CN102206621B

CN102206621B - 一种基于阳离子交换膜的酶微反应器

Info

Publication number: CN102206621B
Application number: CN201110063769A
Authority: CN
Inventors: 刘虎威; 周志贵; 周宇; 白玉
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2011-03-16
Filing date: 2011-03-16
Publication date: 2012-10-10
Anticipated expiration: 2031-03-16
Also published as: CN102206621A

Abstract

本发明公开了一种基于阳离子交换膜的酶固定化方法及酶微反应器，属于蛋白质酶解技术领域。以阳离子交换膜作为酶固定化的载体，实现该方法的酶微反应器的核心组件-反应腔由第一和第二阳离子交换膜(1)、(3)和聚醚醚酮薄膜(2)组成，聚醚醚酮薄膜(2)夹在第一和第二阳离子交换膜(1)和(3)之间。聚醚醚酮薄膜(2)上刻蚀的微通道(4)穿透聚醚醚酮薄膜(2)的上下表面。酶溶液连续通过酶微反应器2-10分钟即可完成酶固定化过程，酶通过静电作用和疏水作用固定在阳离子交换膜上。蛋白质溶液连续通过酶微反应器，在数秒内即可完成酶解。酶微反应器在每一次酶解后快速再生，完全避免了不同蛋白质酶解结果的干扰。

Description

一种基于阳离子交换膜的酶微反应器

技术领域

本发明属于蛋白质酶解技术领域，具体涉及一种基于阳离子交换膜的酶固定化方法及酶微反应器。

背景技术

“鸟枪”法是一种被广泛使用的蛋白质组学研究策略，通常包括蛋白质酶解、多肽分离及质谱检测三个步骤，其中，高效完全的酶解是保障研究结果准确可靠的重要前提。传统溶液酶解存在的一些不足之处，如酶解时间长、酶的自身降解等，使得它已不可能满足蛋白质组学高效率、高通量的发展要求。酶的固定化技术很好地克服了溶液酶解的这些不足，酶固定到载体上后，酶的局部浓度增加，提高了酶解效率；同时酶的自身降解减少，酶的稳定性提高，而且固定化酶可以重复利用。近年来发展起来的酶微反应器，将酶固定化技术与微反应器技术相结合，在实现酶固定化的同时，还充分利用了微反应器的诸多优点，如比表面积大、传质速度快、通量高、样品消耗量少等，为蛋白质快速高效酶解提供了理想的技术平台。

通常，酶在微反应器中的固定化方法有物理吸附、共价结合、静电结合等，所采用的载体有填充颗粒、整体柱、膜、毛细管或芯片通道的内壁等。其中，整体柱因其柱压低、传质速度快等特点应用最为广泛。然而整体柱通常是自行制备，与之相比，有许多种类已商品化的膜，如聚二氟乙烯多孔膜(PVDF)、等离子聚合膜(PPF)、纤维素膜、尼龙膜等，可以购买直接使用；并且以膜为载体，具有内表面大、局部酶浓度高的优点，因此，以膜作为固定化酶的载体有着良好的应用前景。

在各种酶固定化方法中，静电结合用于酶的固定，与物理吸附相比作用力强，可以减少酶的流失。尽管共价结合是相对最为牢固的固定化方法，然而通常需要多步骤的反应，过程复杂，耗时长，而且可能造成酶活性的损失。相比之下，静电结合，固定化过程简单快速，对酶活性影响较少，因此，静电结合是更为理想的酶固定化方法。

