリマー;
J.3種類の異なったアミノ酸からなる規則的ターポリマーであって、上記アミノ酸の各々が、以下の群、すなわち、
(a)リジン及びアルギニン;
(b)グルタミン酸及びアスパラギン酸;
(c)フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン
のうちの異なった1つから選択されている規則的ターポリマー;
K.アラニンを実質的に含まず、グルタミン酸、チロシン、及びリジンを含有し、グルタミン酸約0.005から約0.300、チロシン約0.005から約0.250、及びリジン約0.3から約0.7のモル比を有するターポリマーYEK;
L.実質的にアラニンを含まず、グルタミン酸、チロシン、及びリジンを、それぞれ約0.26、約0.16、約0.58というモル比で含有するターポリマーYEK;
M.上述の通りのYEKであって、約2000〜40000Da、好ましくは約13000〜18000Daの平均分子量を有し、アルギニンをリジンの代わりに、アスパラギン酸をグルタミン酸の代わりに、或いはフェニルアラニン又はトリプトファンをチロシンの代わりに用いることが可能であるYEK;
N.3種類の異なったアミノ酸からなるYAKターポリマーであって、上記アミノ酸の各々が、以下の群、すなわち、
(a)リジン及びアルギニン;
(b)アラニン、グリシン、及びバリン;
(c)フェニルアラニン、チロシン、又はトリプトファン
のうちの異なった1つから選択されているYAKターポリマー;
O.実質的にグルタミン酸を含まず、チロシン、アラニン、及びリジンを含有し、チロシン約0.005から約0.25、アラニン約0.3から約0.6、及びリジン約0.1から約0.5のモル比を有するか、或いは、チロシン、アラニン、及びリジンのモル比が、それぞれ約0.10対、約0.54対、約0.35であるYAKターポリマー;
P.上述の通りのYAKであって、約2000〜40000Da、好ましくは約13000〜18000Daの平均分子量を有し、アルギニンをリジンの代わりに、グリシン又はバリンをアラニン又はフェニルアラニンの代わりに、或いはトリプトファンをチロシンの代わりに用いることが可能であるYAK;
Q.3種類の異なったアミノ酸からなるYEAターポリマーであって、上記アミノ酸の各々が、以下の群、すなわち、
(a)グルタミン酸及びアスパラギン酸;
(b)アラニン、グリシン、及びバリン;
(c)フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン
のうちの異なるメンバーから選択されているYEAターポリマー;
R.チロシン、グルタミン酸、及びアラニンを含有し、チロシン約0.005から約0.25、グルタミン酸約0.005から約0.3、及びアラニン約0.005から約0.8のモル比を有するか、或いは、グルタミン酸、アラニン、及びチロシンのモル比が、それぞれ約0.21対、約0.65対、約0.14であるYEAターポリマー;並びに、
S.上述の通りのYEAであって、約2000〜40000Da、好ましくは約13000〜18000Daの平均分子量を有し、アスパラギン酸をグルタミン酸の代わりに、グリシンをアラニンの代わりに、そしてフェニルアラニン又はトリプトファンをチロシンの代わりに用いることが可能であるYEA。
本発明の方法で使用される以上の共重合体はいずれも、ランダムアミノ酸配列(ランダム共重合体)、規則的アミノ酸配列(規則的共重合体)、又は規則的アミノ酸配列を有するペプチド(規則的ペプチド)を有しうる。
さらに、本発明で使用するための共重合体は、L−アミノ酸若しくはD−アミノ酸、又はその混合物から構成されたものでよい。当業者に公知の通り、ほとんどの天然タンパク質にはL−アミノ酸が存在している。しかし、D−アミノ酸は市販されており、本発明のターポリマー及び他の共重合体を作製するのに使用される一部又は全てのアミノ酸の代わりに用いることができる。本発明では、D−アミノ酸及びL−アミノ酸の両方を含有する共重合体の使用、並びに本質的にはL−アミノ酸又はD−アミノ酸のいずれかからなる共重合体が企図されている。
好ましい実施形態では、本発明の方法で使用するためのヘテロ重合体のアミノ酸モル比は、ほぼ共重合体1に好ましいものである。共重合体1のアミノ酸モル比は、グルタミン酸約0.14、アラニン約0.43、チロシン約0.10、及びリジン約0.34である。特定の実施形態によれば、共重合体1の平均分子量は、約13000ダルトンと約18000ダルトンとの間である。アテローム硬化症の治療又は予防における共重合体1の活性は、1つ又は複数の以下の置換、すなわち、グルタミン酸の代わりにアスパラギン酸、アラニンの代わりにグリシン、そしてリジンの代わりにアルギニンを用いた場合に残っていると予測されている。
共重合体1は、数カ国において、Copaxone(登録商標)、酢酸グラチラマーという商品名で、多発性硬化症(MS)の治療用に認可されている。共重合体1は、軽度の副反応を有するのみで、十分に許容されるものであることがいくつかの臨床試験で実証されている(Johnsonら、Neurology、1:65、1995年)。これらの副反応は、ほとんどが注射部位における軽度の反応であった。
より好ましい、グルタミン酸、アラニン、及びチロシンのターポリマーすなわちYEAの単量体モル比は、約0.21対、約0.65対、約0.14である。
より好ましい、グルタミン酸、チロシン、及びリジンのターポリマー、すなわちYEKの単量体モル比は、約0.26対、約0.16対、約0.58である。
より好ましい、チロシン、アラニン、及びリジンのターポリマーすなわちYAKの単量体モル比は、約0.10対、約0.54対、約0.35である。
本明細書中上記に示した通り、本発明は、規則的なアミノ酸配列(規則的共重合体)を有するヘテロ重合体を包含する。そのようなヘテロ重合体及びペプチドの例が国際公開第00/05249号パンフレットに開示されているものであり、この開示の全内容を、参照により本明細書に組み込む。前記出願書に明示的に開示されている32種類のペプチドを、本明細書中下記の表1に再現させる。そのようなペプチド及び他の類似のペプチドは、Cop1に類似した活性を有すると予測されている。そのようなペプチド及び他の類似したペプチドも、Cop1関連ペプチド又はポリペプチドの定義に含まれると考えられ、それらの使用は、本発明の一部であると考えられる。
本明細書で初めて開示された通り、また本明細書中の下記に例示される通り、外因性の酢酸グラチラマーの皮下投与によって、アテローム生成性の食事で飼育されているC57BL/6Jマウスにおけるアテローム硬化症の発達が抑制される。
さらに、酢酸グラチラマーの皮下投与及び経口投与は、アポリポタンパク質E欠失(apoE−/−)マウスにおけるアテローム硬化症の進行を抑制し、動脈硬化病変を低減する。
