CN106323933A

CN106323933A - 一种单质硒含量的测定方法

Info

Publication number: CN106323933A
Application number: CN201610953809.5A
Authority: CN
Inventors: 王凤芹; 汪以真; 张�林
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2016-08-12
Filing date: 2016-11-03
Publication date: 2017-01-11
Anticipated expiration: 2036-11-03
Also published as: CN106323933B

Abstract

本发明公开了一种单质硒含量的测定方法。富硒蛋白多糖中加入XIV型蛋白酶，超声辅助酶解，将酶解液进行离心，所得到的沉淀在盐酸介质中，用双氧水在常温下进行氧化，所得到的四价硒在酸性条件下与2，3‑二氨基萘（DAN）反应生成苤硒脑络生物，用环己烷萃取；测定环己烷层荧光强度，从而计算出富硒蛋白多糖中单质硒的含量。对硒的测定避免使用了混合酸，同时大大减少了酸的用量；消化在常温下进行，可以避免强氧化还原性酸对实验室环境的污染，同时可防止硒的挥发损失，得到较高回收率；单质硒的消解时间短，约30分钟可以完成。

Description

一种单质硒含量的测定方法

技术领域

本发明涉及一种单质硒含量的测定方法。

背景技术

文献报道，有些耐硒菌株能够将无机硒转化为有机硒或红色纳米硒（Keka，2011；Tugarova，2014；Liu，2014；Wang，2013），这些红色纳米硒，本质是粒径在60～80 nm以内红色单质硒（陈辉，2006；付学锋，2008；Dobias，2011）。研究发现，硒的生物学功能甚至毒性又和其含量、价态以及形态密切相关（Chen，2006）。因此，很有必要建立不同价态硒的定量方法。

就单质硒检测而言，研究进展缓慢。只有少数论文涉及单质硒的定量测定（Velinsky，1990；Chen，2006）。其中Keka（Keka，2011）报道采用1 M Na₂S水溶液提取细菌生物合成的纳米硒，再经紫外分光光度法直接测定，但实际上提取的不仅仅是Se（0），还包括了其它价态的Se，和样品中的其它的基质，从而造成检测结果远远高于单质硒的实际含量；Loeschner采用Na₂SO₃原位衍生单质硒，再用高效液相色谱电感耦合等离子体质谱（HPLC-ICP-MS）定量分析Na₂SeSO₃（Loeschner，2014），该方法标样Na₂SeSO₃没有商品化，每次合成耗时长，而且反应效率不能量化，另外最重要的一点是HPLC-ICP-MS仪器不能普及，导致用该方法定量分析单质硒在普通实验室不能实现。

荧光分光光度法（Watkinson，1960；Hall，1969）是比较经典的总硒含量测定方法（Koike，1993），该方法在前处理过程中，样品须在HClO₄-HNO₃甚至H₂SO₄中，高温条件下进行消解，再进行过夜放置（Ducros，1992）。Ducros （Ducros，1994）改进了上述方法，样品经HNO₃-H₂O₂加热回流微波消解再加入HCl进行酸化，整个消化过程45分钟。以上样品中的硒被统一氧化还原成四价，对四价硒检测得到的是样品中总硒的含量。以上方法均涉及到加热装置，其次一个消解时间长，一个涉及回流及微波功率的控制，给实际操作带来不便。前期，本申请人公开了一种快速定量检测单质硒的方法及分离收集装置。所述方法将待测单质硒样品置入分离收集装置中加热，冷却后用Na₂S水溶液对硒粉进行收集，再利用紫外分光光度计测量吸光度值。该方法要求对样品先进行干燥处理。而本发明则适用于液态、固态的样本。

发明内容

针对现有单质硒检测技术的缺乏以及富硒蛋白多糖中单质硒含量检测的需要，本发明提供了一种单质硒含量的测定方法，快速、环保、简便。

一种单质硒含量的测定方法，常温下将待测样品中加入XIV型蛋白酶，超声辅助酶解，将酶解液进行离心，所得到的沉淀在HCl提供的酸性环境下利用双氧水氧化成为SeO₃ ^2-离子，其中的四价硒在微酸性pH 1.5～2.0条件下，与2，3-二氨基萘（DAN）生成苤硒脑络生物，用环己烷萃取，用荧光光度计在激发波长为376 nm、发射波长为520 nm条件下测定荧光强度，从而计算出样品中的硒含量。

