CN101101245A - 毛细管微量成分分析方法和仪器装置 - Google Patents

Abstract

本发明的[课题]利用毛细管进行微量分析的方法，装置，可以用于复杂的环境样品，生化样品的直接分析，不需任何预处理。[解决手段]将毛细管的保护层除掉一微小部分，然后用化学侵蚀法将其微小部分做成多孔体，在高分子膜涂层覆盖，并设置在一容器里。容器里的样品中的成分通过涂层覆盖的高分子膜注入毛细管内。大小离子先在该微小涂层覆盖的高分子膜分离，再进行毛细管电泳或电色谱或液相色谱分离。

Description

毛细管微量成分分析方法和仪器装置

技术领域

本发明是有关于利用毛细管进行微量成分分析的方法和仪器装置仪器的发明。特别是关于不需要分析前样品的预处理操作，复杂样品可以直接用于分析的简单快速的毛细管微量成分分析方法和装置仪器的发明。

背景技术

分析对象很微量时，要求在稀释较少的细毛细管内进行分离分析。如毛细管电泳分析(CE)，毛细管高效液相色谱(HPLC)分析。可是，因为毛细管的内径很细，样品的复杂成分会导致毛细管内壁的吸附和堵塞等问题。

因而，在分析复杂样品，像泥水这样的很复杂的环境样品，或血样，尿样，牛奶这样的生物样品中的微量成分(如氯化物离子，金属离子等)时，通常至少先需把样品过滤，然后再用溶剂萃取，固相萃取，膜分离等样品预处理方法处理后，再用高效液相色谱(HPLC)，或毛细管电泳分析(CE)等方法进行分析。可是，这样的样品预处理往往导致样品变质，污染，或损失，使得样品中的微量成分难以正确测量。

为了解决这个问题，在HPLC里通常用阀把预处理柱和毛细管分离柱相连，这种情况，连接部分产生死体积，也产生样品的扩散和吸附等问题。

在CE分析里，本作者曾报道过在毛细管的一端接上一段细透析膜，先在细透析膜上浓缩蛋白质再进行CE分析。也报道过在细透析膜上注样，小离子能直接注入而大分子注不进去的报道。因为细透析膜的内径和毛细管的内径不一样，这样也存在着死体积的问题。还有，细透析膜和毛细管的相接比较困难(参考文献1，2)。

也有把两根毛细管相接的报道，相接处也存在着死体积的问题(参考文献4，5)。

还有，把离毛细管一端几厘米的地方的polyimide高分子膜烧掉1mm左右，然后用HF侵蚀成多孔膜，在此多孔膜处浓缩蛋白质进行CE的报道。这种做法得到的多空膜很脆弱，一碰就断，实际上不实用(参考文献3)。

本发明想解决的课题

本发明提供一种能简单而且高效率的分析微量成分的毛细管分析技术和仪器。该技术和仪器包括利用本发明中的新型毛细管的液相色谱(HPLC)，毛细管电泳(CE)，毛细管电色谱(CEC)等毛细管分析技术。

更详细地说，本发明提供一种不需过滤等任何样品预处理，也不需微小阀门等任何连接部件的毛细管分离技术和仪器装置。在本毛细管分析技术里，样品是通过毛细管的微小局部处的分离膜注样于毛细管内，或通过该分离膜将样品中的某分析对象浓缩在毛细管内的。该微小局部内的分离膜是在毛细管微小处经过化学处理而形成的，其耐久性高，也可通过选择膜的构造做成高选择性的分离膜，以便用于生物样品的分析。

课题的解决手段

在毛细管管壁上开一微小孔，并在微小孔内形成分离膜的同时，使含该微小孔的毛细管部分同样品溶液或分离用溶出液或缓冲溶液相接触，这样样品中的成分通过分离膜被导入或浓缩在毛细管内后再进行分析为特征。还有，毛细管外表皮的微小剥落处形成后，含该剥落处的毛细管部分被纳入一小容器内，然后该剥落处做成多孔质或贯穿孔后，用高分子膜涂层等化学处理覆盖住为特征。

发明的效果

本发明是在毛细管管壁的一个或复数个微小处设置高分子膜和多孔膜，使得预处理部分和分离管一体化而无死体积。这样传统的预处理引起的死体积问题完全解决。毛细管的多孔膜处的机械强度也没有问题。使得本法能用于毛细管电泳以外，也可以用于HPLC和CEC的在线预处理。因为不需样品预处理，使得本毛细管分析技术操作特别简单，大大缩小分析时间。