apoE−/−マウスは、十分に確立されたアテローム硬化性モデルである。ヒトの動脈硬化病変と同様に、Tリンパ球がapoE−/−病変中に存在し(Roselaarら、1996年、Artherioscler Thromb Vasc Biol 16:1013−1018)、経口免疫寛容又は免疫化のいずれかによる免疫調節が疾患に影響を与えることが示されている(Georgeら、2004年、Cardiovasc Res.62:603−9)。本発明は、酢酸グラチラマーのアテローム産生抑制効果を初めて開示するものである。酢酸グラチラマーは、臨床現場では現在、多発性硬化症の治療に用いられている。
アテローム硬化症発達の初期における酢酸グラチラマーのアテローム産生抑制効果を確認するために、雄性C57BL/6Jマウスの疾患の高脂血症モデル(Varadhachary、同上)、及びapoE−/−マウスのアテローム硬化性モデルを用いた。アテローム硬化症に伴うTh1免疫反応が有害であること、そして、Th1分化経路を調節することによって、この疾患を治療する新規の薬理学ツールが得られる可能性があることを示す証拠が徐々に蓄積されている。したがって、Th1分化経路の既知なホスホジエステラーゼ阻害剤であるペントキシフィリン(PTX)を用いた12週間の治療は、アポリポタンパク質E欠失マウスにおける動脈硬化病変の大きさを60%低減することが最近示された(Lauratら、2001年、104:197−202)。実施例に示す通り、GAの毎日投与を、GAの誘導によるTh1からTh2へのシフトに十分な期間である8週間行ったところ、未処置群と比較して、脂肪線条の面積の著しい減少が引き起こされた。アテローム硬化症における免疫調節の様々な側面を調査した最初の試みは、正常固形飼料又はアテローム生成性の固形飼料で飼育された、アポリポタンパク質E、LDL受容体、IL−10、又はINF−γを欠失したマウスなどの、遺伝学的に免疫無防備状態にされた動物で行われた(例えば、Whitman 2000、同上)。しかし、外因的に投与された様々な化合物の、アテローム硬化症の発達への効果に関する一部の調査は、非免疫調節性処置によるアテローム硬化症の低減に注目して、アテローム生成食で飼育された感受性のC57BL16Jマウス系統のモデルで行われたものであり(Garberら、2001年、J.Lipid Res.42、545−552;Gonenら、2002〜03年、70:215−218)、血中脂質レベルへの効果がなかったのにもかかわらず、アテローム硬化症の発達が低減していたことを示した。これらの調査では、処置群及び未処置群の両方で血中脂質レベルが上昇していた。
本発明は、アテローム生成食で飼育された感受性マウスにおけるアテローム硬化症を抑制するのに、既存の薬物(多発性硬化症に適応される)と共に免疫調節を用いる併用の概念を実証するものである。この抗アテローム硬化効果は、血漿コレステロールレベル及びLDLレベルがGA処置によって影響されていないという事実にもかかわらず実現された。アテローム生成性の固形飼料を与えられた群における血漿コレステロールレベル及びLDLレベルは、対照群と比較して、有意に上昇していた。この結果、及びアテローム生成食によってマウスの体重が影響を受けなかったという新知見は、以前の知見と一致している(Garberら、及びGonenら、同上)。
本発明は、酢酸グラチラマーにアテローム硬化症を予防する可能性があることをさらに開示する。
いかなる理論にも、作用機序にも拘泥するものではないが、大動脈の脂肪線条面積を減少させるGAの効果は、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を有するマウスで観測にされたように(Aharoni、2001年、Transplantation、72:598−605)、GAが、Th2サイトカインの分泌を増強させながら、増殖及びTh1サイトカインの分泌の抑制する能力に起因しているのかもしれない。さらに、MSを患っている患者にGAを投与すると、IL−10レベル及びIL−4レベルの上昇、並びにIL−12レベル及び腫瘍壊死因子α(TNF−α)レベルの低下が通常見られる(Salamaら、2003年、Brain、126:2638−2647)。Th2細胞、B細胞、及びマクロファージに発するそのようなIL−10分泌の増大は、実際に動脈硬化病変の大きさの縮小を引き起こした(Varadhachary、同上)。さらに、IL−10の過剰発現は、動脈硬化病変の形成を減弱させ、リンパ球及びマクロファージの表現型の変化と関連していた(Pinderskiら、2002年、Circ Res.90、1064−1071)。したがって、アテローム発生においても、GAの十分に確立された効果である、IL−10発現を増大させることによる局所的又は全身的な潜在的治療効果があると推定できる。GAによって増強される別のTh2サイトカインであるTGF−β(Aharoni、同上)も、アテローム硬化症に影響を与える役割を果たしている可能性がある。TGF−βの免疫活性の1つは、CD4+エフェクター経路を調節することであると提案されており、これは、in vivoにおけるTh1タイプ反応の減弱を証拠としている(Koglinら、1998年、Circ Res.83:652−660)。さらにこれから、結論として、TGF−βの免疫調節効果は、アテローム硬化性の状態における炎症反応を調節するものかもしれないと提案されている。
(併用療法)
様々な実施形態によれば、本発明の方法は、少なくとも1種類の共重合体を、少なくとも1種類の免疫調節剤と併せて投与するステップをさらに含み、上記少なくとも1つの免疫調節剤は、Th1リンパ球の活性又は存在を減弱できる。別の実施形態によれば、上記少なくとも1種類の免疫調節剤は、α−IL−4、α−IL−12、α−IL−18、α−IFN−γ、α−インテグリン、及びα−CD4+からなる群から選択された抗体である。上記α−インテグリンは、リンパ球の浸潤を防止できるものなら、いかなる分子でもよい。
様々な実施形態によれば、本発明の方法は、少なくとも1種類の共重合体を、少なくとも1種類の免疫調節剤と併せて投与するステップをさらに含み、上記少なくとも1つの免疫調節剤は、Th1リンパ球の活性又は存在を減弱できる。別の実施形態によれば、上記少なくとも1種類の免疫調節剤は、α−IL−4、α−IL−12、α−IL−18、α−IFN−γ、α−インテグリン、及びα−CD4+からなる群から選択された抗体である。上記α−インテグリンは、リンパ球の浸潤を防止できるものなら、いかなる分子でもよい。
なお別の実施形態によれば、上記免疫調節剤は、IL−12、IL−18、インテグリン、及びIFN−γからなる群から選択された分子の発現を抑制できる。したがって、上記免疫調節剤は、アンチセンスヌクレオチド配列、センスヌクレオチド配列、短鎖干渉RNA、リボザイム、及びアプタマーからなる群から選択されたポリヌクレオチドでありうる。
近年、核酸化学及び遺伝子導入における進歩がきっかけとなって、遺伝子干渉によって疾患を治療する新規のアプローチが生まれた。アンチセンス技術は、遺伝子特異的な干渉を実現するためのプロトコールの中で最も一般的に記載されているアプローチの1つとなっている。アンチセンス戦略では、対象とする遺伝子のメッセンジャーRNAに相補的な、化学量論的な量の1本鎖の核酸を細胞内に導入する。
