DE102017201810B4

DE102017201810B4 - Getrocknete amplifikationszusammensetzungen

Info

Publication number: DE102017201810B4
Application number: DE102017201810.0A
Authority: DE
Inventors: Matthias Jost; Mark Filipowsky; Vladislav Nodelman; Robert Stephen Dickson; Cheryl Lynn Crowell; Steven Mauch; Donald Martin
Original assignee: Gen Probe Inc
Current assignee: Gen Probe Inc
Priority date: 2016-02-05
Filing date: 2017-02-06
Publication date: 2024-03-21
Anticipated expiration: 2037-02-07
Also published as: AU2023201084A1; JP2022141876A; EP4286529A3; EP4286529A2; JP2021087451A; US20190284604A1; CA3011617A1; AU2017214675A1; JP7015785B2; EP3411499A1; DE102017201810A1; KR20180103945A; CN108699593A; JP2019509027A; GB2553164A; WO2017136782A1; GB201701910D0; GB2553164B; EP3411499B1; AU2017214675B2

Abstract

Zusammensetzung, die eine wässrige Lösung umfasst, die mindestens eine Polymerase, einen Füllstoff, einen Chelatbildner, ein Detergens und einen organischen Puffer enthält, wobei die wässrige Lösung eine Konzentration an anorganischem Salz von 7 mM oder weniger aufweist.

Description

QUERVERWEIS AUF VERWANDTE ANMELDUNGEN
Diese Anmeldung beansprucht den Vorteil der provisorischen US-Patentanmeldung Nr. 62/291,770 , eingereicht am 5. Februar 2016, die hierdurch unter Bezugnahme eingeschlossen ist.
HINTERGRUND
Kommerzielle Kits für die Durchführung von Nukleinsäureamplifikations- und/oder -detektionsreaktionen enthalten häufig Reagenzien wie zum Beispiel Enzyme, einschließlich eines oder mehrerer von einer Polymerase, wie zum Beispiel einer DNAabhängigen DNA-Polymerase oder einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase (z. B. reverse Transkriptase), Nukleotide, Detergenzien, Puffer, Primer, Sonden und anorganisches Salz, einschließlich MnCl₂, MgCl₂, NaCl und KCl (Innis et al., (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Kap. 1, Optimizations of PCRs). Anorganische Salze sind bei der Stabilisierung bestimmter Komponenten einer Nukleinsäurereaktionsmischung und bei der Durchführung bestimmter Schritte einer Nukleinsäure-basierten Reaktion verwendbar. Jedoch sind diese gleichen Salze unerwünschte Komponenten von Formulierungen, die vor der Verwendung zu lyophilisieren und/oder zu lagern sind, da diese Salze einen negativen Einfluss auf die Stabilität und Trockenheit einer lyophilisierten Zusammensetzung ausüben.
Es wurde berichtet, dass Magnesiumionen die Aktivität von Polymerasen und anderen Enzymen erhöhen. Es wurde berichtet, dass Kaliumchlorid Nukleinsäurehybridisierungen erleichtert. Es wurde auch berichtet, dass mehrere anorganische Salze, einschließlich solcher mit Magnesium, Proteine unter verschiedenen Bedingungen von Stress, einschließlich Hitze, Aussetzung gegenüber chaotropen Mitteln und Lyophilisierung, schützen (siehe z. B. Liu et al. (2007) FEBS Letters. 581:1047; Kanaya et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:32729; Innis et al., (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Kap. 1, Optimizations of PCRs; Menendez et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:167; Janeway et al. (1993) Biochemistry. 32:1601; Fox et al. (1971) J. Biol. Chem. 246:5739; Chang et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:277:4663; Rutter et al. (1958) J. Biol. Chem. 233:374; Huszar et al. (1981) J. Virol. 37:580-588; Wang (2000) Int. J. Pharmaceutics. 203:1-60).
Es wird angenommen, dass die Gegenwart der Salze in einer Reaktionsmischung zur Vermeidung von Denaturierung von Enzymen notwendig ist. Jedoch wird die Stabilität einer lyophilisierten Substanz durch die Hygroskopie jedweder Salze, die in dem lyophilisierten Kuchen vorliegen, beeinträchtigt. Die Hygroskopie einer lyophilisierten Substanz beeinträchtigt wiederum die Zeit, die zur Verpackung der lyophilisierten Substanz verfügbar ist, und beeinträchtigt die Dauer und Bedingungen, unter denen die lyophilisierte Substanz gelagert und versandt werden kann. Die unerwünschte Rehydratisierung einer lyophilisierten Substanz hat einen negativen Einfluss auf die Aktivität von lyophilisierten Komponenten. Zur Minimierung des negativen Einflusses durch unerwünschte Rehydratisierung einer lyophilisierten Substanz wird die Langzeitlagerung derartiger Substanzen gewöhnlich unter Kühlung durchgeführt.
ZUSAMMENFASSUNG
Offenbart hierin sind Zusammensetzungen, die eine wässrige Lösung umfassen, die eine Polymerase und/oder eine reverse Transkriptase, einen Füllstoff, ein Detergens und einen organischen Puffer enthält, wobei die wässrige Lösung eine Konzentration des anorganischen Salzes von 7 mM oder weniger aufweist.
In einigen Ausführungsformen der wässrigen Lösungen umfasst die wässrige Lösung weiter mindestens ein Oligonukleotid, das zur Durchführung eines molekularen Assays verwendbar ist. In einigen Ausführungsformen umfasst die wässrige Lösung Oligonukleotide für die Durchführung eines molekularen Multiplex-Assays. In einigen Ausführungsformen schließt das mindestens eine Oligonukleotid ein Amplifikationsoligomer ein. In einigen Ausführungsformen schließt das mindestens eine Oligonukleotid eine Detektionssonde ein. In einigen Ausführungsformen schließt die Detektionssonde eine Markierung ein, die kovalent mit einem Oligonukleotid verbunden ist. In einigen Ausführungsformen ist die Markierung ein fluoreszierendes oder chemilumineszierendes Molekül. In einigen Ausführungsformen ist die Detektionssonde eine TaqMan-Detektionssonde. In einigen Ausführungsformen ist das Detektionssondenoligonukleotid zur Bildung einer Haarnadel konfiguriert. In einigen Ausführungsformen schließt das mindestens eine Oligonukleotid ein Adapteroligonukleotid ein. In einigen Ausführungsformen schließt das mindestens eine Oligonukleotid einen Adapter ein, der zur Bildung einer Haarnadel konfiguriert ist. In einigen Ausführungsformen schließt das mindestens eine Oligonukleotid eine Zieleinfang-Sonde ein. In einigen Ausführungsformen weist die Zieleinfang-Sonde einen Ziel-hybridisierenden Teil auf, der mit einer Ziel-Nukleinsäure unter stringenten Bedingungen spezifisch hybridisiert. In einigen Ausführungsformen schließt der molekulare Assay einen Nukleinsäureamplifikationsassay ein. In einigen Ausführungsformen schließt der molekulare Assay einen Nukleinsäuredetektionsassay ein. In einigen Ausführungsformen schließt der molekulare Assay einen Nukleinsäuresequenzierungsassay ein. In einigen Ausführungsformen schließt der molekulare Assay einen Nukleinsäurehybridisierungsassay ein.
In einigen Ausführungsformen der wässrigen Lösungen ist der Füllstoff Trehalose, Raffinose oder eine Kombination davon. In einigen Ausführungsformen liegt der Füllstoff in einer Konzentration von etwa 0,16 M bis etwa 0,32 M vor.
In einigen Ausführungsformen der wässrigen Lösungen liegen die anorganischen Salze in einer Masse pro Mikroliter von etwa 0,029 ug/ul bis etwa 0,373 ug/ul vor. In einigen Ausführungsformen enthält die wässrige Lösung von etwa 0,029 ug/ul an Natriumchlorid bis etwa 0,292 ug/ul an Natriumchlorid. In einigen Ausführungsformen enthält die wässrige Lösung von etwa 0,019 ug/ul an Kaliumchlorid bis etwa 0,373 ug/ul an Kaliumchlorid. In einigen Ausführungsformen enthält die wässrige Lösung von etwa 0,006 ug/ul an Natriumionen bis etwa 0,115 ug/ul an Natriumionen. In einigen Ausführungsformen enthält die wässrige Lösung von etwa 0,010 ug/ul an Kaliumionen bis etwa 0,196 ug/ul an Kaliumionen. In einigen Ausführungsformen enthält die wässrige Lösung von etwa 0,009 ug/ul an Chloridionen bis etwa 0,355 ug/ul an Chloridionen.
In einigen Ausführungsformen der wässrigen Lösungen umfasst die wässrige Lösung eine Konzentration an anorganischem Salz von 4 mM oder weniger. In einigen Ausführungsformen umfasst die wässrige Lösung eine Masse pro Mikroliter an anorganischem Salz von etwa 0,234 ug bis etwa 0,298 ug. In einigen Ausführungsformen umfasst die wässrige Lösung eine Masse pro Mikroliter an Chloridionen von etwa 0,071 ug bis etwa 0,284 ug. In einigen Ausführungsformen umfasst die wässrige Lösung eine Konzentration an anorganischem Salz von 3 mM oder weniger. In einigen Ausführungsformen umfasst die wässrige Lösung eine Masse pro Mikroliter an anorganischem Salz von etwa 0,175 ug bis etwa 0,224 ug. In einigen Ausführungsformen umfasst die wässrige Lösung eine Masse pro Mikroliter an Chloridionen von etwa 0,053 ug bis etwa 0,213 ug. In einigen Ausführungsformen umfasst die wässrige Lösung eine Konzentration an anorganischem Salz von 2 mM oder weniger. In einigen Ausführungsformen umfasst die wässrige Lösung eine Masse pro Mikroliter an anorganischem Salz von etwa 0,117 ug bis etwa 0,149 ug. In einigen Ausführungsformen umfasst die wässrige Lösung eine Masse pro Mikroliter an Chloridionen von etwa 0,036 ug bis etwa 0,142 ug. In einigen Ausführungsformen umfasst die wässrige Lösung eine Konzentration an anorganischem Salz von 1 mM oder weniger. In einigen Ausführungsformen umfasst die wässrige Lösung eine Masse pro Mikroliter an anorganischem Salz von etwa 0,058 ug bis etwa 0,075 ug. In einigen Ausführungsformen umfasst die wässrige Lösung eine Masse pro Mikroliter an Chloridionen von etwa 0,018 ug bis etwa 0,071 ug. In einigen Ausführungsformen umfasst die wässrige Lösung eine Konzentration an anorganischem Salz von 500 uM oder weniger. In einigen Ausführungsformen umfasst die wässrige Lösung eine Masse pro Mikroliter an anorganischem Salz von etwa 0,029 ug bis etwa 0,037 ug. In einigen Ausführungsformen umfasst die wässrige Lösung eine Masse pro Mikroliter an Chloridionen von etwa 0,009 ug bis etwa 0,036 ug.
In einigen Ausführungsformen der wässrigen Lösungen beträgt die Konzentration an anorganischem Salz der wässrigen Lösung weniger als 1 mM Natriumchlorid. In einigen Ausführungsformen enthält die wässrige Lösung kein Natriumchlorid. In einigen Ausführungsformen enthält die wässrige Lösung weniger als 1 mM Magnesiumionen. In einigen Ausführungsformen enthält die wässrige Lösung weniger als 0.1 mM Magnesiumionen, geeigneterweise keine Magnesiumionen.
In einigen Ausführungsformen der wässrigen Lösungen umfasst die wässrige Lösung weiter Desoxynukleosidtriphosphate (dNTPs). In einigen Ausführungsformen schließen die dNTPs dATP in einer Konzentration von 0,1 mM bis 0,3 mM in der wässrigen Lösung ein. In einigen Ausführungsformen liegt das dATP in einer Konzentration von 0,2 mM in der wässrigen Lösung vor. In einigen Ausführungsformen schließen die dNTPs dGTP in einer Konzentration von 0,1 mM bis 0,3 mM in der wässrigen Lösung ein. In einigen Ausführungsformen liegt das dGTP in einer Konzentration von 0,2 mM in der wässrigen Lösung vor. In einigen Ausführungsformen schließen die dNTPs dCTP in einer Konzentration von 0,1 mM bis 0,3 mM in der wässrigen Lösung ein. In einigen Ausführungsformen liegt das dCTP in einer Konzentration von 0,2 mM in der wässrigen Lösung vor. In einigen Ausführungsformen schließen die dNTPs dTTP in einer Konzentration von 0,2 mM bis 0,6 mM in der wässrigen Lösung ein. In einigen Ausführungsformen schließen die dNTPs dUTP in einer Konzentration von 0,2 mM bis 0,6 mM in der wässrigen Lösung ein. In einigen Ausführungsformen schließen die dNTPs markierte dNTPs ein.
In einigen Ausführungsformen der wässrigen Lösungen liegt die Polymerase in einer Konzentration von etwa 0,20 U/ul bis etwa 0,72 U/ul in der wässrigen Lösung vor. In einigen Ausführungsformen liegt die Polymerase in der wässrigen Lösung in einer Konzentration vor, die aus folgenden ausgewählt ist: 0,25 U/ul, 0,30 U/ul bis 0,32 U/ul, 0,4 U/ul, 0,5 U/ul, 0,45 U/ul und 0.72 U/ul. In einigen Ausführungsformen ist die Polymerase eine Hot-Start-Polymerase. In einigen Ausführungsformen ist die Polymerase eine rekombinante Taq-DNA-Polymerase, die durch einen Antikörper gebunden ist, der die Polymeraseaktivität der Polymerase spezifisch blockiert. In einigen Ausführungsformen ist die Polymerase eine chemisch modifizierte rekombinante Taq-DNA-Polymerase, wobei die chemische Modifikation die Polymeraseaktivität der Polymerase inhibiert. In einigen Ausführungsformen ist die Polymerase für den Einbau von markierten dNTPs in ein Nukleinsäureverlängerungsreaktionsprodukt modifiziert.
In einigen Ausführungsformen der wässrigen Lösungen umfasst die wässrige Lösung eine reverse Transkriptase in einer Konzentration von etwa 0,1 U/ul bis etwa 0,6 U/ul. In einigen Ausführungsformen ist die reverse Transkriptase eine AMV-reverse-Transkriptase. In einigen Ausführungsformen ist die reverse Transkriptase eine MMLV-reverse-Transkriptase.
In einigen Ausführungsformen der wässrigen Lösungen umfasst die wässrige Lösung weiter einen RNase-Inhibitor. In einigen Ausführungsformen liegt der RNase-Inhibitor in der wässrigen Lösung in einer Konzentration von etwa 0,12 U/ul bis etwa 0,20 U/ul vor.
In einigen Ausführungsformen der wässrigen Lösungen umfasst die wässrige Lösung weiter einen Chelatbildner. In einigen Ausführungsformen ist der Chelatbildner aus der Gruppe ausgewählt, die aus Folgenden besteht: Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäure (EDDS), Methylglycindiessigsäure (MGDA), Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) und Ethylenglycol-bis((3-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure (EGTA). In einigen Ausführungsformen ist der Chelatbildner EDTA und liegt in der wässrigen Lösung in einer Konzentration von 1,5 mM bis 2,0 mM vor.
Offenbart hierin sind getrocknete Formen der vorstehend beschriebenen wässrigen Lösungen.
Offenbart hierin sind getrocknete Zusammensetzungen, die ein Enzym, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer Polymerase und einer reversen Transkriptase besteht, einen Füllstoff, einen organischen Puffer und ein Detergens umfassen. Die getrockneten Zusammensetzungen umfassen auch ein oder mehrere anorganische Salze, wobei das eine oder die mehreren anorganischen Salze in der getrockneten Zusammensetzung in einer Masse vorliegen, die 0,350 % oder weniger der Gesamtmasse der getrockneten Zusammensetzung beträgt.
In einigen Ausführungsformen der getrockneten Zusammensetzungen liegt das eine oder liegen die mehreren anorganischen Salze in der getrockneten Zusammensetzung in einer Masse vor, die von etwa 0,311 % bis etwa 0,024 % der Gesamtmasse der getrockneten Zusammensetzung beträgt. In einigen Ausführungsformen ist das eine oder sind die mehreren anorganischen Salze aus der Gruppe ausgewählt, die aus Folgenden besteht: Natriumchlorid, Kaliumchlorid und sowohl Natriumchlorid als auch Kaliumchlorid.
In einigen Ausführungsformen der getrockneten Zusammensetzungen umfasst die getrocknete Zusammensetzung weiter mindestens ein Oligonukleotid, das zur Durchführung eines molekularen Assays verwendbar ist. In einigen Ausführungsformen umfasst die getrocknete Zusammensetzung Oligonukleotide für die Durchführung eines molekularen Multiplex-Assays. In einigen Ausführungsformen schließt das mindestens eine Oligonukleotid ein Amplifikationsoligomer ein. In einigen Ausführungsformen schließt das mindestens eine Oligonukleotid eine Detektionssonde ein. In einigen Ausführungsformen schließt die Detektionssonde eine Markierung ein, die kovalent mit einem Oligonukleotid verbunden ist. In einigen Ausführungsformen ist die Markierung ein fluoreszierendes oder chemilumineszierendes Molekül. In einigen Ausführungsformen ist die Detektionssonde eine TaqMan-Detektionssonde. In einigen Ausführungsformen ist das Detektionssondenoligonukleotid zur Bildung einer Haarnadel konfiguriert. In einigen Ausführungsformen schließt das mindestens eine Oligonukleotid ein Adapteroligonukleotid ein. In einigen Ausführungsformen schließt das mindestens eine Oligonukleotid einen Adapter ein, der zur Bildung einer Haarnadel konfiguriert ist. In einigen Ausführungsformen schließt das mindestens eine Oligonukleotid eine Zieleinfang-Sonde ein. In einigen Ausführungsformen weist die Zieleinfang-Sonde einen Ziel-hybridisierenden Teil auf, der mit einer Ziel-Nukleinsäure unter stringenten Bedingungen spezifisch hybridisiert. In einigen Ausführungsformen schließt der molekulare Assay einen Nukleinsäureamplifikationsassay ein. In einigen Ausführungsformen schließt der molekulare Assay einen Nukleinsäuredetektionsassay ein. In einigen Ausführungsformen schließt der molekulare Assay einen Nukleinsäuresequenzierungsassay ein. In einigen Ausführungsformen schließt der molekulare Assay einen Nukleinsäurehybridisierungsassay ein.
In einigen Ausführungsformen der getrockneten Zusammensetzungen ist der Füllstoff Trehalose, Raffinose oder eine Kombination davon.
In einigen Ausführungsformen der getrockneten Zusammensetzungen umfasst die getrocknete Zusammensetzung weiter Desoxynukleosidtriphosphate (dNTPs).
In einigen Ausführungsformen der getrockneten Zusammensetzungen ist die Polymerase ein Hot-Start-Enzym. In einigen Ausführungsformen ist die Polymerase eine rekombinante Taq-DNA-Polymerase, die zu einem Antikörper gebunden ist, der die Polymeraseaktivität spezifisch blockiert. In einigen Ausführungsformen ist die Polymerase eine chemisch modifizierte rekombinante Tαq-DNA-Polymerase. In einigen Ausführungsformen ist die Polymerase für den Einbau von markierten dNTPs in ein Nukleinsäureverlängerungsreaktionsprodukt modifiziert.
In einigen Ausführungsformen der getrockneten Zusammensetzungen ist die reverse Transkriptase eine AMV-reverse-Transkriptase oder ist die reverse Transkriptase eine MMLV-reverse-Transkriptase.
In einigen Ausführungsformen der getrockneten Zusammensetzungen umfasst die getrocknete Zusammensetzung weiter einen RNase-Inhibitor.
In einigen Ausführungsformen der getrockneten Zusammensetzungen umfasst die getrocknete Zusammensetzung weiter einen Chelatbildner. In einigen Ausführungsformen ist der Chelatbildner aus der Gruppe ausgewählt, die aus EDTA, EGTA, EDDS, DTPA und MGDA besteht.
Offenbart hierin sind Verfahren zur Bildung einer Mischung für die Verwendung bei der Durchführung einer Nukleinsäure-basierten Amplifikationsreaktion, wobei das Verfahren die Vereinigung einer Rekonstitutionslösung und einer getrockneten Zusammensetzung wie vorstehend beschrieben umfasst, wobei die Rekonstitutionslösung mindestens ein anorganisches Salz umfasst.
In einigen Ausführungsformen der Verfahren umfasst die Rekonstitutionslösung eine Konzentration an anorganischem Salz von weniger als 1 mM. In einigen Ausführungsformen umfasst die Rekonstitutionslösung ein anorganisches Salz, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Natriumionen, Kaliumionen, Magnesiumionen, Manganionen, Chloridionen und Kombinationen davon besteht. In einigen Ausführungsformen umfasst die Rekonstitutionslösung MgCl₂ in einer Konzentration von etwa 3,8 mM bis etwa 4,4 mM oder umfasst sie KCl in einer Konzentration von etwa 50 mM bis etwa 80 mM oder beide. In einigen Ausführungsformen umfasst die Rekonstitutionslösung eine MgCl₂ -Konzentration, die die MgCl₂-Konzentration übersteigt, die in der rekonstituierten getrockneten Zusammensetzung notwendig ist (die Menge an MgCl₂, die in der rekonstituierten getrockneten Zusammensetzung notwendig ist, wird auf der Grundlage mehrerer Faktoren bestimmt, wie zum Beispiel Enzymbedarf, Anforderungen des molekularen Assays und Optimierungsergebnisse des molekularen Assays). Diese Rekonstitutionslösungen, die überschüssiges McCl₂ umfassen, werden als universelle Rekonstitutionslösungen bezeichnet. Universelle Rekonstitutionslösungen sind für die Rekonstitution getrockneter Zusammensetzungen verwendbar, die eine Vielfalt an Komponenten für die Durchführung verschiedener molekularer Assays enthalten. Lediglich beispielshalber kann eine universelle Rekonstitutionslösung MgCl₂ in einer Konzentration X umfassen. Eine getrocknete Zusammensetzung #1 benötigt MgCl₂ in einer Konzentration von 0,8 X, während eine getrocknete Zusammensetzung #2 MgCl₂ in einer Konzentration von 0,95 X benötigt. Sowohl die getrocknete Zusammensetzung #1 als auch die getrocknete Zusammensetzung #2 werden mit der gleichen universellen Rekonstitutionslösung rekonstituiert und die MgCl₂-Konzentrationen in den rekonstituierten getrockneten Zusammensetzungen werden auf die gewünschten Höhen durch Verwendung eines Chelatbildner verringert. Bevorzugt werden die getrockneten Zusammensetzungen #1 und #2 jeweils derart formuliert (z. B. in dem vorgetrockneten Bulk-Reagenz), dass sie einen Chelatbildner in einer Menge einschließen, der das überschüssige MgCl₂ aus der anschließend verwendeten universellen Rekonstitutionslösung binden wird. Bei Rekonstitution wird der Chelatbildner einiges des MgCl₂ binden, wodurch nur die gewünschte Konzentration an MgCl₂ (z. B. 0,8 X bzw. 0,95 X für diese beispielhafte Beschreibung) frei in Lösung zurückbleibt.
In einigen Ausführungsformen der Verfahren umfasst die Rekonstitutionslösung Methylparaben in einer Massekonzentration von etwa 0,012 m/V-% bis etwa 0,020 m/V-% oder umfasst sie Propylparaben in einer Massekonzentration von etwa 0,006 m/V-% bis etwa 0,010 m/V-% oder umfasst sie absolutes Ethanol in einer Volumenkonzentration von etwa 0,20 V/V-% bis etwa 0,30 V/V-% oder eine Kombination davon. In einigen Ausführungsformen beträgt die Konzentration von Methylparaben in der Rekonstitutionslösung 0,016 m/V-%. In einigen Ausführungsformen beträgt die Konzentration von Propylparaben in der Rekonstitutionslösung 0,008 m/V-%. In einigen Ausführungsformen liegt das absolute Ethanol in der Rekonstitutionslösung bei etwa 0,26 V/V-% vor.
Offenbart hierin sind Verfahren für die Herstellung einer getrockneten Zusammensetzung für die Verwendung bei der Durchführung eines molekularen Assays, wie zum Beispiel einer Nukleinsäure-basierten Amplifikationsreaktion, einer Nukleinsäure-basierten Detektionsreaktion, einer Nukleinsäure-basierten Sequenzierungsreaktion, einer Nukleinsäure-basierten Hybridisierungsreaktion und Kombinationen davon. In einigen Ausführungsformen umfassen die Verfahren einen Trocknungsschritt, der aus der Gruppe von Verfahren ausgewählt ist, die aus folgenden besteht: Dehydratisierung, Desikkation, Lyophilisierung und Sprühtrocknung. In einigen Ausführungsformen umfassen die Verfahren die Trocknungsschritte von: (i) Gefrieren einer wässrigen Lösungszusammensetzung wie hierin beschrieben, wodurch eine gefrorene Form der Zusammensetzung gebildet wird; und (ii) Aussetzen der gefrorenen Form der Zusammensetzung gegenüber Lyophilisierungsbedingungen, wodurch eine getrocknete Form der Zusammensetzung gebildet wird. In einigen Ausführungsformen wird die wässrige Zusammensetzung in einem Lyophilisator getrocknet, um eine lyophilisierte Zusammensetzung zu erzeugen.
Getrocknete Zusammensetzungen sind nach Rekonstitution für Nukleinsäure-basierte Reaktionen (z. B. Amplifikations- und/oder Detektionsreaktionen) verwendbar. Getrocknete Zusammensetzungen, die feuchten Umgebungen länger ausgesetzt waren, liefern überraschenderweise robuste Amplifikations- und/oder Detektionsergebnisse, wenn sie rekonstituiert und in Nukleinsäureamplifikations- und/oder -detektionsassays verwendet werden. Die getrocknete Form der Zusammensetzungen, die einer feuchten Umgebung ausgesetzt waren, wobei die Höhe der absoluten Feuchte der feuchten Umgebung mehr als 2,3 Gramm Wasser pro Kubikmeter Luft für eine Zeitdauer von bis zu 3 Stunden, bevorzugt für eine Zeitdauer von 90 Minuten bis 180 Minuten, bevorzugt etwa 90 Minuten oder bevorzugt etwa 180 Minuten beträgt, werden dann rekonstituiert und sind in Nukleinsäureamplifikations- und/oder -detektionsassays verwendbar. In bestimmten Ausführungsformen ist die rekonstituierte Form von getrockneten Zusammensetzungen in Amplifikations- und/oder Detektionsreaktionen verwendbar, auch wenn die getrockneten Zusammensetzungen einer feuchten Umgebung ausgesetzt wurden, wobei die Höhe der relativen Feuchte der feuchten Umgebung 10 % oder weniger für eine Zeitdauer von bis zu 8 Stunden beträgt. In bestimmten Ausführungsformen ist die rekonstituierte Form der getrockneten Zusammensetzungen in Amplifikations- und/oder Detektionsreaktionen verwendbar, auch wenn die getrockneten Zusammensetzungen einer feuchten Umgebung ausgesetzt wurden, wobei die Höhe der absoluten Feuchte der feuchten Umgebung 2,3 Gramm Wasser pro Kubikmeter Luft bei 25 °C oder weniger für eine Zeitdauer von bis zu 8 Stunden beträgt. In bestimmten Ausführungsformen wird ein wässriges Bulk-Reagenz für eine längere Zeitdauer inkubiert, dann wird das gesamte oder ein Teil des wässrigen Bulk-Reagenzes getrocknet, um getrocknete Zusammensetzungen zu bilden, die bei Rekonstitution der getrockneten Zusammensetzungen überraschenderweise robuste Nukleinsäureamplifikations- und/oder -detektionsergebnisse liefern, wenn sie in einem Nukleinsäureamplifikations- und/oder -detektionsassay verwendet werden.
In einigen Ausführungsformen wird die getrocknete Zusammensetzung in einem abgedichteten Gefäß gelagert. In einigen Ausführungsformen ist die getrocknete Zusammensetzung vor dem Lagerungsschritt der getrockneten Zusammensetzung in dem abgedichteten Gefäß einer feuchten Umgebung ausgesetzt, wobei die Höhe der absoluten Feuchte der feuchten Umgebung mehr als 2,3 Gramm Wasser pro Kubikmeter Luft beträgt. In einigen Ausführungsformen wird die vorgetrocknete wässrige Lösung bei Raumtemperatur für bis zu 8 Stunden vor Beginn des Trocknungsschritts gelagert. In einigen Ausführungsformen wird die vorgetrocknete wässrige Lösung bei Raumtemperatur für eine Zeitdauer von etwa 45 Minuten bis etwa 8 Stunden vor Beginn des Trocknungsschritts gelagert. In einigen Ausführungsformen ist die getrocknete Zusammensetzung vor dem Lagerungsschritt der getrockneten Zusammensetzung in dem abgedichteten Gefäß einer feuchten Umgebung ausgesetzt, wobei die Höhe der relativen Feuchte der feuchten Umgebung weniger als 10 % beträgt. In einigen Ausführungsformen ist die getrocknete Zusammensetzung vor dem Lagerungsschritt der getrockneten Zusammensetzung in dem abgedichteten Gefäß einer feuchten Umgebung ausgesetzt, wobei die Höhe der absoluten Feuchte der feuchten Umgebung 2,3 Gramm Wasser pro Kubikmeter Luft bei 25 °C oder weniger beträgt. In einigen Ausführungsformen wird die getrocknete wässrige Lösung bei Raumtemperatur für bis zu 8 Stunden vor dem Lagerungsschritt der getrockneten Zusammensetzung in dem abgedichteten Gefäß gelagert.
Offenbart hierin sind Kits für die Verwendung bei der Durchführung eines molekularen Assays. In einigen Ausführungsformen sind die Kits für die Durchführung einer Nukleinsäure-basierten Amplifikationsreaktion vorgesehen. In einigen Ausführungsformen sind die Kits für die Durchführung einer Nukleinsäure-basierten Detektionsreaktion vorgesehen. In einigen Ausführungsformen sind die Kits für die Durchführung einer Nukleinsäure-basierten Sequenzierungsreaktion vorgesehen. In einigen Ausführungsformen sind die Kits für die Durchführung einer Nukleinsäure-basierten Hybridisierungsreaktion vorgesehen. In einigen Ausführungsformen sind die Kits für die Durchführung einer Kombination von molekularen Assays, wie zum Beispiel einer Nukleinsäure-basierten Amplifikations- und Detektionsreaktion, vorgesehen. In einigen Ausführungsformen umfassen die Kits in einem Gefäß eine getrocknete Zusammensetzung wie hierin beschrieben. In einigen Ausführungsformen umfassen die Kits in einem Gefäß eine Lösung für die Rekonstitution einer getrockneten Zusammensetzung für die Verwendung in einem molekularen Assay, wie zum Beispiel einer Amplifikationsreaktion und/oder einer Detektionsreaktion. In einigen Ausführungsformen umfassen die Kits ein erstes Gefäß, das eine getrocknete Zusammensetzung wie hierin beschrieben enthält, und ein zweites Gefäß, das eine Rekonstitutionslösung enthält, die MgCl₂ in einer Konzentration von etwa 3,8 mM bis etwa 4,4 mM umfasst. In einigen Ausführungsformen ist das erste Gefäß eine Multiwellplatte, die ein oder mehrere Wells umfasst. In einigen Ausführungsformen enthält mindestens eines des einen oder der mehreren Wells eine getrocknete Zusammensetzung. In einigen Ausführungsformen enthält jedes des einen oder der mehreren Wells eine getrocknete Zusammensetzung. In einigen Ausführungsformen enthalten zwei oder mehr des einen oder der mehreren Wells eine getrocknete Zusammensetzung für die Durchführung verschiedener molekularer Assays. In einem Aspekt dieser Ausführungsform hat jedes getrocknete Pellet in den zwei oder mehr Wells eine unterschiedliche MgCl₂-Konzentrationsanforderung. Weiterhin wird in einem Aspekt dieser Ausführungsform jedes getrocknete Pellet, das eine unterschiedliche MgCl₂-Konzentrationsanforderung aufweist, mit einer universellen Rekonstitution rekonstituiert, die eine MgCl₂-Konzentration von gleich oder mehr als des zusätzlichen MgCl₂ aufweist, das für jeden molekularen Assay erforderlich ist. In einigen Ausführungsformen enthält mindestens eines des einen oder der mehreren Wells ein getrocknetes Einzeleinheitsdosis-Pellet, das Masseprozente des anorganischen Salzes zur Masse des Pellets von 0,311 % oder weniger enthält. In einigen Ausführungsformen enthält jedes des einen oder der mehreren Wells ein getrocknetes Einzeleinheitsdosis-Pellet, das Masseprozente des anorganischen Salzes zur Masse des Pellets von 0,311 % oder weniger enthält. In einigen Ausführungsformen ist das erste Gefäß aus einem Material mit einer niedrigen Moisture Vapor Transmission Rate hergestellt, das thermisch leitfähig ist, das optisch transparent ist, das eine geringe Autofluoreszenz bereitstellt oder eine Kombination davon. In einer Ausführungsform umfasst das erste Gefäß eine Kappe zur Abdichtung der Öffnung des Gefäßes. In einigen Ausführungsformen ist die Kappe eine Folie, ein Stopfen oder eine elastomere Substanz. In einigen Ausführungsformen hat die Kappe eine niedrige Moisture Vapor Transmission Rate. In einigen Ausführungsformen sind das erste und das zweite Gefäß in einer Vorrichtung integriert, die für die automatisierte Überführung der Rekonstitutionslösung von dem zweiten Gefäß in das erste Gefäß geeignet ist.
KURZE BESCHREIBUNGEN DER ABBILDUNGEN

