CN101042396B - 在有机玻璃微流控芯片通道表面修饰硅凝胶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微流控芯片技术领域，具体为一种在有机玻璃微流控芯片微流通道表面修饰硅凝胶的方法。其步骤是将正硅酸酯注入有机玻璃微流控芯片微流通道，使其充分渗入通道的表面层，然后将酸性水溶液注入微流通道，使正硅酸酯在酸的作用下发生水解，生成硅溶胶，再用干燥处理，在微流通道表面获得连续均一的亲水性硅凝胶修饰层。该硅凝胶表面修饰层可提高溶液对微流通道的浸润、增强电渗流、降低有机物在通道表面的吸附以及改善芯片对样品的分离效果，同时还为微流通道的进一步修饰提供便利。本发明方法具有工艺简单、成本低廉和操作简便的特点，可用于微流控芯片的大规模生产。制备的硅凝胶表面修饰微流控芯片在生物医药分析、环境监测、食品分析和临床诊断等领域有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属微流控芯片技术领域，具体涉及一种有机玻璃微流控芯片微流通道表面硅凝胶修饰层的原位制备方法。
背景技术
微型全分析系统(μ-TAS)于1990年由瑞士Ciba-Geigy公司的Manz和Widmer[1]首次提出。微流控芯片是当前微全分析系统发展的重点并以其高效、快速、试剂用量少、低耗及集成度高等优点引起了国内外分析和生命科学界有关专家的广泛关注，在环境监测、临床诊断、药物分析、法医和军事等领域显示了良好的应用前景[2-4]。微流控芯片分析技术的基本特征和最大优势是多种单元技术的灵活组合和大规模集成，是一个多学科交叉的高度集成的技术体系。近年来，作为微流控芯片基础的芯片材料与微制造技术已受到许多发达国家的广泛关注。作为微纳米技术的重要组成部分，微流控芯片也是生命科学研究的重要技术平台，有着十分光明的应用前景，各国竞相研究，目前国内外很多大公司和研究机构致力于微流控芯片的实用开发，微流控分析芯片正开始从基础与应用基础研究阶段进入深度产业化的转折时期。
传统微流控芯片主要使用玻璃和石英玻璃[4]，玻璃芯片加工技术要求高，需专用的设备，难以采用模具大批量生产，价格比较昂贵，限制了其广泛应用。于是近年来聚合物微流控芯片得到了发展，其制作主要采用注塑、印模、浇铸和单体铸模原位聚合等技术，因为价格低廉和容易大批量生产，具有良好的产业化前景，其中聚甲基丙烯酸甲酯(有机玻璃)是微流控芯片制作中较常使用的聚合物[5，6]。通常有机玻璃微流控芯片采用热压印模制备技术，使用热引发[7]和光引发[8]甲基丙烯酸甲酯原位聚合制备有机玻璃芯片也有文献报道，但聚合时间长达4到12小时，不适合大规模制作的要求。最近我们课题组首创了紫外光引发甲基丙烯酸甲酯表面原位聚合制备有机玻璃微流控芯片技术[9]，将聚合时间缩短到半小时以内，大大简化了制备过程。然而微流控芯片表面电荷低，电渗流约为玻璃的一半，其表面亲水性不佳，对缓冲溶液在通道内的浸润和填充不利，更严重的是有机玻璃对一些被分析的有机物有严重的吸附，造成了分离效果的下降，限制了其使用范围。然而有机玻璃芯片可以通过表面和本体修饰来改变其表面物理和化学性质，以达到改善分离、防止吸附和增强电渗流等目的。目前聚合物芯片的化学修饰尚处于起步阶段，有关研究较少，但可以预见，这将是一个重要的研究方向。本课题组曾开发了本体修饰聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片的制备技术并获得授权[10]。最近我们创新性地提出了基于表面溶胶一凝胶技术的有机玻璃微流控芯片微通道表面硅凝胶修饰方法。经检索，未发现有类似方法的文献报道。
参考文献
[1]Manz A，Graber N，Widmer HM.Sens.Actuators B1990，1，244-248.
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[10]陈刚，张鲁雁，杨艽原，吴性良，本体修饰聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片的制备方法，专利号ZL200410093483.0.