发明内容

针对溶液酶解和现有的酶微反应器技术存在的不足，本发明提供一种基于阳离子交换膜的快速酶固定化方法。

本发明的另一个目的是提供一种新型酶微反应器，采用以阳离子交换膜为载体的酶固定化方法，为蛋白质组学研究提供快速高效的蛋白质酶解技术手段。

本发明酶固定化方法以阳离子交换膜为载体，静电结合用于酶的固定。

本发明酶微反应器的核心组件-反应腔由第一阳离子交换膜1、聚醚醚酮（PEEK）薄膜2（50~200μm厚）和第二阳离子交换膜3组成，如图1所示。PEEK薄膜2上刻蚀有微通道4，微通道4穿透PEEK薄膜2的上下表面。通过机械压力或者粘合剂，PEEK薄膜2的上表面与第一阳离子交换膜1的下表面紧密贴合，并且PEEK薄膜2的下表面与第二阳离子交换膜3的上表面紧密贴合。PEEK薄膜2和与其紧密贴合的第一和第二阳离子交换膜1和3的膜表面组成的腔体即为酶微反应器的反应腔。第一和第二PEEK管5和6分别与微通道4的两端相通，作为微通道4的入口和出口管路。微通道4以及第一和第二PEEK管5和6都采用PEEK材料来减少酶、被分析蛋白质以及酶解产生的多肽在这些部位的非特异吸附。此外，本发明设计的微通道4的流路与膜平行，酶或蛋白质溶液即使以较高流速通过时，系统也可以维持较低压力。

本发明所述的酶微反应器的操作流程包括以下三步：

1.酶固定化。胰蛋白酶溶解于pH为7.5~8.5的缓冲溶液中，胰蛋白酶溶液连续通过酶微反应器2-10分钟即可完成酶固定化。胰蛋白酶的pI值为10.5，在pH值7.5~8.5的缓冲溶液中带正电荷，通过静电作用与阳离子交换膜相结合，此外，阳离子交换膜的高聚物基质还可以通过疏水作用吸附酶。

2.蛋白质酶解。经过变性或其他方式处理过的蛋白质溶液连续通过酶微反应器，蛋白质在通过微反应腔的数秒内即可完成酶解。流出物收集在样品瓶或者其他接受装置中，然后经液相色谱/质谱（LC/MS）对酶解产物进行分析，通过得到的多肽信息对蛋白质进行分析。

3.酶微反应器的再生。在完成一次蛋白质样品酶解后，依次通过含NaOH的NaCl水溶液、HCl水溶液和纯水对酶微反应器进行再生。再生后的酶微反应器重复1~3操作对另一个蛋白质样品进行分析。

本发明的积极进步效果在于：a.酶通过静电作用和疏水作用固定在阳离子交换膜上，固定化过程对酶活性影响较小，而且只需要数分钟，与已报道的酶固定化技术相比时间大大缩短；b.蛋白质溶液连续通过酶微反应器，在数秒内即可完成酶解，酶解过程简单快速；c.酶微反应器在完成一次蛋白质酶解后快速再生，完全避免了不同蛋白质酶解结果的干扰，提高了蛋白质分析的准确性；d.酶微反应器易于与其他蛋白质样品处理或多肽分离分析技术在线联用，可以为蛋白质分析提供高效、自动化程度高的技术平台。

下面通过酶微反应器在酶固定量、酶活性和酶解反应的重复性等方面以及酶微反应器与LC/MS在线联用系统在蛋白质分析中的应用方面的研究证明本发明的有益效果和实用性。

一．酶微反应器的酶固定量及酶活性的研究

胰蛋白酶溶液（1mg/mL，缓冲溶液：50mM Tris，20mM CaCl₂，HCl调节pH至8.0）以5μL/min的流速连续通过酶微反应器（微通道4尺寸：40mm长，240μm宽，50μm深）2分钟，通过LC/MS测定酶溶液通过酶微反应器前后减少的酶量，计算得出：经过2分钟的固定化过程，酶在酶微反应器中的固定量为2.6μg。已知微通道4接触的上下两层阳离子交换膜1和3的膜表面积总和为0.192cm²，故酶在膜上的吸附量为13.5μg/cm²。