实施发明的方法例子

本发明的技术方案是先在毛细管外表面的保护树脂膜开一个微小孔。保护树脂膜不只是为了保持毛细管的机械强度，对下一步的防止侵蚀也起重要作用。正因为这样，只是将没有树脂保护膜的微小剥离处侵蚀处理成多孔质才有可能。作为树脂保护膜，polyimideTeflon，Peek等能耐侵蚀处理的树脂材料都行。

为了侵蚀处理成多孔质，毛细管的内部只要是含氧化硅骨骼的材料，什么都行。石英玻璃管或Monolith毛细管柱等可以用来做毛细管。填充有填充剂的毛细管也可以用于此。剥离毛细管外表面微小局部的树脂保护膜的方法可以是用火烧掉该树脂膜，然后用Epoxy树脂涂层覆盖住大部分烧掉的部分，只剩下直径1mm左右的小孔。在本发明中，多孔质部越小越好。为了多孔质部尽量小，本发明用激光照射树脂膜，这样，激光聚焦点可以小到10个微米以下。

然后将此微小孔下面的毛细管用HF(调整适当的浓度和温度)侵蚀处理，溶解掉二氧化硅骨骼，最后成很薄的多孔膜。或可用高压电场击穿的方法将微小剥落处制成导电性膜(同时检测电流)。然后，将该微小多孔处进行化学处理涂层，增加其机械强度和耐用性和选择性。

Methylsilane，Octylsilane等疏水性硅烷化试剂在水溶液中安定性好，可以起多孔膜的保护作用。而且，用非水溶剂时，可以利用无机盐析出来改变特性。进一步地用diol，aminopropyl，cellulose acetate等材料进行高分子膜化，可以使多孔膜表面被高分子膜包层，大大增加耐用性。

另外，如果使用分子量2000以上的oligomer材料的话，10微米以下的小孔的话，即使不是多孔质而是贯穿孔，也能形成高分子膜而涂层于微小孔处。Polyethylenglycol，polyvinylalcohl，silica sol-gel等材料均可以用于此覆盖涂层目的。

具体实施例

图1-4所示是本发明中的毛细管的构造和制造工程的一个例子。

毛细管通常是石英玻璃的毛细管。在该毛细管1的外表层的树脂保护膜(如polyimide)2上用激光照射或其他手段剥离成一微小孔3(图1)。微小孔3处的保护膜被剥离掉，大小在10微米以下。也可用其他方法剥离，如烧掉后再用高分子膜覆盖其余部，剩下一小孔。

下一步是将微小孔处3固定在容器4内。固定方法可以是将毛细管1放置在玻璃片5(或其他塑料板或其它材料)上后再放置容器4，然后用胶或结合剂6固定(图2)。容器4可以是玻璃或塑料或其他非导电性材料做成的小容器。

下面是容器4里加HF水溶液7，对微小剥离部3进行侵蚀。同时，毛细管的两端相接的容器8，12和毛细管1内填充电泳用缓冲液或无机盐NaCl等的水溶液5，并在容器4和8里分别插入电极101和102，接上电源10，在容器4和8间加电压(几百伏或几千伏)，并同时观察电流计100上的电流(图3)。在毛细管剥离处成多孔膜前，毛细管是绝缘体，不会有电流观察到。一旦观察到电流，马上除去容器1中的HF水溶液，再用水清洗容器4。这时微小剥离处3已形成多孔质膜或导电性膜，然后滴入一定浓度的cellulose acetate的丙酮溶液或其他高分子材料的溶液。待丙酮或其他有机溶剂蒸发后，微小剥离处3上形成cellulose acetate或其他高分子材料的涂层覆盖膜11(图4)。

这样微小剥离处的涂层覆盖膜具有导电性，缓冲溶液中的小离子能穿透，蛋白质等大分子不能透过它。此剥离处的涂层覆盖膜处的容器里放样品溶液，同时在毛细管内填充缓冲溶液并在毛细管的一端的容器里放缓冲溶液，通过适当形式加电场，可以使样品中的小离子通过分离膜注入毛细管内而大分子和微粒不会注入。相反，如果在毛细管的一端的容器里放样品溶液，剥离处的涂层覆盖膜处的容器里放缓冲溶液，通过适当形式加电场，蛋白质等大分子从毛细管的一端注入毛细管，并浓缩在毛细管里的多孔膜管壁处，而小离子却能从多孔膜泳动出去而不会浓缩在毛细管里。也就是不需任何过滤等预处理操作或使用浓缩柱等浓缩操作，本毛细管分析技术可以浓缩蛋白质或只注入小离子。