发明内容
本发明的目的在于提出一种在有机玻璃微流控芯片微流通道表面修饰硅凝胶的方法，以便提高溶液对微流通道的浸润、增强电渗流、降低有机物在通道表面的吸附以及改善芯片对样品的分离效果，同时还为通道表面的进一步修饰提供便利。
本发明提出的在有机玻璃微流控芯片微流通道表面修饰硅凝胶的方法，将工F硅酸酯注入有机玻璃微流控芯片微流通道，静置20—28小时，使其充分渗入微流通道的表面层；然后将酸性水溶液注入微流通道，静置2-4小时，使表面吸附的和渗入其表面层的正硅酸酯在酸的作用下发生原位水解，生成硅溶胶，再经干燥处理，在有机玻璃微流控芯片微流通道表面获得连续均一的亲水性硅凝胶修饰层。
上述方法中，所用正硅酸酯可以是正硅酸甲酯、正硅酸乙酯、正硅酸丙酯或正硅酸丁酯等，所用酸性水溶液可以是盐酸水溶液。
该硅凝胶表面修饰层可提高溶液对微流通道的浸润、增强电渗流、降低有机物在通道表面的吸附以及改善芯片对样品的分离效果，同时还为微流通道的进一步修饰提供便利。本发明方法具有工艺简单、成本低廉和操作简便的特点，可用于微流控芯片的大规模生产。制备的硅凝胶表面修饰微流控芯片在生物医药分析、环境监测、食品分析和临床诊断等领域有良好的应用前景。
本发明还提出了硅凝胶表面修饰有机玻璃微流控芯片的制备方法，具体步骤如下：
采用计算机辅助设计软件设计芯片结构，典型的设计如图1所示，由单十字交叉微流通道和溶液连接孔构成，采用高分辨率(如3600dpi)激光照排系统在透明薄膜上打印成掩膜，微通道部分为黑色线条，宽度为40微米，其他部分为透明。在经氧化处理的硅片(p型，厚500μm，直径4英寸，晶向<100>，表面二氧化硅氧化层厚800nm)通过旋转涂膜技术涂覆一层正性光刻胶(Shipley S1813光刻胶，Shipley，Marlborough，MA，美国)，旋涂条件为3000rpm，时间为60秒。然后在110℃烘烤处理60秒以提高光刻胶的附着并除出残留的溶剂(暴光前烘)，然后盖上掩膜(含设计的微流结构)，使用Karl Suss MA6/BA6光刻机(Karl Suss，Germany)进行接触式紫外线曝光40秒后，浸入20％Microposit351显影剂(Shipley)80秒，以洗去暴光部分的光刻胶层，然后于150℃烘箱中烘30分钟使毛细管通道和溶液连接孔部分未曝光的光刻胶硬化，然后以光刻胶和SiO2层为掩膜材料用60℃的40％KOH水溶液刻蚀裸露的硅片至深度为40微米，除去光刻胶后即制成硅片阳模。
在甲基丙烯酸甲酯单体中加入少量热引发剂偶氮二异丁腈(甲基丙烯酸甲酯单体质量的0.15％)和少量光引发剂安息香(甲基丙烯酸甲酯单体质量的0.15％)，在50℃水浴加热并摇动使其溶解，然后于85℃水浴中加热15分钟，每5分钟摇动混合溶液一次，使单体溶该预聚成甘油状清亮溶液。将上述预聚溶液沿微流控芯片硅阳模凸出的分离通道直接浇在硅阳模上并成条状，将一片有机玻璃片直接盖在预聚溶液上并压紧，使预聚溶液充满有机玻璃片与硅阳模间的缝隙，要求微流通道结构全部在有机玻璃片的下方，然后将工件水平放置。用20W紫外灯(365nm，距离4-5厘米)通过有机玻璃片照射预聚溶液30分钟引发表面原位聚合，聚合温度25℃。当模具从微流控芯片基片脱去后，硅阳模凸出的微结构可以高保真的被复制为微流控芯片基片表面凹进去的微流通道。微流控芯片基片与模具键合的十分牢固，可先将工件在60-70℃水浴中加热1-2分钟，置于20-25℃的冷水中2-3分钟后基片与模具自动分离完成脱模。如将铸模夹在两间距约为150微米的平板玻璃间，可制得盖膜。将脱模后的微流控芯片基片通道末端钻孔(如图1的溶液连接孔1、3、5和6，孔径2mm)用于连接溶液。将通道末端钻孔的微流控芯片基片和盖膜用水冲洗，吹干后立即合上，用长尾票夹将基片和盖膜夹在两片玻璃片间，要求长尾票夹的压力直接施加在微流控芯片分离通道两侧，然后将工件置于108℃的鼓风烘箱中保持10min，取出自然冷却到室温，即完成基片与盖膜的键和封装，制得的粗片经修边得有机玻璃微流控芯片成品，实物照片见图1。