zeigt die Aktivität, die in Proben bestimmt wurde, die mit oder ohne Magnesium lyophilisiert worden waren und dann trocken bei verschiedenen Temperaturen gelagert worden waren.
zeigt den Einfluss der Lagerungszeit bei Raumtemperatur (Lagerung des Bulk-Reagenzes vor der Lyophilisierung) auf die Aktivität, die aus dem lyophilisierten Pellet gewonnen wurde. Das Bulk-Reagenz wurde unter mehreren Bedingungen gelagert, getrocknet und in einer Nukleinsäureamplifikations- und -detektionsreaktion zur Identifizierung von Influenza A in einer Probe verwendet.
Die sind Histogrammdarstellungen, die die Daten der relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU) für Amplifikations- und Detektionsassays veranschaulichen, die unter Verwendung von rekonstituierten Formen von getrockneten Einzeleinheitsdosis(single unit dose = SUD)-Pelletzusammensetzungen durchgeführt wurden, die aus Bulk-Reagenzien ohne KCl mit oder ohne MgCl₂ hergestellt waren und für eine Zeitdauer bei Raumtemperatur oder auf Eis inkubiert wurden.
ist ein Bioanalyzer-Gel-artiges Bild, das die Wirkung zeigt, die die Inkubation des vorgetrockneten Bulk-Reagenzes in Gegenwart oder Abwesenheit von MgCl₂ auf einen anschließenden Nukleinsäure-Multiplex-Amplifikationsassay gegen Influenza A, Influenza B und das respiratorische Syncytial-Virus (RSV) hat. Dem Bulk-Reagenz, das kein MgCl₂ enthielt und wiederum getrocknet wurde, um eine getrocknete Zusammensetzung ohne MgCl₂ zu erzeugen, wurde das MgCl₂ vor der Amplifikationsreaktion zugegeben. Die Reagenzien, die mit MgCl₂ in dem vorgetrockneten Bulk-Reagenz inkubiert wurden, zeigen nichtspezifische Amplifikation von niedrigem Molekulargewicht (Verschmierung), was die Bildung eines niedermolekularen Nebenprodukts anzeigt, das Primer-Dimere und andere unechte Ereignisse anzeigt, die anschließend zu einer niedrigeren Amplifikationseffizienz des vorgesehenen Nukleinsäureziels führen. Reagenzien, die ohne MgCl₂ in dem vorgetrockneten Bulk-Reagenz inkubiert wurden, zeigen stärkere eindeutige Zielbanden und eine geringere Bildung von Nebenprodukten im Vergleich zu den Bedingungen, unter denen MgCl₂ in dem vorgetrockneten Bulk-Reagenz vorliegt, was zeigt, dass die Stabilität im Bulk-Formulierungs-Master-Mix durch den Ausschluss von MgCl₂ verbessert ist. Spur 1 ist das nach 90 Minuten auf einer eisgekühlten Platte mit 2,5 mM MgCl₂ in dem Master-Mix erhaltene Ergebnis; Spur 2 ist das nach 90 Minuten auf Eisplatte ohne MgCl₂ in dem Master-Mix erhaltene Ergebnis; Spur 3 ist das nach 90 Minuten bei Raumtemperatur auf einer vorgekühlten Platte mit 2,5 mM MgCl₂ in dem Master-Mix erhaltene Ergebnis; Spur 4 ist das nach 90 Minuten bei Raumtemperatur auf einer vorgekühlten Platte ohne MgCl₂ in dem Master-Mix erhaltene Ergebnis; Spur 5 ist das nach 180 Minuten auf einer eisgekühlten Platte mit 2,5 mM MgCl₂ in dem Master-Mix erhaltene Ergebnis; Spur 6 ist das nach 180 Minuten auf einer eisgekühlten Platte ohne MgCl₂ in dem Master-Mix erhaltene Ergebnis; Spur 7 ist das nach 180 Minuten bei Raumtemperatur mit 2,5 mM MgCl₂ in dem Master-Mix erhaltene Ergebnis; Spur 8 ist das nach 180 Minuten bei Raumtemperatur ohne MgCl₂ in dem Master-Mix erhaltene Ergebnis.
zeigt die längere Stabilität der Bulk-Formulierungen ohne MgCl₂ unter Verwendung von Influenza A als Marker. Die Amplifikationsreaktion, die als relative Fluoreszenzeinheiten (RFU) von Bulk-Reagenzien gemessen wurde, die bei Raumtemperatur für 3,75 und 7,75 Stunden inkubiert wurden, wurde mit einer frischen flüssigen Kontrolle verglichen, was die Stabilität des Bulk-Reagenzes bei Raumtemperatur für mehr als 7,75 Stunden bestätigte, wenn MgCl₂ aus dem Master-Mix ausgeschlossen wird.
zeigt die durchschnittliche Restfeuchte von lyophilisiertem Reagenz, die als relative Absorption von drei Formulierungen gemessen wurde, wie durch Fourier-Transform-Nahinfrarot(FT-nIR)-Spektroskopie bei einer Ortswellenlänge von 5170 cm^-1 (A₅₁₇₀) bestimmt wurde.
zeigt die Auswirkung von KCl-Konzentration auf die Restfeuchte, gemessen als Absorption.

