CN102735830A - 氨基甲酸乙酯检测试纸的制备及其检测方法 - Google Patents

Abstract

一种氨基甲酸乙酯试纸的制备方法，按如下三个步骤进行：一是备料，购得活性≥220u/g的乙酰胆碱酯酶、纯度为99％的氨基甲酸乙酯、吸水性好的中速定性滤纸和2，6-二氯靛酚乙酸酯；二是酯酶溶液的配制；三是试纸的固定化制备。用本方法制得的试纸进行检测的方法按四个步骤进行：一是标准检测溶液的制备；二是标准比色卡的制作；三是试纸有效性的确认；四是比色与含量的框定。用本试纸对酒精饮料和发酵等食品中的氨基甲酸乙酯有害物进行检测与去除，具有快速、方便、只需目测即可判断的优点，不但适于食品检测部门应用，食品生产企业、销售部门、用户均可自行检测，应用推广面广。

Description

氨基甲酸乙酯检测试纸的制备及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种食品尤其是发酵食品中的氨基甲酸乙酯的快速定性和半定量的检测试纸的制备和检测方法。

背景技术

氨基甲酸乙酯(EC)的分子式是C₃H₇NO₂，不仅是烟草的天然成分，也存在于发酵食品(酸牛奶，酱油等)和酒精饮料(黄酒，清酒，葡萄酒等)中。人体摄取EC的主要途径是饮用酒精饮料。研究表明氨基甲酸乙酯在生物体内约有0.5％被细胞色素P450氧化为乙酰基氨基甲酸乙酯，再进一步形成乙酰基氨基甲酸乙酯环氧化物，通过这种途径形成的环氧化物能够在生物体内形成DNA加聚物，导致DNA结构的双链损坏，进而导致细胞的癌变；另有0.1％左右的氨基甲酸乙酯被细胞色素P450氧化为N-羟基氨基甲酸乙酯，这种物质能够诱导由二价铜离子(Cu²⁺)调控的DNA的损伤，引起癌变。

氨基甲酸乙酯对人的危害主要由人饮入酒精饮料引起的，在酒精饮料中氨基甲酸乙酯的形成途径主要有以下三点：

1、焦碳酸二乙酯和氨反应生成氨基甲酸乙酯：

O(CO₂C₂H₅)₂+NH₃→H₂NCO₂C₂H₅+CO₂+C₂H₅OH

2、氨甲酰磷酸和乙醇反应生成氨基甲酸乙酯：

H₂NCO₂PO₃H₂+C₂H₅OH→H₂NCO₂C₂H₅+H₃PO₄

3、尿素和乙醇反应生成氨基甲酸乙酯：

H₂NCONH₂+C₂H₅OH→H₂NCO₂C₂H₅+NH₃

现在对氨基甲酸乙酯的检测技术主要有以下几种方法：

(1)二氯甲烷提取-气质联用技术：将已知酒精浓度的待测样品加水稀释后，用正己烷洗涤，然后用二氯甲烷进行提取、浓缩、定容，再用气相色谱-质谱检测器测定，外标法进行定量，其检出限为10μg·kg^-1，此方法的回收率较低，色素等杂质较多。

(2)固相萃取-气质联用技术：采用固相萃取技术对酒精饮料中氨基甲酸乙酯进行提取和净化处理，后用GC/MS进行定性、定量分析的方法精度和效率都有了很大程度的提高，但萃取柱在每次使用时都需要清洗，给测定带来了一定的困难。该方法能够检测出最低浓度为2.0μg·kg^-1，回收率达到了90.0％～101.3％。

(3)二维或多维-气质联用技术(MDGC/MS)：采用二维色谱技术可以直接测定白酒中的氨基甲酸乙酯的含量，因二维色谱技术分离能力较强，可以避免复杂的化学前处理，加快了测定的速度。但是，此方法有一定的局限性，只适合高浓度EC的酒类，并且偏差较大。

(4)高效液相色谱结合荧光检测器：此方法的原理是氨基甲酸乙酯和9-羟基呫吨在酸性条件下生成产生荧光的物质，利用荧光检测器可对氨基甲酸乙酯进行定性和定量分析。研究表明，此方法测定的准确性无法与气质联用法相比。

上述氨基甲酸乙酯的定性或定量检测的共同不足是涉及到大量仪器及繁琐的前处理步骤，检测周期过长，易引入分析测定误差，不适合快速检测。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题在于提供一种氨基甲酸乙酯检测试纸的制备方法。