将正硅酸酯用注射器通过图1芯片左侧的溶液连接孔1注入有机玻璃微流控芯片微流通道，静置20-28小时使正硅酸酯充分渗入通道的表面层。多余的正硅酸酯用水冲洗2分钟，然后将0.05-0.2mol/L盐酸水溶液注入微流通道，静置2-4小时，其表面吸附的和渗入其表面层的正硅酸酯会在酸的作用下发生水解，生成硅溶胶。通道经冲洗后，芯片置于60℃的鼓风烘箱中3-4小时，可在有机玻璃微流控芯片微流通道表面获得连续均一的亲水性硅凝胶修饰层，即得微流通道表面修饰有硅凝胶的有机玻璃微流控芯片。
本发明在制备硅凝胶修饰层时，还可通过硅烷偶联剂，在修饰层中固定酶等生物活性物质。
附图说明
图1为本发明涉及的典型微流控芯片实物照片。(芯片中文字：Fudan SensoChip40μm)
图2为5微升的水滴在(a)硅凝胶修饰有机玻璃和(b)纯有机玻璃上的照片。其中(A)为侧视，(B)为斜视，(C)硅凝胶修饰后的有机玻璃微流控芯片微流通道扫描电子显微镜照片(放大倍数200倍)。
图3为红外光谱图。其中(A)为纯有机玻璃，(B)为硅凝胶修饰有机玻璃。
图4为微流控芯片，电泳分离250μM鸟嘌呤(a)、黄嘌呤(b)和尿酸(c)混合溶液的电泳图谱。分离电压：+2000V；进样电压：+1500V；进样时间：3s；运行缓冲溶液：20mM硼酸盐-10mM磷酸盐缓冲液(pH8.2)；检测电极：320μm直径碳电极；检测电压：+0.9V(vs.Ag/AgCl)。其中，(A)为使用纯有机玻璃微流控芯片，(B)为使用硅凝胶表面修饰有机玻璃微流控芯片。
图5为(A)纯有机玻璃和(B)硅凝胶修饰有机玻璃的扫描电子显微镜照片(放大倍数5000倍)。
图6为(A)纯有机玻璃和(B)硅凝胶修饰有机玻璃表面的原子力显微镜照片。
图7为(A)纯有机玻璃和(B)硅凝胶修饰有机玻璃表面的X-射线光电子能谱。
具体实施方式
下面通过实施例和附图进一步描述本发明：
1、微流通道表面修饰有硅凝胶的有机玻璃微流控芯片的制作、表征和应用
(A)纯有机玻璃微流控芯片设计和制作方法见上文。
(B)硅凝胶在有机玻璃微流控芯片微流通道表面的修饰将正硅酸乙酯或正硅酸甲酯用5毫升注射器通过图1芯片左侧的溶液连接孔1注入有机玻璃微流控芯片微流通道，使正硅酸乙酯充满通道，不得有气泡。静置24小时使其充分渗入微流通道的表面层。多余的正硅酸酯用水冲洗2分钟，然后将0.1mol/L盐酸水溶液注入微流通道，静置3小时，其表面吸附的和渗入其表面层的正硅酸酯会在酸的作用下发生水解，生成硅溶胶，通道经水冲洗后，芯片置于60℃的鼓风烘箱中3小时，可在有机玻璃微流控芯片微流通道表面获得连续均一的亲水性硅凝胶修饰层，即得微流通道表面修饰有硅凝胶的有机玻璃微流控芯片。
(C)有机玻璃表面硅凝胶修饰层的表征有机玻璃表面经本专利描述的方法可制得亲水性硅凝胶修饰层，使有机玻璃的接触角从66.3°降低到硅凝胶修饰后的27.4°，图2(A)和(B)显示了5微升的水滴在(a)硅凝胶修饰有机玻璃和(b)纯有机玻璃上的侧视和斜视照片，可见有机玻璃表面经修饰后对水的浸润明显得到改善。
硅凝胶修饰后的有机玻璃微流控芯片微流通道扫描电子显微镜照片见图2(C)，未见有剥离的修饰层，说明本工艺得到的硅凝胶修饰层与芯片是一体的。图3为纯有机玻璃和硅凝胶修饰有机玻璃的红外光谱图，有明显差异。硅凝胶修饰有机玻璃的红外光谱图在波数1075cm-1处有Si-O-Si的特征吸收峰，在波数3100-3600cm-1范围有宽的Si-OH特征吸收峰，说明通过本发明的修饰工艺，的确能在有机玻璃表面形成硅凝胶修饰层。