选用N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）研究了固定化酶的活性，并将其与溶液中酶的活性进行了比较。BAEE及其酶解产物N-苯甲酰-L-精氨酸（BA）由配置有紫外（UV）检测器的LC分析，实验条件如下：色谱柱为C8反相色谱柱（柱长150mm，内径2.1mm，填料粒径5μm）；流动相为75%乙腈/25%水（含0.5%三氟乙酸），流速为0.2mL/min；UV波长为254nm。实验得到的典型色谱图如图2（a）所示。五个浓度的BAEE（5、10、20、50、100mM，溶解于50mM NH₄HCO₃）分别以2μL/min的流速通过再生后的酶微反应器（恒温于37°C水浴中，酶解时间14.4秒），收集流出物由LC/UV分析BA生成量。用以对照的溶液酶解的酶解时间为10分钟，酶解温度为37°C。图2（b）和（c）分别为微反应器固定化酶和溶液中酶的Lineweave-Burk方程回归直线，计算得到的K_m值分别为20.7和4.8mM，每μg酶对应的V_max分别为155.7和1.5mM/s，可见微反应器酶的V_max是溶液中酶的100多倍，证明了酶微反应器快速高效的酶解能力。

二．酶微反应器的酶解反应重复性的研究

本研究先考察了所采用的再生条件的有效性。完成0.1mg/mL细胞色素C（CYC）酶解的酶微反应器经过再生后，依次以2μL/min的流速通过50mM NH₄HCO₃和0.1mg/mL CYC（溶液通过微反应器时间为14.4秒），收集流出物由LC/MS分析，LC实验条件如下：色谱柱为C18反相色谱柱（柱长150mm，内径2.1mm，填料粒径5μm）；流动相A相为水（含0.1%甲酸）,B相为乙腈（含0.1%甲酸），洗脱程序：0-15分钟5%B，15-65分钟5%-60%B，65.5-80分钟95%B，80.5-95分钟5%B，流速为0.2mL/min。采集到的MS/MS数据由Moscot检索多肽信息，在NH₄HCO₃和CYC的流出物中都未检测到CYC酶解产生的多肽片段，证明经过再生步骤，酶、非特异吸附的蛋白质和多肽都被除去。

进一步选择CYC作为模型蛋白连续进行10次酶解，结果如图3所示。可以看出，检测到的匹配的多肽数量及序列覆盖率（RSD 3.2%）都有较好的重复性，证明了酶微反应器的可靠性。

三．酶微反应器/LC/MS在线联用系统在蛋白质分析中的应用

酶微反应器/LC/MS在线联用系统由流动注射泵7、酶微反应器8、带有20μL样品定量环的六通阀9、LC梯度洗脱高压泵10、LC色谱柱11和质谱仪12组成，装置示意图如图4所示，通过六通阀9的切换可以实现在线的蛋白质酶解、多肽的分离与检测。选择三种模型蛋白质，包括CYC、肌球蛋白（MYG）和牛血清蛋白（BSA），研究了在线联用系统的实用性。

酶解之前，MYG经8M尿素变性后稀释至0.3mg/mL；BSA依次经二硫苏糖醇（DTT）还原和碘乙酸（IAA）烷基化反应后稀释至0.3mg/mL；0.1mg/mL CYC未经过变性直接用于酶解。三种蛋白质分别经过酶微反应器（酶固定化条件同“酶固定量的研究”部分）和溶液酶解（蛋白质与酶质量比为50∶1），酶解时间分别为14.4秒和6小时，酶解产物由LC/MS进行分析，CYC实验条件与“酶微反应器的酶解反应重复性的研究”相同，MYG和BSA的流动相洗脱程序为：0-15分钟5%B，15-90分钟5%-60%B，90.5-105分钟95%B，105.5-120分钟5%B，其他条件与CYC相同。三种蛋白质通过在线联用系统进行酶解和6小时溶液酶解得到的多肽数量及序列覆盖率如表1所示，可以看出，在线联用系统酶解蛋白质序列覆盖率与溶液酶解相当或者更高，然而酶解时间大大缩短，证明了酶微反应器的有益效果和实用性。

表1三种蛋白质通过酶微反应器进行酶解和溶液酶解的实验结果

本发明以阳离子交换膜为载体制备了一种新型的酶微反应器用于蛋白质的酶解，酶通过静电作用和疏水作用固定化在阳离子交换膜上，固定化过程对酶活性影响较小，而且可以在数分钟内完成，与已报道的酶固定化技术相比时间大大缩短。另外，酶微反应器在每一次酶解后快速再生，避免了不同蛋白质样品酶解结果的干扰，提高了蛋白质分析的准确性。

