CN106053629A - 集成化在线样品预处理装置及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种集成化在线样品预处理装置,其特征在于:即将酶反应器、固相萃取柱与液相色谱‑质谱系统在线联用,构建集酶水解‑固相萃取富集‑液相色谱‑质谱分离分析的一体化样品预处理分析平台系统,具体包括一级切换阀,二级切换阀,连接在两级切换阀之间的酶反应器,连接在一级切换阀上的定量环和固相萃取柱Ⅰ,连接在二级切换阀上的固相萃取柱Ⅱ和分离柱及质谱仪。将本发明的预处理装置应用于烟气代谢物分析检测,可实现目标化合物在线高效水解,并集多种SPE富集净化一体,富集倍数高,重现性好,为实现复杂基质样品中烟气代谢物的高灵敏、高通量分析研究提供了重要的技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及一种样品在线预处理装置,即将固定化酶反应器、离子交换柱、固相萃取柱与液相色谱-质谱系统在线联用,构建集酶水解-固相萃取富集-液相色谱-质谱分离分析的一体化样品预处理分析平台系统。利用该装置可提高体液内烟气代谢物的分析检测的速度。
背景技术
恶性肿瘤由于具有死亡率高、发病率高等特点,是威胁人类健康的病魔之一,已成为各科学研究领域关注的热点之一。 肺癌作为一种常见的恶性肿瘤, 其死亡率居各种恶性肿瘤的首位, 并且发病率呈明显上升趋势, 有研究报道 90%的肺癌相关死亡与吸烟行为密切相关[1]。吸烟诱发肺癌的一个重要影响因素是吸烟过程中产生的有害物质在体内的代谢产物具有强致癌性[2-3]。因此,检测体内烟气成分代谢标志物对系统研究其在体内的代谢机制,揭示不同烟气有害成分对人体健康的危害具有非常重要的意义。
以尼古丁与 4-甲基亚硝胺-1-(3-吡啶)-1-丁酮(NNK)为例,两者是烟草制品中非常重要的两类化合物。尼古丁是烟草植物及其制品中含量最丰富的生物碱,约占总生物碱含量的 98%,吸烟成瘾与其密不可分。它在体内半衰期较短(约 2h),约70-80%被代谢成可天宁,并相继产生可天宁衍生的代谢产物,因此,可天宁是评价吸烟剂量及暴露环境烟气量的生物标记物[4]。NNK是尼古丁亚硝基化或微量烟碱亚硝基化形成的一种烟气致癌物,其在细胞色素 P450酶和谷胱甘肽转硫酶调控下的体内代谢产物 4-甲基亚硝胺基-1-(3-吡啶)-1-丁醇(NNAL)及其糖苷态衍生物(NNAL-Glucs)是研究NNK在人体内代谢过程中致毒与解毒机制非常有价值的接触生物标志物。游离 NNAL及NNAL-Glucs的含量总和与游离态NNAL含量的比值可用于评估与 NNK 有关的癌症发生的风险[5]。然而,在烟气暴露者体液中,可天宁及其代谢产物的浓度通常在 ng/mL 数量级,NNAL及NNAL-Glucs一般在 pg/mL级别;体液样品的复杂程度较高,检测受到基质严重干扰。
目前,游离可天宁与 NNAL 分析通常包括两个基本步骤:(1)液液萃取或固相萃取等前处理技术对样品进行富集纯化;(2)基于气相色谱(GC)或液相色谱(LC)分离与热能分析(TEA)或串联质谱(MS/MS)联用的技术进行分析检测。在当前的研究中,总可天宁和 NNAL的分析需要在富集净化步骤前首先将其糖苷衍生物进行去糖基化,从而得到游离的可天宁与 NNAL。该过程可以通过酸碱水解或酶水解等方式进行,其中通过 β-葡萄糖醛酸酶水解的方式应用较多。这种传统的水解反应存在耗时较长(16-24h),水解效率较低等缺点。除此之外,虽然目前常采用的方法较 Carmella 等人最早开发的经典方法[6]相对简单,无需多次提取和纯化等步骤,但是现有技术中代谢物的水解与富集过程依然需要离线操作,在分离分析检测之前仍需要进行真空浓缩、重溶等过程,多步样品处理容易造成样品损失污染,并且操作繁琐、耗时较长,严重阻碍了烟气代谢物的高灵敏和高通量分析。另外,总可天宁与总 NNAL 浓度动态范围宽,在体液内含量差异达 3-4个数量级,也难以实现同时分析[7]。因此,为了解决现有分析技术检测体液中总可天宁及总 NNAL 等代谢标记物方面存在的问题,发展集成化在线样品预处理技术有望为可天宁、NNAL 等多种烟气代谢标记物高灵敏、高通量分析研究提供重要技术支撑。
