CN1731155A - 农药残毒快速检测用固体酶试剂及其制备方法与使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种有机磷及氨基甲酸酯类农药残毒快速检测用固体酶试剂及其制备方法与使用方法。本发明有机磷及氨基甲酸酯类农药残毒快速检测用固体酶试剂由胆碱酯酶、缓冲溶液、载体组成。本发明固体酶试剂可在室温下(20～25℃)稳定储存20天以上，解决了酶在室温(20～25℃)或冰箱冷藏(0～4℃)下储存易于失活、酶溶液于在－20℃下冷冻储存由于多次溶冻所带来的酶活显著降低、固体酶试剂合力差、酶活损失较多导致直接影响农药残毒检测的准确性的问题。本发明固体酶成本低，制备方法简单，便于推广应用，其配合使用底物试剂、显色剂试剂及缓冲溶液试剂，可以满足蔬菜、水果、环境水或粮食中农药残毒现场快速分析的需求并保证测试结果的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及一种组合物，尤其涉及一种含酶的固体组合物试剂，特别涉及一种机磷及氨基甲酸酯类农药残毒快速检测用含酶的固体组合物试剂。
背景技术
残留农药对人类健康的危害是食品安全问题中举世瞩目的热点之一，世界范围内由于有机磷及氨基甲酸酯类农药残留超标而引起的中毒事件屡有发生，其中有69.5％是由有机磷农药所致。因此对食品、环境中农药残留进行监测是一件非常重要的工作。目前对于有机磷及氨基甲酸酯类农药残毒快速检测通常采用酶抑制法，利用酶被抑制的程度，借助农药残毒速测仪通过酶催化动力学光度法测量，或者通过颜色变化，或者通过酸度测量等方法，进行有机磷及氨基甲酸酯类农药残留毒性的快速检测。在上述酶催化动力学反应体系中，涉及了酶试剂、底物、显色剂等，而酶试剂在检测中具有关键性作用。一般而言，酶在室温(20～25℃)或冰箱冷藏(0～4℃)下储存易于失活(酶在室温保存不得超过2天，在冰箱冷藏不得超过1周)直接影响农药残毒检测的准确性。在农副产品的产销过程中，因酶试剂稳定性得不到保证，从而影响测量的准确性，使得绝大多数的农产品在进入餐桌之前，食用的安全性难以得到保证，无公害农产品的品质得不到有效的控制。为了适应农药残毒现场检测的需要，研究酶的固化技术，使固体酶能稳定贮存，是一个有效解决问题的途径。酶的固定化方法很多，如物理吸附法、离子结合法、包埋法、共价结合法、交联法等。其中包埋、共价结合、共价交联三种方法虽结合力强、但酶活损失较多；吸附法制备简单，成本低，但结合差，在受到离子强度、pH变化影响后，酶会从载体上游离下来。目前已有的固体酶试剂还不能满足有机磷及氨基甲酸酯类农药残毒快速检测的需要。
发明内容
本发明提供一种有机磷及氨基甲酸酯类农药残毒快速检测用固体酶试剂及其制备方法与使用方法。本发明有机磷及氨基甲酸酯类农药残毒快速检测用固体酶试剂可在室温下(20～25℃)稳定储存20天以上，从而克服了已有固体酶试剂存在的缺点，又克服了酶溶液于在-20℃下冷冻储存由于多次溶冻所带来的酶活显著降低的弊病，有效解决了目前有机磷及氨基甲酸酯类农药残毒快速检测存在的问题。
本发明有机磷及氨基甲酸酯类农药残毒快速检测用固体酶试剂的组分及配比为：
胆碱酯酶：活度为1000units/mL的乙酰胆碱酯酶或丁酰胆碱酯酶之一 5-50μL、
缓冲溶液：1)0.1M pH＝7.8-8.2的磷酸盐缓冲溶液 5-30mL、
2)0.1M pH＝7.8-8.2 Tris-HCl缓冲溶液 20-50mL、
载体：聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP) 2-10g；
本发明有机磷及氨基甲酸酯类农药残毒快速检测的固体酶试剂的组分及优选配比为：
胆碱酯酶：活度为1000units/mL的乙酰胆碱酶或丁酰胆碱酯酶之一 10-30μL、
缓冲溶液：1)0.1M pH＝7.8-8.2的磷酸盐缓冲溶液 8-20mL、
2)0.1M pH＝7.8-8.2 Tris-HCl缓冲溶液 25-40mL、
载体：聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP) 5-8g；