附图说明

图1是基于阳离子交换膜的酶微反应器的核心组件-反应腔的展开示意图；

图2是酶活性测定结果，其中（a）是LC/UV分析BAEE及其酶解产物BA得到的典型色谱图；（b）是酶反应器中固定化酶的Lineweave-Burk曲线；（c）是溶液中自由酶的Lineweave-Burk曲线；

图3是以细胞色素C为模型蛋白质来研究酶微反应器的酶解反应重复性的实验结果；

图4是酶微反应器/LC/MS在线联用系统的示意图；

图5是已制备的酶微反应器的展开示意图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

一、酶微反应器的结构

酶微反应器的核心组件-反应腔由以聚苯乙烯-二乙烯基苯（PS-DVB）为基质、磺酸根为交换基团的第一阳离子交换膜1（60mm长，33mm宽）、第二阳离子交换膜3（50mm长，33mm宽）以及PEEK薄膜2（60mm长，33mm宽，50μm厚）组成。PEEK薄膜2上的微通道4（40mm长，240μm宽，50μm深）由准分子激光器刻蚀，微通道4穿透PEEK薄膜2的上下表面。通过机械压力或者粘合剂，PEEK薄膜2的上表面与第一阳离子交换膜1的下表面紧密贴合，并且PEEK薄膜2的下表面与第二阳离子交换膜3的上表面紧密贴合。第一和第二阳离子交换膜1和3的外侧各紧密贴合一张第一和第二聚碳酸酯（PC）薄片13和14（60mm长，33mm宽，1mm厚）用以支撑和固定膜。在第二PC薄片14的上表面机械加工具有相同尺寸的第一和第二微槽21和22（12mm长，400μm宽，400μm深），第一和第二微槽21和22的一端对应于微通道4的端点，另一端为第二PC薄片14的边缘。将第二阳离子交换膜3平整地放在第二PC薄片14上，长边上下对齐，第二阳离子交换膜3的两短边离第二PC薄片14的两短边的距离均为5mm。通过在第二阳离子交换膜3的上表面指压一根外径为360μm毛细管将第二阳离子交换膜3对应于第一和第二微槽21和22的部分膜分别内陷于第一和第二微槽21和22中。将第一和第二PEEK管5和6（150mm长，360μm外径，100μm内径）分别放置于第一和第二微槽21和22中，第一和第二PEEK管的一部分位于陷入微槽的第二阳离子交换膜3的上表面。由于第二阳离子交换膜3的长度小于第二PC薄片14的长度，所以第一和第二PEEK管的一部分位于刻蚀在第二PC薄片14上的第一和第二微槽中，用环氧树脂结构胶将PEEK管固定在第一和第二微槽21和22中。PEEK薄膜2与第二阳离子交换膜3紧密贴合后，第一和第二PEEK管5和6与微通道4相通。所有上述结构夹在相同尺寸的两个铝块15和16（60mm长，60mm宽，10mm厚）之间的中间位置处，四角用长于所有部件总厚度的螺丝17、18、19和20固定。制备的酶微反应器的展开示意图如图5所示，酶微反应器固定在一个密闭盒子中，置于37°C水浴中恒温。

酶微反应器的反应腔还可以作为微流控集成系统的一部分，与具备蛋白质分离、分析功能的腔体整合到一片微流控芯片中用于蛋白质的分析。微通道4两端还可以采用其他接口与第一和第二PEEK管5和6连接。

二、酶微反应器的操作流程

1.酶固定化。新鲜配制的胰蛋白酶溶液（1mg/mL，缓冲溶液：50mM Tris，20mM CaCl₂，HCl调节pH至8.0）以5μL/min的流速连续通过酶微反应器2分钟完成固定化。然后，以5μL/min的流速通入50mM NH₄HCO₃4分钟以除去未吸附的酶。

