CN101096636B - 一种可换芯式微流控芯片蛋白酶解反应器 - Google Patents

Abstract

本发明属于微流控芯片技术领域，具体为一种可换芯式微流控芯片蛋白酶解反应器及其制备方法。该反应器由具有双尖端单通道的微流控芯片和固定有蛋白酶的玻璃纤维(即酶芯)组成，其中，酶芯贯穿芯片的微流通道并从两尖端穿出。酶芯由玻璃纤维通过浸涂方式在表面修饰壳聚糖膜等，然后通过吸附、包埋或共价键合等技术将蛋白酶固定在玻璃纤维表面而获得。使用前，将该玻璃纤维酶芯插入微流控芯片的微通道中，即得可换芯式微流控芯片酶反应器。本发明中，玻璃纤维酶芯价格低廉，可以根据需要更换，从而提高了芯片和酶试剂的使用效率，降低了酶法测定的成本。本发明制作的反应器在临床诊断、环境监测、生命科学研究和食品分析等领域有良好的应用前景。

Description

一种可换芯式微流控芯片蛋白酶解反应器

技术领域

本发明属微流控芯片技术领域，具体涉及一种可换芯式微流控芯片蛋白酶解反应器及其制备技术。

背景技术

自从1990年瑞士Ciba-Geigy公司的Manz和Widmer[1]首次提出微型全分析系统以来，微流控芯片就以其高效、快速、试剂用量少、低耗以及集成度高等优点引起了国内有关专家的广泛关注，在其方法学研究迅速发展的基础上，微流控芯片在生物医学研究、临床诊断、药物分析、环境监测、法医和军事等领域显示了良好的应用前景[2-4]。

微流控芯片微流通道尺寸在微米级，是纳升到微升级小体积样品的理想操作和分析平台，特别适用于生物医药分析和临床检测小体积样品的酶法和免疫法分析和检测。其中一个很重要的用途是用于蛋白质的酶解和分析。蛋白质的酶解是蛋白组学中蛋白质分析的一个关键步骤。由于传统的溶液酶解灵敏度低而且耗时(12小时以上)，所以建立高效快速的新型蛋白质酶解方法具有重要意义。

通常使用的微流控芯片酶反应器是将蛋白酶如胰蛋白酶通过溶胶-凝胶包埋[5，6]和共价键合[7]等技术固定在芯片微流通道内表面。存在的问题是一旦酶失活，整个芯片就报废了，目前阶段芯片的价格还在几十乃至几百元一片，限制了微流控芯片酶反应器的广泛使用。此外报废的芯片丢弃后会对环境带来影响。于是想到如果芯片通道内固定酶的载体是可更换的，这个问题就迎刃而解了。于是我们在玻璃纤维表面通过浸涂的方法修饰一层高分子薄膜，然后将胰蛋白酶固定在高分子薄膜中。将该固定有酶的玻璃纤维插入微流控芯片的微流通道，即制得可换芯式微流控芯片酶反应器。该反应器将蛋白质的酶解时间从传统的溶液酶解的12小时以上大幅度降低到5秒，大大节约了酶解时间，提高了工作效率。失效的芯片可通过更换纤维酶芯的方法使芯片再生，由于玻璃纤维直径在几十微米，材料使用量极少，用其制作的纤维酶芯价格低廉，可采用上述浸涂的方法批量加工。通过更换固定的酶的种类还可在此基础上开发新的微流控芯片酶反应器，如血糖测定用可换芯式微流控芯片酶反应器等。

参考文献

[1]Manz A，Graber N，Widmer HM.Sens.Actuators B 1990，1，244-248.

[2]Dittrich，PS，Tachikawa K，Manz A.Anal.Chem.2006，78，3887-3908.

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[6]Wu HL，Tian YP，Liu BH，et al.J.Proteome Res.2004，3，1201-1209..

[7]Peterson DS，Rohr T，Svec F，et al.Anal.Chem.2002，174，4081-4088..