国際公開第02/10365号パンフレットは、プロモーター、抑圧する遺伝子の少なくとも1つのアンチセンスヌクレオチド配列及び/又はセンスヌクレオチド配列を含有する組換え体コンストラクトを用いた形質転換による真核生物の遺伝子抑圧の方法を提示している。特定の癌状態のアンチセンスオリゴヌクレオチド治療は、米国特許第5,098,890号明細書に記載されている。米国特許第5,135,917号明細書は、ヒトインターロイキン−1受容体の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提示している。米国特許第5,087,617号明細書は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて癌患者を治療する方法を提示している。米国特許第5,166,195号明細書は、HIVのオリゴヌクレオチド阻害剤を提示している。米国特許第5,004,810号明細書は、単純ヘルペスウイルスのVmw65 mRNAにハイブリッド形成でき、さらに複製を阻害するオリゴマーを提示している。米国特許第5,194,428号明細書は、インフルエンザウイルスに対する抗ウィルス活性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提示している。米国特許第4,806,463号明細書は、HTLV−III(ヒトT細胞リンパ指向性ウイルスIII型、HIVとしても知られている)の複製を抑制するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドと、それらを使用する方法とを提示している。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトに安全に投与されており、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関するいくつかの臨床試験が現在進行中である。したがって、オリゴヌクレオチドが有用な治療手段でありうること、並びに細胞及び動物、特にヒトを治療するための治療計画で、同じものを、有用となるように設計できることが確立されている。
アプタマーは、概ね核酸に結合する非オリゴヌクレオチド標的に特異的に結合するオリゴヌクレオチドである。アプタマーを生成させるのに適した物質としての1本鎖DNAの使用が米国特許第5,840,567号明細書に開示されている。DNAアプタマーの使用は、ヌクレアーゼ安定性、特に血漿ヌクレアーゼ安定性の増大、及びPCR又は他の方法による増幅の容易さを含めたいくつかの点で、RNAより有利である。通常、RNAは、増幅前に逆転写酵素を用いることによってDNAに変換されるが、この過程は、すべての配列で等しく効率的なものではなく、その結果、選択されたプールから一部のアプタマーが失われる。
RNA干渉は、短鎖干渉RNA(siRNA;Fireら、Nature 391:806、1998年)を用いるが、siRNAによって媒介された、動物における配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングの過程を指す。植物における対応する過程は、通常、転写後遺伝子サイレンシング又はRNAサイレンシングと呼ばれる。転写後遺伝子サイレンシングの過程は、外来遺伝子の発現を防止するのに使用される、進化的に保存された細胞防衛機構であると考えられており、様々な植物相及び門によって一般的に共有されている。
RNA干渉では、2本鎖RNA(dsRNA)を適用し、そのdsRNAが、それに対応する遺伝子の発現を減少させる。RNAiの現象は、その後、多くの生物に存在し、天然に存在する細胞過程であることが証明された。国際公開第00/01846号パンフレットは、特異的なdsRNA分子を用いて、細胞に特定の表現型を与える原因となる特定の遺伝子を同定する方法を開示する。国際公開第01/29058号パンフレットは、dsRNAによって媒介されるRNAiに関与する特定の遺伝子を開示する。国際公開第99/07409号パンフレットは、特定の抗ウイルス薬と併用される、特定のdsRNA分子からなる特異的な組成物を開示する。国際公開第99/53050号パンフレットは、ある特定のdsRNAを用いて、植物細胞内の核酸の形質発現を低下させる特定の方法を開示する。国際公開第01/49844号パンフレットは、標的生物における遺伝子サイレンシングを容易にするのに使用する特定のDNAコンストラクトを開示する。
国際公開第02/055692号、第02/055693号パンフレット、及び欧州特許第1144623号明細書は、RNAiを用いて、遺伝子発現を抑制する方法を開示する。国際公開第99/49029号、第01/70949号パンフレット、及びオーストラリア特許第4037501号明細書は、siRNA分子を発現する特定のベクターを開示する。米国特許第6,506,559号明細書は、RNAiを媒介する特定のsiRNAコンストラクトを用いて、in vitroで遺伝子発現を抑制する方法を開示する。米国特許第5,681,747号明細書は、PKCαの3’非翻訳領域の一部に特異的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチドを用いてヒト−PKCαの発現を抑制する方法を開示する。
上記の組合せ薬物は、共に投与してもよく、また、順次に投与してもよい。本発明は、これらの薬剤を実質的に同時に併用投与することを明確に包含し、上記薬剤は、これらの活性物質を固定された比率で有する、経口投与又は非経口的投与に適した単一単位剤形であるか、或いは、それぞれが独立的に経口投与又は非経口注射に適した形態でありうる各薬剤用の複数且つ個別の単位剤形であることが、明確に理解されるよう。
上記共重合体は、当業者が利用できるいかなる手順で作製してもよい。例えば、上記共重合体は、溶液中における所望のモル比のアミノ酸を用いることによって、或いは固相合成手順によって、縮合条件下で生成させることができる。縮合条件には、適切な温度、pH、及びあるアミノ酸のカルボキシル基を別のアミノ酸のアミノ基に縮合させてペプチド結合を形成させる溶媒条件が含まれる。ペプチド結合の形成を促進させるために、縮合剤、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドを用いることができる。側鎖部分、及び一部のアミノ基又はカルボキシル基などの官能基を望ましくない副反応から保護するために、ブロック基を用いることができる。
