CN104076111B - 用于膜蛋白在线鉴定的膜蛋白富集、纯化、酶解一体化装置及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物分析与检测技术领域，具体为一种用于膜蛋白线鉴定的膜蛋白富集、纯化、酶解一体化装置。该装置由高压泵、六通阀、膜蛋白共价固定反应柱及有关连接组成。所述膜蛋白固定反应柱中填料表面的活性基团能够与膜蛋白游离氨基、羧基发生反应，从而将膜蛋白牢牢固定在反应柱上。本发明利用共价键合的原理将膜蛋白固定在反应柱内，增溶剂以及磷脂等干扰物可通过流动相在线冲洗的方法除去，不会造成额外的样品损失，从而达到理想的鉴定效果。实验表明，利用本发明装置具有反应效率高、非特异性吸附小等优点，并成功运用到大鼠鼠肝组织膜蛋白组的鉴定中。本发明装置结构新颖，实用高效，具有推广应用潜力。
Description
技术领域
本发明属于生物分析与检测技术领域，具体涉及一种基于膜蛋白共价固定原理的膜蛋白富集、纯化、酶解一体化装置及其使用方法。
技术背景
膜蛋白执行着细胞内外物质交换、细胞识别与免疫应答、信号传导和调控，以及能量传递等重要功能。因此，膜蛋白的研究已经发展成为蛋白质组学领域中的重要部分。基于shot-gun方法的高通量蛋白质组学技术结合先进的生物信息学分析，为膜蛋白的研究提供了新的手段和办法。然而，膜蛋白丰度低、疏水性强、水溶性差、且大部分膜蛋白存在糖基化、磷酸化等翻译后修饰，造成膜蛋白的鉴定难度加大，对目前通用的蛋白质组学技术提出了挑战。
近年来，膜蛋白的研究主要分为两个方向。一是开发能够与蛋白酶解、色谱分离和质谱鉴定相兼容的膜蛋白增溶剂。美国Waters公司推出了一种酸不稳定型表面活性剂RapiGestSF，它可以增加膜蛋白的溶解能力，而且不抑制蛋白水解酶活性，不过费用昂贵，而且酸沉淀过程中会造成疏水性肽段的损失。二是寻找能够去除传统膜蛋白增溶剂（如SDS）的行之有效的方法，以减小其对后续鉴定过程的影响。Qian等基于十二烷基磺酸钾在水溶液中不溶的特点，利用钾离子沉淀法来去除SDS；Li等利用强阳离子交换柱来分离去除SDS；梁宋平等将膜蛋白固定在胶内，然后通过洗涤凝胶的方法来去除SDS，并发表了一系列工作对其进行改进。目前报导的这些方法在SDS去除方面效果都不错，但是样品损失情况严重，重复性较差，很难推广应用。
基于以上认识，目前膜蛋白组学的研究真正需要的是一种设计新颖，制备便捷，分析快速高效的在线鉴定系统。结合这一目标，我们将膜蛋白固定、增溶剂去除以及酶解三个步骤集成到一个10cm长的反应柱内，通过一个六通阀和一个十通阀的切换实现了膜蛋白的在线鉴定，大大降低了样品损失，简化了实验步骤。
发明内容
本发明的目的在于提供一种膜蛋白固定效率高、样品损失率低，结构简单、操作方便的，用于膜蛋白线鉴定的膜蛋白富集、纯化、酶解一体化装置。
本发明提供的用于膜蛋白线鉴定的膜蛋白富集、纯化、酶解一体化装置，由一个四元高压泵、一个进样针、一个进样环、一个六通阀、一个膜蛋白共价固定的反应柱、一个十通阀和一个捕集柱组成；其中，六通阀具有6个接口，四元高压泵与六通阀的2号口相连，六通阀的5号口为进样口，进样环连接于六通阀的1号口和4号口之间，反应柱连接于六通阀的3号口与十通阀的1号口之间，捕集柱连接于十通阀的2号口与6号口之间，六通阀的5号口与十通阀的5号口连接废液瓶；所述四元高压泵具有A、B、C、D共4个相位，分别对应于A、B、C、D4个相，A相为反应缓冲液，B相为Tris-HCl和0NaCl的混合溶液，C相为NH4CO3溶液，D相为去离子水。如图1所示。