所述的待测样品为富硒蛋白多糖。

所述的测定方法，具体步骤如下：称取25 mg的富硒蛋白多糖于5 mL离心管中，加入3 mg XIV型蛋白酶，再加入3 mL的水，37℃超声30 min，然后离心30 min，转速设为10000rpm/min，收集沉淀，并向沉淀中加入3 mL的水，混匀后10000 rpm/min离心30 min，离心结束后弃去上清，向得到的沉淀中加入100 uL浓度为6 mol/L的 HCL，再向其中加入3 mL H₂O₂常温下反应30 min，将上述反应后的反应液转移到容量瓶中，并用水定容至10 mL，再用水稀释6倍，从中取出2.0 mL加入至锥形瓶中，再加入30～40mL的水，调节pH至 1.5～2.0，接着加入3 mL EDTA 混合液摇匀，后加入3 mL DAN溶液，摇匀，置于沸水中保持5 min，取出冷却至室温，然后全部转移到125 mL分液漏斗中，加10 mL环己烷振荡2.0 min，静置分层后，用激发光波长376 nm、发射光波长520 nm 测定环己烷层的荧光强度，从而得到富硒蛋白多糖中单质硒含量。

本发明的有益效果：

本发明先对富硒蛋白多糖用XIV型酶进行酶解，使结合在蛋白质上的硒水解成为水溶性的硒代氨基酸，用离心的方法对水溶性的含硒物质与单质硒进行分离；对单质硒硒的避免使用混合酸，并且大大减少了酸的用量；整个消解过程在常温下进行，避免了使用加热装置和微波装置；整个前处理过程在5 mL离心管中进行，可防止硒的挥发损失，得到较高回收率，同时有效提高样品前处理的可操作性和准确性；避免了使用成本较高的HPLC-ICP-MS的使用，使普通实验室能够用该方法完成单质硒含量的检测；消化时间大大缩短，消化过程30分钟内可以完成。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明进一步详细的说明；

图1为亚硒酸钠标准溶液的标准曲线及线性方程。

具体实施方式

方法原理

常温下单质硒在HCl提供的酸性环境下被双氧水氧化成为SeO₃ ^2-离子，四价硒在微酸性条件下与2，3-二氨基萘（DAN）生成苤硒脑络生物，用环己烷萃取。用荧光光度计在激发波长为376 nm、发射波长为520 nm条件下测定荧光强度，从而计算出样品中的硒含量。

称取25 mg的富硒蛋白多糖于5 mL离心管中，加入3 mg XIV型蛋白酶，再加入3 mL的水，置于超声波清洗机中超声30 min，温度设置为37℃，将上述酶解液离心30 min，转速设为10000 rpm/min，收集沉淀，并向沉淀中加入3 mL的水，混匀后10000 rpm/min离心30min，离心结束后弃去上清，向沉淀中加入100 uL浓度为6 mol/L的 HCL，再向其中加入3 mLH₂O₂常温下反应30 min，将上述反应液转移到容量瓶中，并用水定容至10 mL，再用水稀释6倍，从中取出2.0 mL加入至锥形瓶中，再加入30～40mL的水，调节pH至 1.5～2.0，接着加入3 mL EDTA 混合液摇匀，后加入3 mL DAN溶液，摇匀，置于沸水中保持5 min，取出冷却至室温，然后全部转移到125 mL分液漏斗中，加10 mL环己烷振荡2.0 min，静置分层后，用激发光波长376 nm、发射光波长520 nm 测定环己烷层的荧光强度，从而得到富硒蛋白多糖中单质硒含量。

仪器与试剂

softmax pro5多功能连续光谱酶标仪（美国Molecular Devices公司），高速冷冻离心机（美国Thermo公司），数显恒温水浴锅（常州国华），pH计（美国Mettler Toledo 公司），纯水仪（日本Yamato公司），纯水来自本纯水仪。

XIV型蛋白酶（Protease from stretomyces griseus，sigma公司）、色谱级硒粉、色谱级亚硒酸钠和2，3-二氨基萘（DAN）分析纯从sigma公司购买。DAN 试剂（1.0 g/L）：此试剂在暗室内配制。称取DAN（纯度95%～98%）200 mg 于一带盖锥形瓶中，加入0.1 mol/L 盐酸200 mL，振摇约15 min 使其全部溶解。加入约40 mL 环己烷，继续振荡5 min。将此液倒入塞有玻璃棉（或脱脂棉）的分液漏斗中，待分层后滤去环己烷层，收集DAN 溶液层，反复用环己烷纯化直至环己烷中荧光降至最低时为止（约纯化12 次）。将纯化后的DAN 溶液储于棕色瓶中，加入约1 cm 厚的环己烷覆盖表层，至冰箱内保存。必要时在使用前再以环己烷纯化一次。至荧光值约为7～8；盐酸、EDTA二钠、盐酸羟胺、环己烷均为分析纯，由国药集团化学试剂有限公司生产；EDTA 混合液：称取EDTA 二钠盐2.5 g，加水并加热至完全溶解，冷却后稀释至125mL；加入6.25 g 盐酸羟胺溶于水中，稀释至250 mL。