发明内容

本发明的目的在于提出一种用于蛋白组学中蛋白质分析的基于固定有胰蛋白酶玻璃纤维的可换芯式微流控芯片蛋白酶解反应器及其制备方法。

本发明提供的酶反应器，是一种具有固定有胰蛋白酶玻璃纤维酶芯的可换芯式微流控芯片蛋白酶解反应器。其结构如图1所示。它由具有双尖端单通道的有机玻璃微流控芯片1和固定有胰蛋白酶的玻璃纤维2(即酶芯)组成；其中有机玻璃微流控芯片1由含微流通道4的基片和空白盖片构成，基片由甲基丙烯酸甲酯预聚溶液夹于商品有机玻璃板和硅阳模间引发聚合制得，基片和盖片通过热压封装；为方便玻璃纤维芯的穿入，将芯片两头分别加工成尖端3的形式，且贯穿芯片的微流通道4在两尖端内部；玻璃纤维2贯穿有机玻璃微流控芯片1上的微流通道4，并从两端的尖端3穿出。

本发明中，所述固定有胰蛋白酶的玻璃纤维2一般采用玻璃纤维，通过浸涂的方式在纤维表面修饰壳聚糖/海藻酸钠层层自组装膜或者单层壳聚糖修饰膜等，然后通过吸附、包埋以及共价键合等技术使胰蛋白酶固定在玻璃纤维表面。使用前插入双尖端单通道有机玻璃微流控芯片1中即构成可换芯式微流控芯片蛋白质酶解反应器15。

本发明还提出了上述可换芯式微流控芯片蛋白酶解反应器的制作方法，具体步骤如下：

(1)按常规方法制备有机玻璃微流控芯片1，其中微流通道4的下边宽度为40-60微米；两端加工成尖端3的形式；

(2)制备固定胰蛋白酶的玻璃纤维，将直径为40到60微米的玻璃纤维5于45-50℃的0.1mol/L NaOH溶液水溶液处理5-15分钟，用蒸馏水7清洗后，再浸于10mg/mL的含15-25mg/mL的乙酸的壳聚糖溶液6中10-20分钟，在纤维表面修饰一层带正电的壳聚糖，用蒸馏水7清洗后，浸于8-12mg/mL的海藻酸钠溶液8中10-20分钟，在带正电的壳聚糖表面通过静电引力修饰一层带负电的海藻酸盐，如图2所示，该浸涂过程循环重复3-6次，在玻璃纤维表面修饰得到3-6层由壳聚糖和海藻酸钠交替修饰层构成的层层自组装修饰层；然后在空气中自然干燥，再将该修饰纤维浸于含5mg/mL胰蛋白酶的pH为8.0的50mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸缓冲溶液8中，于4℃的冰箱中放置1-2小时，使胰蛋白酶在修缮膜中成分吸收，然后浸于30-70mmol/L的CaCl₂溶液中20-60分钟，使海藻酸钠生成不溶于水的海藻酸钙，降低膜的溶解度并提高酶的包埋效率，所得固定有胰蛋白酶的玻璃纤维2在低温下干燥，保存于4℃冰箱中备用。

(3)使用前，将该玻璃纤维酶芯插入双尖端单通道微流控芯片的微流通道中，即得可换芯式微流控芯片酶反应器，可用于蛋白的酶解。

此外也可将玻璃纤维直接浸涂壳聚糖等含伯胺基的高分子材料修饰膜中，通过戊二醛将酶交连在修饰膜中制备纤维酶芯。具体步骤为：将玻璃纤维浸于浸于8-12mg/mL的含15-25mg/mL的乙酸的壳聚糖溶液6中1-2分钟，取出晾干，重复操作4-8次，可在玻璃纤维表面修饰一层壳聚糖，然后浸于0.1mol/L的NaOH溶液中10-20分钟，中和膜中的乙酸。再浸于4-5mg/mL的戊二醛水溶液中20-40分钟，取出用水清洗，然后浸于含15-25mmol/L CaCl₂和4-5mg/mL胰蛋白酶的pH 8.0的50mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸缓冲溶液中，于4℃的冰箱中放置20-40分钟，低温干燥，保存于4℃冰箱中备用。使用本方法，胰蛋白酶是通过共价键固定在玻璃纤维表面的聚合物层中的。

本发明巧妙地将酶固定在可以更换的玻璃纤维表面，插入芯片的微流通道中制备可换芯式微流控芯片酶反应器，当反应器酶失活后，可通过更换玻璃纤维酶芯使芯片再生，提高了芯片和酶试剂的使用效率，节约了资源，降低了酶法测定的成本。本发明中使用的玻璃纤维酶芯价格低廉，可采用浸涂工艺批量加工，具有工艺简单和价格低廉的特点。本发明制作的可换芯式微流控芯片酶反应器在临床诊断、环境监测、生命科学研究和食品分析等领域有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明酶反应器结构示意图。其中(A)双尖端单通道聚合物微流控芯片1，(B)插有固定有酶的玻璃纤维2的可换芯式微流控芯片酶反应器。