本发明中，膜蛋白共价固定的反应柱所用的填料为表面修饰有三氟乙磺酸基、环氧基或醛基等活性基团的球形材料，这些基团与膜蛋白表面的游离氨基可发生亲核取代反应，从而高效地固定膜蛋白。该亲核取代反应具有快速高效、非特异性吸附小等优点，能够固定95%以上的膜蛋白。而且，提取膜蛋白时用到的各种去污剂或表面活性剂以及脂双层中的磷脂可通过合适的流动相洗脱的方法完全去除，不造成实质的样品损失。随后再向反应柱通入蛋白酶及其缓冲溶液，在线将固定于材料上的膜蛋白充分酶解。进一步通过捕集柱富集酶解后的肽段，然后进入液质联用系统分析。酶解肽段也可通过阀切换直接进入LC/MS分析系统，避免样品在流转中的损失。
本发明利用六通阀的切换实现膜蛋白进样、反应与酶解；利用十通阀的切换实现肽段的捕集与液质联用的分离鉴定。整个鉴定过程中，膜蛋白无需经过离线处理，大大降低了样品的损失。
本发明提供的膜蛋白富集、纯化、酶解一体化装置的使用方法，具体步骤为：
第一步：将六通阀和十通阀均保持在A位，用进样针将膜蛋白样品注射入进样环，并利用高压泵将A相缓冲液冲洗反应柱；
第二步：将六通阀切换至B位，用A相将进样环中的样品以0.1-0.4μL/min的流速通过反应柱；
第三步，将六通阀切换至A位，先后用B相和C相冲洗反应柱，并在进样环中注射Trypsin溶液；
第四步，将六通阀切和十通阀均换至B位，用C相将酶溶液以0.1-0.4μL/min的流速通过反应柱，然后用D相冲洗反应柱以及捕集柱；
第五步：将十通阀切换至C位，利用液质联用系统对捕集柱内的肽段进行分析（如图2）。
本发明中，膜蛋白共价固定的反应柱的制备方法如下：用一个金属两通配合垫片作为柱塞，将表面修饰有三氟乙磺酸基、环氧基、醛基等活性基团的球形材料分散在无水乙醇中，利用压力作用填入一小段毛细管中；再利用液相高压泵，边超声边将填料填充均匀紧密（如图3）。
本发明提供的膜蛋白富集、纯化、酶解一体化装置可用于膜蛋白的鉴定，具体步骤为：按照密度梯度离心的方法提取膜蛋白（如大鼠鼠肝组织的膜蛋白），并溶解在A相（0.8MPBS、2%SDS和1%ILs的混合溶液，pH9.0）中得到0.5μg/μL的膜蛋白溶液。将20L膜蛋白溶液注射入进样环，以0.2μL/min的速度流经反应柱，并保持柱温60℃。反应2小时后，换用B相（0.1MTris-HCl和0.5MNaCl的混合溶液，pH8.0）以相同的速度流经反应柱1小时。随后换用C相（50mMNH4CO3溶液）以2μL/min的速度冲洗反应柱1小时。切换六通阀至A位，在进样环中注入40μL浓度为10ng/μL胰蛋白酶溶液，并将六通阀和十通阀均切换至B位，将反应柱与捕集柱接通，换用C相（50mMNH4CO3溶液）以0.2L/min的速度流经反应柱，则酶解肽段富集在捕集柱上。最后用D相（去离子水）以2L/min的速度冲洗反应柱以及捕集柱，达到除盐的目的。最后将十通阀切换至C位，进行液质联用系统分析。
利用本发明设计的膜蛋白富集、纯化、酶解一体化装置，可以在10小时内完成全部实验步骤，并且从10μg膜蛋白中鉴定出322种膜蛋白，其中192种膜蛋白含有跨膜结构。实验结果充分证明，本发明的膜蛋白在线鉴定系统达到了实际应用的要求，因而具有广阔的应用前景。
本发明中，利用2%十二万基磺酸钠（SDS）与1%离子液体（ILs）作为膜蛋白溶剂，可达到增大溶解度和促进固定反应的双重效果。
本发明中，膜蛋白被共价固定到反应柱内的填料表面，膜蛋白增溶剂以及磷脂等干扰物质能够通过流动相在线冲洗的方法轻松去除，既不会对后续实验造成影响，也不会造成实质的样品损失。
本发明中，膜蛋白在填料表面形成单分子层，使得蛋白水解酶与膜蛋白的接触几率增大。而且，由于膜蛋白上氨基与填料随机反应，所以蛋白水解酶对膜蛋白的酶切更加丰富。因此，整个酶解过程用时更短，效率更高。
附图说明
图1为本发明的膜蛋白富集、纯化、酶解一体化装置示意图。
图2为在线膜蛋白鉴定流程图。A相：反应缓冲液（PBS、2%SDS和1%ILs，pH9.0）；B相：0.1MTris-HCl和0.5MNaCl的混合溶液，pH8.0；C相：50mMNH4CO3溶液；D相：去离子水。
图3为反应柱的剖面图。
具体实施方式
实施例1：膜蛋白反应柱的制备