固定化酶反应器(IMER)使酶在较长时间内可以反复使用,不仅酶的稳定性提高,而且易与底物和产物分开,水解效率增加,水解时间显著缩短。袁等[8]通过制备有机-硅胶杂化整体柱基质的胰蛋白酶反应器,将蛋白质水解时间缩短到2.5 分钟,大大提高了水解效率, 并将其成功与阳离子交换-反相二维液相色谱质谱在线联用,为实现大分子的高通量分离分析提供了必要条件。基于固相萃取(SPE)的样品富集方法与液液萃取技术相比,具有回收率高、富集倍数高,重现性好的特点,最重要的是容易实现在线、自动化和样品的批量处理。多种固相萃取技术,如混合型阳离子交换(MCX)、C18、分子印迹(MIP)等技术的发展,为实现烟气代谢物的高效富集与高灵敏分析奠定了基础。 将固相萃取技术与液相色谱质谱在线联用的分析策略能够显著减少分析时间,提高分析通量[9-10]。但是将固定化酶反应器用于目标化合物在线高效水解,并集多种SPE富集净化一体,与液相色谱-质谱分析结合的集成化技术用于体液等复杂基质样品中烟气代谢物的高灵敏、高通量分析尚未见报道。
发明内容
本发明的目的正是基于上述现有技术状况,针对体液内烟气代谢物分析检测过程中,离线操作效率低、分析通量低和灵敏度低等方面的问题,提供一种集成化在线样品预处理装置及其应用,构建了集酶水解-固相萃取富集-液相色谱分离-质谱鉴定分析的一体化样品预处理分析平台。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:
一种集成化在线样品预处理装置,即将酶反应器、固相萃取柱与液相色谱-质谱系统在线联用,构建集酶水解-固相萃取富集-液相色谱-质谱分离分析的一体化样品预处理分析平台系统,具体包括一级切换阀,二级切换阀,连接在两级切换阀之间的酶反应器,连接在一级切换阀上的定量环和固相萃取柱Ⅰ,连接在二级切换阀上的固相萃取柱Ⅱ和分离柱及质谱仪;
所述一级切换阀为十通阀,定量环连接在一级切换阀的B、E位之间、并可切换连接在J、G位,固相萃取柱Ⅰ连接在一级切换阀的C、G位之间,一级切换阀的D位和I位分别连接有输液泵,一级切换阀的A位、F位分别为进样口和废液出口;
所述二级切换阀为六通阀,固相萃取柱Ⅱ连接在二级切换阀的B、E位之间,质谱仪通过分离柱连接在二级切换阀的C位,二级切换阀的D位连接有输液泵,F位为废液出口;
所述酶反应器的进、出口分别连接在一级切换阀的H位和二级切换阀的B位。
在本发明中,所述酶反应器是以微米或纳米颗粒基质为载体,包括聚合物颗粒、碳颗粒、硅氧化物颗粒或复合材料颗粒基质;或者是以整体材料基质为载体,包括聚合物整体材料、硅基质整体材料、有机无机杂化基质整体材料;或者是纳米颗粒掺杂的整体材料,包括金纳米颗粒掺杂或其他无机纳米颗粒掺杂;酶是蛋白酶、脂肪酶、β-葡萄糖醛酸酶、萄糖氧化酶中的一种或多种;酶以物理吸附、包埋或共价键合方式中的任意一种或两种修饰在基质材料表面。
所述定量环规格为2 μL-5 mL范围中的任意一种。所述泵的流量为1 nL/min.-5mL/min。
连接在一、二级切换阀上的固相萃取柱均可以是阳离子交换柱、阴离子交换柱、混合型离子交换柱、正相萃取柱、反相萃取柱、分子印迹柱中任意一种。
所述分离柱可为反相色谱柱、正相色谱柱、疏水色谱柱、亲和色谱柱、固定化金属亲和色谱柱或体积排阻色谱柱。
将本发明的集成化在线样品预处理装置用于分析检测烟气代谢物,依次包括以下五大步骤:(1)通过固相萃取柱(4)对样品进行初步富集与净化;(2)通过酶反应器(5)实现目标代谢物的高效水解;(3)通过串联固相萃取柱(7),对水解后目标物进行富集净化;(4)采用分离柱9对目标分析物进行分离;(5)质谱仪10分析检测目标代谢物碎片离子。