下面是复杂样品中的小离子分析时的注样说明。

在分析复杂样品中的小离子时，如图5所示，样品溶液13放在容器4里，而毛细管两端的容器8和12以及毛细管里放分离小离子用缓冲溶液14。在容器4和8间由高压电源15加注样电压(电压大小看容器4和8间的距离，一般是50伏/厘米左右，电场的极性看分析的对象是正还是负离子。如果分析对象是负离子，容器4里的电极是正极，容器5里的电极是负极。如果是正离子，容器4和8里的电极的极性相反)。在电场作用下，容器4里的小离子将通过涂层覆盖高分子膜，多孔质玻璃膜电泳到毛细管里。而大分子和微粒进不了涂层覆盖高分子膜，因为也进不了毛细管内。过了一定的注样时间后，切断容器4和8间的电压，将容器4里的样品溶液换成缓冲溶液14，并在毛细管两端的容器8和12间由高压电源15加分离电压(容器12内放入电极103)，进行正常的毛细管电泳分析或毛细管电泳色谱分析，分离的样品离子被检出器16检出(图6)。电压的切换通过设置开关，容器里的电极可以固定在容器里或不加电压时拿出来。

下面是复杂样品中的大离子在毛细管内浓缩时的注样说明。

在分析含微量大分子离子(如蛋白质等)的样品时，如图5所示，样品溶液18放在容器8里，而容器4和12以及毛细管里放大分子离子分离用缓冲溶液17。在容器4和8间加电压(电压大小看容器4和8间的距离，一般是50伏/厘米左右，电场的极性看分析的对象是正还是负离子。如果分析对象是负离子，容器4里的电极是正极，容器8里的电极是负极。如果是正离子，容器4和8里的电极的极性相反)。在电场作用下，容器8里的大分子离子电泳到毛细管里，但是因为是大分子，不能通过涂层覆盖高分子膜和多孔膜，因而停留在毛细管内的多孔膜前。也就是被浓缩在毛细管内的多孔膜处。而小离子却能透过高分子膜，电泳到容器4里。过了一定的注样时间后，将容器8里的样品溶液换成缓冲溶液17，并在毛细管两端的容器8和12间由高压电源15加分离电压，进行正常的毛细管电泳分析或毛细管电用色谱分析，分离的样品离子被检出器16检出(图8)。电压的切换通过设置开关，容器里的电极可以固定在容器里或不加电压时拿出来。

上面例子中的容器4和8间的距离可以按需要调整。如图9所示，容器4和8也可以固定在同一玻璃板5上。

下面是复杂样品中的某些成分在毛细管内选择性浓缩时的注样说明。

如图10所示，毛细管注样端可填充一定长度的固相萃取剂或吸附剂20，为了防止固相萃取剂的移动，固相萃取剂20的两端可设置frit(19和21)。Frit可用sol-gel法做成的SiO2胶或glass wool这样的材料。然后在frit 19`处或靠近frit 19`的地方用上述方法做成微小多孔质膜或直接开成微小贯穿孔22或22’，并固定在容器23内。然后，如图11所示，毛细管的两端放在容器24和25内，并注入缓冲溶液，在容器23内加样品溶液26后，容器23和24间加电压。样品离子通过微小多孔质膜或微小贯穿孔进入毛细管，并吸附在固相萃取剂或吸附剂20上。

注样一定时间后，如图12所示，容器23中的样品溶液换成缓冲液27，容器24中的缓冲液换成解吸溶液(有机解吸剂和缓冲溶液的混合液)28，在容器23和24间加电压或用落差法(将容器24位置提高或容器25位置降低)注入一定量的解吸溶液。然后把容器24中的解吸溶液换成缓冲液27，继续用落差法或电泳法将注进去的解吸溶液移动过frit 19。下一步是如图13所示，在容器23和25间加分离电压，进行正常的毛细管电泳分析或毛细管电用色谱分析，分离的样品离子被检出器检出。