本发明要解决的第二个技术问题在于提供一种氨基甲酸乙酯检测试纸的检测方法。

解决上述问题所用的技术方案是：

本氨基甲酸乙酯试纸的制备方法按如下步骤进行：

(1)备料：活性≥220u/g的乙酰胆碱酯酶，纯度为99％的氨基甲酸乙酯，试纸的纸基为吸水性好的中速定性滤纸，底物为1g·L^-1的2，6-二氯靛酚乙酸酯；

(2)酶溶液的配制：乙酰胆碱酯酶的用量10u，体积比为5％的戊二醛2μL，质量比为1％的BSA 10μL，配成70μL的酶溶液；

(3)试纸的制备：将上述的酶溶液与定性滤纸在3℃的条件下常规固定化8h，得到氨基甲酸乙酯检测试纸。

本氨基甲酸乙酯试纸进行检测的方法按如下步骤进行：

(1)标准检测溶液的制备：用纯度为99％以上的氨基甲酸乙酯配制成浓度分别为0、0.1mg·L^-1、0.2mg·L^-1、0.3mg·L^-1、0.4mg·L^-1的五种水溶液，水为去离子水；

(2)标准比色卡的制作：将上述五种氨基甲酸乙酯浓度的标准水溶液用制备的酶片试纸依次检测，试纸上会呈现五种不同的颜色，以相应浓度的标准溶液的检测情况所呈现的不同颜色制作成标准色卡；浓度为零时，试纸呈现深蓝色；浓度为0.1mg·L^-1时，试纸呈现的淡蓝色；浓度为0.2mg·L^-1时，蓝色更淡，几乎分辨不清；浓度为0.3mg·L^-1时，试纸呈现淡淡的橙红色；浓度为0.4mg·L^-1时，试纸呈现橙红色；

(3)试纸有效性的确认：在对待测样品进行检测之前，首先对试纸的有效性进行确认，对于同批次制作的试纸至少进行一次确认；随机抽取一张制作好的试纸，滴加半滴到一滴上述氨基甲酸乙酯浓度的标准溶液，再向试纸上滴加半滴到一滴底物溶液，观察颜色变化并与标准比色卡上的氨基甲酸乙酯浓度的颜色对比，若试纸变色达到标准程度，试纸检测效果良好，可用于检测；若颜色比标准色度变淡或不变色，则试纸失效，应废弃不用；

(4)比色与含量的框定：将待测样品进行检测，以试纸所呈现的颜色与标准比色卡对照，即得出所测样品中氨基甲酸乙酯的大致含量。

本发明的有益效果是与以往氨基甲酸乙酯的检测方法相比，试纸体积小可随身携带，检测方法简单迅速，只需进行目测加以辨别，简化了检测程序。生产和应用本检测试纸对环境和人不会造成污染和危害。检测试纸应用面广，可以提供食品安全监管部门用于基本的氨基甲酸乙酯的定性和半定量检测，还可以推广入户，自行检测和防范，也可以推广到食品、饮料的生产和销售等行业应用。

具体实施方式

下面结合实施例子对本发明作进一步详述：

本氨基甲酸乙酯试纸的制备方法按如下步骤进行：

(1)备料：活性≥220u/g的乙酰胆碱酯酶，纯度为99％的氨基甲酸乙酯，试纸的纸基为吸水性好的中速定性滤纸，底物为1g·L^-1的2，6-二氯靛酚乙酸酯；

(2)酶溶液的配制：乙酰胆碱酯酶的用量10u，体积比为5％的戊二醛2μL，质量比为1％的BSA 10μL，配成70μL的酶溶液；

(3)试纸的制备：将上述的酶溶液与定性滤纸在3℃的条件下常规固定化8h，得到氨基甲酸乙酯检测试纸。

本氨基甲酸乙酯试纸进行检测的方法按如下步骤进行：

(1)标准检测溶液的制备：用纯度为99％以上的氨基甲酸乙酯配制成浓度分别为0、0.1mg·L^-1、0.2mg·L^-1、0.3mg·L^-1、0.4mg·L^-1的五种水溶液，水为去离子水；

(2)标准比色卡的制作：将上述五种氨基甲酸乙酯浓度的标准水溶液用制备的酶片试纸依次检测，试纸上会呈现五种不同的颜色，以相应浓度的标准溶液的检测情况所呈现的不同颜色制作成标准色卡；浓度为零时，试纸呈现深蓝色；浓度为0.1mg·L^-1时，试纸呈现的淡蓝色；浓度为0.2mg·L^-1时，蓝色更淡，几乎分辨不清；浓度为0.3mg·L^-1时，试纸呈现淡淡的橙红色；浓度为0.4mg·L^-1时，试纸呈现橙红色；