DEFINITIONEN
Der Begriff „etwa“ zeigt eine unerhebliche Variierung einer Menge einer Komponente einer Zusammensetzung an, die keine wesentliche Wirkung auf die Aktivität oder Stabilität der Zusammensetzung ausübt.
Ein „Füllstoff“ stellt eine Matrix für die Ablagerung von Proteinen und anderen Reagenzien während der Trocknung und Lagerung bereit. (Carpenter et al. (2002) Rational design of stable lyophilized protein formulations. Kluwer Academic/Plenum, New York, S. 109-133). Füllstoffe können für die Bildung eines Produkt-„Kuchens“ oder einer anderen Struktur verwendet werden und können verhindern, dass Protein aus dem Gefäß während der Trocknung verloren geht, und Proteinstabilität erhöhen.
Ein Chelatbildner ist ein Mittel, das zweiwertige Ionen bindet, einschließlich zweiwertige Ionen wie Mg²⁺-Ionen oder Mn²⁺-Ionen, die für die Enzymaktivität erforderlich sind.
Die Begriffe „Lyophilisierung“, „lyophilisiert“ und „gefriergetrocknet“ beziehen sich auf ein Verfahren, durch das der zu trocknende Stoff zuerst gefroren wird und dann das Eis oder gefrorene Lösungsmittel durch Sublimation in einer Vakuumumgebung entfernt wird.
Der Begriff „stringent“ in Bezug auf Nukleinsäurehybridisierung (einschließlich „stringente Hybridisierungsbedingungen“ oder „stringente Bedingungen“) bezieht sich auf Bedingungen, wo ein spezifisches Oligonukleotid mit seinen Zielnukleinsäuren, vor anderen Nukleinsäuren, die in der Testprobe vorliegen, hybridisieren kann. Man wird einsehen, dass diese Bedingungen in Abhängigkeit von Faktoren variieren können, einschließlich des GC-Gehalts und der Länge des Oligonukleotids, der Hybridisierungstemperatur, der Zusammensetzung des Hybridisierungreagenzes oder der Lösung und des Grads der angestrebten Hybridisierungsspezifität. Geeignete Hybridisierungsbedingungen sind in der Technik für Sonden, Amplifikationsoligonukleotide, Zieleinfang-Oligonukleotide, Blocker und andere Oligonukleotide gut bekannt, können basierend auf Sequenzzusammensetzungen vorhergesagt werden oder können unter Verwendung von routinemäßigen Testverfahren bestimmt werden (z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), in den Abschnitten 1.90-1.91, 7.37-7.57, 9.47-9.51 und 11.47-11.57, insbesondere den Abschnitten 9.50-9.51, 11.12-11.13, 11.45-11.47 und 11.55-11.57).
Ein Amplifikationsoligomer ist ein Primer oder Promotor-Primer, der Templateabhängige Replikation einer Zielnukleinsäure unterstützen kann. Ein Amplifikationsoligomerenpaar ist ein Paar derartiger Oligomere, die Templateabhängige Replikation von gegenüberliegenden Strängen eines Templates unterstützen. Multiplex-Amplifikation ist eine Amplifikation, die gleichzeitig mit mehreren Amplifikationsoligomerenpaaren durchgeführt wird.
Eine Sonde ist ein Oligonukleotid, das mit einem Amplifikationsprodukt hybridisieren kann, um die Gegenwart oder Menge des Amplifikationsprodukts aufzuzeigen. Derartige Sonden enthalten häufig ein Molekül, das ein fluoreszierendes oder anderes detektierbares Signal abgibt, in welchem Fall sie als detektierbar markierte Sonden bezeichnet werden.
Eine Primer-Sonde-Gruppe ist eine Kombination von Primern und Sonde, die für die Erzeugung eines Amplifikationsprodukts aus einer Template-Nukleinsäure und Detektion eines Amplifikationsprodukts aus einer Template-Nukleinsäure konfiguriert ist.
Wie hierin verwendet, bezeichnet eine „Markierung“ eine Einheit oder Verbindung, die direkt oder indirekt mit einer Sonde oder mit einem dNTP verbunden ist, die/das detektierbar ist oder zu einem detektierbaren Signal führt. Eine direkte Markierung kann durch Bindungen oder Wechselwirkungen erfolgen, die die Markierung mit einer Sonde verknüpfen, einschließlich kovalenter Bindungen oder nichtkovalenter Wechselwirkungen, z. B. Wasserstoffbrückenbindungen, hydrophober und ionischer Wechselwirkungen oder Bildung von Chelaten oder Koordinationskomplexen. Eine indirekte Markierung kann durch die Verwendung einer verbrückenden Einheit oder eines „Linkers“ erfolgen, wie eines Bindungspaarglieds, eines Antikörpers oder zusätzlichen Oligomers, die/der entweder direkt oder indirekt markiert ist und die/der das detektierbare Signal verstärken kann. Markierungen schließen jedwede detektierbare Einheit ein, wie ein Radionuklid, einen Liganden (z. B. Biotin, Avidin), ein Enzym oder Enzymsubstrat, eine reaktive Gruppe oder ein Chromophor (z. B. Farbstoff, Partikel oder Kügelchen, der/das detektierbare Farbe verleiht), eine lumineszierende Verbindung (z. B. biolumineszierende, phophoreszierende oder chemilumineszierende Markierungen) oder ein Fluorophor. Markierungen können in einem homogenen Assay detektierbar sein, in dem gebundene markierte Sonde in einer Mischung eine detektierbare Veränderung zeigt, die sich von der einer ungebundenen markierten Sonde unterscheidet, z. B. Instabilität oder unterschiedliche Abbaueigenschaften. Die Synthese und Verfahren zur Anbringung von Markierungen an Nukleinsäuren und zur Detektion von Markierungen sind gut bekannt (z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Kapitel 10; US-Pat. Nr. 5,658,737 , 5,656,207 , 5,547,842 , 5,283,174 und 4,581,333 ). Mehr als eine Markierung oder mehr als eine Art von Markierung können an einer bestimmten Sonde vorliegen oder zur Detektion kann eine Mischung aus Sonden verwendet werden, in der jede Sonde mit einer Verbindung markiert ist, die ein detektierbares Signal erzeugt (z. B. US-Pat. Nr. 6,180,340 und 6,350,579 ).
„Rekonstitutionszeit“ ist die Zeit, die zur Rehydratisierung einer getrockneten Formulierung mit einer Lösung zur Bildung einer Lösung erforderlich ist. Bevorzugt, doch nicht immer in Abhängigkeit von der Formulierung, ist eine rekonstituierte Lösung eine, die für das bloße Auge keine Partikel oder Trübung erkennen lässt.
Relative Fluoreszenzeinheiten (RFU) sind ein Maß des Amplifikationsprodukts und folglich eines Nukleinsäureanalyten in einer Probe, der zu dem Amplifikationsprodukt führt.
Ct bezeichnet die Anzahl von Zyklen, die zum Erreichen der exponentiellen Phase in einer Echtzeit-PCR erforderlich waren. Ct steht im umgekehrten Verhältnis zur Menge an Analyt in einer Probe.
Positivität in Bezug auf Assay-Reaktionsergebnisse bezieht sich auf experimentelle Daten, die mit einer Probe erzeugt wurden und die einen Schwellenwert (wie zum Beispiel einen RFU-Wert) überschritten haben. Schwellenwerte werden von einem Anwender festgelegt und werden normalerweise basierend auf empirischen Daten, die für einen gegebenen Assay erhalten wurden, bestimmt. Normalerweise wird für Nukleinsäureamplifikationsassays ein Schwellenwert so festgelegt, dass positive Proben die Schwelle überschritten haben und in eine exponentielle Wachstumsphase des Assays gerückt sind. Positivitätswerte beziehen sich auf eine einzelne Probe, die den Schwellenwert überschritten hat, oder auf einen Prozentanteil einer Vielzahl von Proben, die den Schwellenwert überschritten haben. Beispielsweise wenn die Vielzahl von Proben zwölf Proben darstellt und wenn die Anzahl von Proben, die überschreiten, als sechs bestimmt wurde, beträgt die Positivität „50 %“. Der Schwellenwert wird häufig festgelegt, um Hintergrundwerte auszuschließen.
Eine „Einzeleinheitsdosis“ oder „SUD“ bezieht sich auf ein Volumen einer Reaktionsmischung, das zur Durchführung eines molekularen Assays mit einer einzelnen Probe verwendet wird. Eine Einzeleinheitsdosis kann in flüssiger Form oder in getrockneter Form vorliegen. Beispielshalber kann eine Einzeleinheitsdosis ein getrocknetes Pellet sein, das Reagenzien enthält, die für die Amplifikation einer einzelnen Probe in einem einzelnen Gefäß verwendbar sind.
LOD ist die Nachweisgrenze eines Analyten. LOD + 1 ist die LOD, die der Anwender detektiert hat, plus einem Log. Mit anderen Worten ist LOD + 1 das Zehnfache der Zahl an Analyten, die die LOD ist.
Bereiche von Werten hierin schließen alle ganzen Zahlen darin und, sofern praktikabel, alle Teilzahlen darin ein. Beispielsweise würde ein Bereich von pH-Werten von pH 2,0 bis pH 5,0 alle ganzen und Teilzahlen darin einschließen, während ein Längenbereich für ein Oligonukleotid von 23 bis 30 fortlaufenden Nukleotiden nur alle ganzen Zahlen darin einschließen würde.
Wann immer sich die Offenbarung auf eine Zusammensetzung bezieht, die spezifizierte Komponenten umfasst, sollte die Offenbarung so verstanden werden, dass sie auch Zusammensetzungen offenbart, die aus oder im Wesentlichen aus den spezifizierten Komponenten bestehen.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
I. Allgemeines
Die vorliegende Offenbarung stützt sich teilweise auf die Erkenntnis, dass Instabilität von zuvor lyophilisierten Kits für die Durchführung molekularer Assays, wie zum Beispiel Nukleinsäureamplifikationen, auf der Gegenwart von anorganischen Salzen beruht. Diese Salze können zu unerwünschten Hybridisierungsprodukten oder anderen Nebenprodukten vor, während und nach dem Trocknen führen. Diese Salze machen eine getrocknete Zusammensetzung auch hygroskopisch, sodass die Zusammensetzung aus ihrer Umgebung Wasser absorbiert. Somit ist aufgrund des Salzgehalts in einer getrockneten Zusammensetzung eine begrenzte Exposition gegenüber Feuchtigkeit, Kühlung oder Tiefkühllagerung und/oder Lagerung in Gegenwart eines Trockenmittels gefordert. Die Gegenwart von Wasser und Salzen verursacht den vorzeitigen Verlust an Aktivität der Polymerasekomponente der getrockneten Zusammensetzung und kann auch die Hybridisierung von Nukleinsäuren miteinander unterstützen. Die Gegenwart von Salzen kann auch das Vermögen zur Herstellung getrockneter Reagenzien, beispielsweise durch Lyophilisierung, verringern. Umgekehrt ist bekannt, dass die Abwesenheit von Salzen in einer Zusammensetzung, die Enzym enthält, zur Denaturierung der Enzymkomponente führt, sodass die Herstellung salzfreier Zusammensetzungen dieser Enzyme ebenfalls nicht wünschenswert ist. Die vorliegende Offenbarung hat diese Probleme durch Trocknen von Bulk-Reagenzien zur Ausführung von Nukleinsäure-basierter Reaktionsmischung aus Bulk-Reagenzien, die im Wesentlichen frei von anorganischen Salzen sind, überwunden. Derartige Salze werden bei Rekonstitution der getrockneten Zusammensetzung eingegeben. Wider Erwarten, dass anorganische Salze für die Stabilität von Polymerasen notwendig sind, wurde festgestellt, dass getrocknete Nukleinsäure-basierte Reaktionsmischungen, die im Wesentlichen frei von anorganischem Salz sind, langfristig über dem Gefrierpunkt, bei vollständiger oder wesentlicher Bewahrung von Aktivität bei Rekonstitution, gelagert werden können.
II. Bulk-Reagenzien & getrocknete Pellets.
Bulk-Reagenzien (manchmal als vorlyophilisierte Mischungen, Lösungen, wässrige Lösungen oder Zusammensetzungen bezeichnet) gemäß der Offenbarung schließen normalerweise Folgendes ein: eine Polymerase, Nukleotide für die Verwendung in einer Nukleinsäure-basierten Amplifikationsreaktion, einen organischen Puffer, bevorzugt Tris, und einen Füllstoff, wie zum Beispiel Trehalose oder Raffinose oder eine Kombination davon. Bulk-Reagenzien können auch eine oder mehrere Nukleinsäuren einschließen oder nicht. Bulk-Reagenzien können zusätzlich reverse Transkriptase-Enzyme, Chelatbildner und RNase-Inhibitoren einschließen. Der Begriff Bulk-Reagenz wird in Bezug auf eine wässrige Lösung wie vorstehend beschrieben verwendet, wobei die wässrige Lösung in zwei oder mehr Aliquoten aufgeteilt werden wird, die im Wesentlichen die gleichen Konzentrationen an Reagenzien aufweisen. Auch kann ein aliquotierter Teil des Bulk-Reagenzes als ein Bulk-Reagenz bezeichnet werden. Unabhängig vom Zusammenhang ist ein Bulk-Reagenz eine wässrige Lösung wie hierin beschrieben.
Derartige Bulk-Reagenzien sind im Wesentlichen frei von anorganischen Salzen, was bedeutet, dass die Konzentration an anorganischem Salz einzeln und insgesamt weniger als 7 mM und bevorzugt weniger als 1 mM beträgt. Bevorzugt beträgt die Konzentration an Mg²⁺ weniger als 1 mM, weniger als 0,5 mM, weniger als 0,1 mM oder weniger als 0,05 mM. Bevorzugt beträgt die Konzentration an Na⁺ weniger als 1 mM, weniger als 0,5 mM, weniger als 0,1 mM oder weniger als 0,05 mM. Bevorzugt beträgt die Konzentration an K⁺ weniger als 1 mM, weniger als 0,5 mM, weniger als 0,1 mM oder weniger als 0,05 mM. Bevorzugt beträgt die Konzentration an Cl- weniger als 1 mM, weniger als 0,5 mM, weniger als 0,1 mM oder weniger als 0,05 mM.
Bevorzugt beträgt die Konzentration an Mg²⁺ weniger als 1 mM und beträgt die Konzentration an Na⁺ weniger als 1 mM. Bevorzugt beträgt die Konzentration an Mg²⁺ weniger als 0,5 mM und beträgt die Konzentration an Na⁺ weniger als 0,5 mM. Bevorzugt beträgt die Konzentration an Mg²⁺ weniger als 0,1 mM und beträgt die Konzentration an Na⁺ weniger als 0,1 mM. Bevorzugt beträgt die Konzentration an Mg²⁺ weniger als 0,05 mM und beträgt die Konzentration an Na⁺ weniger als 0,05 mM.
Bevorzugt beträgt die Konzentration an Mg²⁺ weniger als 1 mM und beträgt die Konzentration an K⁺ weniger als 1 mM. Bevorzugt beträgt die Konzentration an Mg²⁺ weniger als 0,5 mM und beträgt die Konzentration an K⁺ weniger als 0,5 mM. Bevorzugt beträgt die Konzentration an Mg²⁺ weniger als 0,1 mM und beträgt die Konzentration an K⁺ weniger als 0,1 mM. Bevorzugt beträgt die Konzentration an Mg²⁺ weniger als 0,05 mM und beträgt die Konzentration an K⁺ weniger als 0,05 mM.
Bevorzugt beträgt die Konzentration an Mg²⁺ weniger als 1 mM und beträgt die Konzentration an Cl- weniger als 1 mM. Bevorzugt beträgt die Konzentration an Mg²⁺ weniger als 0,5 mM und beträgt die Konzentration an Cl- weniger als 0,5 mM. Bevorzugt beträgt die Konzentration an Mg²⁺ weniger als 0,1 mM und beträgt die Konzentration an Cl- weniger als 0,1 mM. Bevorzugt beträgt die Konzentration an Mg²⁺ weniger als 0,05 mM und beträgt die Konzentration an Cl- weniger als 0,05 mM.
Bevorzugt beträgt die Konzentration an Na⁺ weniger als 1 mM und beträgt die Konzentration an K⁺ weniger als 1 mM. Bevorzugt beträgt die Konzentration an Na⁺ weniger als 0,5 mM und beträgt die Konzentration an K⁺ weniger als 0,5 mM. Bevorzugt beträgt die Konzentration an Na⁺ weniger als 0,1 mM und beträgt die Konzentration an K⁺ weniger als 0,1 mM. Bevorzugt beträgt die Konzentration an Na⁺ weniger als 0,05 mM und beträgt die Konzentration an K⁺ weniger als 0,05 mM.
Bevorzugt beträgt die Konzentration an Na⁺ weniger als 1 mM und beträgt die Konzentration an Cl- weniger als 1 mM. Bevorzugt beträgt die Konzentration an Na⁺ weniger als 0,5 mM und beträgt die Konzentration an Cl- weniger als 0,5 mM. Bevorzugt beträgt die Konzentration an Na⁺ weniger als 0,1 mM und beträgt die Konzentration an Cl- weniger als 0,1 mM. Bevorzugt beträgt die Konzentration an Na⁺ weniger als 0,05 mM und beträgt die Konzentration an Cl- weniger als 0,05 mM.
Bevorzugt beträgt die Konzentration an K⁺ weniger als 1 mM und beträgt die Konzentration an Cl- weniger als 1 mM. Bevorzugt beträgt die Konzentration an K⁺ weniger als 0,5 mM und beträgt die Konzentration an Cl- weniger als 0,5 mM. Bevorzugt beträgt die Konzentration an K⁺ weniger als 0,1 mM und beträgt die Konzentration an Cl- weniger als 0,1 mM. Bevorzugt beträgt die Konzentration an K⁺ weniger als 0,05 mM und beträgt die Konzentration an Cl- weniger als 0,05 mM.
Bevorzugt beträgt die Konzentration an Mg²⁺ weniger als 1 mM und beträgt die Konzentration an Na⁺ weniger als 1 mM und beträgt die Konzentration an K⁺ weniger als 1 mM. Bevorzugt beträgt die Konzentration an Mg²⁺ weniger als 0,5 mM und beträgt die Konzentration an Na⁺ weniger als 0,5 mM und beträgt die Konzentration an K⁺ weniger als 0,5 mM. Bevorzugt beträgt die Konzentration an Mg²⁺ weniger als 0,1 mM und beträgt die Konzentration an Na⁺ weniger als 0,1 mM und beträgt die Konzentration an K⁺ weniger als 0,1 mM. Bevorzugt beträgt die Konzentration an Mg²⁺ weniger als 0,1 mM und beträgt die Konzentration an Na⁺ weniger als 0,1 mM und beträgt die Konzentration an K⁺ weniger als 0,1 mM. Bevorzugt beträgt die Konzentration an Mg²⁺ weniger als 0,05 mM und beträgt die Konzentration an Na⁺ weniger als 0,05 mM und beträgt die Konzentration an K⁺ weniger als 0,05 mM.
Bevorzugt beträgt die Konzentration an Na⁺ weniger als 1 mM und beträgt die Konzentration an K⁺ weniger als 1 mM und beträgt die Konzentration an Cl- weniger als 1 mM. Bevorzugt beträgt die Konzentration an Na⁺ weniger als 0,5 mM und beträgt die Konzentration an K⁺ weniger als 0,5 mM und beträgt die Konzentration an Clweniger als 0,5 mM. Bevorzugt beträgt die Konzentration an Na⁺ weniger als 0,1 mM und beträgt die Konzentration an K⁺ weniger als 0,1 mM und beträgt die Konzentration an Cl- weniger als 0,1 mM. Bevorzugt beträgt die Konzentration an Na⁺ weniger als 0,1 mM und beträgt die Konzentration an K⁺ weniger als 0,1 mM und beträgt die Konzentration an Cl- weniger als 0,1 mM. Bevorzugt beträgt die Konzentration an Na⁺ weniger als 0,05 mM und beträgt die Konzentration an K⁺ weniger als 0,05 mM und beträgt die Konzentration an Cl- weniger als 0,05 mM.
Bevorzugt beträgt die Konzentration an Mg²⁺ weniger als 1 mM und beträgt die Konzentration an K⁺ weniger als 1 mM und beträgt die Konzentration an Cl- weniger als 1 mM. Bevorzugt beträgt die Konzentration an Mg²⁺ weniger als 0,5 mM und beträgt die Konzentration an K⁺ weniger als 0,5 mM und beträgt die Konzentration an Cl- weniger als 0,5 mM. Bevorzugt beträgt die Konzentration an Mg²⁺ weniger als 0,1 mM und beträgt die Konzentration an K⁺ weniger als 0,1 mM und beträgt die Konzentration an Cl- weniger als 0,1 mM. Bevorzugt beträgt die Konzentration an Mg²⁺ weniger als 0,1 mM und beträgt die Konzentration an K⁺ weniger als 0,1 mM und beträgt die Konzentration an Cl- weniger als 0,1 mM. Bevorzugt beträgt die Konzentration an Mg²⁺ weniger als 0,05 mM und beträgt die Konzentration an K⁺ weniger als 0,05 mM und beträgt die Konzentration an Cl- weniger als 0,05 mM.
Bevorzugt beträgt die Konzentration an Mg²⁺ weniger als 1 mM und beträgt die Konzentration an Na⁺ weniger als 1 mM und beträgt die Konzentration an Cl- weniger als 1 mM. Bevorzugt beträgt die Konzentration an Mg²⁺ weniger als 0,5 mM und beträgt die Konzentration an Na⁺ weniger als 0,5 mM und beträgt die Konzentration an Cl- weniger als 0,5 mM. Bevorzugt beträgt die Konzentration an Mg²⁺ weniger als 0,1 mM und beträgt die Konzentration an Na⁺ weniger als 0,1 mM und beträgt die Konzentration an Cl- weniger als 0,1 mM. Bevorzugt beträgt die Konzentration an Mg²⁺ weniger als 0,1 mM und beträgt die Konzentration an Na⁺ weniger als 0,1 mM und beträgt die Konzentration an Cl- weniger als 0,1 mM. Bevorzugt beträgt die Konzentration an Mg²⁺ weniger als 0,05 mM und beträgt die Konzentration an Na⁺ weniger als 0,05 mM und beträgt die Konzentration an Cl- weniger als 0,05 mM.
Bevorzugt beträgt die Konzentration an Mg²⁺ weniger als 1 mM und beträgt die Konzentration an Na⁺ weniger als 1 mM und beträgt die Konzentration an K⁺ weniger als 1 mM und beträgt die Konzentration an Cl- weniger als 1 mM. Bevorzugt beträgt die Konzentration an Mg²⁺ weniger als 0,5 mM und beträgt die Konzentration an Na⁺ weniger als 0,5 mM und beträgt die Konzentration an K⁺ weniger als 0,5 mM und beträgt die Konzentration an Cl- weniger als 0,5 mM. Bevorzugt beträgt die Konzentration an Mg²⁺ weniger als 0,1 mM und beträgt die Konzentration an Na⁺ weniger als 0,1 mM und beträgt die Konzentration an K⁺ weniger als 0,1 mM und beträgt die Konzentration an Cl- weniger als 0,1 mM. Bevorzugt beträgt die Konzentration an Mg²⁺ weniger als 0,05 mM und beträgt die Konzentration an Na⁺ weniger als 0,05 mM und beträgt die Konzentration an K⁺ weniger als 0,05 mM und beträgt die Konzentration an Cl- weniger als 0,05 mM.
Nukleotide für den Einschluss in einer Amplifikationsreaktion werden normalerweise als dNTPs bereitgestellt. Beispielhafte Konzentrationen für dNTPs sind: 0,1 bis 0,3 mM an dATP; 0,1 bis 0,3 mM an dGTP; 0,1 bis 0,3 mM an dCTP; 0,2 bis 0,6 mM an dTTP; 0,2 bis 0,6 mM an dUTP; und bevorzugt etwa 0,2 mM an dATP; etwa 0,2 mM an dGTP; etwa 0,2 mM an dCTP und 0,4 mM dTTP oder dUTP. Nukleotide für den Einschluss in einer Amplifikationsreaktion können auch als markierte dNTPs bereitgestellt werden, wie sie für Sequenzierungsreaktionen verwendbar sind.
Derartige Mischungen können für verschiedene Arten von Amplifikation, einschließlich PCR, RT-PCR und transkriptionsvermittelter Amplifikation, durch die Wahl von Enzym und anderen Komponenten angepasst werden.
DNA-Polymerase-Enzyme sind kommerziell erhältlich oder können von einem Anwender hergestellt werden. Ein Beispiel eines Polymerase-Enzyms ist eine Taq-Polymerase, die kommerziell von Qiagen erhältlich ist (Germantown, MD, Kat.-Nr. 201203). Ein weiteres Beispiel einer Taq-Polymerase ist kommerziell als GoTaq® G2 Flexi DNA Polymerase erhältlich (Promega, Madison, WI, Kat.-Nr. M7801). Andere DNA-Polymerasen, die kommerziell erhältlich sind, schließen folgende ein, doch sind nicht beschränkt auf Tth DNA Polymerase (z. B. Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Kat.-Nr. 11480022001) und chimäre DNA-Polymerasen, wie zum Beispiel Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (NEB, Ipswich, MA, Kat.-Nr. M0530S). Ebenfalls kommerziell erhältlich sind Hot-Start-DNA-Polymerase-Enzyme. Beispielsweise ist eine Taq-Polymerase kommerziell als GoTaq® Hot Start Polymerase (Promega, Kat.-Nr. M5001) erhältlich. Die GoTaq® Hot Start Polymerase ist ein antikörpervermitteltes Hot-Start-Enzym, bei dem die Taq-Polymerase an einen Antikörper gebunden ist, der Polymeraseaktivität blockiert. Der blockierende Antikörper wird unter Verwendung von großer Hitze denaturiert, somit während des Aufheizschritts am Anfang einer PCR-Reaktion, der Antikörper wird denaturiert und die Polymeraseaktivität wiederhergestellt. Es können verschiedene Antikörper mit dem Hot-Start-Verfahren verwendet werden, beispielsweise TAQSTART Antikörper (Clontech Laboratories, Mountain View, CA, Kat-Nr. R028A). Ebenso sind andere Hot-Start-Polymerase-Enzyme erhältlich, einschließlich chemisch vermittelter Hot-Start-Polymerasen. Entsprechende Polymerase und Antikörper sind von einer Vielzahl von kommerziellen Quellen erhältlich und können alternativ von dem Anwender hergestellt werden.
Reverse-Transkriptase-Enzyme sind kommerziell erhältlich oder können von einem Anwender hergestellt werden. Beispiele von kommerziell erhältlicher reverser Transkriptase schließen Folgende ein, doch sind nicht beschränkt auf: MMLV (Maloney Murine Leukemia Virus) Reverse Transcriptase & SuperScript® III Reverse Transcriptase (z. B. ThermoFisher Scientific, Carlsbad, CA, Kat.-Nr. 28025-013 & 18080-044), MMLV RT (Sigma-Aldrich, Kat.-Nr. M1302), AMV Reverse Transcriptase (NEB, Ipswich, MA, Kat.-Nr. M0277S) und GoScript™ Reverse Transcriptase (Promega, Kat.-Nr. A50003). GoScript Reverse Transcriptase schließt eine reverse Transkriptase und eine Reihe von Reagenzien für die Synthese von Erststrang-cDNA ein, die für quantitative PCR-Amplifikation optimiert ist. Entsprechende reverse Transkriptase und Reagenzien sind von verschiedenen kommerziellen Quellen erhältlich und können alternativ von dem Anwender hergestellt werden.
Beispielhafte Konzentrationen für DNA-Polymerase-Enzym in Einzeleinheitsdosen sind 0,01-1,0 U/ul. Beispielsweise 0,32 U/ul oder 0,4 U/ul oder 0,72 U/ul oder 0,32-0,4 U/ul oder 0,4-0,72 U/ul oder 0,05-0,3 U/ul oder 0,8-1,0 U/ul. Eine Einheit von DNA-Polymerase ist als die Menge an Enzym definiert, die zur Katalyse des Einbaus von 10 Nanomol an dNTPs in säureunlöslichen Stoff in 30 Minuten bei 74 °C erforderlich ist. Beispielhafte Konzentrationen für das reverse-Transkriptase-Enzym in Einzeleinheitsdosen sind 0,01 U/ul-1,0 U/ul. Eine Einheit von reverser Transkriptase ist als die Menge an Enzym definiert, die zur Katalyse des Transfers von 1 nmol an Desoxynukleotid in durch Säure ausfällbaren Stoff in 10 Minuten bei 37 °C erforderlich ist.
Ein bevorzugter organischer Puffer ist Tris. Alternative organische Puffer, die in den Bulk-Reagenzien der Offenbarung eingeschlossen werden können, schließen Phosphat, Citrat, Acetat, CHES, Histidin und Goodsche Puffer, wie zum Beispiel HEPES, MES, MOPS, Tricin und Glycinamid, sowie Pufferkombinationen ein. Andere organische Puffer schließen Succinat, Citrat, Gluconat, Phosphat und dergleichen ein. Bevorzugte Puffer sind in einem pH-Bereich von etwa 5,5 bis etwa 7,0 oder etwa 6,0 bis etwa 7,5, bevorzugt bei einem pH von etwa 6,5 wirksam. Beispiele für Puffer, die den pH in diesem Bereich kontrollieren, schließen Succinat (wie zum Beispiel Natriumsuccinat), Gluconat, Histidin, Citrat und andere organische Säurepuffer ein.
Bevorzugte Füllstoffe sind Trehalose oder Raffinose oder eine Kombination davon. Andere Füllstoffe, die verwendet werden können, schließen Saccharose, Mannitol, Trehalose zuzüglich Mannitol, Saccharose zuzüglich Mannitol, Saccharose zuzüglich Glycin und Hydroxyethylstärke ein. Siehe Cleland et al. (2001) J. Pharm. Sci. 90:310; Meyer et al. (2009) Eur. J. Pharm. Sci. 38:29; Webb et al. (2003) J. Pharm. Sci. 92: 715; Garzon Rodrigues et al. (2004) J. Pharm. Sci. 93:684; Qiu et al. (2012) Int. J. Pharmaceuticals. 437:51; Van Dijk-Wolthuis et al. (1997) Polymer. 38:6235 6242. Hydroxyethylstärke wird in Hetastärke, Hexastärke, Pentastärke und Tetrastärke eingeteilt (siehe z. B. WO2014/099198 von Chow). Der Füllstoff liegt bevorzugt in einer Konzentration von folgenden vor: 0,16 M bis 0,32 M oder alternativ bei 0,04 bis 0,12 M, 0,08 bis 0,16 M, 0,12 bis 0,20 M, 0,16 bis 0,24 M, 0,20 bis 0,28 M, 0,24 bis 0,32 M, 0,28 bis 0,36 M, 0,32 bis 0,40 M oder jedweder Kombination der Bereiche, wie zum Beispiel 0,08 bis 0,24 M.
Bulk-Reagenzien können eine mehrere Nukleinsäuren einschließen, wie zum Beispiel Amplifikationsoligomere (z. B. Primer, T7-Promotoroligonukleotide), Einfang-Sonden, Detektionssonden, Taqman-Sonden, Haarnadel-Detektionssonden, Adapter, Haarnadel-Adapter, Positivkontroll-Template und Negativkontroll-Template.
Optionale zusätzliche Komponenten eines Bulk-Reagenzes schließen Folgende ein: RNase-Inhibitor, PCR-Reagenzien, Detergenzien, zwitterionische Detergenzien, anionische Detergenzien, kationische Detergenzien, nichtionische Detergenzien, Tenside, Primer, Sonden, Template, Chelatbildner, Methylparaben und Propylparaben. Eine beispielhafte Konzentration für Methylparaben ist 0,01- 0,024 Gewichts-%, beispielsweise etwa 0,016 % oder alternativ etwa 0,010 %, etwa 0,014 %, etwa 0,016 %, etwa 0,020 %, etwa 0,024 % und jedwede Bereiche, die von diesen Werten eingegrenzt werden. Ein beispielhafter Konzentrationsbereich für Propylparaben ist 0,002-0,016 % oder 0,008 % oder alternativ etwa 0,002 %, etwa 0,004 %, etwa 0,006 %, etwa 0,008 %, etwa 0,010 %, etwa 0,012 %, etwa 0,014 %, etwa 0,016 % oder jedweder Bereich, der von diesen Werten eingegrenzt wird. Eine Einheit ist als die Menge an RNasin^® Ribonuklease Inhibitor definiert, die zur Inhibierung der Aktivität von 5 ng Ribonuklease A um 50% erforderlich ist. Die Aktivität wird durch die Inhibierung der Hydrolyse von cyclischem Cytidin-2',3'-monophosphat durch Ribonuklease A gemessen.
Chelatbildner schließen einen oder mehrere von Folgenden ein: EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure), EGTA (Ethylenglycol-bis((3-aminoethylether)-N,N,N`,N`-tetraessigsäure), EDDS (Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäure), MGDA (Methylglycindiessigsäure) und DTPA (Diethylentriaminpentaessigsäure. Beispielhafte Konzentrationen für Chelatbildner sind von 1,0 mM-2,5 mM.
RNase-Inhibitor-Proteine sind nativ und rekombinant, sind 50-kDa-Proteine, die RNase-A-Familie und humane plazentale RNasen durch nichtkovalente Bindung zu RNasen in einem 1 : 1-Verhältnis inhibieren (Promega Corp., Madison, WI). Siehe Botella-Estrada et al. (2001) Cancer Gene Ther. 8:278; Polakowski et al. (1992) EXS. 61:428. RNase-Inhibitor-Proteine können entweder ein rekombinantes oder ein natives Protein sein. Beispielhafte Konzentrationen an RNase-Inhibitor sind etwa 0,04 U/ul bis etwa 0,4 U/ul.
