CN102103115B

CN102103115B - 一种电化学乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备方法

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Publication number: CN102103115B
Application number: CN201110028036.7A
Authority: CN
Inventors: 孙霞; 王相友; 刘君峰; 赵文苹; 杜淑媛
Original assignee: Shandong University of Technology
Current assignee: Shandong University of Technology
Priority date: 2011-01-26
Filing date: 2011-01-26
Publication date: 2014-03-12
Anticipated expiration: 2031-01-26
Also published as: CN102103115A

Abstract

本发明涉及传感器技术领域，尤其涉及一种乙酰胆碱酯酶生物传感器。一种电化学乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备方法，包括以下步骤：酶膜的制作工艺、玻碳电极的修饰工艺、酶膜的固定工艺，玻碳电极的修饰工艺采用功能化多壁碳对玻碳电极进行修饰，包括以下步骤：多壁碳纳米管的功能化、清洗、测试、修饰。由于采用上述技术方案，本发明制成的乙酰胆碱酯酶生物传感器具有结构简单、灵敏度高、能重复检测等优点。

Description

一种电化学乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备方法

技术领域

本发明涉及传感器技术领域，尤其涉及一种乙酰胆碱酯酶生物传感器。

背景技术

随着我国经济的快速稳定增长，人民生活水平不断提高，对食物消费的要求也越来越高。回归大自然、消费无公害食品，已成为新时期消费的潮流和市场走向。但是环境污染对农产品的卫生质量造成了很大威胁，食物中毒事件不断见诸报道，已引起人们的广泛关注。

为了保障人们的食用安全，很多农产品批发市场、宾馆、饭店等场所都应用检测设备检测农产品的农药残留情况。目前，我国农药残留的速测方法是酶抑制试纸法和酶抑制分光光度法(农残快速检测仪)，可以实现有机磷农药及氨基甲酸酯类农药的现场快速检测，具有较好的实用价值。速测卡是通过肉眼观察卡片的颜色变化，因此一般只能用于严重超标的蔬菜样品进行定性测量。酶抑制分光光度法的应用也比较广泛，国内已有多种农药残留速测仪均是基于此原理。分光光法的原理是基于吸光度的变化进行检测的，但蔬菜水果中大量的色素会对分光光度法造成很大的影响，导致检测结果的不准确。但是上述方法存在回收率低、错检、漏检比例较高、重复性差、难以满足低残留和定量检测的要求等缺点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种电化学乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备方法，以解决上述技术问题。

本发明所解决的技术问题可以采用以下技术方案来实现：

一种电化学乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备方法，包括以下步骤：酶膜的制作工艺、玻碳电极的修饰工艺、酶膜的固定工艺，所述玻碳电极的修饰工艺采用功能化多壁碳对所述玻碳电极进行修饰，包括以下步骤：

1)多壁碳纳米管的功能化：称取10mg的多壁碳纳米管(MWNTs)，放入100mL的烧杯中，量取40mL浓HNO₃和H₂SO₄混合液(V∶V＝1∶3)加入所述烧杯中混合后，超声4h、120℃离心回流3h，水洗至中性，红外炉干燥，室温下保存待用；

2)清洗：所述玻碳电极修饰前，用0.3μm、30nm的Al₂O₃浆在麂皮上抛光至镜面，抛光后用双蒸水洗去表面污物，再移入超声水浴中清洗，每次2～3min，重复三次，最后依次用1∶1乙醇、1∶1HNO₃和去离子水超声清洗，氮气环境下干燥；

3)测试：清洗后，所述玻碳电极要在0.5mol/L的H₂SO₄溶液中用循环伏安法活化，扫描范围为-0.6～1.0V，扫速0.1V/S，反复扫描直至达到稳定的循环伏安图为止；最后在0.20mol/L KNO₃中记录1×10^-3mol/L K₃Fe(CN)₆溶液的循环伏安曲线，以测试所述玻碳电极的性能，扫描速度50mV/S，扫描范围为-0.1V～0.6；当所述循环伏安曲线中的峰电位差在80mV以下，所述玻碳电极可使用，否则要重新返回步骤2)中，处理所述玻碳电极，直到符合要求；