分析检测过程包括五个管路连接模式:①进样模式(参见图2):一级切换阀(3)的AB位相通,将定量环连接在一级切换阀(3)的B、E位,完成进样过程;②在线固相萃取(参见图3):一级切换阀(3)的B、C位相通,由输液泵(1)输送的流动相将定量环(2)中的样品以一定流速通过固相萃取柱Ⅰ(4)完成样品固相萃取过程;③再进样过程(参见图4):一级切换阀(3)的BC位相通,定量环(2)连接一级切换阀(3)的J、G位,将②中收集的样品进到定量环(2)中完成再次进样;④在线样品水解与固相萃取(参见图5):切换一级切换阀位置,使I位与J位相通,切换二级切换阀位置,使A、B位相通,酶反应器(5)与固相萃取柱Ⅱ(7)串联连接,经输液泵(11)流出的缓冲液将定量环中的样品推送到酶反应器(5)中,样品发生酶水解,并通过固相萃取柱Ⅱ(7)进行捕集;⑤色谱分离与质谱鉴定(参见图6):切换二级切换阀(6),使D、E位相通,固相萃取柱Ⅱ(7)与分离柱(9)串联连接,输液泵(8)流出的流动相依次经固相萃取柱Ⅱ(7)与分离柱(9)对样品进行分离,再经质谱仪(10)完成检测。
所述进样方式可以为手动进样,也可以是自动进样器进样。
本发明相比现有技术具有以下优点:集酶水解-固相萃取富集-液相色谱-质谱分离分析为一体,可实现目标化合物在线高效水解,并集多种SPE富集净化一体,富集倍数高,重现性好,为实现复杂基质样品中烟气代谢物的高灵敏、高通量分析研究提供了重要的技术支撑。
附图说明
图1为本发明专用的装置示意图。
图中:1.输液泵、2.定量环、3.一级切换阀、4.固相萃取柱Ⅰ、5.酶反应器、6.二级切换阀、7.固相萃取柱Ⅱ、8.输液泵、9.分离柱、10.质谱仪、11.输液泵。A-J是切换阀进出口位置。
图2为样品进样状态示意图。
图3为在线固相萃取状态示意图。
图4是二次进样模式状态示意图。
图5是在线样品水解与固相萃取过程状态示意图。
图6是样品分离状态示意图。
图7是尿液或血液中烟气代谢物预处理过程示意图。其中a状态为进样状态;b表示样品在线固相萃取状态;c表示在线固相萃取后的样品二次进样状态;d表示样品在线水解与固相萃取状态;e为样品分离分析鉴定状态。
具体实施方式
本发明以下结合附图对本发明的集成化在线样品预处理装置的构成及分析检测过程做进一步描述:
参见图1-6:一种集成化在线样品预处理装置,具体包括输液泵1、定量环2、一级切换阀3、固相萃取柱Ⅰ4、酶反应器5、二级切换阀6、固相萃取柱Ⅱ7、输液泵8、分离柱9、质谱仪10、输液泵11组成。定量环2通过一级切换阀3的B、E进出口分别连接。固相萃取柱Ⅰ4通过一级切换阀3的C、G进出口连接,固相萃取柱Ⅱ7连接二级切换阀6的B、E位。酶反应器通过一级切换阀H位与二级切换阀A位连接。
具体分析检测过程依次分为以下五大步骤:(1)通过固相萃取柱Ⅰ4对样品进行初步富集与净化;(2)通过酶反应器5实现目标代谢物的高效水解;(3)通过串联固相萃取柱Ⅱ7,对水解后目标物进行富集净化;(4)采用分离柱9对目标分析物进行分离;(5)质谱10分析检测目标代谢物碎片离子。
整个预处理系统共有5个管路连接模式。①进样模式(图2):一级切换阀3的AB位相通,将定量环2连接在一级切换阀3的B、E位,完成进样过程。②在线固相萃取(图3):一级切换阀3的B、C位相通,由输液泵1输送的流动相将定量环2中的样品以一定流速通过固相萃取柱Ⅰ4完成样品固相萃取过程。③再进样过程(图4):一级切换阀3的BC位相通,定量环2连接一级切换阀的J、G位,将②中收集的样品进到定量环2中完成再次进样。④在线样品水解与固相萃取(图5):切换一级切换阀位置,使I位与J位相通,切换二级切换阀位置,使A、B位相通,酶反应器5与固相萃取柱Ⅱ7串联连接,经输液泵11流出的缓冲液将定量环2中的样品推送到酶反应器5中,样品发生酶水解,并通过固相萃取柱Ⅱ7进行捕集;⑤色谱分离与质谱鉴定(图6):切换二级切换阀6,使D、E位相通,固相萃取柱Ⅱ7与分离柱9串联连接,输液泵8流出的流动相依次经固相萃取柱Ⅱ7与分离柱9对样品进行分离,再经质谱仪10完成检测。