富硒蛋白多糖由本实验室发酵（Xu，2009）。

实施例1 标准曲线的绘制

准确称取量25.0 mg亚硒酸钠溶解在100 mL水中，逐步稀释成1.50，1.20，1.0，0.80，0.50，0.30以及0.15 ug/mL亚硒酸钠标准工作液。每个浓度取2 mL，用水稀释至40 mL，用6mol/L盐酸调节pH至1.5～2.0，接着加入3 mL EDTA 混合液摇匀，后加入3 mL DAN溶液，摇匀，置于沸水中保持5 min。取出冷却至室温，全部转移到125 mL的分液漏斗中，加10 mL环己烷振荡2.0 min，静置分层后，于荧光分光光度计上，用激发光波长376 nm、发射光波长520 nm 测定环己烷层的荧光强度。

实施例2 硒粉总硒含量测定

准确称取20.0 mg的硒粉于3 mL的离心管中，加入100 uL浓度为6 mol/L的 HCL，再向其中加入3 mL H₂O₂常温下反应30 min，将上述反应液转移到容量瓶中，并用水定容至1000mL，再配成0.2 ug/L硒粉待测液。从中取出2.0 mL加入至锥形瓶中，再加入30～40mL的水，调节pH至 1.5～2.0，接着加入3 mL EDTA 混合液摇匀，后加入3 mL DAN溶液，摇匀，置于沸水中保持5 min，取出冷却至室温，然后全部转移到125 mL分液漏斗中，加10 mL环己烷振荡2.0 min，静置分层后，用激发光波长376 nm、发射光波长520 nm 测定环己烷层的荧光强度。

实施例3富硒蛋白多糖中单质硒含量测定

根据以上实施例1-3得到的结果与讨论：

1、标准曲线的绘制

10 mL环己烷中所含亚硒酸钠的量作标准曲线如图1所示，曲线的回归方程为y=74.524x+8.585，相关系数平方为0.999，0～3.0 ug亚硒酸钠在每10 mL环己烷中浓度与荧光强度呈良好的线性关系。

、硒粉总硒含量测定结果

0.2 ug/L硒粉待测液，以亚硒酸钠标准曲线比对，其中亚硒酸钠含量为0.432 ug/L，换算成硒的含量为结果为0.196 ug/L，结果表明HNO₃-H₂O₂体系在常温下能够将硒粉消化完全。

、富硒蛋白多糖中单质硒含量测定结果

5次测得富硒蛋白多糖中单质硒含量平均值为2625.13 ug/g，相对标准偏差为4.49%，如下表所示。

。

Claims

1.一种单质硒含量的测定方法，其特征是：常温下将待测样品中加入XIV型蛋白酶，超声辅助酶解，将酶解液进行离心，所得到的沉淀在HCl提供的酸性环境下利用双氧水氧化成为SeO₃ ^2-离子，其中的四价硒在微酸性pH 1.5～2.0条件下，与2，3-二氨基萘（DAN）生成苤硒脑络生物，用环己烷萃取，用荧光光度计在激发波长为376 nm、发射波长为520 nm条件下测定荧光强度，从而计算出样品中的硒含量。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征是：所述的待测样品为富硒蛋白多糖。

3.根据权利要求2所述的测定方法，其特征是：具体步骤如下：

称取25 mg的富硒蛋白多糖于5 mL离心管中，加入3 mg XIV型蛋白酶，再加入3 mL的水，37℃超声30 min，然后离心30 min，转速设为10000 rpm/min，收集沉淀，并向沉淀中加入3 mL的水，混匀后10000 rpm/min离心30 min，离心结束后弃去上清，向得到的沉淀中加入100 uL浓度为6 mol/L的 HCL，再向其中加入3 mL H₂O₂常温下反应30 min，将上述反应后的反应液转移到容量瓶中，并用水定容至10 mL，再用水稀释6倍，从中取出2.0 mL加入至锥形瓶中，再加入30～40mL的水，调节pH至 1.5～2.0，接着加入3 mL EDTA 混合液摇匀，后加入3 mL DAN溶液，摇匀，置于沸水中保持5 min，取出冷却至室温，然后全部转移到125 mL分液漏斗中，加10 mL环己烷振荡2.0 min，静置分层后，用激发光波长376 nm、发射光波长520nm 测定环己烷层的荧光强度，从而得到富硒蛋白多糖中单质硒含量。