CN101008594B - 含样品前处理膜的微流控芯片的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明给出一种含样品前处理膜的微流控芯片及制备方法，芯片由底片和盖片两部分组成，底片以玻璃、硅、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA或聚二甲基硅氧烷PDMS为基材，刻蚀有流体混合和反应的微通道网络；盖片采用PDMS制作并与底片封合，在与底片各微通道口对应位置，开有供微流体出入的导液孔，在底片与进样口正对的位置放置样品前处理膜，样品前处理膜通过双次浇注法原位嵌入盖片中，有效地实现了样品前处理膜与微流控芯片微管道网络一体化集成，制备得到了可用于复杂样品中待测目标组分纯化富集的含样品前处理膜的微流控芯片。由此形成的微流控分析芯片系统是可拆卸式复合结构，可重复使用，同时芯片分析系统的集成化程度、检测选择性和分析灵敏度均获得提高。
Description
技术领域
本发明属于微型全分析系统(μ-TAS，Miniaturized Total Analytical System)技术领域，具体为一种可用于生物体液样品纯化或富集的微流控芯片。
背景技术
微全分析系统(μ-TAS，又称芯片实验室，lab-on-a-chip)，由于具备可实现自动化、连续化和缩微化分析的特点，从而能够极大地减少试剂的消耗量、缩短分析时间、提高分析检测效率。经过十几年的发展，μ-TAS在疾病诊断、生化分析、临床检测等领域获得了广泛的应用。目前以血液、尿液等体液为样品主体的生化检测体系是μ-TAS的主要应用对象之一，其基底和成分复杂，基体效应与各种干扰组分共存，目前去除体液中大分子干扰的样品前处理过程大多是在微芯片外通过离心、过滤等方式实现的，这必然会造成样品的损失与污染，同时不利于μ-TAS的集成化。因此，发展微流控芯片系统中的样品预处理技术，是微全分析系统发展必须突破的瓶颈之一。
针对现阶段微流控芯片系统中对生物大分子的预处理方法，目前常用的有：在芯片微通道内利用微机电技术加工制作成堰、栅栏、柱、筛等微器件，构成过滤式预处理芯片，但是微加工和操作方法复杂，成本高；通过在芯片内刻蚀微通道，并引入开口管、填充柱和整体柱等不同形式的吸着剂构成固相萃取型预处理芯片，此方法可以通过选取不同性质的吸着剂使分析选择性大为提高，然而由于存在洗脱过程亦使预处理效率降低；对芯片局部施加电场、磁场或声场，构成基于电场、磁场或声场作用原理的预处理芯片，但也易造成待测小分子结构的破坏。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备简单、成本低廉、分离分析效率高的含样品前处理膜的微流控芯片及其制备方法，采用该芯片可实现复杂样品中待测组分的净化、富集和分析检测。
本发明的技术方案如下：
含样品前处理膜的微流控芯片，它由含有流体混合和反应的微通道网络的底片和有导液孔的盖片组成。其中：底片可以是玻璃、硅、PMMA或PDMS材质，盖片选用PDMS材质，样品前处理膜位于与底片对应的进样通道口正上端，并通过双次浇注法原位嵌入PDMS盖片上；其中膜、盖片和底片可以方便拆卸和复用。
本发明采用的样品前处理膜的膜材料可以是尼龙、乙酰化醋酸纤维、聚胺、聚乙烯醇、聚砜，或以此为基质进行多种化学修饰和改性所获得的具有一定特性的膜材料。
本发明提供的含样品前处理膜的微流控芯片的制备方法，包括以下几个步骤：
(1)底片制备：在玻璃、硅基材上采用湿法刻蚀，在PMMA基材上采用压印的方法，或在PDMS基材上采用浇注成型的方法，均可获得直线型、弯道型或其它类型的微通道网络，以用于试剂的混合和反应，并作为微流控芯片的底片。