(3)试纸有效性的确认：在对待测样品进行检测之前，首先对试纸的有效性进行确认，对于同批次制作的试纸至少进行一次确认；随机抽取一张制作好的试纸，滴加半滴到一滴上述氨基甲酸乙酯浓度的标准溶液，再向试纸上滴加半滴到一滴底物溶液，观察颜色变化并与标准比色卡上的氨基甲酸乙酯浓度的颜色对比，若试纸变色达到标准程度，试纸检测效果良好，可用于检测；若颜色比标准色度变淡或不变色，则试纸失效，应废弃不用；

(4)比色与含量的框定：将待测样品进行检测，以试纸所呈现的颜色与标准比色卡对照，即得出所测样品中氨基甲酸乙酯的大致含量。

用氨基甲酸乙酯试纸检测的化学原理：

乙酰胆碱酯酶能够催化橙红色的底物2，6-二氯靛酚乙酸酯水解成深蓝色的2，6-二氯靛酚和乙酸，如果反应体系中存在氨基甲酸乙酯，则氨基甲酸乙酯将与2，6-二氯靛酚乙酸酯竞争与乙酰胆碱酯酶的反应。若含有氨基甲酸乙酯的溶液和试纸上与纸基结合的乙酰胆碱酯酶反应后便会强烈的抑制2，6-二氯靛酚乙酸酯水解反应的发生，根据颜色变化的程度或抑制程度来间接检测溶液中氨基甲酸乙酯的含量。取待测溶液于试纸上，再辅以底物于试纸上，经过一定时间后观察蓝色物质的生成程度，再与事先制作好的标准色卡进行比较，判断待测溶液中氨基甲酸乙酯的大致含量。从市场上直接购置生物纯级的乙酰胆碱酯酶，用于试纸的制作，市购乙酰胆碱酯酶可避免由自制乙酰胆碱酯酶产生的酶活性低及活性不均一的现象。再将市购乙酰胆碱酯酶经过载体结合法固定化加载到纸基上，能够较好的保持酶的活性。

本方法在生产和应用试纸时，不会对环境造成二次污染，检测时只需辅以2，6-二氯靛酚乙酸酯，分解的产物为2，6-二氯靛酚和乙酸，也不会对环境和人造成污染和危害。原料中的酯酶为生物化学品，很难在体外保持活性，本发明中将酯酶经过载体结合法固定化，加载到不与酯酶自身和底物反应的纸基上，能够保持酯酶较好的活性，提高检测的可靠性。

Claims (2)

1.一种氨基甲酸乙酯试纸的制备方法，其特征是按如下步骤进行：

(1)备料：活性≥220u/g的乙酰胆碱酯酶，纯度为99％的氨基甲酸乙酯，试纸的纸基为吸水性好的中速定性滤纸，底物为1g·L^-1的2，6-二氯靛酚乙酸酯；

(2)酶溶液的配制：乙酰胆碱酯酶的用量10u，体积比为5％的戊二醛2μL，质量比为1％的BSA 10μL，配成70μL的酶溶液；

(3)试纸的制备：将上述的酶溶液与定性滤纸在3℃的条件下常规固定化8h，得到氨基甲酸乙酯检测试纸。

2.用权利要求书1所述的氨基甲酸乙酯试纸制备方法制得的试纸，其特征是检测方法按如下步骤进行：

(1)标准检测溶液的制备：用纯度为99％以上的氨基甲酸乙酯配制成浓度分别为0、0.1mg·L^-1、0.2mg·L^-1、0.3mg·L^-1、0.4mg·L^-1的五种水溶液，水为去离子水；

(2)标准比色卡的制作：将上述五种氨基甲酸乙酯浓度的标准水溶液用制备的酶片试纸依次检测，试纸上会呈现五种不同的颜色，以相应浓度的标准溶液的检测情况所呈现的不同颜色制作成标准色卡；浓度为零时，试纸呈现深蓝色；浓度为0.1mg·L^-1时，试纸呈现的淡蓝色；浓度为0.2mg·L^-1时，蓝色更淡，几乎分辨不清；浓度为0.3mg·L^-1时，试纸呈现淡淡的橙红色；浓度为0.4mg·L^-1时，试纸呈现橙红色；

(3)试纸有效性的确认：在对待测样品进行检测之前，首先对试纸的有效性进行确认，对于同批次制作的试纸至少进行一次确认；随机抽取一张制作好的试纸，滴加半滴到一滴上述氨基甲酸乙酯浓度的标准溶液，再向试纸上滴加半滴到一滴底物溶液，观察颜色变化并与标准比色卡上的氨基甲酸乙酯浓度的颜色对比，若试纸变色达到标准程度，试纸检测效果良好，可用于检测；若颜色比标准色度变淡或不变色，则试纸失效，应废弃不用；

(4)比色与含量的框定：将待测样品进行检测，以试纸所呈现的颜色与标准比色卡对照，即得出所测样品中氨基甲酸乙酯的大致含量。