本発明の共重合体を調製するのに、米国特許第3,849,550号明細書に開示されている方法を用いることができる。例えば、開始物質としてジエチルアミンを含む無水ジオキサン中、常温で、チロシン、アラニン、γ−ベンジルグルタミン酸、及びN,E−トリフルオロアセチル−リジンのN−カルボン酸無水物を重合させる。グルタミン酸のγ−カルボキシル基は、氷酢酸中の臭化水素によって非ブロック化することができる。トリフルオロアセチル基は、1Mのピペリジンによってリジンから除去する。当業者ならば、所望のアミノ酸、すなわち共重合体1における4種類のアミノ酸のうちの3種類を含有するペプチド及びポリペプチドを生成させるために、グルタミン酸、アラニン、チロシン、又はリジンのうちのいずれか1つが関与する反応を選択的に除去することによって、この方法を改変できることを容易に理解する。米国特許第6,620,847号、同第6,362,161号、同第6,342,476号、同第6,054,430号、同第6,048,898号、及び同第5,981,589号明細書は、酢酸グラチラマー(Cop−1)を調製する改良法を開示する。この出願の目的では、「常温」及び「室温」という用語は、通常、約20℃から約26℃までの範囲の温度を意味する。
上記共重合体の分子量は、ポリペプチド合成中、又は上記ターポリマーが生成された後に調整することができる。上記分子量をポリペプチド合成中に調整するためには、ポリペプチドがほぼ所望の長さに達した時に合成が止まるように、合成条件又はアミノ酸の量を調整する。合成の後に、分子量分別カラム又はゲル上でのポリペプチドクロマトグラフィーなどの利用可能な任意のサイズ選択手順を用い、さらに所望の分子量範囲を収集することによって、所望の分子量を有するポリペプチドを得ることができる。高分子量の分子種を除去するために、これらのポリペプチドを、例えば酸加水分解又は酵素的加水分解によって、部分的に加水分解し、その後精製して、上記酸又は酵素を除去することができる。
一実施形態では、所望の分子量を有する共重合体を、保護されたポリペプチドを臭化水素酸と反応させて、所望の分子量プロフィールを有するトリフルオロアセチルポリペプチドを形成させるステップを含む方法によって調製することができる。この反応は、1回以上の試験反応によって予め決定された時間及び温度で行う。試験反応中には、時間及び温度を変化させて、試験ポリペプチドの所与のバッチの分子量範囲を測定する。そのバッチのポリペプチドにとって最適な分子量範囲を与える試験条件を、そのバッチに使用する。したがって、試験反応によって予め決められた時間及び温度で、保護されたポリペプチドを臭化水素酸と反応させるステップを含む方法によって、所望の分子量プロフィールを有するトリフルオロアセチルポリペプチドを産生させることができる。その後、ピペリジン水溶液を用いて、所望の分子量プロフィールを有するトリフルオロアセチルポリペプチドをさらに処理して、所望の分子量を有する低毒性ポリペプチドを形成させる。
好ましい実施形態では、所与のバッチからの保護されたポリペプチドの試験試料を、約20〜28℃の温度で約10〜50時間、臭化水素酸と反応させる。数回の試験反応を行うことによって、そのバッチにとって最良な条件を決定する。例えば、一実施形態では、保護されたポリペプチドを、約26℃の温度で約17時間、臭化水素酸と反応させる。
(医薬組成物)
本発明で使用されるランダム共重合体及び規則的共重合体は、薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物中に配合することができる。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」には、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌薬及び抗真菌薬、等張剤及び吸収遅延剤、甘味料、並びに同様のものが含まれる。薬学的に許容される担体は、限定されるものではないが、希釈剤、結合剤及び接着剤、潤滑剤、崩壊剤、着色剤、充填剤、風味剤、甘味剤、並びに緩衝剤及び特定の治療組成物を調製するのに必要となりうる吸収剤など種々の物質を含めた広範な物質から調製することができる。薬学的活性物質と、そのような媒体及び薬剤との併用は、当技術分野で周知である。なんらかの従来の媒体又は薬剤が活性成分と非適合でない限り、治療組成物中でのその使用が企図されている。
本発明で使用されるランダム共重合体及び規則的共重合体は、薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物中に配合することができる。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」には、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌薬及び抗真菌薬、等張剤及び吸収遅延剤、甘味料、並びに同様のものが含まれる。薬学的に許容される担体は、限定されるものではないが、希釈剤、結合剤及び接着剤、潤滑剤、崩壊剤、着色剤、充填剤、風味剤、甘味剤、並びに緩衝剤及び特定の治療組成物を調製するのに必要となりうる吸収剤など種々の物質を含めた広範な物質から調製することができる。薬学的活性物質と、そのような媒体及び薬剤との併用は、当技術分野で周知である。なんらかの従来の媒体又は薬剤が活性成分と非適合でない限り、治療組成物中でのその使用が企図されている。
したがって、本発明に従った使用に供する医薬組成物は、薬学的に使用できる製剤に活性化合物を加工するのを容易にする賦形剤及び補助剤を含む1つ又は複数の生理的に許容される担体を用いて、従来の方法で配合することができる。適切な配合は、選択された投与経路に依存する。
注射用には、本発明の化合物を水溶液中、好ましくは、ハンク液、リンゲル液、又は生理食塩緩衝液などの生理的に適合性の緩衝液中に配合することができる。経粘膜投与用には、透過させるべき障壁に適した浸透剤を製剤中で使用する。そのような浸透剤、例えばDMSO又はポリエチレングリコールは、当技術分野で一般的に知られている。
経口投与用の化合物は、活性化合物を当技術分野で周知の薬学的に許容される担体と併せることによって、容易に配合することができる。そのような担体は、本発明の化合物を、錠剤、丸剤、糖剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液、及び同様のものとして、患者による経口摂取用に配合するのを可能にする。経口利用するための製剤は、固体の賦形剤を用いて作製でき、任意選択で、この結果得られた混合物を研摩し、必要に応じて適当な補助剤を添加した後に、粉末混合物を加工して、錠剤又は糖衣剤コアを得る。適当な賦形剤は、中でも、ラクトース、ショ糖、マンニトール、又はソルビトールを含めた糖などの充填剤;例えば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボメチルセルロースナトリウムなどのセルロース調製物;及び/又はポリビニルピロリドン(PVP)などの生理的に許容される重合体である。必要に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、又はアルギン酸ナトリウムなどのアルギン酸若しくはアルギン酸塩などの崩壊剤を添加することができる。