(2)含样品前处理膜的盖片制备：为了使膜与盖片PDMS形成一个可拆卸的一体化结构，本发明采用PDMS双次浇注方法来制作盖片，具体步骤是：A、将膜片对应于底片上的进样通道口处，放置于底面与基片形状、尺寸大小均相同且内表面光洁的玻璃槽内，膜片中央贴放直径为1～5mm的圆形导管，用于保护膜表面，避免受到PDMS预聚物的浸透；将导管外围均匀浇注一层1～2mm厚的PDMS，将其放入60℃的烘箱内聚合2h。第一次浇注PDMS的目的在于使膜方便、准确地固定于底片对应的进样通道口正上端，并使膜可从腔体中取出并重新更换与其大小形状相同的新膜片。B、在A的基础结构上，对应底片其余通道口的位置上插上直径在2～3mm的导管用以开设导液孔，进行PDMS的第二次浇注，浇注的PDMS厚度控制在3～4mm，于60℃的烘箱内聚合4h，剥离下来即得到作为整体盖片。第二次浇注PDMS的目的在于形成对应于底片整体管道网络的整体盖片，这时第一次浇注的含膜PDMS层再次固定，并原位嵌入PDMS盖片上，与后续浇注层形成良好的结合。PDMS两次浇注法制作盖片的优势在于，能准确定位膜的位置，并能避免膜在浇注过程中被PDMS预聚物污染，同时原位嵌入PDMS盖片的膜能与底片形成良好的封合，避免夹膜后通道口的漏液问题。
(3)将(2)获得的含膜盖片与(1)获得的底片进行封合，并将盖片的导液孔与底片的流体通道口对准，形成本发明所述的含样品前处理膜的微流控芯片。
本发明采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)双次浇注方法来有效地将样品前处理膜与微流控芯片集成为一体，制备得到可用于复杂样品中待测目标组分纯化或富集的含样品前处理膜的微流控芯片，具有制备简单、成本低廉的优点；样品前处理膜可通过化学修饰和改性方式增加其对目标组分的选择性，也可方便地进行更换，由此形成的微流控分析芯片系统是可拆卸式复合结构，可重复使用，同时芯片分析系统的集成化程度、检测选择性和分析灵敏度均获得提高。通过PDMS双次浇注方法形成的含膜盖片，能有效解决在单次浇注PDMS时易造成液体泄漏的问题，从而为复杂样品尤其是生物体液类样品的纯化富集提供了有效而便捷的方法。
采用本发明提供的含样品前处理膜的微流控芯片，在药物盐酸多巴酚丁胺-鲁米络-高锰酸钾化学发光体系中，对血清中的盐酸多巴酚丁胺样品进行检测，灵敏度比未加膜进样时提高了约2.10倍，比较微流控芯片上五次测量的相对标准偏差RSD，结果未加膜进样时RSD为19.46％，加膜之后的RSD降低到9.53％。结果表明，含样品前处理膜的微流控芯片使整个微流控分析芯片系统的集成化程度、检测选择性和分析灵敏度得以明显提高。
附图说明
图1为含样品前处理膜的微流控芯片的结构分解示意图；
图2为双次浇注PDMS的含膜盖片的结构放大图；
其中，1为PDMS盖片，2为玻璃底片，3为聚酰胺膜，4为进样口，5～7为导液孔，8为微通道网络，9为微通道口，10为圆形导管，11为第一次浇注的PDMS层，12为第二次浇注的PDMS层，D为检测点。
具体实施方式
下面通过在聚酰胺膜上键合染料配基辛巴蓝F-3GA进行膜改性，将获得的亲和膜作为选择性吸附白蛋白等大分子的膜材料，特别注意，膜的改性方法和净化富集的药物样品可以有多种，并不局限于该实施例所提及的。在本发明所提出的前处理微流控芯片系统中，以化学发光法对血清中药物盐酸多巴酚丁胺的净化富集效果进行分析检测。
实施例1：含样品前处理膜的微流控芯片
聚酰胺膜3的改性方法：取φ5mm的聚酰胺膜片10张，在30℃于2.5mol·L-1HCl溶液中活化，活化后的膜片用蒸馏水清洗：然后，在一密闭容器中加入染料辛巴蓝F-3GA和活化后的聚酰胺膜片，60℃下反应30min后，加入NaCl以加速染料在膜上的沉积。继续反应30min后，加入Na2CO3，升温至80℃，反应4小时。反应过程中，不断振荡反应液，使膜表面的配基键合均匀一致，反应结束后，用80％的乙醇和蒸馏水清洗染料偶联聚酰胺膜，直到清洗液中无染料为止，之后将膜保存在pH7.0含0.02％的叠氮化钠的醋酸-醋酸钠缓冲液中，以免亲和膜受到污染。