本发明通过扫描电子显微镜和原子力显微镜观察硅凝胶修饰有机玻璃表面的形貌，照片分别见图5和图6。扫描电子显微镜显示有机玻璃表面经硅凝胶修饰后，形成了由10-20纳米颗粒构成的连续的粗糙表面。原子力显微镜显示有机玻璃表面的均方根粗糙度为2.44纳米，而用硅凝胶修饰后，均方根粗糙度为13.9纳米，为了证明图6中突起的表面修饰层为硅凝胶，测试了(A)纯有机玻璃和(B)硅凝胶修饰有机玻璃表面的X-射线光电子能谱，见图7。X-射线光电子能谱可以测定材料表面3-5纳米厚度的表层元素分布。有机玻璃表面的X-射线光电子能谱中无硅峰，而在修饰有硅凝胶的有机玻璃表面的X-射线光电子能谱中有明显的硅峰，加上修饰后氧峰增强和碳峰降低，均提示通过本发明的修饰工艺的确可以在有机玻璃表面制备数纳米厚的硅凝胶修饰层。
(D)硅凝胶表面修饰有机玻璃微流控芯片的应用微流控芯片的一个重要应用是电泳分离，图4为使用(A)纯有机玻璃微流控芯片和(B)硅凝胶表面修饰有机玻璃微流控芯片电泳分离250μM鸟嘌呤(a)、黄嘌呤(b)和尿酸(c)4的电泳图谱。很明显有机玻璃微流控芯片微流通道表面经硅凝胶修饰，样品的分离效率得到显著提高，分离时间从180秒缩短到80秒，而且样品峰的灵敏度得到明显增强。表明本发明涉及的硅凝胶表面修饰有机玻璃微流控芯片在电泳分离中有良好的实际应用价值。
尽管玻璃芯片性能优良，但其加工工艺复杂，每枚芯片都需要单独刻蚀，成本比较高，限制了其使用。而本发明通过溶胶-凝胶技术在有机玻璃微流控芯片通道内构建类似玻璃的硅凝胶修饰层，改善了分离效果，加上有机玻璃微流控芯片可以通过压印和浇铸等工艺用模具大规模生产，所以本发明具有良好的应用前景。
2、高亲水性有机玻璃板的制备
将有机玻璃板浸于正硅酸乙酯24小时，表面多余的正硅酸乙酯用水冲洗2分钟，然后浸于0.1mol/L盐酸水溶液3小时，表面吸附的和渗入表面层的正硅酸乙酯会在酸的作用下发生水解，生成硅溶胶，经水冲洗后，置于60℃的鼓风烘箱中3小时，可在有机玻璃表面获得连续均一的亲水性硅凝胶修饰层，制得高亲水性有机玻璃板。该高亲水性有机玻璃板在雨淋时形成连续的水膜，防止了表面水珠的形成，可用作室外的窗玻璃等。
3、基于表面修饰硅凝胶有机玻璃微流控芯片的酶微流反应器的制备
硅凝胶修饰有机玻璃微流控芯片的微流通道表面二氧化硅凝硅可通过γ—氨丙基三乙氧基硅烷(KH-550)处理，使其带伯胺基，然后用戊二醛交联使酶固定在微流控通道表面，构成酶微流反应器。具体的实例为：将10％KH-550的甲醇溶液(含水5％)注入上述表面修饰有硅凝胶的有机玻璃微流控芯片微通道，4小时后，用甲醇冲洗，然后将1％的戊二醛水溶液注入通道，30分钟后，将5mg/mL的胰蛋白酶溶液(溶解于含20mM CaCl2的50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH8.0))注入微流通道，在冰箱中反应30分钟，可将胰蛋白酶键合固定在微通道表面，制得胰蛋白酶微流反应器。将目标蛋白如牛血清白蛋白溶液用注射泵以一定流速(如2微升/分钟)注入胰蛋白酶微流反应器，流出的就是被酶解的肽段混合物，用质谱鉴定获得了良好的结果。
Claims (3)
1.一种在有机玻璃微流控芯片微流通道表面修饰硅凝胶的方法，其特征在于具体步骤为：将正硅酸酯注入有机玻璃微流控芯片微流通道，静置20-28小时，使其充分渗入微流通道的表面层；然后将酸性水溶液注入微流通道，静置2-4小时，使表面吸附的和渗入其表面层的正硅酸酯在酸的作用下发生原位水解，生成硅溶胶，再经干燥处理，在有机玻璃微流控芯片微流通道表面获得连续均一的亲水性硅凝胶修饰层；其中，所述的正硅酸酯为正硅酸甲酯、正硅酸乙酯、正硅酸丙酯或正硅酸丁酯。
2.根据权利要求1所述的在有机玻璃微流控芯片微流通道表面修饰硅凝胶的方法，其特征在于所述酸性水溶液为盐酸水溶液，浓度为0.05-0.2mol/L。
3.根据权利要求1所述的在有机玻璃微流控芯片微流通道表面修饰硅凝胶的方法，其特征在于该硅凝胶修饰层可通过硅烷偶联剂进一步固定生物活性物质。
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