图2为本发明中层层自组装法制备酶固定玻璃纤维流程图。

图3为本发明制备的酶固定玻璃纤维断面的扫描电子显微镜照片，放大倍数为：(A)2000倍，(B)20000倍。

图4为本发明中可换芯式微流控芯片酶反应器用于蛋白质酶解的装置和主要流程示意图。

图5为使用本发明技术制备的可换芯式微流控芯片酶反应器酶解牛血清白蛋白(A)和肌红蛋白(B)的产物的MALDI-TOF质谱图。流速2.0μL/min，酶解时间＜5s，蛋白质溶液浓度200ng/μL(溶于10mmol/L NH₄HCO₃水溶液(pH 8.1)中)，所有匹配的肽段用“*”标出；(A)使用层层自组装法制备的玻璃纤维酶芯，(B)使用戊二醛交连法制备的玻璃纤维酶芯。

图中标号：1为有机玻璃微流控芯片，2为固定有胰蛋白酶的玻璃纤维，3为内含微流通道的微流控芯片尖端，4为微流通道，5为玻璃纤维，6为10mg/mL壳聚糖溶液(溶于20mg/mL乙酸水溶液中)，7为蒸馏水，8为10mg/mL海藻酸钠水溶液，9为5mg/mL胰蛋白酶溶液(溶于50mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸缓冲溶液(pH 8.0))，10为固定了胰蛋白酶的壳聚糖/海藻酸钠层层自组装修饰层，11为玻璃纤维5与固定了胰蛋白酶的壳聚糖/海藻酸钠自组装修饰层10间的边界线，12为注射泵，13为待测蛋白质样品溶液，14为硅橡胶连接管，15为可换芯式微流控芯片酶反应器，16为从芯片酶反应器15流出的蛋白酶解溶液，17为质谱点样板，18为样品蛋白酶解后获得肽段的质谱图示意图。

具体实施方式

下面通过实施例和附图进一步描述本发明：

1、层层自组装法制备可换芯式微流控芯片酶反应器及其应用

采用计算机辅助设计软件设计芯片结构，由单一微流通道构成，采用高分辨率(如3600dpi)激光照排系统在透明薄膜上打印成掩膜，微通道部分为黑色线条，宽度为60微米，其他部分为透明。在经氧化处理的硅片(p型，厚500μm，直径4英寸，晶向<100>，表面二氧化硅氧化层厚800nm)通过旋转涂膜技术涂覆一层正性光刻胶(Shipley S1813光刻胶，Shipley，Marlborough，MA，美国)，旋涂条件为3000rpm，时间为60秒。然后在110℃烘烤处理60秒以提高光刻胶的附着力并除去残留的溶剂(暴光前烘)，然后盖上掩膜(含设计的微流结构)，使用Karl Suss MA6/BA6光刻机(Karl Suss，Germany)进行接触式紫外线曝光40秒后，浸入20％Microposit 351显影剂(Shipley)80秒，以洗去暴光部分的光刻胶层，然后于150℃烘箱中烘30分钟使毛细管通道和溶液连接孔部分未曝光的光刻胶硬化，然后以光刻胶和SiO₂层为掩膜材料用60℃的40％KOH水溶液刻蚀裸露的硅片至深度为65微米，除去光刻胶后即制成硅片阳模。