下面是实际的分析例子。

图14是8种阴离子用传统的毛细管电泳分析中的从一端注样的分析结果(图14-A)和用本法，即通过涂层覆盖多孔膜注样后的分析结果(图14-B)。毛细管电泳分析中的缓冲溶液的pH是8，两端电压是20kV，用间接UV吸光度检出的方法检出。从图14中可以看出，这些小分子离子可以从多孔膜注样，注样后的分析结果和从一端注样的分析结果基本一致，从多孔膜注样的样品注样率同一端注样时相比为70-80％左右。

图15是4种带苯环结构的有机物的用传统的毛细管电泳分析中的从一端注样的分析结果(图15-A)和用本法，即通过多孔膜注样后的分析结果(图15-B)。毛细管电泳分析中的缓冲溶液的pH是11，两端电压是20kV，用直接UV吸光度检出的方法检出。从图15中可以看出，这些带苯环结构的有机物可以从多孔膜注样，注样后的分析结果和从一端注样的分析结果基本一致，从多孔膜注样的样品注样率同一端注样时相比为20-40％左右。

图16是牛奶样品的分析结果。通常，象牛奶这样的复杂生化样品用毛细管电泳分析法分析时，牛奶中的脂肪，蛋白质等成分会吸附在毛细管内壁，这样，渗透流不安定，分析结果的再现性不好。如图16-c所示，传统毛细管电泳分析牛奶时，第一次注样的分析结果和第二次注样的分析结果不一样。另一方面，本法在毛细管的微小部导入的多孔分离膜只允许小离子电泳进入毛细管，蛋白质这样的大分子不能进入毛细管。另外，电泳法注样时，中性脂肪类化合物也进不了毛细管内。因为，如图16-A，B所示，第一次注样的分析结果和第十一次注样的分析结果一样。牛奶样品每天注样20回，连续4日注样80回得到的结果如图17所示，有良好的再现性。

图18是河水样品的分析结果。通常，象河水这样的复杂环境样品用毛细管电泳分析法分析时，至少得进行过滤这样的操作。日本福井大学附近的九头龙的河水样品在过滤后用毛细管电泳分析的结果如图18-A所示，连续实验是没有再现性。而用本法，通过多孔膜注样的话，如图18-B所示再现性良好。

图19是本法快速浓缩蛋白质的例子。图19-A，B是传统的毛细管电泳实验，也就是从毛细管的一端注样后再进行毛细管电泳分离检测，4种蛋白质的检出限在0.01/ml左右。

另一方面，用本发明的方法，也就是先将蛋白质浓缩到毛细管内的多孔膜处，再进行毛细管电泳分离的话，4种蛋白质的检出限可降低到0.0003/ml以下。浓缩倍数分别在100-2000倍。

本法也可用于细胞培养液中的微量的蛋白质的分析。

图20-A是两种氯化酚的普通CE的结果，检出限是0.5μg/ml.图20-B是本发明中用图10-13所示的in capillary SPE-CE方法得到的两种氯化酚的分析结果。在毛细管注样端填充吸附剂Abselut sorbent约1mm(两端分别用sol-gel做成的frit和glass wool堵住)。从图20-B可以看到，用本发明的方法，检出限是0.5ng/ml.比普通的方法降低了1000倍。本发明也可以用于两维电泳分离。如图21所示，用两台高压电源29和30，两台检出器31和32，并可进行两维电泳分离，如CIEF-CE或CEC-CE等。

本发明也可用于CEC和HPLC的柱子上。如图22所示，在monolith HPLC的MonoCap C18柱子1上的一定位置的上下两处用上述方法开两个微小剥离处。然后，把微小剥离处放入4通连接器34里后，用HF侵蚀处理后涂层覆盖高分子膜。

然后如图23所示，柱子的一端同HPLC的高压泵38相接，另一端同检出器39相接。样品(如咖啡因)溶液用注样针37通过4通连接器25注入，样品中的小离子通过涂层覆盖高分子膜进入柱子内，大分子和粒子被排出柱外。

然后拔出注样针37，旋上4通连接器。进行正常的HPLC或CEC(图24).

用0.1M磷酸缓冲溶液/acetronitrile(80/20)作为移动相，在流速2微升/分时HPLC的结果如图25所示。

图25-A是单独分析咖啡因的结果，图25-B是单独分析咖啡因和牛血清蛋白混合物的结果。

图25-C是普通HPLC分析咖啡因和牛血清蛋白混合物的结果。很明显本发明能从在注样是将混合物中的大分子除掉。

参考文献

1.X-Wu，Takanori Kasasima，Anal.Sci，16，329-331(2000).