Bulk-Reagenzien können Detergenz in niedriger Konzentration enthalten. Detergenzien schließen ionische (kationische oder anionische), nichtionische und zwitterionische Detergenzien ein, die von etlichen kommerziellen Anbietern (z. B. Geno Technology, Inc., St. Louis, MO) erhältlich sind. Beispiele schließen folgende ein, doch sind nicht beschränkt auf: Lithiumlaurylsulfat, Amproliumhydrochlorid, Benzalkoniumchlorid, Cholin-p-toluolsulfonat-Salz, Dodecyltrimethylammoniumchlorid, 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat, Ethylhexadecyldimethylammoniumbromid, Hexadecylpyridiniumchlorid, Hexadecyltrimethylammoniumchlorid, Natriumdodecylsulfat, Hexadecyltrimethylammonium-p-toluolsulfonat, Luviquat™, Methylbenzethoniumchlorid, Myristyltrimethylammoniumbromid, N,N',N'-Polyoxyethylen-(10)-N-talg-1,3-diaminopropan-Flüssigkeit, Oxyphenoniumbromid, Tetraheptylammoniumbromid, Tetrakis(decyl)ammoniumbromid, Tricaprylylmethylammoniumchlorid, Amidosulfobetain-16, Tridodecylmethylammoniumchlorid, Trimethyloctadecylammoniumbromid, Nonidet P-40^®, Tween-20^®, Tween-80^®, Brij-35^®, Triton X-100^®.
Beispielhafte Volumen eines Bulk-Reagenzes schließen folgende ein: etwa 1 ul, etwa 5 ul, etwa 10 ul, etwa 20 ul, etwa 24 ul, etwa 50 ul, etwa 100 ul, etwa 200 ul, etwa 300 ul, etwa 400 ul, etwa 500 ul, etwa 600 ul, etwa 700 ul, etwa 800 ul, etwa 900 ul, etwa 1 000 ul (1 ml), etwa 2 ml, etwa 5 ml, etwa 10 ml, etwa 20 ml, etwa 50 ml und so weiter. Beispielhafte Volumen einer Einzeleinheitsdosis schließen von etwa 1 ul bis etwa 1 ml ein. Rekonstituierte getrocknete Zusammensetzungen können in dem gleichen flüssigen Volumen, wie es zur Bildung der getrockneten Zusammensetzung verwendet wird, in einem niedrigeren Volumen oder in einem größeren Volumen gebildet werden. Ein niedrigeres Volumen kann etwa 90 %, etwa 80 %, etwa 60 %, etwa 40 %, etwa 20 %, etwa 10 % oder etwa 5 %, bezüglich der Bulk-Reagenzien, betragen. Ein größeres Volumen kann etwa 120 %, 140 %, 160 %, 180 %, 200 % (2-Fache), das etwa 4-Fache, etwa 6-Fache, etwa 8-Fache, etwa 10-Fache, etwa 20-Fache der Bulk-Reagenzien betragen.
Eine zu analysierende Probe kann zu den Bulk-Reagenzien entweder vor Rekonstitution, gleichzeitig mit Rekonstitution oder nach Rekonstitution zugegeben werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die gesamte getrocknete Zusammensetzung nach Rekonstitution für das Vereinigen mit der Probe verwendet, und dabei können die relativen Volumen von Rekonstitutionslösung/Probe beispielsweise etwa 9,9/0,1, 9,8/0,2, 9,5/0,5, 9/1, 8/2, 7/3, 6/4, 5/5 und so weiter betragen.
Falls nicht anders angegeben, können die Konzentrationen von Reagenzien in Bulk-Reagenzien beispielsweise Folgendes betragen: 0,0 % (ein weggelassenes Reagenz), 0,001 %, 0,004 %, 0,008 %, 0,0012 %, 0,0016 %, 0,0020 %, 0,0030 %, 0,0040 %, 0,0050 %, 0,0060 %, 0,0080 %, 0,01 %, 0,02 %, 0,04 %, 0,06 %, 0,1 %, 0,2 %, 0,3 %, 0,4 %, 0,5 %, 0,6 %, 0,8 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 % und desgleichen. Auch werden Reagenzien bereitgestellt, die in „etwa“ den vorstehenden Konzentrationen, in weniger als den vorstehenden Konzentrationen, in mehr als den vorstehenden Konzentrationen und Bereichen, die jedwede zwei der vorstehenden Konzentrationen einbeziehen, vorliegen.
Eine beispielhafte Bulk-Reagenzzusammensetzung weist 0,1-0,3 mM und bevorzugter 0,2 mM dATP, dGTP und dCTP sowie 0,2-0,6 mM und bevorzugter 0,4 mM dUTP oder dTTP und 0,3-0,8 U/µl Polymerase auf. In einigen Zusammensetzungen ist die Polymerase eine Hot-Start-Taq-Polymerase. In einigen Zusammensetzungen ist die Polymerase eine GoTaq^®MDx Hot-Start-Polymerase. Einige Zusammensetzungen schließen auch RNAasin^® RNAase-Inhibitor in 0,12-0,20 U/µl ein. Einige Zusammensetzungen schließen auch EDTA, optional als 1,5-2,0 mM, ein. Eine derartige Zusammensetzung schließt auch Trehalose als 0,16-0,32 M, EDTA als 1,5-2,0 mM ein, und die Polymerase ist Taq in 0.3-0.45 U/µL.
Die vorliegende Offenbarung stellt Reagenzien für PCR-Reaktionen, einschließlich Echtzeit-PCR-Reaktionen, bereit. (Real-time PCR Handbook, Life Technologies (2014); Kutyavin et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28:655; Afonina et al. (2002) Biotechniques. 32:940). In Echtzeit-PCR wird Magnesiumsalz normalerweise in einer Endkonzentration von 3-6 mM verwendet (Real-time PCR Handbook, oben). In einigen Ausführungsformen stellt die Offenbarung Reagenzien für Multiplex-PCR-Reaktionen bereit, das heißt wo eine Vielzahl von Primer-Paaren für die Amplifikation und Detektion einer Vielzahl von Zielen bereitgestellt wird. Die Offenbarung stellt Primer und Sonden für PCR-Reaktionen bereit. Primer und/oder Sonden umfassen Ziel-Hybridisierungssequenzen und können weiter eine oder mehrere von Nicht-Ziel-Hybridisierungssequenzen, Nukleotidanaloga, nachweisbaren Einheiten und Nicht-Nukleotid-Linkern umfassen (siehe z. B. WO 2010/151566 und WO 2013/126793 ). Thermocycler sind erhältlich (Applied Biosystems ProFlex^® PCR System und Veriti^® Thermal Cycler). Gel-Scanner für die Quantifizierung von PCR-Produkten sind erhältlich (Agilent^® 2100 Bioanalyzer^®, Bio-Rad^® Densitometer).
Nach der Bildung eines Bulk-Reagenzes kann es bei Raumtemperatur für eine erhebliche Zeitdauer vor dem Trocknen stehen gelassen werden. Die Zeitdauer kann bis zu 8 Std., bevor der Trocknungsschritt begonnen wird, oder alternativ bis zu 1 Std., bis zu 2 Std., bis zu 4 Std., bis zu 6 Std., bis zu 10 Std., bis zu 12 Std., bis zu 14 Std., bevor der Trocknungsschritt begonnen wird, betragen. Der Einschluss von Salzen in dem Bulk-Reagenz führt zu unerwünschten Hybridisierungsprodukten und anderen Nebenprodukten während dieser Inkubationszeit. Derartige unerwünschte Hybridisierungs- und Nebenprodukte werden durch Bildung der Bulk-Reagenzzusammensetzung mit einer Konzentration an anorganischem Salz von 7 mM oder weniger, beispielsweise im Wesentlichen ohne anorganisches Salz, gemäß der vorliegenden Offenbarung verringert oder eliminiert.
Die Gegenwart von anorganischen Salzen in einem Bulk-Reagenz führt zu einer oder mehreren der folgenden unerwünschten Eigenschaften. Nukleinsäuren können miteinander hybridisieren, wobei die Hybridisierung durch die Gegenwart von anorganischen Salzen, wie zum Beispiel Kalium, Natrium, Mangan, Magnesium und/oder Chlorid gefördert wird. Ebenso kann in Gegenwart von anorganischen Salzen, wie Mangan und Magnesium, unerwünschte Enzymaktivität auftreten, wie zum Beispiel Polymerase-Prozessivität und/oder die Depletion von Triphosphaten. Derartige unerwünschte Aktivität kann mit Nicht-Hot-Start-Enzymen und mit Hot-Start-Enzymen auftreten. Infolge von Nukleinsäurehybridisierung und Enzymaktivität in Gegenwart von Salz kann die Bildung von unerwünschten Nebenprodukten beginnen. Außerdem sind anorganische Salze hygroskopisch und werden Feuchtigkeit in ein getrocknetes Pellet ziehen. Die Rehydratisierung des getrockneten Pellets verringert die Lagerstabilität, Enzymstabilität und ermöglicht die Bildung zusätzlicher störender Nebenprodukte.
Ein getrocknetes Pellets kann Reagenzien enthalten, um eine Einzeleinheitsdosis (SUD) oder optional zwei oder mehr SUDs bereitzustellen. Eine Einzeleinheitsdosis ist eine Ansammlung von Reagenzien, die für die Durchführung einer Amplifikation und/oder einer Detektionsreaktion an nicht mehr als einer Einzelprobe notwendig sind. Einzeleinheitsdosis kann sich auf ein flüssiges Reagenz oder ein getrocknetes Pellet beziehen. Es ist bemerkenswert, dass eine Einzeleinheitsdosis, wie hierin bezeichnet, nicht alle der Reagenzien enthalten muss, um eine Amplifikations- und/oder Detektionsreaktion mit einer Einzelprobe durchzuführen. In einer Einzeleinheitsdosis kann ein Reagenz, das für die Durchführung von Amplifikations- und/oder Detektionsreaktionen benötigt wird, fehlen. Ebenso kann eine Einzeleinheitsdosis eine unzureichende Menge eines Reagenz für die Durchführung von Amplifikations- und/oder Detektionsreaktionen enthalten. Lediglich beispielshalber kann ein getrocknetes Einzeleinheitsdosis-Pellet angemessene Einheiten von Taq-Polymerase für die Durchführung einer Amplifikationsreaktion umfassen, doch könnte kein Magnesium enthalten. In bestimmten Ausführungsformen kann EDTA zu dem getrockneten Einzeleinheitsdosis-Pellet zugegeben werden, um überschüssige zweiwertige Ionen (z. B. Magnesium und/oder Mangan), die in einem Pellet vorliegen können oder durch eine Rekonstitutionslösung zugegeben werden, zu chelatisieren. In einem Beispiel wie diesem kann das Magnesium und/oder Mangan anschließend zu dem getrockneten Einzeleinheitsdosis-Pellet zugegeben werden, wie zum Beispiel durch eine Rekonstitutionslösung. Auch nur beispielshalber kann eine getrocknete Einzeleinheitsdosis eine unangemessene Menge an dNTPs für die Durchführung einer Amplifikationsreaktion umfassen. In einem Beispiel wie diesem kann der Rest der dNTPs zu dem getrockneten Einzeleinheitsdosis-Pellet zugegeben werden, wie zum Beispiel durch eine Rekonstitutionslösung. Ein Fachmann im Besitz dieser Offenbarung wird ohne Weiteres SUDs und getrocknete pelletierte SUDs mit verschiedenen Zusammensetzungen erzeugen, da diese Beispiele nicht einschränkend sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein Bulk-Reagenz 7 mM oder weniger an Gehalt des anorganischen Salzes, bevorzugter 6 mM oder weniger an Gehalt des anorganischen Salzes, bevorzugter 5 mM oder weniger an Gehalt des anorganischen Salzes, bevorzugter 4 mM oder weniger an Gehalt des anorganischen Salzes, bevorzugter 3 mM oder weniger an Gehalt des anorganischen Salzes, bevorzugter 2 mM oder weniger an Gehalt des anorganischen Salzes, bevorzugter 1 mM oder weniger an Gehalt des anorganischen Salzes oder bevorzugter 500 uM oder weniger an Gehalt des anorganischen Salzes. Somit reicht ein bevorzugter Konzentrationsbereich an anorganischem Salz in einem Bulk-Reagenz von etwa 0 mM bis 7 mM Gehalt an anorganischem Salz. Ein weiterer bevorzugter Konzentrationsbereich an anorganischem Salz in einem Bulk-Reagenz reicht von etwa 0 mM bis 6 mM Gehalt an anorganischem Salz. Ein weiterer bevorzugter Konzentrationsbereich an anorganischem Salz in einem Bulk-Reagenz reicht von etwa 0 mM bis 7 mM Gehalt an anorganischem Salz. Ein weiterer bevorzugter Konzentrationsbereich an anorganischem Salz in einem Bulk-Reagenz reicht von etwa 0 mM bis 4 mM Gehalt an anorganischem Salz. Ein weiterer bevorzugter Konzentrationsbereich an anorganischem Salz in einem Bulk-Reagenz reicht von etwa 0 mM bis 3 mM Gehalt an anorganischem Salz. Ein weiterer bevorzugter Konzentrationsbereich an anorganischem Salz in einem Bulk-Reagenz reicht von etwa 0 mM bis 2 mM Gehalt an anorganischem Salz. Ein weiterer bevorzugter Konzentrationsbereich an anorganischem Salz in einem Bulk-Reagenz reicht von etwa 0 mM bis 1 mM Gehalt an anorganischem Salz. Ein weiterer bevorzugter Konzentrationsbereich an anorganischem Salz in einem Bulk-Reagenz reicht von etwa 0 mM bis 0,5 mM Gehalt an anorganischem Salz. Gebräuchliche anorganische Salze für Amplifikations- und Detektionsreaktionsmischungen schließen eines oder mehrere von Natrium, Kalium, Mangan, Magnesium und Chlorid ein, um nur einige zu nennen.
In einem Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz 5 mM oder weniger an anorganischem Salz und liegen die anorganischen Salze in einer Masse pro Mikroliter von 0,373 ug/ul oder weniger oder 0,332 ug/ul oder weniger oder 0,292 ug/ul oder weniger vor. In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz 5 mM oder weniger an anorganischem Salz und liegt das Natriumchlorid in einer Masse pro Mikroliter von 0,292 ug/ul oder weniger oder von 0,146 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor. In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz 5 mM oder weniger an anorganischem Salz und liegt das Natrium in einer Masse pro Mikroliter von 0,115 ug/ul oder weniger, von 0,057 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor. In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz 5 mM oder weniger an anorganischem Salz und liegt das Kaliumchlorid in einer Masse pro Mikroliter von 0,373 ug/ul oder weniger, von 0,186 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor. In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz 5 mM oder weniger an anorganischem Salz und liegt das Kalium in einer Masse pro Mikroliter von 0,196 ug/ul oder weniger, von 0,098 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor. In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz 5 mM oder weniger an anorganischem Salz und liegt das Chlorid in einer Masse pro Mikroliter von 0,355 ug/ul oder weniger, von 0,178 ug/ul oder weniger, von 0,089 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor.
In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz 5 mM oder weniger an anorganischem Salz und liegt das Natriumchlorid in einer Masse pro Mikroliter von 0,292 ug/ul oder weniger, von 0,146 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor und liegt das Natrium in einer Masse pro Mikroliter von 0,115 ug/ul oder weniger, von 0,057 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor und liegt das Kaliumchlorid in einer Masse pro Mikroliter von 0,373 ug/ul oder weniger, von 0,186 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor und liegt das Kalium in einer Masse pro Mikroliter von 0,196 ug/ul oder weniger, von 0,098 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor und liegt das Chlorid in einer Masse pro Mikroliter von 0,355 ug/ul oder weniger, von 0,178 ug/ul oder weniger, von 0,089 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor.
In einem weiteren Aspekt wird ein getrocknetes Pellet durch Trocknen eines flüssigen Bulk-Reagenzes, das 5 mM oder weniger eines anorganischen Salzes umfasst, hergestellt und betragen die Masseprozente des anorganischen Salzes zur Masse des Pellets 0,311 % oder weniger, 0,277 % oder weniger oder 0,244 % oder weniger. In einem weiteren Aspekt wird ein Gefäß bereitgestellt, das ein getrocknetes Einzeleinheitsdosis-Pellet mit Masseprozenten an anorganischem Salz zur Masse des Pellets von 0,311 % oder weniger, 0,277 % oder weniger oder 0,244 % oder weniger enthält. In einem weiteren Aspekt wird eine Multiwellplatte bereitgestellt, die ein oder mehrere Wells umfasst, wobei jedes des einen oder der mehreren Wells ein getrocknetes Einzeleinheitsdosis-Pellet umfasst, das Masseprozente an anorganischem Salz zur Masse des Pellets von 0,311 % oder weniger, 0,277 % oder weniger oder 0,244 % oder weniger enthält.
In einem Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz 4 mM oder weniger an anorganischem Salz, liegen die anorganischen Salze in einer Masse pro Mikroliter von 0,298 ug/ul oder weniger oder 0,266 ug/ul oder weniger oder 0,234 ug/ul oder weniger vor. In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz 4 mM oder weniger an anorganischem Salz und liegt das Natriumchlorid in einer Masse pro Mikroliter von 0,234 ug/ul oder weniger, von 0,117 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor. In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz 4 mM oder weniger an anorganischem Salz und liegt das Natrium in einer Masse pro Mikroliter von 0,092 ug/ul oder weniger, von 0,046 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor. In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz 4 mM oder weniger an anorganischem Salz und liegt das Kaliumchlorid in einer Masse pro Mikroliter von 0,298 ug/ul oder weniger, von 0,149 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor. In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz 4 mM oder weniger an anorganischem Salz und liegt das Kalium in einer Masse pro Mikroliter von 0,156 ug/ul oder weniger, von 0,078 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor. In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz 4 mM oder weniger an anorganischem Salz und liegt das Chlorid in einer Masse pro Mikroliter von 0,284 ug/ul oder weniger, von 0,142 ug/ul oder weniger, von 0,071 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor.
In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz 4 mM oder weniger an anorganischem Salz und liegt das Natriumchlorid in einer Masse pro Mikroliter von 0,234 ug/ul oder weniger, von 0,117 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor und liegt das Natrium in einer Masse pro Mikroliter von 0,092 ug/ul oder weniger, von 0,046 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor und liegt das Kaliumchlorid in einer Masse pro Mikroliter von 0,298 ug/ul oder weniger, von 0,149 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor und liegt das Kalium in einer Masse pro Mikroliter von 0,156 ug/ul oder weniger, von 0,078 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor und liegt das Chlorid in einer Masse pro Mikroliter von 0,284 ug/ul oder weniger, von 0,142 ug/ul oder weniger, von 0,071 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor.
In einem weiteren Aspekt wird ein getrocknetes Pellet durch Trocknen eines flüssigen Bulk-Reagenzes, das 4 mM oder weniger eines anorganischen Salzes umfasst, hergestellt und betragen die Masseprozente des anorganischen Salzes zur Masse des Pellets 0,249 % oder weniger, 0,222 % oder weniger oder 0,195 % oder weniger. In einem weiteren Aspekt wird ein Gefäß bereitgestellt, das ein getrocknetes Einzeleinheitsdosis-Pellet mit Masseprozenten an anorganischem Salz zur Masse des Pellets von 0,249 % oder weniger, 0,222 % oder weniger oder 0,195 % oder weniger enthält. In einem weiteren Aspekt wird eine Multiwellplatte bereitgestellt, die ein oder mehrere Wells umfasst, wobei jedes des einen oder der mehreren Wells ein getrocknetes Einzeleinheitsdosis-Pellet umfasst, das Masseprozente an anorganischem Salz zur Masse des Pellets von 0,249 % oder weniger, 0,222 % oder weniger oder 0,195 % oder weniger enthält.
In einem Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz 3 mM oder weniger an anorganischem Salz, liegen die anorganischen Salze in einer Masse pro Mikroliter von 0,224 ug/ul oder weniger oder 0,199 ug/ul oder weniger oder 0,175 ug/ul oder weniger vor. In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz 3 mM oder weniger an anorganischem Salz und liegt das Natriumchlorid in einer Masse pro Mikroliter von 0,175 ug/ul oder weniger, von 0,088 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor. In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz 3 mM oder weniger an anorganischem Salz und liegt das Natrium in einer Masse pro Mikroliter von 0,069 ug/ul oder weniger, von 0,034 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor. In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz 3 mM oder weniger an anorganischem Salz und liegt das Kaliumchlorid in einer Masse pro Mikroliter von 0,224 ug/ul oder weniger, von 0,112 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor. In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz 3 mM oder weniger an anorganischem Salz und liegt das Kalium in einer Masse pro Mikroliter von 0,117 ug/ul oder weniger, von 0,059 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor. In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz 3 mM oder weniger an anorganischem Salz und liegt das Chlorid in einer Masse pro Mikroliter von 0,213 ug/ul oder weniger, von 0,107 ug/ul oder weniger, von 0,053 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor.
In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz 3 mM oder weniger an anorganischem Salz und liegt das Natriumchlorid in einer Masse pro Mikroliter von 0,175 ug/ul oder weniger, von 0,088 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor und liegt das Natrium in einer Masse pro Mikroliter von 0,069 ug/ul oder weniger, von 0,034 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor und liegt das Kaliumchlorid in einer Masse pro Mikroliter von 0,224 ug/ul oder weniger, von 0,112 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor und liegt das Kalium in einer Masse pro Mikroliter von 0,117 ug/ul oder weniger, von 0,059 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor und liegt das Chlorid in einer Masse pro Mikroliter von 0,213 ug/ul oder weniger, von 0,107 ug/ul oder weniger, von 0,053 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor.
In einem weiteren Aspekt wird ein getrocknetes Pellet durch Trocknen eines flüssigen Bulk-Reagenzes, das 3 mM oder weniger eines anorganischen Salzes umfasst, hergestellt und betragen die Masseprozente des anorganischen Salzes zur Masse des Pellets 0,186 % oder weniger, 0,166 % oder weniger oder 0,146 % oder weniger. In einem weiteren Aspekt wird ein Gefäß bereitgestellt, das ein getrocknetes Einzeleinheitsdosis-Pellet mit Masseprozenten an anorganischem Salz zur Masse des Pellets von 0,186 % oder weniger, 0,166 % oder weniger oder 0,146 % oder weniger enthält. In einem weiteren Aspekt wird eine Multiwellplatte bereitgestellt, die ein oder mehrere Wells umfasst, wobei jedes des einen oder der mehreren Wells ein getrocknetes Einzeleinheitsdosis-Pellet umfasst, das Masseprozente an anorganischem Salz zur Masse des Pellets von 0,186 % oder weniger, 0,166 % oder weniger oder 0,146 % oder weniger enthält.
In einem Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz 2 mM oder weniger an anorganischem Salz, liegen die anorganischen Salze in einer Masse pro Mikroliter von 0,149 ug/ul oder weniger oder 0,133 ug/ul oder weniger oder 0,117 ug/ul oder weniger vor. In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz 2 mM oder weniger an anorganischem Salz und liegt das Natriumchlorid in einer Masse pro Mikroliter von 0,117 ug/ul oder weniger, von 0,058 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor. In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz 2 mM oder weniger an anorganischem Salz und liegt das Natrium in einer Masse pro Mikroliter von 0,046 ug/ul oder weniger, von 0,023 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor. In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz 2 mM oder weniger an anorganischem Salz und liegt das Kaliumchlorid in einer Masse pro Mikroliter von 0,149 ug/ul oder weniger, von 0,075 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor. In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz 2 mM oder weniger an anorganischem Salz und liegt das Kalium in einer Masse pro Mikroliter von 0,078 ug/ul oder weniger, von 0,039 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor. In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz 2 mM oder weniger an anorganischem Salz und liegt das Chlorid in einer Masse pro Mikroliter von 0,142 ug/ul oder weniger, von 0,071 ug/ul oder weniger, von 0,036 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor.
In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz 2 mM oder weniger an anorganischem Salz und liegt das Natriumchlorid in einer Masse pro Mikroliter von 0,117 ug/ul oder weniger, von 0,058 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor und liegt das Natrium in einer Masse pro Mikroliter von 0,046 ug/ul oder weniger, von 0,023 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor und liegt das Kaliumchlorid in einer Masse pro Mikroliter von 0,149 ug/ul oder weniger, von 0,075 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor und liegt das Kalium in einer Masse pro Mikroliter von 0,078 ug/ul oder weniger, von 0,039 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor und liegt das Chlorid in einer Masse pro Mikroliter von 0,142 ug/ul oder weniger, von 0,071 ug/ul oder weniger, von 0,036 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor.
In einem weiteren Aspekt wird ein getrocknetes Pellet durch Trocknen eines flüssigen Bulk-Reagenzes, das 2 mM oder weniger eines anorganischen Salzes umfasst, hergestellt und betragen die Masseprozente des anorganischen Salzes zur Masse des Pellets 0,124 % oder weniger, 0,111 % oder weniger oder 0,097 % oder weniger. In einem weiteren Aspekt wird ein Gefäß bereitgestellt, das ein getrocknetes Einzeleinheitsdosis-Pellet mit Masseprozenten an anorganischem Salz zur Masse des Pellets von 0,124 % oder weniger, 0,111 % oder weniger oder 0,097 % oder weniger enthält. In einem weiteren Aspekt wird eine Multiwellplatte bereitgestellt, die ein oder mehrere Wells umfasst, wobei jedes des einen oder der mehreren Wells ein getrocknetes Einzeleinheitsdosis-Pellet umfasst, das Masseprozente an anorganischem Salz zur Masse des Pellets von 0,124 % oder weniger, 0,111 % oder weniger oder 0,097 % oder weniger enthält.
In einem Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz 1 mM oder weniger an anorganischem Salz, liegen die anorganischen Salze in einer Masse pro Mikroliter von 0,075 ug/ul oder weniger oder 0,066 ug/ul oder weniger oder 0,058 ug/ul oder weniger vor. In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz 1 mM oder weniger an anorganischem Salz und liegt das Natriumchlorid in einer Masse pro Mikroliter von 0,058 ug/ul oder weniger, von 0,029 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor. In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz 1 mM oder weniger an anorganischem Salz und liegt das Natrium in einer Masse pro Mikroliter von 0,023 ug/ul oder weniger, von 0,011 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor. In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz 1 mM oder weniger an anorganischem Salz und liegt das Kaliumchlorid in einer Masse pro Mikroliter von 0,075 ug/ul oder weniger, von 0,037 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor. In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz 1 mM oder weniger an anorganischem Salz und liegt das Kalium in einer Masse pro Mikroliter von 0,039 ug/ul oder weniger, von 0,020 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor. In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz 1 mM oder weniger an anorganischem Salz und liegt das Chlorid in einer Masse pro Mikroliter von 0,071 ug/ul oder weniger, von 0,036 ug/ul oder weniger, von 0,018 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor.
In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz 1 mM oder weniger an anorganischem Salz und liegt das Natriumchlorid in einer Masse pro Mikroliter von 0,058 ug/ul oder weniger, von 0,029 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor und liegt das Natrium in einer Masse pro Mikroliter von 0,023 ug/ul oder weniger, von 0,011 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor und liegt das Kaliumchlorid in einer Masse pro Mikroliter von 0,075 ug/ul oder weniger, von 0,037 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor und liegt das Kalium in einer Masse pro Mikroliter von 0,039 ug/ul oder weniger, von 0,020 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor und liegt das Chlorid in einer Masse pro Mikroliter von 0,071 ug/ul oder weniger, von 0,036 ug/ul oder weniger, von 0,018 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor.
In einem weiteren Aspekt wird ein getrocknetes Pellet durch Trocknen eines flüssigen Bulk-Reagenzes, das 1 mM oder weniger eines anorganischen Salzes umfasst, hergestellt und betragen die Masseprozente des anorganischen Salzes zur Masse des Pellets 0,062 % oder weniger, 0,055 % oder weniger oder 0,049 % oder weniger. In einem weiteren Aspekt wird ein Gefäß bereitgestellt, das ein getrocknetes Einzeleinheitsdosis-Pellet mit Masseprozenten an anorganischem Salz zur Masse des Pellets von 0,062 % oder weniger, 0,055 % oder weniger oder 0,049 % oder weniger enthält. In einem weiteren Aspekt wird eine Multiwellplatte bereitgestellt, die ein oder mehrere Wells umfasst, wobei jedes des einen oder der mehreren Wells ein getrocknetes Einzeleinheitsdosis-Pellet umfasst, das Masseprozente an anorganischem Salz zur Masse des Pellets von 0,062 % oder weniger, 0,055 % oder weniger oder 0,049 % oder weniger enthält.
In einem Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz 500 uM oder weniger an anorganischem Salz, liegen die anorganischen Salze in einer Masse pro Mikroliter von 0,037 ug/ul oder weniger oder 0,033 ug/ul oder weniger oder 0,029 ug/ul oder weniger vor. In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz 500 uM oder weniger an anorganischem Salz und liegt das Natriumchlorid in einer Masse pro Mikroliter von 0,029 ug/ul oder weniger, von 0,015 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor. In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz 500 uM oder weniger an anorganischem Salz und liegt das Natrium in einer Masse pro Mikroliter von 0,011 ug/ul oder weniger, von 0,006 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor. In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz 500 uM oder weniger an anorganischem Salz und liegt das Kaliumchlorid in einer Masse pro Mikroliter von 0,037 ug/ul oder weniger, von 0,019 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor. In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz 500 uM oder weniger an anorganischem Salz und liegt das Kalium in einer Masse pro Mikroliter von 0,020 ug/ul oder weniger, von 0,010 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor. In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz 500 uM oder weniger an anorganischem Salz und liegt das Chlorid in einer Masse pro Mikroliter von 0,036 ug/ul oder weniger, von 0,018 ug/ul oder weniger, von 0,009 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor.