在单体甲基丙烯酸甲酯中加入少量热引发剂偶氮二异丁腈(单体质量的0.1-0.2％)和少量光引发剂安息香(单体质量的0.1-0.2％)，在50℃水浴加热并摇动使其溶解，然后于80-90℃水浴中加热15-20分钟，每5分钟摇动混合溶液一次，使单体溶液预聚成甘油状清亮溶液。将上述预聚溶液沿微流控芯片硅阳模凸出的分离通道直接浇在硅阳模上并成条状，将一片有机玻璃片直接盖在预聚溶液上并压紧，使预聚溶液充满有机玻璃片与硅阳模间的缝隙，要求微流通道结构全部在有机玻璃片的下方，然后将工件水平放置。用20W紫外灯(365nm，距离4-5厘米)通过有机玻璃片照射预聚溶液20-30分钟引发表面原位聚合，聚合温度为15-35℃。当模具从微流控芯片基片脱去后，硅阳模凸出的微结构可以高保真的被复制为微流控芯片基片表面凹进去的微流通道。微流控芯片基片与模具键合的十分牢固，可先将工件在60-70℃水浴中加热1-2分钟，置于20-25℃的冷水中2-3分钟后基片与模具自动分离完成脱模。将上述硅阳模用玻璃板代替可制作微流控芯片盖片。将基片和盖片用水冲洗，吹干后立即将基片和盖片的原位合成的新鲜表面面对面合上，将工件置于105-110℃的鼓风烘箱中保持10-15min，取出自然冷却到室温，即完成基片与盖片的键和封装，制得的粗片经修边和加工尖端得双尖端单通道有机玻璃微流控芯片1。其中，微流通道4的总长度为65毫米，微流通道4的断面为梯形，上边宽度为155微米，下边宽度为60微米，高为65微米，其结果示意图见图1(A)。

将硬质玻璃棒在煤气灯上加热拉制成玻璃纤维5，直径约为50微米，于50℃的0.1mol/L NaOH溶液水溶液处理10分钟后，用蒸馏水7清洗后，浸于10mg/mL的含20mg/mL乙酸的壳聚糖溶液6中15分钟，接着在纤维表面修饰一层带正电的壳聚糖，用蒸馏水7清洗后，浸于10mg/mL的海藻酸钠溶液8中15分钟，在带正电的壳聚糖表面通过静电引力修饰一层带负电的海藻酸盐，如图2所示，该浸涂循环重复4次，可在玻璃纤维表面修饰一层由4层壳聚糖和4海藻酸钠交替修饰构成的层层自组装修饰层，在空气中自然干燥后，将该修饰纤维浸于含5mg/mL胰蛋白酶的50mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸缓冲溶液(pH 8.0)中，于4℃的冰箱中放置1.5小时，使胰蛋白酶在修饰膜中充分吸收，然后浸于50mmol/L的CaCl₂溶液中30分钟，使海藻酸钠生成不溶于水的海藻酸钙，降低膜的溶解度并提高酶的包埋效果和稳定性，所得固定有胰蛋白酶的玻璃纤维酶芯2在4℃自然干燥，保存于4℃冰箱中备用。图3为本发明制备的固定了酶的玻璃纤维断面的扫描电子显微镜照片，可见在玻璃纤维表面的确修饰了一层厚度在120-150微米的修饰层。使用前，将该玻璃纤维酶芯插入双尖端单通道有机玻璃微流控芯片的微流通道中，即得可换芯式微流控芯片酶反应器15，其结构示意图和实物照片分别见图1(B)和图1(C)。反应器按图4所示通过硅橡胶管14与注射泵12连接可用于蛋白质样品溶液13的酶解。根据流速估算酶解时间约为5秒。从酶反应器15流出的酶解液16滴在质谱点样板17上，通过MALDI-TOF质谱仪测定。其中酶解牛血清白蛋白的产物的MALDI-TOF质谱图见图5(A)，可见在谱图中出现了酶解肽段的质谱峰，通过检索网上数据库，发现有27条肽段匹配，得到鉴定的氨基酸有222个。蛋白序列覆盖度为36％，而溶液酶解的牛血清白蛋白的蛋白序列覆盖度为38％，表明本发明可换芯式微流控芯片酶反应器在5秒内的酶解效果与溶液酶解12小时的结果相当，说明本发明涉及的酶反应器具有良好的酶解能力。图5(A)的插图表明当芯片中酶芯移去后，除基质的质谱峰外，无其他信号，表明在没有酶芯的芯片中牛血清白蛋白得不到酶解。

2、戊二醛交连法制备可换芯式微流控芯片酶反应器及其应用

使用的双尖端单通道有机玻璃微流控芯片制备方法、尺寸和规格均同实施例1。

将直径为50微米的玻璃纤维浸于10mg/mL的含20mg/mL乙酸的壳聚糖溶液6中1分钟，取出晾干，重复操作6次，可在玻璃纤维表面修饰一层壳聚糖，通过浸于0.1mol/L的NaOH溶液中15分钟中和膜中的乙酸，再浸于5mg/mL的戊二醛水溶液中30分钟后取出用水清洗，置于含20mol/L CaCl₂溶液的5mg/mL胰蛋白酶的Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.0)中，在4℃的冰箱中放置30分钟后，在4℃自然干燥，保存于4℃冰箱中备用。