経口的に使用できる医薬組成物には、ゼラチン製のプッシュフィットカプセル、並びにゼラチン製の密閉軟カプセル、及びグリセロール又はソルビトールなどの可塑剤が含まれる。プッシュフィットカプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、タルク若しくはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、及び任意選択による安定化剤との混合物中に活性成分を含有できる。
軟カプセル中では、活性化合物を、脂肪油、流動パラフィン、又は液体ポリエチレングリコールなどの適当な液体中に溶解又は懸濁させることができる。さらに、安定化剤を添加してもよい。経口投与用のすべての製剤は、選択された投与経路に適した製剤中にあるべきである。
口腔内投与用には、組成物は従来の方法によって配合された錠剤又はトローチ剤の形態を取ることができる。
非経口的投与用の医薬組成物は、水溶性型活性成分の水溶液が含まれる。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製できる。適当な親油性溶媒若しくは媒体には、胡麻油などの脂肪油、又はオレイン酸エチル、トリグリセリド、若しくはリポソームなどの合成脂肪酸エステルが含まれる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデキストランなど、懸濁液の粘度を増大させる物質を含有しうる。上記懸濁液は、任意選択で、適切な安定化剤、又は化合物の溶解度を増大させて、高度に濃縮された溶液の調製を可能にする薬剤を含有しうる。
米国特許第6,214,791号明細書は、摂食又は吸入を介した、共重合体−1の経口投与によって、多発性硬化症を治療する方法を開示する。共重合体−1が経口的に摂取する場合、それを他の食物形態と混合して、固体、準固体、懸濁液、又はエマルジョン形態で摂取してもよく、また、それを、水、懸濁剤、乳化剤、調味料、及び同様のものを含めた薬学的に許容される担体と混合させてもよい。一実施形態では、経口組成物が腸溶性のものである。共重合体−1は、上述した特定の形態で、吸入又は点鼻薬によって経鼻投与することもできる。さらに、気管又は気管支路の粘膜上皮細胞に共重合体−1を送達するのに、経口吸入を用いることもできる。
本発明の様々な実施形態によれば、上記少なくとも1種類の共重合体の治療有効量は、約1.0mgから約500.0mg/日までの範囲である。別法では、上記少なくとも1種類の共重合体のそのような治療有効量が、約20.0mgから約100.0mg/日までの範囲である。
本発明の特定の実施形態をより完全に例示するために、下記の実施例を提示する。しかし、それらは、いかなる意味においても、本発明の広範な範囲を限定するものと理解するべきではない。当業者ならば、本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に開示されている原理の多数の変形形態及び変更形態を容易に生み出すことができる。
以上の実施形態は概ね筒状の配置を利用しているが、他の形態も本発明の範囲内にあることを当業者ならば理解するであろう。したがって、入口並びに/或いは第1の断面及び/又は第2の断面は、多角形の横断面を有する可能性もあり、その場合、外径の寸法に関して上記に論じた制限は、代わりに外周長に適用されるであろう。
(材料及び方法)
(C57BL/J6マウス)
平均体重19gの月齢14カ月の雄性C57BL/J6マウス(Harlan社)を、ランダムに3つの群(各群に5匹の動物)に分割した。これらの群は、2週間の新環境順応期間に入った。陽性対照である群Aと、処置群である群Bとに、1.25%コレステロール、0.5%コール酸ナトリウム、及び15%脂肪を含有するアテローム生成性の高脂肪食(Harlan Laboratories,Teklad Premier Laboratory Diets社、米国ウィスコンシン州マディソン(Madison)TD88051所在)を与えた。陰性対照である群Cは、正常なマウス固形飼料(Altromin社、標準食)で飼育した。各動物の平均飼料摂取が約5g/日となるように配慮して、固形飼料を供給した(Walkerら、1999年、Arterioscler Thromb Vasc Biol.19、2673−2679)。飼料及び高圧滅菌水の補給を1日おきに行った。検査期間中すべての動物の体重を毎週計量した。マウスは、Weizmann Institute of Scienceの標準的動物飼育要件に従って通気されたケージ中、温度制御された環境で、12時間の明暗サイクルの下に飼育した。
(C57BL/J6マウス)
平均体重19gの月齢14カ月の雄性C57BL/J6マウス(Harlan社)を、ランダムに3つの群(各群に5匹の動物)に分割した。これらの群は、2週間の新環境順応期間に入った。陽性対照である群Aと、処置群である群Bとに、1.25%コレステロール、0.5%コール酸ナトリウム、及び15%脂肪を含有するアテローム生成性の高脂肪食(Harlan Laboratories,Teklad Premier Laboratory Diets社、米国ウィスコンシン州マディソン(Madison)TD88051所在)を与えた。陰性対照である群Cは、正常なマウス固形飼料(Altromin社、標準食)で飼育した。各動物の平均飼料摂取が約5g/日となるように配慮して、固形飼料を供給した(Walkerら、1999年、Arterioscler Thromb Vasc Biol.19、2673−2679)。飼料及び高圧滅菌水の補給を1日おきに行った。検査期間中すべての動物の体重を毎週計量した。マウスは、Weizmann Institute of Scienceの標準的動物飼育要件に従って通気されたケージ中、温度制御された環境で、12時間の明暗サイクルの下に飼育した。
新環境順応の後、群A(陽性対照)及び群C(陰性対照)の動物に、0.2mlのPBSを皮下(SC)注射で毎日与えた。群B(処置群)の動物には、PBS中にある酢酸グラチラマー(GA)(COPAXONE(登録商標)、Teva Pharmaceutical Industries社)をSC注射で毎日与えた(0.5mg/0.2ml)。すべてのマウスについて、8週間後に眼球後採血を行い、人的に頚椎脱臼させることによって屠殺した。それらの動物の心臓及び上行大動脈を摘出し、ダルベッコのPBS(Life Technologies社)でリンスし、脂肪線条形成の評価に使用した。
(apoE−/−マウス)
apoE−/−(C57BL/6Jに10回戻し交雑)マウスをJackson Laboratory社から入手し、特異病原体不在条件下で、正常な固形飼料を与えて飼育した。すべての実験手順を、Weizmann Institute of Science動物飼育委員会の承認の下で行った。
apoE−/−(C57BL/6Jに10回戻し交雑)マウスをJackson Laboratory社から入手し、特異病原体不在条件下で、正常な固形飼料を与えて飼育した。すべての実験手順を、Weizmann Institute of Science動物飼育委員会の承認の下で行った。