In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz 500 uM oder weniger an anorganischem Salz und liegt das Natriumchlorid in einer Masse pro Mikroliter von 0,029 ug/ul oder weniger, von 0,015 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor und liegt das Natrium in einer Masse pro Mikroliter von 0,011 ug/ul oder weniger, von 0,006 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor und liegt das Kaliumchlorid in einer Masse pro Mikroliter von 0,037 ug/ul oder weniger, von 0,019 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor und liegt das Kalium in einer Masse pro Mikroliter von 0,020 ug/ul oder weniger, von 0,010 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor und liegt das Chlorid in einer Masse pro Mikroliter von 0,036 ug/ul oder weniger, von 0,018 ug/ul oder weniger, von 0,009 ug/ul oder weniger oder von 0,0 ug/ul vor.
In einem weiteren Aspekt wird ein getrocknetes Pellet durch Trocknen eines flüssigen Bulk-Reagenzes, das 500 uM oder weniger eines anorganischen Salzes umfasst, hergestellt und betragen die Masseprozente des anorganischen Salzes zur Masse des Pellets 0,031 % oder weniger, 0,028 % oder weniger oder 0,024 % oder weniger. In einem weiteren Aspekt wird ein Gefäß bereitgestellt, das ein getrocknetes Einzeleinheitsdosis-Pellet mit Masseprozenten an anorganischem Salz zur Masse des Pellets von 0,031 % oder weniger, 0,028 % oder weniger oder 0,024 % oder weniger enthält. In einem weiteren Aspekt wird eine Multiwellplatte bereitgestellt, die ein oder mehrere Wells umfasst, wobei jedes des einen oder der mehreren Wells ein getrocknetes Einzeleinheitsdosis-Pellet umfasst, das Masseprozente an anorganischem Salz zur Masse des Pellets von 0,031 % oder weniger, 0,028 % oder weniger oder 0,024 % oder weniger enthält.
In einem Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz von etwa 5 mM bis etwa 500 uM an anorganischem Salz, liegen die anorganischen Salze in einer Masse pro Mikroliter von etwa 0,373 ug/ul bis etwa 0,029 ug/ul vor. In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz von etwa 5 mM bis etwa 500 uM an anorganischem Salz und liegt das Natriumchlorid in einer Masse pro Mikroliter von 0,292 ug/ul bis etwa 0,029 ug/ul vor. In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz von etwa 5 mM bis etwa 500 uM an anorganischem Salz und liegt das Natrium in einer Masse pro Mikroliter von 0,115 ug/ul bis etwa 0,006 ug/ul vor. In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz von etwa 5 mM bis etwa 500 uM an anorganischem Salz und liegt das Kaliumchlorid in einer Masse pro Mikroliter von etwa 0,373 ug/ul bis etwa 0,019 ug/ul vor. In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz von etwa 5 mM bis etwa 500 uM an anorganischem Salz und liegt das Kalium in einer Masse pro Mikroliter von 0,196 ug/ul bis etwa 0,010 ug/ul vor. In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz von etwa 5 mM bis etwa 500 uM an anorganischem Salz und liegt das Chlorid in einer Masse pro Mikroliter von 0,355 ug/ul bis etwa 0,009 ug/ul vor. In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz von etwa 5 mM bis etwa 500 uM an anorganischem Salz, liegen die anorganischen Salze in einer Masse pro Mikroliter von etwa 0,373 ug/ul bis etwa 0,029 ug/ul vor und liegt das Natriumchlorid in einer Masse pro Mikroliter von etwa 0 ug/ul vor. In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz von etwa 5 mM bis etwa 500 uM an anorganischem Salz, liegen die anorganischen Salze in einer Masse pro Mikroliter von etwa 0,373 ug/ul bis etwa 0,029 ug/ul vor und liegt das Kaliumchlorid in einer Masse pro Mikroliter von etwa 0 ug/ul vor. In einem weiteren Aspekt wird ein getrocknetes Pellet durch Trocknen eines flüssigen Bulk-Reagenzes, das von 5 mM bis 500 uM eines anorganischen Salzes umfasst, hergestellt und betragen die Masseprozente des anorganischen Salzes zur Masse des Pellets von etwa 0,311 % bis 0,024 %.
In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz von etwa 5 mM bis etwa 500 uM an anorganischem Salz und liegt das Natriumchlorid in einer Masse pro Mikroliter von 0,292 ug/ul bis etwa 0,029 ug/ul vor und liegt das Natrium in einer Masse pro Mikroliter von 0,115 ug/ul bis etwa 0,006 ug/ul vor und liegt das Kaliumchlorid in einer Masse pro Mikroliter von etwa 0,373 ug/ul bis etwa 0,019 ug/ul vor und liegt das Kalium in einer Masse pro Mikroliter von 0,196 ug/ul bis etwa 0,010 ug/ul vor und liegt das Chlorid in einer Masse pro Mikroliter von 0,355 ug/ul bis etwa 0,009 ug/ul vor.
In einem weiteren Aspekt umfasst ein Bulk-Reagenz von etwa 5 mM bis etwa 500 uM an anorganischem Salz, liegen die anorganischen Salze in einer Masse pro Mikroliter von etwa 0,373 ug/ul bis etwa 0,029 ug/ul vor und liegt das Natriumchlorid in einer Masse pro Mikroliter von etwa 0 ug/ul vor und liegt das Kaliumchlorid in einer Masse pro Mikroliter von etwa 0 ug/ul vor.
In einem weiteren Aspekt wird ein getrocknetes Pellet durch Trocknen eines flüssigen Bulk-Reagenzes, das von 5 mM bis 500 uM eines anorganischen Salzes umfasst, hergestellt und betragen die Masseprozente des anorganischen Salzes zur Masse des Pellets von etwa 0,311 % bis 0,024 % und betragen die Masseprozente des Natriumchlorids zur Masse des Pellets etwa 0 % und/oder betragen die Masseprozente des Kaliumchlorids zur Masse des Pellets etwa 0 %. In einem weiteren Aspekt wird ein Gefäß bereitgestellt, das ein getrocknetes Einzeleinheitsdosis-Pellet mit Masseprozenten an anorganischem Salz zur Masse des Pellets von etwa 0,311 % bis 0,024 % enthält, und betragen die Masseprozente des Natriumchlorids zur Masse des Pellets etwa 0 % und/oder betragen die Masseprozente des Kaliumchlorids zur Masse des Pellets etwa 0 %. In einem weiteren Aspekt wird eine Multiwellplatte bereitgestellt, die ein oder mehrere Wells umfasst, wobei jedes des einen oder der mehreren Wells ein getrocknetes Einzeleinheitsdosis-Pellet enthält, das Masseprozente an anorganischem Salz zur Masse des Pellets von etwa 0,311 % bis 0,024 % enthält, und die Masseprozente des Natriumchlorids zur Masse des Pellets etwa 0 % betragen und/oder die Masseprozente des Kaliumchlorids zur Masse des Pellets etwa 0 % betragen.
In einer Ausführungsform wird eine Multiwellplatte bereitgestellt, die ein oder mehrere Wells umfasst. In einem Aspekt umfassen ein oder mehrere Wells Wände, die aus einem Material hergestellt sind, das eine niedrige Moisture Vapor Transmission Rate, Wärmeleitfähigkeit, optische Transparenz, niedrige Autofluoreszenz und eine Kombination davon umfasst. In einem Aspekt umfassen ein oder mehrere Wells Wände, die kegelförmig sind. In einem Aspekt umfassen ein oder mehrere Wells Wände, die zur Einpassung in einen PCR-Thermocycler für die Durchführung einer PCR-Amplifikationsreaktion mit einer Reaktionsmischung konfiguriert sind, die in dem Well enthalten ist. In einem Aspekt umfassen Wells Wände, die zur Einpassung in einen Bereich zur Aufnahme eines wärmeleitfähigen Röhrchen einer Vorrichtung für die Durchführung von PCR, TMA oder anderen Nukleinsäureamplifikationsreaktionen konfiguriert sind. In einem Aspekt umfassen ein oder mehrere Wells Wände, die zur Einpassung in einen Heizblock (siehe z. B. die Trockenblöcke für die Verwendung mit digitalen Trockenblockerhitzern, die von Southern Labware, Cumming GA, als Produkt SKUs BSH100G erhältlich sind) konfiguriert sind. In einem Aspekt umfassen ein oder mehrere Wells der Multiwellplatte eine Öffnung für den Zugang zur Kammer des Wells. In einem Aspekt umfassen ein oder mehrere Wells jeweils eine Kappe zur Abdichtung der Öffnung des zugehörigen Wells. In einem Aspekt wird eine Öffnung von jedem des einen oder der mehreren Wells mit einer Kappe abgedichtet, die eine Folie mit niedriger Moisture Vapor Transmission Rate ist. In einem Aspekt wird eine Öffnung von jedem des einen oder der mehreren Wells mit einer Kappe abgedichtet, die eine elastomere Substanz mit niedriger Moisture Vapor Transmission Rate ist. In einem Aspekt umfasst eine Multiwellplatte ein oder mehrere Wells, wie hierin beschrieben, und wobei eine Kammer des Wells ein getrocknetes Einzeleinheitsdosis-Pellet enthält, das ein Polymerase-Enzym und ein anorganisches Salz umfasst, wobei die Masseprozente des anorganischen Salzes zur Masse des Pellets von etwa 0,311 % bis 0,024 % betragen. In einem Aspekt umfasst eine Multiwellplatte ein oder mehrere Wells, wie hierin beschrieben, und wobei eine Kammer des Wells ein getrocknetes Einzeleinheitsdosis-Pellet enthält, das ein reverse-Transkriptase-Enzym und ein anorganisches Salz umfasst, wobei die Masseprozente des anorganischen Salzes zur Masse des Pellets von etwa 0,311 % bis 0,024 % betragen. In einem Aspekt umfasst eine Multiwellplatte ein oder mehrere Wells, wie hierin beschrieben, und wobei eine Kammer des Wells ein getrocknetes Einzeleinheitsdosis-Pellet enthält, das ein Polymerase-Enzym, ein reverse-Transkriptase-Enzym und ein anorganisches Salz umfasst, wobei die Masseprozente des anorganischen Salzes zur Masse des Pellets von etwa 0,311 % bis 0,024 % betragen.
Die Reaktionsmischungen können zusammengestellt werden und Reaktionen können in einem automatisierten Probennahme-Handhabungs-Gerät durchgeführt werden, wie zum Beispiel dem Hologic® Panther Instrument (Hologic, Inc., MA), das eine Roboter-Vorrichtung mit Pipettierern, Mischern, Inkubatoren und Waschstationen darstellt, mit dem mehrere simultane Assays durchgeführt werden können, in denen beispielsweise PCR-Reaktionen, transkriptionsvermittelte Amplifikation und Zieleinfang-Hybridisierung angewendet werden.
III. Ausrüstung und Verfahren für die Trocknung
Bulk-Reagenzien können unter Verwendung von Standardverfahren und -ausrüstung lyophilisiert werden. Gefriertrockner sind erhältlich von z. B. GEA Process Engineering, Columbia, MD. Vertragsdienstleistungen zur Gefriertrockung werden von etlichen Firmen angeboten (z. B. Biopharma Technology Ltd., Winchester, Hampshire, Großbritannien, und von BioPharma Solutions Sterile Contract Manufacturing, Baxter Healthcare Corp, Deerfield, IL). Anleitungen für die Lyophilisierung sind aus etlichen Quellen erhältlich (z. B.L. Rey, J.C. May (Hrsg.) (2010) Freeze Drying/Lyophilization of Pharmaceuticals and Biological Products, 3. Aufl. Informa Healthcare, NY, oder Methods in Enzymology, Bd. 22, Seiten 33-39, Academic Press, New York (1971); oder Freeze-Drying, E. W. Flosdorf, Rheinhold, New York (1949)). Optional kann der Sauerstoffgehalt während der Gefriertrocknung verringert werden (Phillips et al. (2001) Biologics. 19:219).
Es ist eine Vielfalt an Behältern für die Trocknung geeignet. Ein Behälter sollte dem Außendruck standhalten können, wenn der Behälter abgedichtet und unter Teilvakuum aufbewahrt wird. Der Behälter sollte aus einem Material hergestellt sein, das eine angemessene Übertragung von Wärme von außen nach innen ermöglicht. Die Größe des Behälters ist bevorzugt derart, dass die zu trocknende Lösung nicht mehr als 20 % des Gesamtvolumens einnimmt, um ein Überlaufen zu vermeiden.
Proben können in getrennten Gefäßen oder einem Multipräparatgefäß getrocknet werden. Ein Multipräparatgefäß bedeutet ein zusammenhängendes Gefäß, das mindestens zwei Präparate enthalten kann, sodass sie parallel, doch separat gelagert und gehandhabt werden können. Standardformate für Multipräparatbehältnisse schließen 6, 24, 96, 384 oder 1536 Wells ein. Das Volumen von jedem Well in einem Beispiel eines 96-Well-Formats beträgt etwa 300-400 Mikroliter mit einem Arbeitsvolumen von etwa 75-200 Mikroliter. Die Volumen variieren im Allgemeinen umgekehrt zur Anzahl der Wells, normalerweise in einem Bereich zwischen 1 nl und 10 ml für jedes Well, obwohl auch andere Größen erwogen werden. Beispielhafte Wells können unter anderem flache Böden, runde Böden oder V-förmige Böden aufweisen. Wie hierin verwendet, wird ein Gefäß auch als ein Well bezeichnet. Wie hierin verwendet, wird ein Multipräparatgefäß auch als eine Multiwellplatte bezeichnet. Außerdem werden Wells manchmal weiterhin als Reaktions-Wells bezeichnet. Der Begriff Reaktions-Well erfordert nicht, dass tatsächlich eine Reaktion in dem Reaktions-Well stattfindet. Der Begriff wird eher verwendet, um ein Gefäß oder ein Well zu bezeichnen, das ein Reagenz enthält und worin nicht notwendigerweise eine Reaktion, eine Teilreaktion oder eine vollständige Reaktion stattfinden muss.
Eine Multiwellplatte kann in einigen Ausführungsformen hierin einer Lyophylisierung unterzogen werden, um eine getrocknete Zusammensetzung aus einer wässrigen Lösung zu bilden. Die Lyophilisierung kann in einer Nest-Vorrichtung stattfinden (siehe schwebende Internationale Patentanmeldung Nr. PCT/US2016/045166 ). Ein „Nest“ ist ein Behälter zur Aufnahme der Multiwellplatte, wobei das „Nest“ Entlüftungen einschließt, die durch einen Mechanismus geschlossen werden können, der außerhalb einer abgedichteten Lyophilisierungskammer betätigt werden kann. Das „Nest“, das die Multiwellplatte enthält, wird in eine Lyophilisierungskammer gestellt, wobei die eine oder die mehreren Entlüftungen in der geöffneten Position vorliegen. Die Kammer wird dann abgedichtet und es wird eine Lyophilisierungsatmosphäre in der gesamten Kammer, einschließlich des Raums in dem „Nest“, eingestellt. Die eine oder die mehreren Entlüftungen werden dann geschlossen, wodurch das „Nest“ abgedichtet wird. Die Abdichtung der Lyophilisierungskammer wird später freigegeben und das „Nest“, das die Multiwellplatte enthält, wird entfernt. Das „Nest“ kann dann den Standort wechseln und mit der darin positionierten Multiwellplatte gelagert werden bis ein Anwender diese zur Verwendung der darin befindlichen lyophilisierten Zusammensetzung oder zur erneuten Abdichtung der Multiwellplatte, die die lyophilisierten Präparate enthält, für die weitere Lagerung oder den weiteren Verkauf benötigt. Die Wells der Multiwellplatte können dann abgedichtet werden, was im Wesentlichen den Eintritt von Feuchtigkeit aus der Umgebungsluft hemmt. Das kleine Ausmaß an Feuchtigkeitseintritt in eine abgedichtete Multiwellplatte kann durch Lagerung der abgedichteten Multiwellplatte in einem Beutel, der Trockenmittel enthält, verhindert werden. Ähnlich können separate Gefäße einer Lyophilisierung unterzogen werden und können einer Lyophilisierung in einem „Nest“ unterzogen werden.
Andere Trocknungsverfahren schließen folgende ein: Sprühtrocknung, Fließbetttrocknung, Entfeuchter und Chargen-Kontakttrocknung, wo ein Filterkuchen bei niedriger Temperatur unter Vakuum zu einem frei fließenden Trockenprodukt getrocknet wird (NP Cheremisinoff (2000) Handbook of Chemical Preocessing Equipment, butterworth Heinemann, Boston, MA). Entfeuchter sind erhältlich von Bry Air, Inc., Sunbury, Ohio, und DST Seibu Giken, Wyomissing, PA. Rotationstrockner, Konustrockner und Schranktrockner sind erhältlich (McGill AirPressure LLC, Columbus, Ohio). In einer Ausführungsform entfernen Vakuumtrockner Feuchtigkeit durch Exponieren der Stoffe gegenüber einem reduzierten Druck, wo gerade genug Wärme verwendet wird, um die durch Verdampfung verlorengegangene zu ersetzen. Trockenmittel schließen Kieselgel-Trockenmittel, Molekularsieb-Trockenmittel, wie zum Beispiel Aluminosilicat und synthetisches Zeolith, und Bentonit-Trockenmittel ein.
Reaktionsmischungen werden bevorzugt in demselben Gefäß getrocknet, in dem sie für die Verwendung rekonstituiert werden.
Eine lyophilisierte oder anderweitig getrocknete Formulierung weist einen niedrigen Wassergehalt auf, beispielsweise unter 5 Gewichts-% Wasser, unter 4 %, unter 3 %, unter 2 %, unter 1,0 %, unter 0,5 %, unter 0,2 %, unter 0,1 %, unter 0,05 %, unter 0,02 %, unter 0,01 Gewichts-% usw., oder von unter 5 Gewichts-% Wasser bis unter 0,01 Gewichts-%, von unter 4 % bis unter 0,01 %, von unter 3 % bis unter 0,01 %, von unter 2 % bis unter 0,01 %, von unter 1,0 % bis unter 0,01 %, von unter 0,5 % bis unter 0,01 %, von unter 0,2 % bis unter 0,01 %, von unter 0,1 % bis unter 0,01 %, von unter 0,05 % bis unter 0,01 %, von unter 0,02 % bis unter 0,01 %.
IV. Lagerung
Lyophilisierte oder anderweitig getrocknete Zusammensetzungen müssen vor der Verwendung gelagert werden. Die Lagerungsdauer kann eine Zeitdauer einschließen, in der die getrockneten Zusammensetzungen bei Raumtemperatur unter Exposition gegenüber Umgebungsluft gelagert werden. Eine derartige Dauer kann bis zu 3 Stunden betragen oder alternativ bis zu 1,0 Stunden, bis zu 1,5 Stunden, bis zu 2,0 Stunden, bis zu 2,5 Stunden, bis zu 3,5 Stunden, bis zu 4,0 Stunden, bis zu 5,0 Stunden, bis zu 6,0 Stunden, bis zu 8,0 Stunden oder im Bereich von jedweder der Zeiten liegen, wie zum Beispiel von 90 min bis 180 min. Die absolute Feuchte während einer derartigen Lagerung kann mindestens 2,3 Gramm Wasser pro Kubikmeter Luft bei 25 °C oder alternativ mehr als 1,8, 2,0, 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3,0 Gramm Wasser pro Kubikmeter Luft betragen. Alternativ kann die relative Feuchte z. B. etwa 10 %, etwa 20 %, etwa 30 %, etwa 40 %, etwa 50 %, etwa 60 %, etwa 70 %, etwa 80 %, etwa 90 %, etwa 95 % relative Feuchte betragen. In bestimmten Ausführungsformen kann die relative Feuchte etwa 10 % betragen und kann die Dauer der Lagerungszeit bis zu 8 Stunden betragen. In bestimmten Ausführungsformen kann die absolute Feuchte etwa 2,3 Gramm pro Kubikmeter Luft bei 25 °C betragen und kann die Dauer der Lagerungszeit bis zu 8 Stunden betragen.
Die Lagerung kann auch eine längere Dauer einschließen, in der getrocknete Zusammensetzungen abgedichtet sind, wodurch im Wesentlichen der Kontakt mit Umgebungsluft außerhalb der Abdichtung verhindert wird. Diese Lagerungsdauer kann für eine lange Zeit sein, beispielsweise mindestens eine Woche, mindestens einen Monat, mindestens sechs Monate, mindestens ein Jahr oder mindestens zwei Jahre. Eine Dauer von einem Monat bis zwei Jahre ist beispielhaft.
Lagerungstemperaturen für die Langzeitlagerung oder für Lang- oder Kurzzeitstabilitätsstudien schließen beispielsweise folgende ein: 0-2 °C, 0-4 °C, 2-4 °C, 2-6 °C, 20 °C, 25 °C, 30 °C, 40 °C, 50 °C, 60 °C, sowie Minustemperaturen, wie zum Beispiel -4 bis -2 °C, -6 bis -2 °C, -8 bis -2 °C, -10 bis -2 °C, -20 °C, -40 °C, -60 °C, - 80 °C, unter flüssigem Stickstoff. Bevorzugt erfolgt die Lagerung über dem Gefrierpunkt und in dem Bereich von etwa 4-8 °C. Studien zum beschleunigten Abbau können bei etwa 25 °C, etwa 30 °C, etwa 35 °C, etwa 40 °C für eine Dauer von beispielsweise einer Stunde, zwei Stunden, vier Stunden, 24 Stunden, zwei Tagen, vier Tagen, acht Tagen, einem Monat usw. durchgeführt werden. Bedingungen für die Lagerung oder alternativ für die Stabilitätsprüfung können solche sein, die in der Temperatur schwanken, wie zum Beispiel solche, die von über bis unter einem Gefrierpunkt schwanken.
Durch die Abwesenheit von anorganischen Salzen wird der Verlust an Enzymaktivität und die Bildung von Nebenprodukten während der Lagerung von Bulk-Reagenzien vor dem Trocknen, während der Kurzzeitlagerung von getrockneter Zusammensetzung vor dem Abdichten und Langzeitlagerung nach dem Abdichten verringert. Bevorzugt beträgt die Enzymaktivität nach der gesamten Lagerung mindestens 99 % des Werts vor unmittelbar vor Beginn der Lagerung, mindestens 98 %, mindestens 95 %, mindestens 90 %, mindestens 80 %, mindestens 75 %, mindestens 70 %, mindestens 60 %, mindestens 50 %, mindestens 40 %, mindestens 30 %, mindestens 20 % und Bereiche, die diese Prozentwerte eingrenzen, des Werts vor Beginn der Lagerung oder alternativ des Werts einer Vergleichsprobe, die unter optimalen Bedingungen gelagert wurde.
V. Rekonstitution
Eine bevorzugte Rekonstitutionslösung stellt 3,8-4,4 mM MgCl₂ und 50-80 mM KCl in Wasser bereit. Die Rekonstitutionslösung kann auch 0,012-0,020 % Methylparaben, 0,006-0,010 % Propylparaben und/oder 0,26 % absoluten Ethanol neben anderen Komponenten enthalten.
Die Rekonstitutionszeit kann unter 1 Sek., unter 2 Sek., unter 5 Sek., unter 10 Sek., unter 15 Sek., unter 20 Sek., unter 50 Sek. oder unter 60 Sek. (1 Minute) betragen, nachdem eine zugegebene wässrige Lösung, die für die beabsichtigte Verwendung der getrockneten Zusammensetzung geeignet ist, mit der getrockneten Zusammensetzung in Kontakt gebracht wird, wobei der Kontakt optional durch jedwedes Schütteln, Klopfen, Vortex-Verwirbeln, Schaukeln, Ein- und Ausziehen mit einer Pipettenspitze oder Knicken oder Drücken eines verformbaren Gefäßes gefördert wird. Eine beispielhafte Rekonstitutionszeit beträgt 2-10 Sek. Die Rekonstitutionszeit kann mit der Rekonstitutionslösung bei jedweder Kühlschranktemperatur (etwa 4 °C), Lösung bei Umgebungstemperatur (etwa 23 °C) oder mit einer warmen Lösung (etwa 37 °C) gemessen werden. Normalerweise wurde die getrocknete Zusammensetzung aus einem Kühlschrank entnommen und ist vor der Zugabe der Rekonstitutionslösung kalt. Die Umgebung (der Raum) für jedwede dieser Vorgehensweisen hat normalerweise Umgebungstemperatur von etwa 23 °C. Die Zeit, die bestimmt wird, dass eine Substanz rekonstituiert ist, kann beispielsweise die Zeit sein, die bestimmt wird, dass die Substanz vollständig gelöst ist. Eine vollständige Auflösung kann durch visuelle Prüfung bestimmt werden, beispielsweise wo die Abwesenheit von Trübung oder die Abwesenheit eines Schlierenmusters ein Maß für die vollständige Auflösung ist. Alternativ kann die vollständige Auflösung mithilfe eines optischen Instruments bestimmt werden, wie zum Beispiel eines Geräts, das Lichtstreuung misst.
VI. Stabilität von Zusammensetzungen
die Stabilität von Zusammensetzungen wird normalerweise nach Rekonstitution eines getrockneten Produkts aus der Aktivität (d. h. Rate oder Ausbeute der Amplifikation) oder der Bildung von Nebenprodukten bewertet. Mangelnde Stabilität kann aus dem Verlust an Aktivität oder der Bildung von Nebenprodukten während der Lagerung entweder vor oder nach dem Trocknen resultieren. Die Aktivität oder Bildung von Nebenprodukten kann ein absolutes oder relatives Maß sein. Wenn relativ, kann die Grundlinie für den Vergleich eine Bulk-Reagenzmischung vor dem Trocknen und der Rekonstitution oder eine rekonstituierte Kontrollmischung sein, die sich von der zu testenden in einer bestimmten Weise (z. B. Gegenwart von Magnesium oder anderem Salz oder Ion davon) unterscheidet. Die Aktivität kann durch die Rate der Echtzeit-Amplifikation oder die Endausbeute an Amplifikationsprodukt oder Trefferrate bewertet werden. Nebenprodukte können durch eines oder mehrere von Folgenden untersucht werden: Gelelektrophorese, einen Gel-Scanner, Agarose-Gele, Kapillarelektrophorese und so weiter.
Die Aktivität einer rekonstituierten Amplifikationsmischung (falls notwendig für jedwede Abweichungen aufgrund eines verschiedenen Rekonstitutionsvolumens relativ zum Volumen des vorgetrockneten Reagenzes korrigiert) liegt bevorzugt innerhalb von 75, 80, 85, 90 oder 95 % oder ist innerhalb des experimentellen Fehlers von der des Reagenzes vor dem Trocknen nicht unterscheidbar. Die Nebenprodukte, die in einer rekonstituierten Amplifikationsmischung vorliegen (falls notwendig für jedwede Abweichungen aufgrund eines verschiedenen Rekonstitutionsvolumens relativ zum Volumen des vorgetrockneten Reagenzes korrigiert), betragen bevorzugt weniger als 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 oder 1 Gewichts-% oder durchschnittliche Molzahlen der ursprünglichen Verbindungen, die in dem Bulk-Reagenz vor dem Trocknen vorlagen. Bevorzugt liegen die Nebenprodukte unterhalb einer Nachweisgrenze.
VII. Kits
Die vorstehend beschriebenen, getrockneten Zusammensetzungen können in einem Kit bereitgestellt werden. Ein derartiger Kit kann die getrockneten Zusammensetzungen in einem Gefäß, zum Beispiel einem Röhrchen, enthalten. In einigen Ausführungsformen enthält der Kit eine Multiwellplatte, die ein oder mehrere Wells umfasst. Einige Kits enthalten eine Vielzahl von getrockneten Zusammensetzungen, die in separaten Gefäßen bereitgestellt werden. Einige Kits schließen eine oder mehrere Multiwellplatten ein, die mehrere getrocknete Zusammensetzungen in einem oder mehreren abgedichteten Well-Elementen der Multiwellplatten einschließen.
Einige Kits schließen auch eine Rekonstitutionslösung in einem separaten Gefäß von den getrockneten Zusammensetzungen ein. Die Rekonstitutionslösung kann in großer Menge zur Abgabe von Aliquoten in einzelne Gefäße mit getrockneter Zusammensetzung bereitgestellt werden oder kann in Form von einer oder mehreren Einheitsdosierungen, jeweils für die Kombination mit einem einzigen Gefäß, das eine getrocknete Zusammensetzung enthält, bereitgestellt werden.
Optional können ein Gefäß, das getrocknete Zusammensetzung enthält, und ein Gefäß, das Rekonstitutionslösung enthält, durch ein zerbrechliches Material getrennt sein. Das zerbrechliche Material kann Aluminiumfolie, Polypropylen, Polyester, Polyvinylchlorid (PVC), Polyethylen oder ein anderes ähnliches Material sein. Die Barriere kann eine, zwei, drei oder mehr Schichten einschließen, wobei jede Schicht die gleiche Zusammensetzung aufweist oder jede Schicht eine unterschiedliche Zusammensetzung aufweist, wie zum Beispiel eine Folienschicht in Verbindung mit einer PVC-Schicht. Folien können z. B. von Dow Chemical Co., Midland, MI, oder Arkema, Inc., King of Prussia, PA, erworben werden. Das Durchstechen des zerbrechlichen Materials ermöglicht, dass die Rekonstitutionslösung mit der lyophilisierten Zusammensetzung in Kontakt kommt.
Der Kit kann so gestaltet sein, dass er in einen Thermocycler oder in einen Inkubator passt, sodass enzymatische Reaktionen direkt in einem Fach des Kits stattfinden, um zu vermeiden, dass Zusammensetzungen in andere Reaktionsgefäße oder Behälter, die derartige Gefäße halten, überführt werden müssen.
Die Kits können für die Einführung eines vom Anwender bereitgestellten Reagenzes in ein Gefäß innerhalb des Kits geeignet sein, beispielsweise mithilfe eines Anschlusses, eines Schlauchs, einer Spritze, die ein Septum durchsticht (siehe US2014/0121515 und US2014/0276356 ), oder alternativ können vom Anwender bereitgestellte Reagenzien, wie zum Beispiel eines Nukleinsäure-Templates, mit Reagenzien der Offenbarung in einem vom Anwender bereitgestellten Behälter gemischt werden. Ein oder mehrere der Fächer des Kits können in einem leeren Zustand bereitgestellt werden und als Mischkammer verwendet werden.
BEISPIELE
Beispiel 1. Bulk-Reagenzien
Die Beispiele 1 bis 3 veranschaulichen die Herstellung eines Bulk-Reagenzes, das Trocknen eines Einzeleinheitsdosis-Volumens des Bulk-Reagenzes, um ein getrocknetes SUD-Pellet in einem Gefäß zu erhalten, und die Rekonstitution des getrockneten Pellets, um eine SUD-Amplifikations- und -Detektionsmischung zu erhalten. Die Tabelle 1 und die Tabelle 2 offenbaren Komponenten von beispielhaften Bulk-Reagenzien für das Trocknen. Die zwei Tabellen offenbaren auch beispielhafte Einzeleinheitsdosis-Konzentrationen. Master-Mix 1 war ein 2 X Master-Mix, der Folgendes umfasst: 0,4 mM von jeweils dATP, dGTP, dCTP und dTTP, 0,8 mM dUTP, BSA und im Wesentlichen keine anorganischen Salze. Taq-Polymerase in Tabelle 1 lag in einem Glycerol-freien TRIS-Puffer vor, der ein kationisches Detergenz enthielt.
2 X Master-Mix 2 ist: 0,4 mM dATP, dGTP , dCTP, 0.8 mM dUTP, 0,74 Einheiten/ µl GoTaq^® MDx Hot-Start-Polymerase, Glycerol-frei in proprietärem Puffer, der Tris und nicht-acetyliertes BSA enthält, 0,48 M Trehalose.
50 X GoScript RT Mix ist Folgendes: 20 U/µl GoScript^®, 8 Einheiten/µl RNasin^® Plus RNase-Inhibitor in Tabelle 2; 10 U/µl GoScript^®, 8 Einheiten/µl RNasin^® Plus in Tabelle 1.
GoScript^® RT Custom ist eine konzentrierte Lösung von GoScript RT mit 160 U/µl,
Glycerol-frei, kein RNase-Inhibitor.