使用前，将该玻璃纤维酶芯插入双尖端单通道聚合物微流控芯片1的微流通道4中，即得可换芯式微流控芯片酶反应器15，反应器按图4所示通过硅橡胶管14与注射泵12连接后可用于蛋白质样品溶液13的酶解。从酶反应器15流出的酶解液16滴在质谱点样板上，通过MALDI-TOF质谱仪测定。其中酶解肌红蛋白的产物的MALDI-TOF质谱图见图5(B)，通过检索网上数据库，发现有13条肽段匹配，鉴定的氨基酸有114个。蛋白序列覆盖度为74％，而溶液酶解的肌红蛋白的蛋白序列覆盖度为69％，表明本发明可换芯式微流控芯片酶反应器在5秒内的酶解效果优于溶液酶解12小时的结果，说明本发明涉及的酶反应器具有良好的酶解能力。图5(B)的插图表明当芯片中酶芯移去后，除了基质的质谱峰外，无其他信号，表明在没有酶芯的芯片中肌红蛋白得不到酶解。

通过更换固定的酶的种类还可在此基础上开发新型微流控芯片酶反应器，如血糖测定用微流控芯片酶反应器等。

Claims (2)

1.一种可换芯式微流控芯片蛋白酶解反应器，其特征在于由具有双尖端单通道的有机玻璃微流控芯片(1)和固定有胰蛋白酶的玻璃纤维(2)组成；其中有机玻璃微流控芯片(1)由含微流通道(4)的基片和空白盖片构成，基片由甲基丙烯酸甲酯预聚溶液夹于有机玻璃板和硅阳模间引发聚合制得，基片和盖片通过热压封装；芯片两头分别加工成尖端(3)的形式，且贯穿芯片的微流通道(4)在两尖端内部；玻璃纤维(2)贯穿有机玻璃微流控芯片(1)上的微流通道(4)，并从两端的尖端(3)穿出。

2.一种如权利要1所述的可换芯式微流控芯片蛋白酶解反应器的制备方法，其特征在于具体步骤如下：

(1)按常规方法制备有机玻璃微流控芯片(1)，其中微流通道(4)的下边宽度为40-60微米；两端加工成尖端(3)的形式；

(2)制备有胰蛋白酶的玻璃纤维，将直径为40到60微米的玻璃纤维(5)于45-50℃的0.1mol/L NaOH溶液水溶液处理5-15分钟，用蒸馏水(7)清洗后，再浸于10mg/mL的含15-25mg/mL的乙酸的壳聚糖溶液(6)中10-20分钟，在纤维表面修饰一层带正电的壳聚糖，用蒸馏水(7)清洗后，浸于8-12mg/mL的海藻酸钠溶液(8)中10-20分钟，在带正电的壳聚糖表面通过静电引力修饰一层带负电的海藻酸盐，该浸涂过程循环重复3-6次，在玻璃纤维表面修饰得到3-6层由壳聚糖和海藻酸钠交替修饰层构成的层层自组装修饰层；然后在空气中自然干燥，再将该修饰纤维浸于含5mg/mL胰蛋白酶的pH为8.0的50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液(8)中，于4℃的冰箱中放置1-2小时，使胰蛋白酶在修缮膜中成分吸收，然后浸于30-70mmol/L的CaCl₂溶液中20-60分钟，使海藻酸钠生成不溶于水的海藻酸钙，降低膜的溶解度并提高酶的包埋效率，所得固定有胰蛋白酶的玻璃纤维(2)在低温下干燥，保存于4℃冰箱中备用；

或者：将玻璃纤维浸于浸于8-12mg/mL的含15-25mg/mL的乙酸的壳聚糖溶液(6)中1-2分钟，取出晾干，重复操作4-8次，在玻璃纤维表面修饰一层壳聚糖，然后浸于0.1mol/L的NaOH溶液中10-20分钟，中和膜中的乙酸；再浸于4-5mg/mL的戊二醛水溶液中20-40分钟，取出用水清洗，然后浸于含15-25mmol/L CaCl₂和4-5mg/mL胰蛋白酶的pH为8.0的50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中，于4℃的冰箱中放置20-40分钟，低温干燥，保存于4℃冰箱中备用；

(3)将该玻璃纤维酶芯插入双尖端单通道微流控芯片的微流通道中，即得可换芯式微流控芯片酶反应器。 

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