截取一段长10cm、内径530μm的毛细管，用无水乙醇清洗三次。一端接上一个配有垫片的金属两通，以此作为柱塞；利用压力差从另一端均匀填入将商品化的填料。然后将毛细管开口端与高压泵相连，边超声边加压，确保填充均匀紧实，并检测反应柱的耐受压力。
实施例2：膜蛋白固定
按照密度梯度离心的方法提取大鼠鼠肝组织膜蛋白，并溶解在A相中得到0.5μg/μL的膜蛋白溶液。反应柱储存在60℃柱温箱中。六通阀与十通阀保持在A位，将20μL膜蛋白溶液注射入进样环。然后将六通阀切换至B位，利用高压泵将A相以0.2μL/min的速度流经反应柱。反应2小时后，换用B相以1μL/min的速度流经反应柱1小时，以此封闭未反应的三氟乙磺酸基团。用D相以2μL/min的速度冲洗反应柱1小时，去除增溶剂以及磷脂等干扰物。
实施例3：膜蛋白在线鉴定系统在大鼠鼠肝组织膜蛋白鉴定实验中的应用
先切换六通阀至A位，在进样环中注入40μL浓度为10ng/μL胰蛋白酶溶液，并将六通阀和十通阀均切换至B位，将反应柱与捕集柱接通，换用C相（50mMNH4CO3溶液）以0.2μL/min的速度流经反应柱，则酶解肽段富集在捕集柱上。最后用D相（去离子水）以2μL/min的速度冲洗反应柱以及捕集柱，达到除盐的目的。经过LC/MS鉴定得到322种蛋白，其中192种膜蛋白含有跨膜结构。
Claims (2)
1.一种膜蛋白在线鉴定的方法，其特征在于采用膜蛋白富集、纯化、酶解一体化装置，该一体化装置由一个四元高压泵、一个进样针、一个进样环、一个六通阀、一个膜蛋白共价固定的反应柱、一个十通阀和一个捕集柱组成；其中，六通阀具有6个接口，四元高压泵与六通阀的2号口相连，六通阀的6号口为进样口，进样环连接于六通阀的1号口和4号口之间，反应柱连接于六通阀的3号口与十通阀的1号口之间，捕集柱连接于十通阀的2号口与6号口之间，六通阀的5号口与十通阀的5号口连接废液瓶；所述四元高压泵分别对应于A、B、C、D四种流动相，A相为反应缓冲液：PBS、2%SDS和1%离子液体，pH9.0，B相为Tris-HCl和NaCl的混合溶液，C相为NH4CO3溶液，D相为去离子水；
鉴定的具体步骤为：
第一步：将六通阀保持在a位，即1号口和6号口相连，2号口和3号口相连，4号口和5号口相连；十通阀保持在a位，即0号口和1号口相连，2号口和3号口相连，4号口和5号口相连，6号口和7号口相连，8号口和9号口相连；用进样针将膜蛋白样品注射入进样环，并利用高压泵将A相缓冲液冲洗反应柱；
第二步：将六通阀切换至b位，即1号口和2号口相连，3号口和4号口相连，5号口和6号口相连；十通阀保持在a位，即0号口和1号口相连，2号口和3号口相连，4号口和5号口相连，6号口和7号口相连，8号口和9号口相连；用A相将进样环中的样品以0.1-0.4μL/min的流速通过反应柱；
第三步，将六通阀切换至a位，先后用B相和C相冲洗反应柱，并在进样环中注射Trypsin溶液；
第四步，将六通阀和十通阀分别切换至b位和b’位，即十通阀b'位连接方式为1号口和2号口相连，3号口和4号口相连，5号口和6号口相连，7号口和8号口相连，9号口和0号口相连，用C相将酶溶液以0.1-0.4μL/min的流速通过反应柱，然后用D相冲洗反应柱以及捕集柱；
第五步：将六通阀与十通阀断开，十通阀切换至c'位，即0号口和1号口相连，2号口和3号口相连，4号口和5号口相连，6号口和7号口相连，8号口和9号口相连，3号口接上一分析柱，利用液质联用系统对捕集柱内的肽段进行分析。
2.根据权利要求1所述的膜蛋白在线鉴定的方法，其特征在于所述膜蛋白共价固定的反应柱所用的填料为表面修饰有三氟乙磺酸基、环氧基或醛基活性基团的球形材料，这些基团与膜蛋白表面的游离氨基可发生亲核取代反应，从而高效地固定膜蛋白。
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