本发明以下结合应用实施例进行说明
实施例1
样品采用吸烟人群尿液样品。
参见图7:将定量环2连接在一级切换阀3的B,E位置,输液泵1为二元梯度泵,与一级切换阀3的D位连接,固相萃取柱Ⅰ4为混合型阴阳离子交换柱(MCX),连接一级切换阀3的C,G位。样品经自动进样器或手动进样注入定量环2(图7a),切换一级切换阀,使B,C位相通,定量环中样品经输液泵1流动相推送进入MCX萃取柱进行在线固相萃取,流速为5μL/min,经洗脱后收集洗脱液(图7b)。
定量环2连接在一级切换阀3的J,G位置。输液泵11为二元梯度泵,与一级切换阀3的I位连接。酶反应器5为有机聚合物基质酶反应器(尿液中蛋白质含量较少,蛋白质在基质材料上吸附相对较少,因此使用机械强度高的有机聚合物基质酶反应器),连接一级切换阀3的H位与二级切换阀6的A位。固相萃取柱Ⅱ7为C18固相萃取柱,连接在二级切换阀6的B,E位。将一级切换阀3的A,J位相通,上述洗脱液稀释或冻干重溶后经自动进样器或手动进样注入定量环2(图7c),再切换一级切换阀3,使J,I位相通,切换二级切换阀使A,B位相通,定量环2中样品经输液泵11中流动相注入酶反应器5进行在线酶水解,流速为1μL/min,并通过串联的C18固相萃取柱Ⅱ7进行在线捕集(图7d)。
输液泵8为二元梯度泵,与二级切换阀6的D位连接。分离柱9为 C18分离柱,连接在二级切换阀6的C位。切换阀位置,二级切换阀D,E位相通,使C18固相萃取柱Ⅱ7与C18分离柱9串联连接。输液泵8流出的流动相依次经固相萃取柱Ⅱ7与分离柱9对样品进行分离,再经质谱仪10完成检测(图7e)。
实施例2
样品采用吸烟人群血液样品。
参见图7:将定量环2连接在一级切换阀3的B,E位置,输液泵1为二元梯度泵,与一级切换阀3的D位连接,固相萃取柱Ⅰ4为混合型阴阳离子交换柱(MCX),连接一级切换阀3的C,G位。样品经自动进样器或手动进样注入定量环2(图7a),切换一级切换阀3,使B,C位相通,定量环中样品经输液泵1流动相推送进入MCX萃取柱进行在线固相萃取,流速为5μL/min,经洗脱后收集洗脱液(图7b)。
定量环2连接在一级切换阀3的J,G位置。输液泵11为二元梯度泵,与一级切换阀3的I位连接。酶反应器5为有机硅杂化基质酶反应器(为了尽量减少血液中蛋白质在基质材料上的吸附),连接一级切换阀3的H位与二级切换阀6的A位。固相萃取柱Ⅱ7为亲水固相萃取柱,连接在二级切换阀6的B,E位。将一级切换阀3的A,J位相通,上述洗脱液稀释或冻干重溶后经自动进样器或手动进样注入定量环2(图7c),再切换一级切换阀3,使J,I位相通,切换二级切换阀使A,B位相通,定量环2中样品经输液泵11中流动相注入酶反应器5进行在线酶水解,流速为1μL/min,并通过串联的亲水固相萃取柱Ⅱ7进行在线捕集(图7d)。
输液泵8为二元梯度泵,与二级切换阀6的D位连接。分离柱9为亲水色谱分离柱,连接在切换阀的C位。切换阀位置,二级切换阀D,E位相通,使亲水固相萃取柱Ⅱ7与亲水色谱分离柱9串联连接。输液泵8流出的流动相依次经固相萃取柱Ⅱ7与分离柱9对样品进行分离,再经质谱仪10完成检测(图7e)。
参考文献:
1.Tobacco smoke and involuntary smoking, IARC monographs on theevaluation of carcinogenic risk to humans, IARCPress, 2004, 83, 36-37