2.蛋白质酶解。经过变性处理的蛋白质溶液以2μL/min的流速连续通过酶微反应器（酶解时间为14.4秒），收集流出物经LC/MS分离检测和Moscot检索后，通过得到的多肽信息对蛋白质进行分析。

3.酶微反应器再生。完成一次蛋白质酶解后，以10μL/min的流速，依次通入10%NaCl（含1%NaOH）、4%HCl和水对酶微反应器进行再生，通入时间分别为15、5和15分钟。再生后的酶微反应器重复1~3操作对另一个蛋白质样品进行分析。

最后需要注意的是，公布实施例的目的在于帮助进一步理解本发明，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附的权利要求的精神和范围内，各种替换和修改都是可能的。因此，本发明不应局限于实施例所公开的内容，本发明要求保护的范围以权利要求书界定的范围为准。

Claims

1.一种酶微反应器，其特征在于，酶微反应器的反应腔由以聚苯乙烯-二乙烯基苯为基质、磺酸根为交换基团的第一阳离子交换膜、以聚苯乙烯-二乙烯基苯为基质、磺酸根为交换基团的第二阳离子交换膜以及一片刻蚀有微通道的聚醚醚酮薄膜即PEEK薄膜组成，所述PEEK薄膜夹在所述第一和第二阳离子交换膜之间，通过机械压力或者粘合剂，所述PEEK薄膜的上表面与所述第一阳离子交换膜的下表面紧密贴合，并且所述PEEK薄膜的下表面与所述第二阳离子交换膜的上表面紧密贴合。

2.如权利要求1所述的酶微反应器，其特征在于，所述PEEK薄膜的厚度为百微米量级，所述微通道穿透所述PEEK薄膜的上、下表面。

3.如权利要求1所述的酶微反应器，其特征在于，所述第一和第二阳离子交换膜的外侧各紧密贴合第一和第二聚碳酸酯薄片用以支撑和固定膜，所述第二阳离子交换膜的长度小于所述第二聚碳酸酯薄片的长度，所述第一和第二阳离子交换膜位于所述第一和第二聚碳酸酯薄片的中间位置处。

4.如权利要求3所述的酶微反应器，其特征在于，在所述第二聚碳酸酯薄片的上表面具有机械加工的相同尺寸的第一微槽和第二微槽，所述第一和第二微槽的一端对应于所述微通道的端点，另一端为所述第二聚碳酸酯薄片的边缘。

5.如权利要求4所述的酶微反应器，其特征在于，通过在第二阳离子交换膜的上表面指压一根毛细管将所述第二阳离子交换膜对应于所述第一和第二微槽的部分膜分别内陷于所述第一和第二微槽中，将第一PEEK管和第二PEEK管分别放置于所述第一和第二微槽中，所述第一和第二PEEK管的一部分位于陷入微槽的第二阳离子交换膜的上表面，用环氧树脂结构胶将所述第一和第二PEEK管位于所述第一和第二微槽的部分固定在所述第一和第二微槽中，所述PEEK薄膜与所述第二阳离子交换膜紧密贴合后，所述第一和第二PEEK管与所述微通道相通。

6.如权利要求1至5任一项所述的酶微反应器，其特征在于，酶微反应器夹在两个铝块之间的中间位置处，四角分别用长度大于两个铝块与上述结构的总厚度的螺丝固定。

7.如权利要求1所述的酶微反应器，其特征在于，所述酶微反应器在完成一次蛋白质样品酶解后，依次通过含NaOH的NaCl、HCl和纯水，使所述酶微反应器再生。

8.权利要求1所述的酶微反应器在液相色谱（LC）和质谱（MS）在线联用系统中应用，该系统包括流动注射泵、权利要求1所述的酶微反应器、六通阀、LC梯度洗脱高压泵、LC色谱柱和质谱仪，其中，酶微反应器分别与流动注射泵和六通阀连接，六通阀又分别与LC梯度洗脱高压泵和LC色谱柱连接，通过六通阀的切换实现在线的蛋白质酶解、多肽的分离与检测。