月齢8カ月のapoE−/−マウス(101匹のマウス)を、各群につき15匹の7群に分割した(0日目の群は例外;n=11)。対照群−時間0(群I)は、処置前の動脈硬化病変の面積を測定するために、処置を行う前に屠殺した。処置は、8週間の期間にわたって毎日行った。対照群(群II)には、PBS(0.2ml)を経口投与した。対照群IIIには、PBS(0.2ml)を皮下(SC)注射した。群IVは、PBS中のGA(5.0μg/0.2ml)で経口的に処置した。群Vは、PBS中のGA(250μg/0.2ml)で経口的に処置した。群VIには、PBS中のGA(0.5mg/0.2ml)を皮下(SC)注射した。群VIIには、PBS中のGA(2.0mg/0.2ml)を皮下(SC)注射した。
(血漿中脂質濃度)
血漿分離を行うために、全血試料を遠心分離し、各群の血漿試料をプールした。Konelab社製30i自動分析器(Kone Instruments、フィンランド国エスポー(Espoo))を用いて、総血漿コレステロール濃度、並びに低密度及び高密度リポタンパク質コレステロール(それぞれLDL及びHDL)濃度を各群で測定した。
血漿分離を行うために、全血試料を遠心分離し、各群の血漿試料をプールした。Konelab社製30i自動分析器(Kone Instruments、フィンランド国エスポー(Espoo))を用いて、総血漿コレステロール濃度、並びに低密度及び高密度リポタンパク質コレステロール(それぞれLDL及びHDL)濃度を各群で測定した。
(アテローム硬化性脂肪線条領域の定量)
いくつかの改変を有するPaigenらの方法(Paigenら、1987年、Atherosclerosis.68:231−240)に従って、大動脈における脂肪線条形成の組織学的評価を行った。簡潔には、心筋の頂端2/3を摘出し、液体窒素中で冷却されたイソペンタンを用いて、基底部分をOCT(Sakura Tissue−Tek社)中で瞬間冷凍させた。冷凍組織ブロックをクライオスタット上に配置し、上行大動脈の10μm連続切片を収集し、未染色の切片を検査することによって、大動脈洞の最も頭側な部分の位置決定が可能になるまで、電荷コーティングされたSuperfrost(商標)ガラススライド上に置いた。この切片が同定された後、400μmにわたる上行大動脈をカバーする40枚の切片を収集した。収集された40枚の切片を1枚おきにオイルレッドO(Riedel de Haen社)で染色し、ヘマトキシリン(Merck社)染色で対比染色を行い、以降の評価に使用した。オイルレッドOで染色された脂肪線条領域は、コンピューター顕微鏡面積測定システム(Nikonミクロ−マクロシステムeclipse E800;NikonデジタルカメラDXM 1200 CCD; Nikon ×20/0.75レンズ倍率)及びWindows(登録商標)XP用のImage−Pro Plus画像分析ソフトウェアを用いて客観的に測定した。染色総面積(各動物における全20枚の切片について計算した)は、各動物の切片1枚あたりで平均した。その後、1切片あたりの面積を各群の動物に関して平均し、μm2で提示した。
いくつかの改変を有するPaigenらの方法(Paigenら、1987年、Atherosclerosis.68:231−240)に従って、大動脈における脂肪線条形成の組織学的評価を行った。簡潔には、心筋の頂端2/3を摘出し、液体窒素中で冷却されたイソペンタンを用いて、基底部分をOCT(Sakura Tissue−Tek社)中で瞬間冷凍させた。冷凍組織ブロックをクライオスタット上に配置し、上行大動脈の10μm連続切片を収集し、未染色の切片を検査することによって、大動脈洞の最も頭側な部分の位置決定が可能になるまで、電荷コーティングされたSuperfrost(商標)ガラススライド上に置いた。この切片が同定された後、400μmにわたる上行大動脈をカバーする40枚の切片を収集した。収集された40枚の切片を1枚おきにオイルレッドO(Riedel de Haen社)で染色し、ヘマトキシリン(Merck社)染色で対比染色を行い、以降の評価に使用した。オイルレッドOで染色された脂肪線条領域は、コンピューター顕微鏡面積測定システム(Nikonミクロ−マクロシステムeclipse E800;NikonデジタルカメラDXM 1200 CCD; Nikon ×20/0.75レンズ倍率)及びWindows(登録商標)XP用のImage−Pro Plus画像分析ソフトウェアを用いて客観的に測定した。染色総面積(各動物における全20枚の切片について計算した)は、各動物の切片1枚あたりで平均した。その後、1切片あたりの面積を各群の動物に関して平均し、μm2で提示した。
(統計的分析)
C57BL/J6マウスの体重の比較には、1要因分散分析を用いた。陰性対照群のC57BL/J6マウス(群C)では、脂肪線条が検出されなかったので、大動脈脂肪線条面積の定量化で得られた結果の統計分析に参加したのは、2つの群(A及びB)のみであった。C57BL/J6データの分析には、スチューデントのt検定を用いた。2つの試料では分散が等しくないと仮定した。結果は、平均±標準偏差(SD)で提示し、p≦0.05を有意であるとした。
C57BL/J6マウスの体重の比較には、1要因分散分析を用いた。陰性対照群のC57BL/J6マウス(群C)では、脂肪線条が検出されなかったので、大動脈脂肪線条面積の定量化で得られた結果の統計分析に参加したのは、2つの群(A及びB)のみであった。C57BL/J6データの分析には、スチューデントのt検定を用いた。2つの試料では分散が等しくないと仮定した。結果は、平均±標準偏差(SD)で提示し、p≦0.05を有意であるとした。
apoE−/−マウスの大動脈洞における病変進行に関する、処置群と対照群との比較には、スチューデントのt検定を用いた。
(実施例1.C57BL/J6マウスの生存率及び体重への酢酸グラチラマー(GA)処置の効果)
検査開始時に記録された、群A(陽性対照)、B(処理される)、及びC(陰性対照)の平均体重は、それぞれ、18.82±1.12、18.96±1.28、及び19.10+1.14gであった(図1)。検査開始の10週間後における、群A、B、及びCの平均体重は、それぞれ24.98±1.93、24.20±0.94、及び26.90±2.17gであった(図1)。したがって、10週間の検査中における、群A、B、及びCの動物の体重増加は、それぞれ、6.16±2.93、5.24±1.40、及び7.80±2.20であった。脂肪線条の発達を較正するために、5匹の追加のマウスをコレステロールの多い飼料で飼育した。検査を開始した後、アテローム生成性の固形飼料で飼育された群A及びBの動物は、正常なマウス固形飼料で飼育された群Cの動物より、平均の体重増加が少なかった。しかし、初期体重にも、10週間後の体重にも、又は検査中における体重増加にも、統計的な相違は見出されなかった。継続的に体重を低下させた後に、GAで処置されている群Bの動物1匹、及び追加のアテローム生成食摂取群のマウス1匹が、それぞれ検査に入ってから5週間後及び6週間後に死体で発見された。PM分析では、これらの動物におけるいかなる異常も発見されなかった。群Bにおける5匹中の4匹の動物と、群A及びCにおける5匹全部の動物が検査の最後まで残った。