进行有机磷及氨基甲酸酯类农药残留毒性的快速筛选检测，酶试剂在检测中具有关键性作用，一般而言，酶在室温(20～25℃)或冰箱冷藏(0～4℃)下储存易于失活(酶在室温保存不得超过2天，在冰箱冷藏不得超过1周)，直接影响农药残毒检测的准确性。常见的酶试剂保存方法一般是将酶溶液进行分装后于-20℃冷冻储存的方式以增加酶的储存周期。但该方法存在着多次溶冻所带来的酶活性易于降低的问题，如果溶冻次数超过2次则酶活性降低显著，使测量结果不稳定，因此该方法也不便于实际应用。
为了便于现场快速、准确地检测农药残毒，其分析用化学试剂必须在室温下具有足够的稳定性、容易保存，反应条件温和，反应完全，速度快，操作简单，携带方便等特点，只有具备这些特点才能有效地检测与控制食品中农药残毒、真正确保食用安全性。
本发明有机磷及氨基甲酸酯类农药残毒快速检测用固体酶试剂所选用的固相载体聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP)与酶的结合力适中，通过物理吸附方式进行固体酶的制备，所制得的固体酶可在室温(20～25℃)下稳定储存20天以上，可以满足现场检测农药残毒的需要；固体酶的基体对原酶的活性基本无影响，可保证检测灵敏度；其水溶解性好，便于实验操作；其成本低，制备方法简单，便于推广应。用本发明固体酶在低温冷冻下储存，多次溶冻对其活性影响较小，便于储存更长时间(-20℃下冷冻可稳定储存2年以上)，决解了目前固体酶存在的结合力不强、酶活损失较多的问题。因此本发明有机磷及氨基甲酸酯类农药残毒快速检测的固体酶试剂配合使用底物试剂、显色剂试剂及缓冲溶液试剂，可以满足蔬菜、水果、环境水或粮食中农药残毒现场快速分析的需求并保证测试结果的准确性。
本发明有机磷及氨基甲酸酯类农药残毒快速检测用固体酶试剂的制备方法，其步骤如下：
1)酶溶液A的配制：将所需的活度为1000units/mL的胆碱酯酶放入烧杯中，用所需的0.1M pH＝7.8-8.2的磷酸盐缓冲溶液稀释，得到酶溶液A；
2)酶溶液B的配制：向上述已配置好的酶溶液A中加入所需的0.1M pH＝7.8-8.2的Tris-HCl缓冲溶液稀释，得到酶溶液B；
3)载体的溶解：将所需的载体放入上述已配置好的酶溶液B中，搅拌，使载体溶解；置于0-4℃冰箱内反应1小时以上，使酶与载体结合；
4)冻干：将上述酶与载体结合物转移至冻干瓶中，将冻干瓶置于-20℃以下低温乙醇浴中轻轻转动冻干，使溶质尽量薄且均匀地涂布于瓶壁上，待溶液蒸发干后，牢固地固定冻干瓶于冻干机上10小时；取下内壁载有冻干粉的冻干瓶，小心地刮下冻干粉1.0g、2.0g、或6.0g放入2mL的安碚瓶中；抽成真空后封口，置于4℃冰箱中冷藏或于冷冻下保存。
本发明有机磷及氨基甲酸酯类农药残毒快速检测用固体酶试剂的使用方法：
1)配固体酶试剂：每个装有6.0g固体酶试剂的安碚瓶为一个试剂包，每次检测用量为30mg；使用时，打开安碚瓶直接称量使用或用0.1M，pH＝7.8-8.2的Tris-HCl或磷酸盐缓冲溶液溶解后使用，每30mg固体酶试剂用4mL缓冲溶液溶解；于开口的安碚瓶中盛装未用尽的固体酶试剂，应置于干燥器内，于室温下20日内不失效；
2)底物试剂：将所需底物试剂用水稀释；按每0.6g.底物稀释至100mL刻度处稀释，每个试剂包内装10mL；底物为碘化硫代乙酰胆碱、溴化硫代乙酰胆碱、氯化硫代乙酰胆碱、碘化硫代丁酰胆碱、溴化硫代丁酰胆碱胆碱、氯化硫代丁酰胆碱、氯化乙酰胆碱、2，6-二氯靛酚乙酯、2，6-二溴靛酚乙酯、2，6-二氯靛酚丙酯或2，6-二溴靛酚丙酯之一；
3)显色剂试剂，仅酶催化动力学光度法测量时使用；按每0.8g显色剂稀释至100mL刻度处稀释，每个试剂包内装10mL；显色剂为5，5’-二硫代-2，2’-二硝基苯甲酸(DTNB)；
将上述3种试剂包各一个、分别用1个塑料洗瓶盛装的0.1M pH＝7.8-8.2的磷酸盐缓冲溶液及0.1M pH＝7.8-8.2 Tris-HCl缓冲溶液各500mL、3-5个塑料滴瓶放入检测箱中；每个检测箱中的试剂可检测待测样品为0.2～1.0g或待测样品汁0.1～0.5mL的样品200组；缓冲溶液使用时也可转入塑料滴瓶中，方便取用。这样，在进行现场检测操作时，便不需要很多玻璃器皿，使得操作方便快捷，可靠性高。