Stabilisatoren, die eingeschlossen sein können, sind Deamidierungsinhibitoren, Antioxidantien, Detergenzien und Tenside, wie zum Beispiel die Tenside: Fettsäureester von Sorbitan-Polyethoxylaten (z. B. Polysorbat 20 oder Polysorbat 80) und Poloxamer 188. Tabelle 1: Beispielhaftes Bulk-Reagenz für das Trocknen

Beschreibung	Bulk-Reagenz (Konzentration mit entsprechenden Einheiten)	Menge pro Liter	SUD (Konzentration mit entsprechenden Einheiten)	Durchführbarer Bereich (Konzentration mit entsprechenden Einheiten)
1,4 M Trehalose	0,30 M	214 ml	0,24 M	0,16-0,32 M
Lsg., EDTA 0,5 M, pH 8,0	2,19 mM	4,4 ml	1,75 mM	0,0-3,5 mM
2 X Master-Mix 1, ohne Salz, ohne MgCl₂	1,25 X	625 ml	1 X
Taq-Polymerase (50 U/ul)	0,4 U/ µl	400 kU (8,00 ml)	0,32 U/µl	0,1-1,0 U/ul
50 X GoScript™ RT Mix für 1-Step RTqPCR, geringes Glycerol, Custom (angepasst)	1,25 X	25,0 ml	1 X
GoScript™ RT Custom Formulierung, 160 U/µl	0,25 U/µl	250 kU (1,6 ml)	0,20 U/µl	0,1-0,6 U/ul
10X Oligonukleotidmischung	1,25 X	125 ml	1 X	0,7 X-1,3 X