4)修饰：取2μL包含功能化的多壁碳纳米管0.12(w/v)％、壳聚糖0.48(w/v)％、戊二醛4.7(v/v)％的凝胶状混合物悬滴在清洗干净的所述玻碳电极表面，室温下干燥8h，随后用0.1mol L^-1磷酸盐缓冲液(pH 8.0)冲洗，4℃保存备用，完成所述玻碳电极的修饰。

本发明采用功能化多壁碳对玻碳电极进行修饰，与传统的采用修饰方法相比，能在较低的电压下获得较高的氧化峰电流，有效地防止了其他氧化物的干涉，提高本发明农药残留检测的精度。将采用功能化多壁碳修饰过的玻碳电极，制成乙酰胆碱酯酶生物传感器后，检测农药的精度更高、实现小型、便捷、适用于现场检测的目的。采用本发明生物传感器制成的相应快速检测仪可以在蔬果采收、上市前，进行农药残留的快速测定，直接对有机磷农药残留是否超标量进行检测，避免因食含有残留农药的蔬果而引起中毒，为农产品安全生产与消费提供残留检测的技术支撑。

所述酶膜的制作工艺包括壳聚糖膜的制作工艺、乙酰胆碱酯酶溶液的制作工艺、乙酰胆碱酯酶的固定工艺。

所述壳聚糖膜的制作工艺包括以下步骤：

1)将醋酸纤维膜置于0.1mol/L、pH8.0的磷酸盐缓冲溶液中，3℃下浸泡48h以上，完成醋酸纤维膜的预处理；

2)取0.1g壳聚糖粉末，加入10ml 1％(m/m)的醋酸水溶液，搅拌10min至形成黄色的溶胶，室温下3000r/min离心5min除去不溶颗粒；

3)将所述醋酸纤维膜置于所述溶胶中浸泡12h，取出晾干后再置于0.1mol/L、pH8.0的PBS浸泡12h，取出晾干，制得所述壳聚糖膜。

所述乙酰胆碱酯酶溶液的制作工艺包括以下步骤：

1)依次取200μL的AChE、20μL 5％(体积分数)的戊二醛、60μL1％(质量分数)的牛血清蛋白(BSA)于1mL塑料离心管中，离心管置于冰浴上；

2)添加0.1mol/L、pH8.0的磷酸盐缓冲溶液720μL，将上述物质充分混匀，当液体的上部出现泡沫时，表示已经混匀，制得乙酰胆碱酯酶溶液。

所述乙酰胆碱酯酶的固定工艺包括以下步骤：

1)取预处理好的壳聚糖膜一片浸入乙酰胆碱酯酶溶液中，4℃下保持8h；

2)8h后，取出所述壳聚糖膜，分别用0.1mol/L、pH8.0的磷酸盐缓冲溶液冲洗至少两次，直到液体中没有泡沫为止；

3)将所述壳聚糖膜浸泡在0.1mol/L、pH8.0的磷酸盐缓冲溶液中，4℃下保存，制得酶膜，完成固定。

所述酶膜的固定工艺采用以下方法：将固定有乙酰胆碱酯酶的酶膜通过O型圈固定在功能化多壁碳修饰过的玻碳电极上，制得乙酰胆碱酯酶生物传感器。

有益效果：由于采用上述技术方案，本发明制成的乙酰胆碱酯酶生物传感器具有结构简单、灵敏度高、能重复检测等优点。采用本发明制得的相应检测仪检测农药残留是具有灵敏度高、操作简单等优点。

附图说明

图1为本发明的制作流程示意图；

图2为本发明功能化多壁碳修饰过的玻碳电极的结构示意图；

图3为本发明经酶膜固定后的玻碳电极的结构示意图。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示进一步阐述本发明。