4)检测
使用检测箱中的试剂，利用酶被抑制的程度，借助农药残毒速测仪通过酶催化动力学光度法测量、通过颜色变化或者通过酸度测量方法之一，进行有机磷及氨基甲酸酯类农药残留毒性的快速筛选检测。
具体实施方式
在检测工作中，检测试剂包中的试剂量可根据需要按比例扩大或缩小，避免浪费。磷酸盐缓冲溶液及Tris-HCl缓冲溶液用于提取样品或作空白提取液，需要量大，可适时补充。检测时，可先加入酶液，然后加入样品提取液(或空白提取液)，再加入显色剂试剂(仅酶催化动力学光度法测量时使用)，最后加入底物，能达到最佳效果。
实施例1
1)酶溶液A的配制：将5μL活度为1000units/mL的乙酰胆碱酯酶放入烧杯中，加入0.1M pH＝7.8-8.2的磷酸盐缓冲溶液5mL，稀释乙酰胆碱酯酶得到酶溶液A；
2)酶溶液B的配制：向上述已配置好的酶溶液A中加入0.1M pH＝7.8-8.2的Tris-HCl缓冲溶液20mL，稀释酶溶液A，得到酶溶液B；
3)载体的溶解：取2.0g载体聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP)放入上述已配置好的酶溶液B中，搅拌，使载体聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP)溶解；置于冰箱内于0-4℃反应1小时以上使酶与载体结合；
4)冻干：将上述酶与载体结合物转移至冻干瓶中，将冻干瓶置于-20℃以下低温乙醇浴中轻轻转动冻干瓶，使溶质尽量薄且均匀地涂布于瓶壁上，待溶液蒸发干后，牢固地固定冻干瓶于冻干机上10小时；取下内壁载有冻干粉的冻干瓶，小心地刮下冻干粉放入小玻璃瓶中，每瓶装1.0g，抽真空密封；置于4℃冰箱中冷藏或于冷冻下保存；
需要对机磷及氨基甲酸酯类农药残毒快速检测，按上述使用方法配试剂包，固体酶试剂直接使用，借助农药残毒速测仪通过酶催化动力学光度法测量，进行有机磷及氨基甲酸酯类农药残留毒性的快速筛选检测。
实施例2
1)酶溶液A的配制：将50μL活度为1000units/mL的丁酰胆碱酯酶；加入0.1M pH＝7..8-8.2的磷酸盐缓冲溶液30mL，稀释酶溶液，得到酶溶液A；
2)酶溶液B的配制：向上述已配置好的酶溶液A中加入0.1M pH7＝7.8-8.2的Tris-HCl缓冲溶液50mL，稀释酶溶液A，得到酶溶液B；
3)载体的溶解：取10g载体聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP)放入上述已配置好的酶溶液B中，搅拌，使载体聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP)溶解；置于0-4℃冰箱内反应1小时以上，使酶与载体结合；
4)冻干：将上述酶与载体结合物转移至冻干瓶中，将冻干瓶置于-20℃以下低温乙醇浴中轻轻转动冻干，使溶质尽量薄且均匀地涂布于瓶壁上，待溶液蒸发干后，牢固地固定冻干瓶于冻干机上10小时；取下内壁载有冻干粉的冻干瓶，小心地刮下冻干粉放入小玻璃瓶中；每瓶装6.0g，抽真空密封；置于4℃冰箱中冷藏或于冷冻下保存；
需要对机磷及氨基甲酸酯类农药残毒快速检测，按上述使用方法配试剂包，用0.1M pH＝7.8-8.2的Tris-HCl缓冲溶液溶解后使用，每30mg固体酶试剂的用4mL缓冲溶液溶解；借助农药残毒速测仪通过酶催化动力学光度法测量，进行有机磷及氨基甲酸酯类农药残留毒性的快速筛选检测。
实施例3
1)液A的配制：将10μL活度为1000units/mL的乙酰胆碱酯酶放入烧杯中，加入0.1MpH＝7.8＝8.2的磷酸盐缓冲溶液8mL，稀释酶溶液，得到酶溶液A；
2)酶溶液B的配制：向上述已配置好的酶溶液A中加入0.1M pH＝7.8-8.2的Tris-HCl缓冲溶液25mL，稀释酶溶液A，得到酶溶液B；