Tabelle 2: Beispielhaftes Bulk-Reagenz für das Trocknen

Beschreibung	Bulk-Reagenz (Konzentration mit entsprechenden Einheiten)	Menge pro Liter	SUD (Konzentration mit entsprechenden Einheiten)	Durchführbarer Bereich (Konzentration mit entsprechenden Einheiten)
Lsg. EDTA 0,5 M, pH 8,0	2,19 mM	4,38 ml	1,75 mM	0,0-3,5 mM
2 X Master-Mix 2, ohne Salz, ohne MgCl₂, mit extra Taq-Pol, mit Trehalose, mit	1,25 X	625 ml	1 X
Nukleotiden
- von Trehalose	0,30 M	”	0,24 M	0,16-0,32 M
- von Taq-Pol	0,46 U/µl	”	0,37 U/µl	0,1-1,0 U/ul
50 X GoScript™ RT Mix für 1-Step RTqPCR, geringes Glycerol, Custom, mit RNasin Plus	1,25 X	25,0 ml	1 X
- von RT	0,5 U/µl	”	0,4 U/µl	0,1-0,6 U/ul
10X Oligonukleotidmischung	1,25 X	125 ml	1 X	0,7 X-1,3 X

Tabelle 3: Beispielhaftes Bulk-Reagenz für das Trocknen

Beschreibung	Stammkonzentration	Endkonzentration	Endvolumen
AllStart 2 X Master-Mix (ohne KCl und ohne MgCh)	2 X	1 X	12 ul/Reaktion
10 X PnP Mix	10 X	1 X	2,5 ul/Reaktion
Z05 DNA-Polymerase	200 U/ul	4 U/ul	1 ul/50 ul Reaktionsmischungsvolumen
AMV Reverse Transkriptase	80 U/ul	5 U/ul	3,13 ul/50 ul Reaktionsmischungsvolumen
T4G32P (Protein für die Entfaltung von Nukleinsäuren)	10 U/ul	2,5 U/ul	12,50 ul/50 ul Reaktionsmischungsvolumen
Enzym-			33,4 ul/50 ul
Verdünnungspuffer			Reaktionsmischungsvolumen
10 X Oligonukleotidmischung	10X	1,25 X	1 X

Die 10 X Oligonukleotidmischung in jedem der Bulk-Amplifikationsreagenzien für die Tabellen 1 bis 3 schlossen Ansammlungen von Primern und Sonden für die Durchführung von Amplifikations- und Detektionsreaktionen in den nachstehenden Beispielen ein. Ein Fachmann wird verstehen, wie Primer- und Sondenmischungen für eine Amplifikationsreaktion herzustellen sind (siehe z. B. Innis, Michael A. et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)). Für die nachstehenden Beispiele lagen Primer und Sonden in dem Bulk-Reagenz in Bulk-Konzentrationen von etwa 8 uM bis etwa 12 uM vor.
Beispiel 2. Lyophilisierung
In diesem Beispiel werden die Bulk-Reaktionsmischungen unter Verwendung eines Lyophilisators getrocknet. Es werden 24 Mikroliter von Bulk-Amplifikationsreagenzien, die im Beispiel 1 allgemein beschrieben sind, zu einem Gefäß gegeben und dann in eine Lyophilisierungkammer eingebracht. Für die Beispiele hierin stellen 24 ul die Menge an Bulk-Reagenz dar, die zur Durchführung einer Amplifikations- und Detektionsreaktion mit einer einzelnen Probe (auch als Einzeleinheitsdosis oder eine SUD bezeichnet) verwendet wird. In diesem Beispiel wurde eine Multiwellplatte (speziell eine 12-Wellplatte) für sowohl die Lyophilisierungsreaktion als auch die Lagerung des lyophilisierten Pellets, das in den Wells der Multiwellplatte vorliegt, verwendet. Jedes der 12 Wells der 12-Wellplatte erhielt ein Aliquot von 24 ul der Bulk-Reaktionsmischung. Das Reagenz in jedem der Wells stellte eine Einzeleinheitsdosis für die Durchführung einer Amplifikations- und Detektionsreaktion mit einer Ziel-Nukleinsäure dar. Es wird ein Lyophilisierungszyklus angestellt (etwa 36-Stunden-Lauf). Nach dem Lyophilisierungszyklus wird die 12-Wellplatte herausgenommen und an einen Ort gebracht, wo die einzelnen Gefäße der 12-Well Platte abgedichtet werden. Die Gefäße werden mit einer Metallfolie über der Gefäßöffnung abgedichtet. Die Metallfolie ist eine Folie mit niedriger Moisture Vapor Transmission Rate. Die abgedichteten 12-Wellplatten werden dann in Beutel mit einem Trockenmittel verpackt. Für die Verwendung in Amplifikationsreaktionen werden die 12-Wellplatten direkt in ein Instrument eingebracht. Die getrocknete Zusammensetzung innerhalb jedes Gefäßes wird manuell rekonstituiert oder im Fall eines Instruments, das mit einer Rekonstitutionslösung ausgestattet ist und zur automatisierten Rekonstitution der getrockneten Zusammensetzung programmiert ist, wird die getrocknete Zusammensetzung durch das Instrument rekonstituiert. Eine Probe wird mit dem Reagenz vereinigt und es wird eine Amplifikations- und Detektionsreaktion durchgeführt.
Beispiel 3. Rekonstitutionslösung.

Dieses Beispiel beschreibt eine Rekonstitutionslösung. Der Zweck der Rekonstitutionslösung ist die Rehydratisierung des getrockneten Pellets als Vorbereitung für die Verwendung des rekonstituierten Pellets bei der Durchführung einer Amplifikations- und Detektionsreaktion mit einer Probe. Zu jedem der 12 Wells der 12-Wellplatte aus dem Beispiel 2 werden 24 ul Rekonstitutionspuffer durch Vorstechen der Folienabdeckung auf dem Well und dann Abgeben des Puffers in das Well abgegeben. Tabelle 4 offenbart die Rekonstitutionslösung, die in diesen Beispielen verwendet wird, unter Bereitstellung von sowohl Bulk-Rekonstitutionslösungskonzentrationen als auch Endkonzentrationen des Assays. Nach der Rekonstitution der getrockneten wurden Ziel-Nukleinsäuren aus einer Probe in die Wells gegeben, und es wurde eine PCR-Amplifikations- und Detektionsreaktion durchgeführt. Tabelle 4: Universelle Rekonstitutionslösung

Beschreibung	Molekulargewicht	Bulk-Rekon. (Konzentration mit entsprechenden Einheiten)	Menge pro Liter	Endlösung des Assays (Konzentration mit entsprechenden Einheiten)
MgCl₂	1,00 M flüss. Stamm.	5,19 mM	5,19 ml	4,15 mM
KCl	74,55 g	81,3 mM	6,06	65 mM
Methylparaben	152,15 g/mol	0,02 % m/V	0,20 g	.016 %
Propylparaben	180,2 g/mol	0,01 % m/V	0,10 g	.008 %
Ethylalkohol, absolut	46,07 g/mol	0,33 % V/V	3,30 ml	0,26 %

Beispiel 4. Negativer Einfluss von anorganischen Salzen auf Bulk-Reagenz

Dieses Beispiel beschreibt den negativen Einfluss von anorganischen Salzen auf Bulk-Reagenzien. Zwei Bulk-Reagenzmischungen wurden im Allgemeinen gemäß Beispiel 1 und Tabelle 5 hergestellt. Der Unterschied zwischen Bulk-Reagenz A und Bulk-Reagenz B in Tabelle 5 war die Gegenwart oder Abwesenheit von MgCl₂ in den Reaktionsmischungen. Tabelle 5: Bulk-Reagenzien mit und ohne anorganische Salze

	Bulk-Reagenz A (ohne MgCl₂ und ohne KCl)	Bulk-Reagenz B (mit MgCl₂ und ohne KCl)
Trehalose	0,30 M	0,30 M
Hot-Start-Taq-DNA-Polymerase (Glycerol-frei)	0,46 Einheiten pro Mikroliter	0,46 Einheiten pro Mikroliter
Reverse Transkriptase	0,5 Einheiten pro Mikroliter	0,5 Einheiten pro Mikroliter
RNasin	0,2 Einheiten pro Mikroliter	0,2 Einheiten pro Mikroliter
dNTP-Mischung	0,25 mM dNTP, 0,5 mM UTP	0,25 mM dNTP, 0,5 mM UTP
Nukleinsäuren^§	7 mikromolar (uM)	7 mikromolar (uM)
KCl	0 mM	0 mM
MgCl₂	0 mM	2,5 mM
Puffer mit geringem	2,7 mM Na⁺	2,7 mM Na⁺
Glycerol	0,035 mM K⁺	0,035 mM K⁺
^§ Nukleinsäuren waren eine Multiplex-Mischung aus Primer und Sonden, die aus den folgenden Primer-Sonden-Sätzen zusammengesetzt war: für Amplifikation und Detektion von Influenza A waren es 2 Vorwärts-Primer, 3 Rückwärts-Primer und 3 Sonden (zwei unterschiedliche Influenza-A-Zielregionen); für Influenza B waren es 1 Vorwärts-Primer, 1 Rückwärts-Primer und 1 Sonde; für RSV waren es 1 Vorwärts-Primer, 1 Rückwärts-Primer und 1 Sonde für RSVA und waren es 1 Vorwärts-Primer, 1
Rückwärts-Primer und 1 Sonde für RSVB; und für die interne Kontrolle waren es 1 Vorwärts-Primer, 1 Rückwärts-Primer und 1 Sonde. Der Wert 7 mikromolar ist die Summe aus allen Primer-Konzentrationen, wobei jeder Primer in etwa 400 nM vorliegt.

Jedes der flüssigen Bulk-Reagenzien A und B wurden auf Eis hergestellt. Die Bulk-Reagenzien A und B wurden dann jeweils separat in die Wells von mehreren Multiwellplatten (hier wurden speziell 12-Wellplatten verwendet) aliquotiert. Diese 12-Wellplatten, die entweder 12 Aliquoten von Bulk-Reagenz A oder 12 Aliquoten von Bulk-Reagenz B enthielten, wurden dann in vier unterschiedliche Inkubationsbedingungen aufgeteilt: (1) 90-Minuten-Inkubation auf Eis; (2) 90-Minuten-Inkubation bei Raumtemperatur; (3) 180-Minuten-Inkubation auf Eis; oder (4) 180-Minuten-Inkubation bei Raumtemperatur. Somit wurde ein Teil von jeder Bulk-Reagenzmischung bei Raumtemperatur für 180 Minuten inkubiert und wurde der andere Teil auf Eis für 180 Minuten inkubiert. Gleichfalls wurde ein Teil von jeder Bulk-Reagenzmischung bei Raumtemperatur für 90 Minuten inkubiert und wurde der andere Teil auf Eis für 90 Minuten inkubiert. In allen Fällen zeigte die Zugabe der Nukleinsäurekomponente zur Reaktionsmischung (zugegeben als letzte Komponente) den Beginn der Inkubationszeit an.
Nach den Inkubationszeiten wurden die aliquotierten Amplifikationsreaktionen in den 12-Wellplatten dann lyophilisiert bis im Wesentlichen trockene Zusammensetzungen erhalten wurden. Jede der entstehenden getrockneten Zusammensetzungen in einem Well der 12-Wellplatten stellte eine getrocknete Einzeleinheitsdosis für eine Triplex-Amplifikations- und -Detektionsreaktion für die Identifizierung von einem oder mehreren von Influenza A, Influenza B und respiratorischem Syncytial-Virus B in einer Probe dar.
Die getrockneten Zusammensetzungen wurden mit einem Puffer, der 65 mM KCl, Methyl- und Propylparaben zu 0,02 % m/V bzw. 0,01 % m/V und 0,33 % V/V absoluten Ethylalkohol enthielt, rekonstituiert. Die Rekonstitutionslösung für getrocknete Zusammensetzungen, die aus Bulk-Reagenz A hergestellt waren, enthielt auch 2,5 mM MgCl₂.
Alle drei der für Influenza A, Influenza B und respiratorischen Syncytial-Virus B positiven Proben wurden mit den rekonstituierten Reaktionsmischungen als 3-Faches ihrer LoD vereinigt, sodass alle Komponenten der rekonstituierten Mischung etwa 80 % ihrer Bulk-Reagenzkonzentration aufwiesen. Diese positiven Proben sind extrahierte Viren in einem negativen Plasma, die mit einem Transportmedium kombiniert waren und seriell zur gewünschten Konzentration verdünnt waren (mit der Ausnahme, dass die RSVB-Probenverdünnungsreihe um einen Faktor von 10 entfernt war). Wie in Tabelle 6 gezeigt, wurde die Mischung aus Primer und Sonden entwickelt, um jedes der drei viralen Ziele, nämlich Influenza A, Influenza B oder respiratorischer Syncytial-Virus B, in einem separaten Fluoreszenzkanal, obgleich in einer einzelnen Molekularreaktion, spezifisch zu detektieren.

Die Proben wurden unter Verwendung eines mit Echtzeit-PCR kompatiblen Thermocyclers (ABI 7500FAST, Applied Biosystems, Carlsbad, CA) untersucht. Die Ergebnisse sind folgendermaßen (Tabelle 6, ). Der positive Prozentwert in der Tabelle stellt die Anzahl an Proben, die RFU-Werte aufwiesen, die den Schwellenwert überschritten, als Prozentanteil der 12 getesteten Proben dar. Bei der Entwicklung und Zusammenstellung der Assays ist bevorzugt, dass die Menge an Virus (virale Teilchen pro Assay) eine ausreichende Menge darstellt, um mindestens 95 % positiv für den bestimmten Assay, der als positive Kontrolle bestimmt wird, zu testen.
Tabelle 6: Ergebnisse

Bedingung	Influenza A Durchschnittl. RLU für positive Proben Anzahl positiv/% positiv	Influenza B Durchschnittl. RLU für positive Proben Anzahl positiv/% positiv	RSVB Durchschnittl. RLU für positive Proben Anzahl positiv/% positiv
#1 Bulk-Reagenz B 90 min Inkubation auf Eis	602 587 6 von 12/50 %	303 112 11 von 12/92 %	320 017 12 von 12/100 %
#2 Bulk-Reagenz A 90 min Inkubation auf Eis	1 235 701 12 von 12/100 %	1 028 348 12 von 12/100 %	1 107 497 12 von 12/100 %
#3 Bulk-Reagenz B 90 min Inkubation Raumtemp.	163 536 4 von 12/33 %	94 229 11 von 12/92 %	684 384 12 von 12/100 %
#4 Bulk-Reagenz A 90 min Inkubation	1 699 434 12 von 12/100 %	1 832 464 12 von 12/100 %	1 064 536 12 von 12/100 %
Raumtemp.
#5 Bulk-Reagenz B 180 min Inkubation auf Eis	576 226 12 von 12/100 %	530 568 12 von 12/100 %	1 048 669 12 von 12/100 %
#6 Bulk-Reagenz A 180 min Inkubation auf Eis	1 396 077 12 von 12/100 %	1 314 236 12 von 12/100 %	934 325 12 von 12/100 %
#7 Bulk-Reagenz B 180 min Inkubation Raumtemp.	34 092 (unter RLU-Schwellenwert) 0 von 12/0 %	57 484 3 von 12/25 %	394 945 12 von 12/100 %
#8 Bulk-Reagenz A 180 min Inkubation Raumtemp.	1 970 034 12 von 12/100 %	1 896 883 12 von 12/100 %	1 074 004 12 von 12/100 %

Diese Ergebnisse zeigen, dass Bulk-Reagenzien (Vor-Lyophilisierungslösungen ohne MgCl₂ und KCl) mindestens 180 Minuten bei Raumtemperatur stabil sind. Getrocknete SUD-Pellets aus Bulk-Reagenz A, sobald sie rekonstituiert und mit Proben vereinigt sind, stellen Amplifikations- und Detektionreaktionen bereit, die robuster sind als solche, die von getrockneten SUD-Pellets aus Bulk-Reagenz B bereitgestellt werden. Bulk-Reagenz B stellte, wenn bei Raumtemperatur oder selbst auf Eis für nur 90 Minuten inkubiert, dann getrocknet und zur Erzeugung einer Amplifikationsreaktionsmischung rekonstituiert, in einer Amplifikationsreaktion ein relativ niedrigeres Signal und eine Fülle von kleinen Nebenprodukten bereit im Vergleich zum Bulk-Reagenz A unter den gleichen Bedingungen. Bulk-Reagenzien, die wenig bis keine anorganischen Salze enthalten, sind für das Trocknen zur Erzeugung einer getrockneten Zusammensetzung verwendbar, die Komponenten für eine Amplifikationsreaktion enthält, einschließlich Polymerase-Enzymkomponenten, dNTPs und Nukleinsäuren.
Beispiel 5. Stabilität von getrockneten Pellets, mit oder ohne Salze
Dieses Beispiel vergleicht die Stabilität von getrockneten Einzeleinheitsdosis-Pellets, die Salze enthalten, mit getrockneten Einzeleinheitsdosis-Pellets, die keine Salze (weniger als 5 mM anorganisches Salz in diesem Beispiel) enthalten. Die Einzeleinheitsdosis-Pellets wurden durch Trocknen eines Bulk-Reagenzes, im Allgemeinen wie vorstehend beschrieben, hergestellt. Unmittelbar nach der Synthese wurden Bulk-Reagenz A und Bulk-Reagenz B jeweils in separate Multiwellreaktionsplatten (12-Well-) aliquotiert und unter Verwendung eines Lyophilisators getrocknet. Nach der Lyophilisierung wurden die Multiwellplatten, die die getrockneten Pellets enthielten, in eine Stickstoffgasumgebung gebracht, die eine relative Feuchte von etwa 5 % aufwies, und wurden die Multiwellplatten durch Bedecken der Wellöffnungen mit einer Folie abgedichtet. Die abgedichteten Platten wurden in einem Aluminiumbeutel verpackt, der ein Trockenmittel enthielt, und die Beutel wurden dann abgedichtet. Die abgedichteten Beutel, die die getrockneten Pellets in Multiwellplatten enthielten, wurden acht Tage bei 4 °C gelagert.
Nach dem achten Tag wurden die in Beuteln verpackten Multiwellplatten in eine von drei Bedingungen wie folgt überfuhrt: Bedingung #1 - 1 Teilmenge von in Beuteln verpackten Multiwellplatten, die getrocknete Pellets aus Bulk-Reagenz A enthielten, und 1 Teilmenge von in Beuteln verpackten Multiwellplatten, die getrocknete Pellets aus Bulk-Reagenz B enthielten, wurden aus dem Beutel genommen und in eine Umgebung von 15 °C mit 70 % relativer Feuchte gebracht; Bedingung #2 - 1 Teilmenge von in Beuteln verpackten Multiwellplatten, die getrocknete Pellets aus Bulk-Reagenz A enthielten, und 1 Teilmenge von in Beuteln verpackten Multiwellplatten, die getrocknete Pellets aus Bulk-Reagenz B enthielten, wurden aus dem Beutel genommen und in eine Umgebung von 45 °C mit 15 % relativer Feuchte gebracht (beschleunigte Stabilität); und Bedingung #3 - 1 Teilmenge von in Beuteln verpackten Multiwellplatten, die getrocknete Pellets aus Bulk-Reagenz A enthielten, und 1 Teilmenge von in Beuteln verpackten Multiwellplatten, die getrocknete Pellets aus Bulk-Reagenz B enthielten, wurden bei 4 °C aufbewahrt (die Multiwellplatte war in einem Beutel mit Trockenmittel, sodass die Feuchte null Prozent betrug). Die Platten wurden unter diesen Bedingungen für weitere dreißig Tage belassen.