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3.A variant associated with nicotine dependence, lung cancer andperipheral arterial disease, Nature, 2008, 452, 638-42
4.Cotinine and tobacco-specific carcinogen exposure among nondailysmokers in a multiethnic sample, Nicotine Tob. Res, 2014, 16, 600-605
5.Exposure to the carcinogen 4-(methyl nitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) in smokers from 3 populations with different risks of lungcancer. Int. J . Cancer, 2009, 125, 2418-2424
6.Metabolites of the tobacco-specific nitrosamine 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1- butanone in smokers’ urine.Cancer Res. 1993, 53, 721-724
7.Combined analysis of the tobacco metabolites cotinine and 4-(methylnitrosamino)-1- (3-pyridyl)-1-butanol in human urine, Anal.Chem.,2015, 87, 1514-1517
8.Preparation of high efficiency and low carry-over immobilized enzymaticreactor with methacrylic acid–silica hybrid monolith as matrix for on-lineprotein digestion,J Chromatogr A., 2014, 1371, 48–5
9.High throughput liquid and gas chromatography-tandem mass spectrometryassays for tobacco-specific nitrosamine and polycyclic aromatic hydrocarbonmetabolites associated with lung cancer in smokers, Chem. Res. Toxicol.2013, 26, 1209-1217
10.Quantification of endogenous brassinosteroids in sub-gram planttissues by in-line matrix solid-phase dispersion-tandem solid phaseextraction coupled with high performance liquid chromatography-tandem massspectrometry, J Chromatogr A. 2014, 1359, 44-51。
Claims (8)
1.一种集成化在线样品预处理装置,其特征在于:即将酶反应器(5)、固相萃取柱、与液相色谱-质谱系统在线联用,构建集酶水解-固相萃取富集-液相色谱-质谱分离分析的一体化样品预处理分析平台系统,具体包括一级切换阀(3),二级切换阀(6),连接在两级切换阀之间的酶反应器(5),连接在一级切换阀(3)上的定量环(2)和固相萃取柱Ⅰ(4),连接在二级切换阀(6)上的固相萃取柱Ⅱ(7)和分离柱(9)及质谱仪(10);