参照图1、图2、图3，一种电化学乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备方法，包括以下步骤：第一步，酶膜的制作工艺，第二步，玻碳电极的修饰工艺，第三步，酶膜的固定工艺。第二步中，玻碳电极的修饰工艺采用功能化多壁碳对玻碳电极4进行修饰，包括以下步骤：第21步，多壁碳纳米管的功能化：称取10mg的多壁碳纳米管5，放入100mL的烧杯中，量取40mL浓HNO₃和H₂SO₄混合液(V∶V＝1∶3)加入烧杯中混合后，超声4h、120℃离心回流3h，水洗至中性，红外炉干燥，室温下保存待用。第22步，清洗：玻碳电极4修饰前，用0.3μm、30nm的Al₂O₃浆在麂皮上抛光至镜面，抛光后用双蒸水洗去表面污物，再移入超声水浴中清洗，每次2～3min，重复三次，最后依次用1∶1乙醇、1∶1HNO₃和去离子水超声清洗，氮气环境下干燥。第23步，测试：清洗后，玻碳电极4要在0.5mol/L的H₂SO₄溶液中用循环伏安法活化，扫描范围为-0.6～1.0V，扫速0.1V/S，反复扫描直至达到稳定的循环伏安图为止；最后在0.20mol/L KNO₃中记录1×10^-3mol/L K₃Fe(CN)₆溶液的循环伏安曲线，以测试玻碳电极4的性能，扫描速度50mV/S，扫描范围为-0.1V～0.6；当循环伏安曲线中的峰电位差在80mV以下，玻碳电极4可使用，否则要重新返回第22步，直到符合要求。第24步，修饰：取2μL包含功能化的多壁碳纳米管50.12(w/v)％、壳聚糖0.48(w/v)％、戊二醛4.7(v/v)％的凝胶状混合物悬滴在清洗干净的玻碳电极4表面，室温下干燥8h，随后用0.1mol L^-1磷酸盐缓冲液(pH 8.0)冲洗，4℃保存备用，完成玻碳电极4的修饰。

本发明采用功能化多壁碳对玻碳电极4进行修饰，与传统的采用普鲁士蓝修饰方法相比，能在较低的电压下获得较高的氧化峰电流，有效地防止了其他氧化物的干涉，提高本发明农药残留检测的精度。将采用功能化多壁碳修饰过的玻碳电极4，制成乙酰胆碱酯酶生物传感器后，检测农药的精度更高、实现小型、便捷、适用于现场检测的目的。采用本发明制成的监测仪可以在蔬果采收、上市前，进行农药残留的快速测定，直接对有机磷农药残留是否超标量进行检测，避免因食含有残留农药的蔬果而引起中毒，为农产品安全生产与消费提供残留检测的技术支撑。

第一步中，酶膜的制作工艺包括第11步，壳聚糖膜的制作工艺，第12步，乙酰胆碱酯酶溶液的制作工艺，第13步，乙酰胆碱酯酶的固定工艺。第11步，壳聚糖膜的制作工艺包括以下步骤：第111步，将醋酸纤维膜置于0.1mol/L、pH8.0的磷酸盐缓冲溶液中，3℃下浸泡48h以上，完成醋酸纤维膜的预处理。第112步，取0.1g壳聚糖粉末，加入10ml 1％(m/m)的醋酸水溶液，搅拌10min至形成黄色的溶胶，室温下3000r/min离心5min除去不溶颗粒。第113步，将醋酸纤维膜置于溶胶中浸泡12h，取出晾干后再置于0.1mol/L、pH8.0的PBS浸泡12h，取出晾干，制得壳聚糖膜。

第12步，乙酰胆碱酯酶溶液的制作工艺包括以下步骤：第121步，依次取200μL的AChE、20μL 5％(体积分数)的戊二醛、60μL1％(质量分数)的牛血清蛋白(BSA)于1mL塑料离心管中，离心管置于冰浴上。第122步，添加0.1mol/L、pH8.0的磷酸盐缓冲溶液720μL，将上述物质充分混匀，当液体的上部出现泡沫时，表示已经混匀，制得乙酰胆碱酯酶溶液。

第13步，乙酰胆碱酯酶的固定工艺包括以下步骤：第131步，取预处理好的壳聚糖膜一片浸入乙酰胆碱酯酶溶液中，4℃下保持8h。第132步，8h后，取出壳聚糖膜，分别用0.1mol/L、pH8.0的磷酸盐缓冲溶液冲洗至少两次，直到液体中没有泡沫为止。第133步，将壳聚糖膜浸泡在0.1mol/L、pH8.0的磷酸盐缓冲溶液中，4℃下保存，制得酶膜6，完成固定。

第三步中，酶膜的固定工艺采用以下方法：将酶膜6通过O型圈7固定在功能化多壁碳修饰过的玻碳电极4上，制得乙酰胆碱酯酶生物传感器。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims

1.一种电化学乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备方法，包括以下步骤：酶膜的制作工艺、玻碳电极的修饰工艺、酶膜的固定工艺，其特征在于，所述酶膜的制作工艺包括壳聚糖膜的制作工艺、乙酰胆碱酯酶溶液的制作工艺、乙酰胆碱酯酶的固定工艺；

所述壳聚糖膜的制作工艺包括以下步骤：

1）将醋酸纤维膜置于0.1mol/L、pH8.0的磷酸盐缓冲溶液中，3℃下浸泡48h以上，完成醋酸纤维膜的预处理；

2）取0.1g壳聚糖粉末，加入10ml1%(m/m)的醋酸水溶液，搅拌10min至形成黄色的溶胶，室温下3000r/min离心5min除去不溶颗粒；

3）将所述醋酸纤维膜置于所述溶胶中浸泡12h，取出晾干后再置于0.1mol/L、pH8.0的PBS浸泡12h，取出晾干，制得所述壳聚糖膜；

所述玻碳电极的修饰工艺采用功能化多壁碳对所述玻碳电极进行修饰，包括以下步骤：

1）多壁碳纳米管的功能化：称取10mg的多壁碳纳米管，放入100mL的烧杯中，量取40mL浓HNO₃和H₂SO₄混合液加入所述烧杯中混合后，超声4h、120℃离心回流3h，水洗至中性，红外炉干燥，室温下保存待用；浓HNO₃和H₂SO₄混合液的体积分数之比为V:V=1:3；

2）清洗：所述玻碳电极修饰前，用0.3μm、30nm的Al₂O₃浆在麂皮上抛光至镜面，抛光后用双蒸水洗去表面污物，再移入超声水浴中清洗，每次2～3min，重复三次，最后依次用1:1乙醇、1:1HNO₃和去离子水超声清洗，氮气环境下干燥；

3）测试：清洗后，所述玻碳电极要在0.5mol/L的H₂SO₄溶液中用循环伏安法活化，扫描范围为－0.6～1.0V，扫速0.1V/S，反复扫描直至达到稳定的循环伏安图为止；最后在0.20mol/L KNO₃中记录1×10^-3mol/L K₃Fe(CN)₆溶液的循环伏安曲线，以测试所述玻碳电极的性能，扫描速度50mV/S，扫描范围为－0.1V～0.6；当所述循环伏安曲线中的峰电位差在80mV以下，所述玻碳电极可使用，否则要重新返回步骤2）中，处理所述玻碳电极，直到符合要求；

4）修饰：取2μL包含功能化的多壁碳纳米管0.12(w/v)%、壳聚糖0.48(w/v)%、戊二醛4.7(v/v)%的凝胶状混合物悬滴在清洗干净的所述玻碳电极表面，室温下干燥8h，随后用0.1mol L^-1、pH8.0的磷酸盐缓冲液冲洗，4℃保存备用，完成所述玻碳电极的修饰。

2.根据权利要求1所述的一种电化学乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备方法，其特征在于，所述乙酰胆碱酯酶溶液的制作工艺包括以下步骤：

1）依次取200μL的AChE、20μL5%(体积分数)的戊二醛、60μL1%(质量分数)的牛血清蛋白于1mL塑料离心管中，离心管置于冰浴上；

2）添加0.1mol/L、pH8.0的磷酸盐缓冲溶液720μL，将上述物质充分混匀，当液体的上部出现泡沫时，表示已经混匀，制得乙酰胆碱酯酶溶液。

3.根据权利要求2所述的一种电化学乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备方法，其特征在于，所述乙酰胆碱酯酶的固定工艺包括以下步骤：

1）取预处理好的壳聚糖膜一片浸入乙酰胆碱酯酶溶液中，4℃下保持8h；

2）8h后，取出所述壳聚糖膜，分别用0.1mol/L、pH8.0的磷酸盐缓冲溶液冲洗至少两次，直到液体中没有泡沫为止；

3）将所述壳聚糖膜浸泡在0.1mol/L、pH8.0的磷酸盐缓冲溶液中，4℃下保存，制得酶膜，完成固定。

4.根据权利要求1至3中任意一项所述的一种电化学乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备方法，其特征在于，所述酶膜的固定工艺采用以下方法：将固定有乙酰胆碱酯酶的酶膜通过O型圈固定在功能化多壁碳修饰过的玻碳电极上，制得乙酰胆碱酯酶生物传感器。