検査開始時に記録された、群A(陽性対照)、B(処理される)、及びC(陰性対照)の平均体重は、それぞれ、18.82±1.12、18.96±1.28、及び19.10+1.14gであった(図1)。検査開始の10週間後における、群A、B、及びCの平均体重は、それぞれ24.98±1.93、24.20±0.94、及び26.90±2.17gであった(図1)。したがって、10週間の検査中における、群A、B、及びCの動物の体重増加は、それぞれ、6.16±2.93、5.24±1.40、及び7.80±2.20であった。脂肪線条の発達を較正するために、5匹の追加のマウスをコレステロールの多い飼料で飼育した。検査を開始した後、アテローム生成性の固形飼料で飼育された群A及びBの動物は、正常なマウス固形飼料で飼育された群Cの動物より、平均の体重増加が少なかった。しかし、初期体重にも、10週間後の体重にも、又は検査中における体重増加にも、統計的な相違は見出されなかった。継続的に体重を低下させた後に、GAで処置されている群Bの動物1匹、及び追加のアテローム生成食摂取群のマウス1匹が、それぞれ検査に入ってから5週間後及び6週間後に死体で発見された。PM分析では、これらの動物におけるいかなる異常も発見されなかった。群Bにおける5匹中の4匹の動物と、群A及びCにおける5匹全部の動物が検査の最後まで残った。
(実施例2.C57BL/J6マウスの血漿中脂質濃度への酢酸グラチラマー(GA)処置の効果)
群A及びBで測定された総血漿コレステロール濃度は、それぞれ、264及び279mg/dlであり、これは群Cの2倍を超える高濃度であった(図2)。群A及びBで測定されたLDL濃度は、それぞれ178及び183mg/dlであり、これは群Cの7倍を超える高さであった。群A及びBで測定されたHDL濃度は、それぞれ54及び51mg/dlであり、これは群Cより低かった(図2)。したがって、アテローム生成食は、コレステロール及びLDLの増加、並びにHDL濃度の低下を引き起こした。GA処置は、脂質濃度に影響しなかった。
群A及びBで測定された総血漿コレステロール濃度は、それぞれ、264及び279mg/dlであり、これは群Cの2倍を超える高濃度であった(図2)。群A及びBで測定されたLDL濃度は、それぞれ178及び183mg/dlであり、これは群Cの7倍を超える高さであった。群A及びBで測定されたHDL濃度は、それぞれ54及び51mg/dlであり、これは群Cより低かった(図2)。したがって、アテローム生成食は、コレステロール及びLDLの増加、並びにHDL濃度の低下を引き起こした。GA処置は、脂質濃度に影響しなかった。
(実施例3.C57BL/J6マウスのアテローム硬化性脂肪線条面積への酢酸グラチラマー(GA)処置の効果)
コレステロールの多い飼料で飼育されていた、群Aにおける5匹すべてのマウスの大動脈中で脂肪線条が発達していた(図3A)。対照的に、対照群Cにおける5匹の動物のいずれにおいても(図3C)、また、GAで処置された群Bで検査の最後まで残っていた4匹の動物のうちの2匹においても(図3B)、分析された大動脈切片(20切片)中には脂肪線条が見出されなかった。図4Aに示されている通り、GA処置を受け、脂肪線条を有していた2匹のマウスにおける、オイルレッド0で染色され、コンピューター顕微鏡法で定量化された平均面積は、陽性対照群Aにおける平均面積より有意に(p=0.014)小さかった(40%のみ)。群Bにおける4匹のマウスすべてと比較して計算した場合、脂肪線条の面積の減少は、未処置のマウスと比較して4倍であった(図4B)。これらの図において、印(*)は、未処置群との相違が有意であることを示す(p≦0.05)。
コレステロールの多い飼料で飼育されていた、群Aにおける5匹すべてのマウスの大動脈中で脂肪線条が発達していた(図3A)。対照的に、対照群Cにおける5匹の動物のいずれにおいても(図3C)、また、GAで処置された群Bで検査の最後まで残っていた4匹の動物のうちの2匹においても(図3B)、分析された大動脈切片(20切片)中には脂肪線条が見出されなかった。図4Aに示されている通り、GA処置を受け、脂肪線条を有していた2匹のマウスにおける、オイルレッド0で染色され、コンピューター顕微鏡法で定量化された平均面積は、陽性対照群Aにおける平均面積より有意に(p=0.014)小さかった(40%のみ)。群Bにおける4匹のマウスすべてと比較して計算した場合、脂肪線条の面積の減少は、未処置のマウスと比較して4倍であった(図4B)。これらの図において、印(*)は、未処置群との相違が有意であることを示す(p≦0.05)。
(実施例4.apoE−/−マウスにおけるアテローム硬化症の進行への酢酸グラチラマー(GA)処置の効果)
高用量及び低用量のGAは、皮下投与されたものも、経口投与されたものも。apoE−/−マウスの体重増加、血漿トリグリセリド(TG)、及び血漿中コレステロールレベルに影響しなかった(図5〜6)。
高用量及び低用量のGAは、皮下投与されたものも、経口投与されたものも。apoE−/−マウスの体重増加、血漿トリグリセリド(TG)、及び血漿中コレステロールレベルに影響しなかった(図5〜6)。
対照群及び処置群の大動脈洞における動脈硬化病変の進行を計算した。群I(時間0)と比較して、有意な病変面積の増大が群III(S.C.PBS)で検出された(92425μm2、p=0.046)。経口投与(50μg)又はS.C.投与(500μg)された低用量のGAは病変進行に影響しなかったが、経口投与又はS.C.投与の両方で、高用量のGA(それぞれ250μg及び2mg)は、対照と比較して、病変領域の進行を実質的に同様に、すなわち、それぞれ37.7%及び44.4%抑制した(図7)。
大動脈のアテローム硬化面積を、以下の群、すなわちI(時間0);III(S.C.PBS);V、(経口GA、250μg);及びVII(S.C.GA、2.0mg)の対照マウス及び処置マウスで測定した。時間0と比較して、有意な病変面積の増大が、対照S.C.群及び経口GA(250μg)群で検出された(Tuket検定、P<0.05)。
S.C.投与された高用量のGA(2.0mg)は、対照群IIIと比較して、病変領域の進行を有意に(t検定、P=0.009)、52%抑制した(図8)。
特定の実施形態に関する以上の記述は、本発明の一般的な性質をかくも完全に明らかにするであろうから、他の者も、現在の知識を適用することによって、過度の実験をせずに、また、一般的な概念から逸脱せずに、そのような特定の実施形態を容易に改変し、且つ/又は様々な適用に適応させることができ、したがって、そのような適応及び改変は、開示された実施形態の等価物の意味及び範囲の中にあると理解されるべきであり、また、そのように意図されている。本明細書に使用された術語又は用語は、限定ではなく、説明を目的としたものであることが理解されよう。開示された様々な機能を実施する手段、物質、及びステップは、本発明から逸脱せずに、様々な代替形態をとることができる。