3)载体的溶解：取5.0g载体聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP)放入上述已配置好的酶溶液B中，搅拌，使载体聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP)溶解；置于冰箱内反应1.0小时以上使酶与载体结合；
4)冻干：将上述酶与载体结合物转移至冻干瓶中，将冻干瓶置于-20℃以下低温乙醇浴中轻轻转动冻干，使溶质尽量薄且均匀地涂布于瓶壁上，待溶液蒸发干后，牢固地固定冻干瓶于冻干机上10小时，；取下内壁载有冻干粉的冻干瓶，小心地刮下冻干粉放入小玻璃瓶中，每瓶装1.0g，抽真空密封；置于4℃冰箱中冷藏或于冷冻下保存
需要对机磷及氨基甲酸酯类农药残毒快速检测，按上述使用方法配试剂包，固体酶试剂直接使用，借助农药残毒速测仪通过酶催化动力学光度法测量，进行有机磷及氨基甲酸酯类农药残留毒性的快速筛选检测。
实施例4
1)酶溶液A的配制：将30μL活度为1000units/mL的丁酰胆碱酯酶；加入0.1M pH＝7..8-8.2的磷酸盐缓冲溶液20mL，稀释酶溶液，得到酶溶液A；
2)酶溶液B的配制：向上述已配置好的酶溶液A中加入0.1M pH7＝7.8-8.2的Tris-HCl缓冲溶液40mL，稀释酶溶液A，得到酶溶液B；
3)载体的溶解：取10g载体聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP)放入上述已配置好的酶溶液B中，搅拌，使载体聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP)溶解；置于0-4℃冰箱内反应1小时以上，使酶与载体结合；
4)冻干：将上述酶与载体结合物转移至冻干瓶中，将冻干瓶置于-20℃以下低温乙醇浴(中轻轻转动冻干，使溶质尽量薄且均匀地涂布于瓶壁上，待溶液蒸发干后，牢固地固定冻干瓶于冻干机上10小时；取下内壁载有冻干粉的冻干瓶，小心地刮下冻干粉放入小玻璃瓶中；每瓶装6.0g，抽真空密封，置于4℃冰箱中冷藏或于冷冻下保存；
需要对机磷及氨基甲酸酯类农药残毒快速检测，按上述使用方法配试剂包，固体酶试剂直接使用，通过颜色变化，进行有机磷及氨基甲酸酯类农药残留毒性的快速筛选检测。
实施例5
1)液A的配制：将25μL活度为1000units/mL的乙酰胆碱酯酶放入烧杯中，加入0.1MpH＝7.8-8.2的磷酸盐缓冲溶液18mL，稀释酶溶液，得到酶溶液A；
2)酶溶液B的配制：向上述已配置好的酶溶液A中加入0.1M pH＝7.8-8.2的Tris-HCl缓冲溶液28mL，稀释酶溶液A，得到酶溶液B；
3)载体的溶解：取8.0g载体聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP)放入上述已配置好的酶溶液B中，搅拌，使载体聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP)溶解；置于冰箱内反应1小时以上使酶与载体结合；
4)冻干：将上述酶与载体结合物转移至冻干瓶中，将冻干瓶置于-20℃以下低温乙醇浴中轻轻转动冻干，使溶质尽量薄且均匀地涂布于瓶壁上，待溶液蒸发干后，牢固地固定冻干瓶于冻干机上10小时；取下内壁载有冻干粉的冻干瓶，小心地刮下冻干粉放入小玻璃瓶中，每瓶装2.0g，抽真空密封；置于4℃冰箱中冷藏或于冷冻下保存；
需要对机磷及氨基甲酸酯类农药残毒快速检测，按上述使用方法配试剂包，固体酶试剂用0.1M，pH＝7.8-8.2的Tris-HCl缓冲溶液溶解后使用，每30mg固体酶试剂的用4mL缓冲溶液溶解；通过酸度测量，进行有机磷及氨基甲酸酯类农药残留毒性的快速筛选检测。
Claims (5)
1.一种有机磷及氨基甲酸酯类农药残毒快速检测用固体酶试剂，其特征在于，其组分及配比为：
胆碱酯酶：活度为1000units/mL的乙酰胆碱酯酶或丁酰胆碱酯酶之一 5-50μL、
缓冲溶液：1)0.1M pH＝7.8-8.2的磷酸盐缓冲溶液 5-30mL、