2.X.-Z.Wu，K.Kasashima，M.Sakai，Anal.Sci.，19，1541(2003).

3.W.Wei，E.S.Yeung，Anal.Chem.，74，3899(2002).

4.Xing-Zheng Wu、Rui Umeda、Anal Bioanal Chem(2005)382：848-852

5.呉 行正、笹木孝司、小林英吾、保母敏行、分析化学、43，609(1994).

6.猪俣 保、その他3名、特許公開平8-15221

附图及附图简要说明

图1本发明的毛细管实施例的加工说明图

图2本发明的毛细管实施例的加工说明图

图3本发明的毛细管实施例的加工说明图

图4本发明的毛细管实施例的加工说明图

图5本发明的一实施例的概略说明图

图6本发明的一实施例的概略说明图

图7本发明的一实施例的概略说明图

图8本发明的一实施例的概略说明图

图9本发明的一实施例的概略说明图

图10本发明的一实施例的概略说明图

图11本发明的一实施例的概略说明图

图12本发明的一实施例的概略说明图

图13本发明的一实施例的概略说明图

图14本发明的一实施例和传统的CE比较结果

图15本发明的一实施例和传统的CE比较结果

图16本发明的一实施例牛奶样品的连续分析结果和传统的CE比较结果

图17本发明的一实施例牛奶样品的连续分析结果

图18本发明的一实施例河水样品的连续分析结果和传统的CE比较结果

图19本发明的一实施例低浓度蛋白质样品的浓缩CE结果和传统的CE比较结果

图20本发明的一实施例氯化酚的in-capillary SPE-CE结果和传统的CE比较结果

图21本发明的一实施例的概略说明图

图22本发明的一实施例的概略说明图

图23本发明的一实施例的概略说明图

图24本发明的一实施例的概略说明图

图25本发明的一实施例咖啡因和牛血蛋白的HPLC分析结果和传统的HPLC比较结果。

Claims (10)

1.毛细管管壁有一个或几个微小孔，该微小孔内充满分离膜或一部分是分离膜覆盖或涂层的侵蚀多孔管壁，该微小孔和分析样品溶液或分析缓冲溶液接触，分析样品中的分析对象通过分离膜或分离膜覆盖或涂层的多孔管壁，被注入毛细管内或在毛细管内浓缩后进行分析为特征的毛细管微量成分分析方法。

2.毛细管的外表皮有一微小剥离部，含该微小剥离部的毛细管部分被设置在一小容器内，并且该微小剥离部内作成多孔通道后被覆盖或涂层上分离膜，使用了有这样特征的毛细管的微量成分分析装置。

3.设置含微小剥离部的毛细管部分的小容器是多通道连接器或多通阀为特征的权利要求项2所记载的毛细管微量成分分析方法和仪器。

4.以毛细管的微小孔分离膜处为界线，一边是毛细管电色谱或毛细管等电点聚焦电泳等分离方式，另一边是毛细管电泳方式的2维分离为特征的权利要求项1～3中有记载的毛细管微量成分分析方法和仪器。

5.内径2`mm以下含Si50％以上的玻璃中空管或玻璃monolith管或填充管的外表面树脂保护膜的微小局部被剥落，该剥落处的Si成分的一部分或全部被溶解，形成多孔质体的同时，该部分用化学处理过为特征的毛细管。

6.用激光或脉冲激光剥落树脂保护膜为特征的权利要求项1或2中所记载的毛细管。

7.用加电压同时检测电流值的方法制作的微小局部的多孔质体，同时并对该多孔质体作了化学处理为特征的权利要求项1或2中所记载的毛细管。

8.上述中的化学处理是Cellulose Acetate膜涂层或Cellulose Acetate有机溶剂的溶液处理过为特征的权利要求项1或2中所记载的毛细管。

9.把上述中的化学处理过的微小局部用于样品过滤，浓缩等预处理的毛细管电泳柱，毛细管电色谱柱，和累似的其他分析用毛细管。

10.使用权利要求项9中记载的毛细管或毛细管柱的电泳分析仪器，电动色谱分析仪器以及其他分析仪器。

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