Claims (36)
- それを必要とする対象の心血管疾患及び障害を治療又は予防する方法であって、治療有効量の、少なくとも1種類の共重合体を含む医薬組成物を投与するステップを含み、前記共重合体が共重合体1及び共重合体1関連ヘテロ重合体から選択され、前記共重合体が少なくとも3種類のアミノ酸を含み、前記アミノ酸の各々が以下の群、すなわち、
(a)リジン及びアルギニン;
(b)グルタミン酸及びアスパラギン酸;
(c)アラニン、グリジン、及びバリン;
(d)チロシン、トリプトファン、及びフェニルアラニン
のうちの少なくとも3つから選択される方法。 - 少なくとも1種類の共重合体が、ランダム共重合体、規則的共重合体、及び規則的ペプチドからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1種類の共重合体が4種類の異なったアミノ酸を含有し、前記アミノ酸の各々が群(a)から(d)までのうちの1つから選択されている、請求項2に記載の方法。
- 前記少なくとも1種類の共重合体が、本質的には、アラニン、グルタミン酸、リジン、及びチロシンからなり、正味で正の全体的電荷を有し、且つ、約2000から約40000ダルトンの分子量を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1種類の共重合体の分子量が約13000から約18000ダルトンである、請求項4に記載の方法。
- 前記少なくとも1種類の共重合体の分子量が約15キロダルトンである、請求項5に記載の方法。
- 前記少なくとも1種類の共重合体が、アラニン、グルタミン酸、リジン、及びチロシンからなり、グルタミン酸約0.14、アラニン約0.43、チロシン約0.10、及びリジン約0.33のモル比を有する、請求項4に記載の方法。
- 前記モル比が、グルタミン酸0.17、アラニン0.49、チロシン0.10、及びリジン0.38である、請求項7に記載の方法。
- 前記モル比が、グルタミン酸0.19、アラニン0.6、チロシン0.10、及びリジン0.4である、請求項7に記載の方法。
- 前記共重合体が酢酸グラチラマーである、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1種類の共重合体が、3種類の異なったアミノ酸を含有するターポリマーであり、前記アミノ酸の各々が群(a)から(d)から選択されている、請求項1に記載の方法。
- 前記ターポリマーが、本質的には、3種類の異なったアミノ酸からなり、前記アミノ酸の各々が、群(a)、(c)、及び(d)のいずれか1つから選択されている、請求項11に記載の方法。
- 前記ターポリマーが、本質的には、チロシン、アラニン、及びリジンからなり、チロシン約0.005から約0.25、アラニン約0.3から約0.6、及びリジン約0.1から約0.5のモル比を有する、請求項12に記載の方法。
- 前記ターポリマーがYAKであり、2000〜40000ダルトンの分子量を有する、請求項18に記載の方法。
- 前記ターポリマーが、本質的には、3種類の異なったアミノ酸からなり、前記アミノ酸の各々が、群(a)、(b)、及び(d)のうちの1つから選択されている、請求項11に記載の方法。
- 前記ターポリマーが、本質的には、アミノ酸であるグルタミン酸、チロシン、及びリジンからなり、グルタミン酸約0.005から約0.300、チロシン約0.005から約0.250、及びリジン約0.3から約0.7のモル比を有する、請求項14に記載の方法。
- 前記ターポリマーがYEKであり、約2000〜40000Daの分子量を有する、請求項15に記載の方法。
- 前記ターポリマーが、本質的には、3種類の異なったアミノ酸からなり、前記アミノ酸の各々が、群(b)、(c)、及び(d)のうちの1つから選択されている、請求項11に記載の方法。
- 前記ターポリマーが、本質的には、アミノ酸であるチロシン、グルタミン酸、及びアラニンからなり、チロシン約0.005から約0.25、グルタミン酸約0.005から約0.3、及びアラニン約0.005から約0.8のモル比を有する、請求項17に記載の方法。
- 前記ターポリマーがYEAであり、約2000〜40000Daの分子量を有する、請求項19に記載の方法。
- 前記少なくとも1種類の共重合体を含むアミノ酸が、L−アミノ酸、D−アミノ酸、並びにL−アミノ酸及びD−アミノ酸の混合物からなる群から選択されている、請求項1に記載の方法。
- 前記規則的ペプチドが、配列番号1〜32から選択されている、請求項2に記載の方法。
- 前記少なくとも1種類の共重合体が、約15から約100アミノ酸を含むランダム共重合体である、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1種類の共重合体を、少なくとも1種類の免疫調節剤と併せて投与するステップをさらに含み、前記少なくとも1種類の免疫調節剤が、Th1リンパ球の活性又は存在を減弱できる、請求項1に記載の方法。
- 前記免疫調節剤が、α−IL−4、α−IL−12、α−IL−18、α−IFN−γ、α−インテグリン、及びα−CD4+からなる群から選択された抗体である、請求項23に記載の方法。
- 前記免疫調節剤が、IL−12、IL−18、インテグリン、及びIFN−γからなる群から選択された分子の発現を低減できる、請求項23に記載の方法。
- 前記免疫調節剤が、アンチセンスヌクレオチド配列、センスヌクレオチド配列、干渉RNA、リボザイム、及びアプタマーからなる群から選択される、請求項25に記載の方法。
- 前記少なくとも1種類の共重合体と、前記少なくとも1種類の免疫調節剤とを順次に投与する、請求項23に記載の方法。
- 前記少なくとも1種類の共重合体と、前記少なくとも1種類の免疫調節剤とを、実質的に同時に投与する、請求項23に記載の方法。
- 前記少なくとも1種類の共重合体と、前記少なくとも1種類の免疫調節剤とを、単一組成物中で同時投与する、請求項23に記載の方法。
- 前記少なくとも1種類の共重合体と、前記少なくとも1種類の免疫調節剤とを、別々の組成物中で投与する、請求項23に記載の方法。
- 前記心血管疾患及び障害が、動脈硬化、アテローム硬化症、及び心筋炎からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記医薬組成物を、経口投与に適した単位剤形に配合する、請求項1に記載の方法。
- 前記医薬組成物を、非経口注射に適した単位剤形に配合する、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1種類の共重合体の治療有効量が、約1.0mgから約500.0mg/日までの範囲である、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1種類の共重合体の治療有効量が約20.0mgから約100.0mg/日までの範囲である、請求項34に記載の方法。
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