所述一级切换阀(3)为十通阀,定量环(2)连接在一级切换阀的B、E位之间、并可切换连接在J、G位,固相萃取柱Ⅰ(4)连接在一级切换阀的C、G位之间,一级切换阀(3)的D位和I位分别连接有输液泵(1、11),一级切换阀的A位、F位分别为进样口和废液出口;
所述二级切换阀(6)为六通阀,固相萃取柱Ⅱ(7)连接在二级切换阀的B、E位之间,质谱仪(10)通过分离柱(9)连接在二级切换阀(6)的C位,二级切换阀(6)的D位连接有输液泵(8),F位为废液出口;
所述酶反应器(5)的进、出口分别连接在一级切换阀(3)的H位和二级切换阀(6)的B位。
2.根据权利要求1所述的集成化在线样品预处理装置,其特征在于:所述酶反应器(5)是以微米或纳米颗粒基质为载体,包括聚合物颗粒、碳颗粒、硅氧化物颗粒或复合材料颗粒基质;或者是以整体材料基质为载体,包括聚合物整体材料、硅基质整体材料、有机无机杂化基质整体材料;或者是纳米颗粒掺杂的整体材料,包括金纳米颗粒掺杂或其他无机纳米颗粒掺杂;酶是蛋白酶、脂肪酶、β-葡萄糖醛酸酶、萄糖氧化酶中的一种或多种;酶以物理吸附、包埋或共价键合方式中的任意一种或两种修饰在基质材料表面。
3.根据权利要求1所述的集成化在线样品预处理装置,其特征在于:所述定量环(2)规格为2 μL-5 mL范围中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的集成化在线样品预处理装置,其特征在于:所述固相萃取柱Ⅰ(4)、固相萃取柱Ⅱ(7)均可为阳离子交换柱、阴离子交换柱、混合型离子交换柱、正相萃取柱、反相萃取柱、分子印迹柱中任意一种。
5.根据权利要求1所述的集成化在线样品预处理装置,其特征在于:所述分离柱(9)为反相色谱柱、正相色谱柱、疏水色谱柱、亲和色谱柱、固定化金属亲和色谱柱或体积排阻色谱柱。
6.一种集成化在线样品预处理装置在烟气代谢物分析检测中的应用,其特征在于,分析检测过程依次包括以下步骤:(1)通过固相萃取柱Ⅰ(4)对样品进行初步富集与净化;(2)通过酶反应器(5)实现目标代谢物的高效水解;(3)通过串联固相萃取柱Ⅱ(7),对水解后目标物进行富集净化;(4)采用分离柱9对目标分析物进行分离;(5)质谱仪10分析检测目标代谢物碎片离子。
7.根据权利要求6所述的集成化在线样品预处理装置在烟气代谢物分析检测中的应用,其特征在于: 分析检测过程包括五个管路连接模式:①进样模式:一级切换阀(3)的AB位相通,将定量环(2)连接在一级切换阀(3)的B、E位,完成进样过程;②在线固相萃取:一级切换阀(3)的B、C位相通,由输液泵(1)输送的流动相将定量环(2)中的样品以一定流速通过固相萃取柱Ⅰ(4)完成样品固相萃取过程;③再进样过程:一级切换阀(3)的BC位相通,定量环(2)连接一级切换阀(3)的J、G位,将②中收集的样品进到定量环(2)中完成再次进样;④在线样品水解与固相萃取:切换一级切换阀位置,使I位与J位相通,切换二级切换阀位置,使A、B位相通,酶反应器(5)与固相萃取柱Ⅱ(7)串联连接,经输液泵(11)流出的缓冲液将定量环中的样品推送到酶反应器(5)中,样品发生酶水解,并通过固相萃取柱Ⅱ(7)进行捕集;⑤色谱分离与质谱鉴定:切换二级切换阀(6),使D、E位相通,固相萃取柱Ⅱ(7)与分离柱(9)串联连接,输液泵8流出的流动相依次经固相萃取柱Ⅱ(7)与分离柱(9)对样品进行分离,再经质谱仪(10)完成检测。
8.根据权利要求7所述的集成化在线样品预处理装置在烟气代谢物分析检测中的应用,其特征在于:所述进样方式可以为手动进样,也可以是自动进样器进样。
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