微流控芯片底片采用玻璃加工而成玻璃底片2，玻璃长75mm，宽25mm，首先用95％的乙醇清洗载玻片，烘干，根据芯片管道结构图，通过湿法刻蚀技术，最终在玻璃片上刻蚀得到宽为150μm，深为80μm的十字交叉型微通道网络8。
取一片上述方法制备的聚酰胺膜3放置于与玻璃底片2尺寸相同且内表面光洁的玻璃槽中，其位置与玻璃底片2上进样口4对准，将直径为4mm的圆形导管10粘于聚酰胺膜3上，聚酰胺膜3及圆形导管的圆心与进样口4重合，在导管外围均匀浇注一层厚度为1mm且外围略超出聚酰胺膜3圆周范围的PDMS 11将膜片固定，然后将其置于60℃的烘箱内聚合2h；取出后再与玻璃槽内对应于玻璃底片2其余微通道口9的位置插上直径为2mm的导液管以开设导液孔5～7，随即第二次浇注PDMS 12，厚度为3mm，然后将其置于60℃的烘箱内聚合4h。
将获得的含膜芯片从玻璃槽内剥离下来作为盖片1，紧贴于制得的玻璃底片2上，各导液孔分别与底片各微通道口9对准，即得到含样品前处理膜的微流控芯片。
实施例2：含样品前处理膜的微流控芯片的检测应用
将含0.10μg·mL-1盐酸多巴酚丁胺的血清样品通过毛细管从进样处注射泵进样，化学发光试剂KMnO4与Luminol(浓度均为2.0×10-6mol·L-1，)的试剂分别从导液孔5、6导入芯片，两者经十字形交叉点混合后，发生化学发光反应，从检测窗口D处获得化学发光信号。通过发光结果的比较可知，流经预处理的亲和膜后，盐酸多巴酚丁胺的化学发光信号响应灵敏度比未加膜进样时提高了约2.10倍，比较微流控芯片上五次测量的相对标准偏差RSD，结果未加膜进样时RSD为19.46％，加膜之后的RSD降低到9.53％。在血清样品经过改性亲和膜时，亲和膜对血清白蛋白有选择性吸附作用，同时膜对血清内大分子成分起到了过滤作用。
Claims (1)
1.一种含样品前处理膜的微流控芯片的制备方法，所述芯片由底片和盖片两部分组成，底片以玻璃、硅、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA或聚二甲基硅氧烷PDMS为基材，刻蚀有流体混合和反应的微通道网络；盖片采用PDMS制作并与底片封合，在与底片各流体通道口对应位置，开有供微流体出入的导液孔，在底片与进样口正对的位置放置样品前处理膜，样品前处理膜通过双次浇注法原位嵌入盖片中，具体包括以下制备步骤：
(1)底片制备：在玻璃、硅基材上采用湿法刻蚀，在PMMA基材上采用热压印方法，或在PDMS基材上采用浇注成型方法，获得直线型、弯道型或其它类型的微通道网络，用于芯片上流体的混合和反应；
(2)含膜盖片制备：通过双次浇注法将样品前处理膜嵌入盖片中，形成整体盖片结构单元：A、将样品前处理膜对应于底片上的进样口处，放置于与底片形状、尺寸大小均相同且内表面光洁的玻璃槽内，样品前处理膜中央贴放直径为1～5mm的圆形导管，在导管外围均匀浇注一层1～2mm厚的PDMS，将其放入烘箱内聚合；B、在由A步骤获得的结构基础上，在对应于底片其余流体通道口的位置上插上直径为2～3mm的导管用以开设导液孔，进行PDMS的第二次浇注，浇注的PDMS厚度控制在3～4mm，在烘箱内聚合，剥离下来即得所需盖片；
(3)将含膜盖片与底片封合，并将盖片的导液孔与底片的流体通道口对准，形成含样品前处理膜的微流控芯片。
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