2)0.1M pH＝7.8-8.2的Tris-HCl缓冲溶液 20-50mL、
载体：聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP). 2-10g。
2.一种如权利要求1所述有机磷及氨基甲酸酯类农药残毒快速检测用固体酶试剂，其特征在于，其组分及配比为：
胆碱酯酶：活度为1000units/mL的乙酰胆碱酶或丁酰胆碱酯酶之一 10-30μL、
缓冲溶液：1)0.1M pH＝7.8-8.2的磷酸盐缓冲溶液 8-20mL、
2)0.1M pH＝7.8-8.2的Tris-HCl缓冲溶液 25-40mL、
载体：聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP). 5-8g。
3.一种如权利要求2所述有机磷及氨基甲酸酯类农药残毒快速检测用固体酶试剂，其特征在于，其组分及配比为：
胆碱酯酶：活度为1000units/mL的乙酰胆碱酯酶或丁酰胆碱酯酶之一 10μL、
缓冲溶液：1)0.1M pH＝7.8-8.2的磷酸盐缓冲溶液 8mL、
2)0.1M pH＝7.8-8.2的Tris-HCl缓冲溶液 25mL、
载体：聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP). 5g。
4.一种如权利要求1-3之一所述有机磷及氨基甲酸酯类农药残毒快速检测用固体酶试剂的制备方法，其步骤如下：
1)酶溶液A的配制：将所需的活度为1000units/mL的胆碱酯酶放入烧杯中，用所需的0.1M pH＝7.8-8.2的磷酸盐缓冲溶液稀释，得到酶溶液A；；
2)酶溶液B的配制：向上述已配置好的酶溶液A中加入所需的0.1M pH＝7.8-8.2的Tris-HCl缓冲溶液稀释，得到酶溶液B；
3)载体的溶解：将所需的载体加入上述已配置好的酶溶液B中，搅拌，使载体溶解；置于0-4℃冰箱内反应1小时以上，使酶与载体结合；
4)冻干：将上述酶与载体结合物转移至冻干瓶中，将冻干瓶置于-20℃以下低温乙醇浴中轻轻转动冻干，使溶质尽量薄且均匀地涂布于瓶壁上，待溶液蒸发干后，牢固地固定冻干瓶于冻干机上10小时；取下内壁载有冻干粉的冻干瓶，小心地刮下冻干粉放入小玻璃瓶中；每瓶装6.0g，抽真空密封，置于4℃冰箱中冷藏或于冷冻下保存。
5.一种如权利要求1-3之一所述有机磷及氨基甲酸酯类农药残毒快速检测用固体酶试剂的使用方法，其步骤如下：
1)配固体酶试剂：每个装有6.0g固体酶试剂的小玻璃瓶为一个试剂包；每次检测用量为30mg；使用时，打开安碚瓶直接称量使用或用0.1M，pH＝7.8-8.2的Tris-HCl或磷酸盐缓冲溶液溶解后使用，每30mg固体酶试剂用4mL缓冲溶液溶解；于开口的安碚瓶中盛装未用尽的固体酶试剂，应置于干燥器内，于室温下20日内不失效；
2)底物试剂：将所需底物试剂用水稀释；按每0.6g.底物稀释至100mL刻度处稀释，每个试剂包内装10mL；底物为碘化硫代乙酰胆碱、溴化硫代乙酰胆碱、氯化硫代乙酰胆碱、碘化硫代丁酰胆碱、溴化硫代丁酰胆碱胆碱、氯化硫代丁酰胆碱、氯化乙酰胆碱、2，6-二氯靛酚乙酯、2，6-二溴靛酚乙酯、2，6-二氯靛酚丙酯或2，6-二溴靛酚丙酯之一；
3)显色剂试剂，仅酶催化动力学光度法测量时使用；按每0.8g显色剂稀释至100mL刻度处稀释，每个试剂包内装10mL；显色剂为5，5’-二硫代-2，2’-二硝基苯甲酸(DTNB)；
将上述3种试剂包各一个、0.1M pH＝7.8-8.2的磷酸盐缓冲溶液及0.1M pH＝7.8-8.2Tris-HCl缓冲溶液各500mL分别用1个塑料洗瓶盛装、3-5个塑料滴瓶放入检测箱中；每个检测箱中的试剂可检测待测样品为0.2～1.0g或待测样品汁0.1～0.5mL的样品200组；
使用检测箱中的试剂，利用酶被抑制的程度，借助农药残毒速测仪通过酶催化动力学光度法测量、通过颜色变化或者通过酸度测量方法之一，进行有机磷及氨基甲酸酯类农药残留毒性的快速筛选检测。
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