Am Ende der Inkubation wurden die getrockneten Pellets aus jeder der Bedingungen in einem Puffer rekonstituiert, der 100 mM KCl und ausreichend MgCl₂ für eine Endkonzentration von 2,5 mM enthielt, und für die Amplifikation und Detektion eines Influenza-A-Ziels unter Verwendung eines Echtzeit-PCR-Thermocyclers (ABI PRISM 7000, Applied Biosystems, Carlsbad, CA) getestet. Kurz gefasst, wurden die Influenza-A-Ziele in einem negativen Pool bei LOD 10^0 (+ / - 1 log) zusammen mit einer vergleichbaren flüssigen Kontrolle extrahiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 und in gezeigt. Tabelle 7

	Durchschnittl. gesamte RFU (N = 4)
Bulk-Reagenz A 4 Grad C / 4 Grad C	1 203 798
Bulk-Reagenz B 4 Grad C / 4 Grad C	255 184
Bulk-Reagenz A 4 Grad C / 15 Grad C	1 012 184
Bulk-Reagenz B 4 Grad C / 15 Grad C	261 882
Bulk-Reagenz A 4 Grad C / 45 Grad C	1 163 704
Bulk-Reagenz B 4 Grad C / 45 Grad C	382 725

Diese Ergebnisse zeigen, dass einzelne getrocknete Pellets für Amplifikationsreaktionen, die weniger als 5 mM anorganische Salze enthalten, höhere RFU-Werte nach der Lagerung unter mehreren unterschiedlichen Temperatur- und Feuchtebedingungen aufweisen im Vergleich zu einzelnen getrockneten Pellets für Amplifikationsreaktionen, die mehr als 5 mM anorganisches Salz enthalten.
Beispiel 6. Einfluss von Haltedauer vor dem Befüllen von Einsätzen mit Reagenz
Tabelle 8 offenbart die Ergebnisse aus einer Stabilitätsstudie, wo alle lyophilisierten Proben aus dem gleichen Bulk-Reagenz hergestellt wurden. Dieses Beispiel beschreibt die Stabilität eines getrockneten Pellets, das im Allgemeinen wie vorstehend gezeigt hergestellt wurde. Ein Bulk-Reagenz, das Polymerase-Enzyme, dNTPs und Nukleinsäuren enthielt, wurde ohne MgCl₂ und ohne KCl hergestellt. Das Bulk-Reagenz wurde in vier separate Teile von äquivalenten Zusammensetzungen geteilt, und jedes der vier Teile wurde entweder: (1) bei Raumtemperatur für 45 Minuten inkubiert, dann getrocknet; (2) bei Raumtemperatur für 4 Stunden inkubiert, dann getrocknet; (3) bei Raumtemperatur für 8 Stunden inkubiert und dann getrocknet; oder (4) ohne Inkubation sofort getrocknet.

Die entstehenden getrockneten Zusammensetzungen wurden dann in einen Aluminiumbeutel überführt, der ein 1,5-g-Trockenmittelkissen enthielt, und der Beutel wurde dann abgedichtet. Die abgedichteten Beutel wurden unter Bedingungen zur Simulierung einer beschleunigten Stabilität, entsprechend 22,5 Monaten bei 5 °C, gelagert. Nach der Inkubation der beschleunigten Stabilität wurden die getrockneten Zusammensetzungen rekonstituiert, und die resultierenden Amplifikationsreaktionen wurden in einem Assay zur Amplifikation und Detektion von Influenza-A-Proben (TCID₅₀/ml = 1) verwendet. Die Ergebnisse in Tabelle 8 zeigen, dass keine Störung der Assay-Leistung zur Amplifikation und Detektion auftritt, wenn eine Bulk-Lösung, die kein MgCl₂ und kein KCl enthält, bis zu 8 Stunden bei Raumtemperatur vor dem Trocknen inkubiert wird. Rekonstituierte getrocknete Zusammensetzungen stellen Amplifikations- und Detektionsreaktionen bereit, die robust sind und reproduzierbare Ergebnisse bereitstellen, selbst bei Tests an Proben, die geringe Virustiter enthalten.

Tabelle 8
Bedingung (n = 12)	Gesamtzykluszeit (durchschnittl. Ct / ± SD Ct)
Raumtemperatur für 45 Minuten	34,5 / ± 0,58
Raumtemperatur für 4 Stunden	34,4 / ± 0,32
Raumtemperatur für 8 Stunden	33,9 / ± 0,60
Keine Inkubation	34,3 / ± 0,39

Diese Studie zeigt, dass das Variieren der Bulk-Haltedauer für flüssiges Lyo-Reagenz während des Abfüllens der Gefäße die enzymatische Aktivität nicht verringert ( ). Zur Untersuchung der Stabilität des Bulk-Reagenzes während des Abfüllens der Gefäße wurde eine Studie durchgeführt, in der die Bulk-Mischung gegenüber Umgebungstemperatur für bis zu 8 Stunden vor der Lyophilisierung exponiert wurde. Es wurden einzelne flüssige Influenza-A/B/RSV-Bulk-Lyo- Reagenzmischungen hergestellt und für 45 Minuten, 4 Stunden und 8 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und dann zur Erzeugung von Lyo-Pellets verwendet. Diese Pellets wurden dann in Beuteln verpackt und 45 °C für 22 Tage ausgesetzt, um eine beschleunigte Stabilität, entsprechend einer Haltbarkeitsdauer von 22,5 Monaten bei 5 °C, vor dem Testen mit einem niedrigen Virustiter zu simulieren. Die Ergebnisse ( ) zeigen, dass keine Störung der Assay-Leistung auftritt, wenn das flüssige Lyo-Bulk bei Umgebungsbedingungen für bis zu 8 Stunden gelagert wird.
Die jeweiligen RFU für die Histogrammbalken sind 824 895, 806 570, 855 772 und 1 162 967. Die Werte für Ct (Entstehungszeit) waren folgendermaßen. Für die flüssige Kontrolle (durchschnittl. Ct= 34,3), für 45 Minuten (durchschnittl. Ct= 34,5), für 4 Stunden (durchschnittl. Ct= 34,4) und für 8 Stunden (durchschnittl. Ct= 33,9). Die jeweiligen Standardabweichungen für die Ct-Werte waren 0,39, 0,58, 0,32 und 0,60 ( ).
Beispiel 7. Rekonstitutionszeitverlaufsstudie
Dies betrifft das in Tabelle 9 gezeigte Experiment. Der experimentelle Aufbau zur Bestimmung, ob Inkubieren eines getrockneten Pellets, das kein KCl und 2,5 mM MgCl₂ enthält, in Rekonstitutionslösung die Assay-Aktivität beeinflusst. Zusammenfassend wurden getrocknete Pellet-SUDs ohne KCl, doch mit 2,5 mM MgCl₂, durch Lyophilisierung eines Bulk-Reagenzes, wie allgemein vorstehend beschrieben, hergestellt. Nach der Lyophilisierung wurden die getrockneten Pellet-SUDs unter Stickstoff bei 5 % relativer Feuchte abgedichtet, in Beuteln mit einem Trockenmittel verpackt und dann bei 4 °C für 27 Tage gelagert. Nach der Inkubation von 27 Tagen wurden die getrockneten Pellets rekonstituiert und zur Detektion von Flu-A (Influenza A) in Proben verwendet, wobei alle Assays 100 mM KCl und 2,0 mM MgCl₂ als Endkonzentrationen in der Reaktionsmischung aufwiesen.

Die SUDs ohne KCl/mit 2.5mM MgCl₂ wurden mit 125 mM KCl rekonstituiert und für 0, 5, 10 oder 15 Minuten auf Eis vor der Überführung in eine vorgekühlte PCR-Platte und der Zugabe des Ziels inkubiert. Die Platte wurde abgedichtet, und die Proben wurden für 1 Minute zentrifugiert. Die Platte wurde dann in das vorgewärmte ABI 7500 FAST Instrument (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) eingebracht. Die Assays wurden an dem ABI mit dem thermischen Profil von 54 Minuten mit N = 4 Wiederholungen und Schwellenwert bei 25 000 durchgeführt. Die Tabelle 9 offenbart die Ergebnisse. Tabelle 9: Reagenzleistungszeitverlauf nach Rekonstitution

Bedingung	Durchschnittliche RFU	Standardabweichung
SUD ohne KCl, null Minuten	2 356 231	492 540
inkubiert
SUD ohne KCl, 5 Minuten inkubiert	1 806 528	418 064
SUD ohne KCl, 10 Minuten inkubiert	1 532 903	425 275
SUD ohne KCl, 15 Minuten inkubiert	1 668 826	1 116 796
Flüssige Kontrolle	4 075 739	154 846

Beispiel 8. Wirkung von Magnesiumchlorid auf die Stabilisierung
Dieses Beispiel untersucht die Wirkung der Entfernung von MgCl₂ aus einem Bulk-Reagenz-Master-Mix, der Puffer, Trehalose, EDTA, Nukleosidtriphosphate, Primer, Sonden und Enzyme enthält, auf die Stabilisierung. Es wurde ermittelt, dass die Entfernung von MgCl₂ aus dem Bulk-Reagenz die Formulierung von 90 Minuten bis zu 7,75 Stunden bei Raumtemperatur vor der Lyophilisierung stabilisiert, wie durch die Aktivität nach der Rekonstitution mit Wasser und MgCl₂ gemessen wurde. Die Zugabe von EDTA zum lyophilisierten Pellet ist für die Chelatbildung mit überschüssigem MgCl₂ in einem Rekonstitutionspuffer verwendbar.
Primer, Sonden und Triphosphate können in einem gepufferten Master-Mix bereitgestellt werden, der vor der Amplifikationsreaktion mit Enzymen versetzt wird. Für einige Amplifikationsreaktionen kann es wünschenswert sein, dass das Enzym in dem endgültigen Master-Mix vorliegt und in einer „gebrauchsfertigen“ Form mit einer universellen Rekonstitutionslösung aus Wasser und MgCl₂ lyophilisiert wird. Dies vermeidet, dass die Mischung vor der Amplifikationsreaktion versetzt werden muss. Magnesium dient als Komplexierungsmittel (Katalysator) für die Polymerisationsreaktion. Ohne vorliegendes Ziel kann nichtspezifische Amplifikation auftreten, die die notwendigen Triphosphate der Reaktionsmischung aufbrauchen kann. Die Aufbewahrung der Stoffe bei 2-8 °C und das Beladen in einen vorgekühlten Lyophilisator kann genutzt werden, um die Reaktionskinetik zu verlangsamen, die den Verbrauch der Triphosphate aus der Reaktionsmischung verlangsamt. Jedoch kann selbst bei 2-8 °C die Stabilität der Reaktionsmischung nur 90 Minuten betragen. Weiterhin erfordert die Einhaltung dieser Beschränkungen während der routinemäßigen Herstellung die Verwendung von Kühlsystemen, um die Temperatur der Bulk-Lösung bei der gewünschten Temperatur zu halten, sowie Schritte des Vorkühlens und dergleichen.
Die Entfernung von MgCl₂ aus dem Bulk-Reagenz, das Puffer, Trehalose, Triphosphate, EDTA, Primer, Sonden und Enzyme einschließt, und die Einbringung in eine Rekonstitutionslösung, die Wasser und MgCl₂ enthält, wurde als Möglichkeit zur Verhinderung oder Minimierung von nichtspezifischer Amplifikation betrachtet, auch wenn es als Katalysator für die Polymerisationsreaktion dient. Die Zugabe von EDTA-Lösung zum Master-Mix, der Puffer, Trehalose, Triphosphate, Primer, Sonden und Enzyme enthielt, konnte zur Chelatbildung von überschüssigem Magnesium in der universellen Rekonstitutionslösung für jeden Analyten genutzt werden. Gepaarte Amplifikationsreaktionen mit und ohne MgCl₂ wurden durchgeführt und wurden unter Nasschemie-Bedingungen ausgeführt, um die Auswirkung auf die Stabilität zu bewerten. Die Ergebnisse sind in gezeigt. Studien ohne Magnesium im Bulk-Reagenz, das Puffer, Trehalose, Triphosphate, EDTA, Primer, Sonden und Enzyme enthielt, zeigten eine Stabilität bei Raumtemperatur für 180 Minuten (siehe Spur 6 und 8, die die gleichen Banden auf dem Bioanalyzer Gel zeigen, im Vergleich zu nichtspezifischen Verschmierungen in den Spuren 5 und 7 mit vorliegendem MgCl₂). Folgestudien sind in gezeigt. Hier wurde die Nukleinsäureamplifikation eines Ziels unter drei verschiedenen Bedingungen durchgeführt: (1) frische flüssige Kontrolle, die Puffer, Trehalose, Triphosphate, EDTA, Primer, Sonden, MgCl₂ und Enzyme einschließt, wobei Enzym unmittelbar vor Beginn der PCR-Reaktion eingegeben wurde; (2) Lyo 67 RT für 3,75 Stunden, was Puffer, Trehalose, Triphosphate, EDTA, Primer, Sonden, und Enzyme einschließt. Die Lösung wurde für 3,75 Stunden gehalten, dann lyophilisiert. Nach der Lyophilisierung wurde das Pellet in Wasser und MgCl₂ unmittelbar vor Beginn der PCR-Reaktion rekonstituiert; und (3) Lyo 67 RT für 7,75 Stunden, was Puffer, Trehalose, Triphosphate, EDTA, Primer, Sonden, und Enzyme einschließt. Die Lösung wurde für 7,75 Stunden gehalten, dann lyophilisiert. Nach der Lyophilisierung wurde das Pellet in Wasser und MgCl₂ unmittelbar vor Beginn der PCR-Reaktion rekonstituiert. Dieses Experiment stellte die Stabilität des Bulk-Reagenzes, das Puffer, Trehalose, Triphosphate, EDTA, Primer, Sonden und Enzyme enthält, für 7,75 Stunden bei Raumtemperatur vor der Lyophilisierung ohne nichtspezifische Amplifikation fest.
Die Entfernung von MgCl₂ aus dem Bulk-Reagenz stellt einen bei Raumtemperatur stabilen Master-Mix bereit, der Puffer, Trehalose, Triphosphate, EDTA, Primer, Sonden und Enzyme enthält.
Beispiel 9 Wirkung von Kaliumchlorid (KCl) auf die Sublimation während der Lyophilisierung
Dieses Beispiel untersuchte die Wirkung von Kaliumchlorid (KCl) auf die Sublimation während der Lyophilisierung. Die PCR benötigt KCl für die PCR-Amplifikation. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass niedrige Konzentrationen von KCl (<10 mM, 0,391 µg/µl Kalium) die Lyophilisierung nicht wesentlich beeinflussen. Hingegen hemmen KCl-Konzentrationen so hoch wie 126 mM (4,92 µg/µl Kalium) die Entfernung von Wasser aus dem Pellet während der Lyophilisierung. Restwasser wird als „Verunreinigung“ betrachtet, die die Stabilität negativ beeinflusst. Der Ausschluss oder die Minimierung der Menge von KCl in dem lyophilisierten Bulk-Reagenz ist in bestimmten Ausführungsformen wünschenswert.
Die Effizienz der Lyophilisierung in Gegenwart von drei Konzentrationen von KCl wurde durch Messung des Restfeuchtegehalts darin nach der Lyophilisierung untersucht. Es ist bekannt, dass höhere Mengen an Restfeuchte den Sublimationsprozess hemmen.
Fourier-Transform-Nahinfrarot(FT-nIR)-Spektroskopie wurde zur Messung des relativen Feuchtegehalts in dem lyophilisierten Bulk-Reagenz verwendet. Es ist bekannt, dass -OH-Bindungen von Wasser Energie im nIR bei einer Ortswellenlänge von 5170 cm^-1 (A₅₁₇₀) absorbieren.

Es wurden drei wässrige Bulk-Reagenzformulierungen hergestellt. Die Zusammensetzung von jeder ist in Tabelle 10 gezeigt. Tabelle 10: Zusammensetzung von wässrigen Bulk-Reagenzformulierungen

	Formulierung
Komponente	1	2	3
Tris-Puffer	27 mM	29 mM	30 mM
pH	8,0	8,0	8,0
Trehalose	0,46 M	0,46 M	0,46 M
KCl	0	126 mM	6,3 mM
DTT	1,3 mM	1,3 mM	1,3 mM
Tween	0,7 %	0,7 %	0,7 %
1,25 X Sonde/Primer-Mix (relativ zur Endkonzentration des Assays)
1,25 X Taq-Polymerase (relativ zur Endkonzentration des Assays)
1,25 X reverse Transkriptase (relativ zur Endkonzentration des Assays)

Es wurden 1,45 ml von jeder Formulierung in zwei 10-ml-Glasgefäße für jede KCl- Konzentration gegeben. Die Gefäße wurden teilweise mit Butyl-Stopfen verschlossen. Alle Gefäße wurden zusammen lyophilisiert. Nach Abschluss der Lyophilisierung wurden die Gefäße unter wasserfreiem Stickstoffgas abgedichtet. Alle der abgedichteten Gefäße wurden aus dem Lyophilisator entfernt und es wurden Crimp Seals angebracht. Die Gefäße wurden dann durch FT-nIR-Spektroskopie auf Restfeuchtegehalt untersucht. Zur Erfassung von Feuchtegehaltabweichung durch Zeitverzögerung wurden Messungen über 10 Tage erhalten. Die Zeitpunkte waren wie folgt: Tag 0, Tag 1, Tag 3, Tags 7 und Tag 10. Der Restfeuchtegehalt wurde durch FT-nIR-Spektroskopie gemessen, die einen nIR-Absorptionsparameter bei 5170 cm^-1 ergab. Für jede Formulierung wurden die Absorptionsparameter gemittelt, dann auf den Durchschnittsparameter, der mit der Referenzprobe, Formulierung 1 (0 µg/µl KCl), erhalten wurde, normalisiert. Es wurde die folgende Berechnung angewendet. $N o r m a l i s i e r t e r P r o b e n p a r a m e t e r = \frac{P r o b e A b s . (Z e i t t)}{F o r m u l i e r u n g 1 A b s . (Z e i t t)}$

Die Tabellen 11 und 12 zeigen die FT-nIR-Absorptionsergebnisse. Tabelle 11: FT-nIR-Absorptionsergebnisse*

	Tag 0			Tag 1			Tag 3
Gefäß ID	A₅₁₇₀	Durchschn. A₅₁₇₀	Normalisiert	A₅₁₇₀	Durchschn. A₅₁₇₀	Normalisiert	A₅₁₇₀	Durchschn. A₅₁₇₀	Normalisiert
1-1	0,0481	0,0506	1,00	0,0557	0,0559	1,00	0,0610	0,0610	1,00
1-2	0,0531	0,0506	1,00	0,0560	0,0559	1,00	0,0610	0,0610	1,00
2E-1	0,1094	0,1083	2,14	0,1214	0,1182	2,12	0,1250	0,1248	2,05
2E-2	0,1072	0,1083	2,14	0,1150	0,1182	2,12	0,1245	0,1248	2,05
2F-1	0,0667	0,0548	1,08	0,0711	0,0612	1,09	0,0749	0,0656	1,07
2F-2	0,0429			0,0512			0,0562

Tabelle 12: FT-nIR-Absorptionsergebnisse - Fortsetzung von Tabelle 11*

Tag 7			Tag 10
A₅₁₇₀	Durchschn. A₅₁₇₀	Normalisiert	A₅₁₇₀	Durchschn. A₅₁₇₀	Normalisiert
0,0651	0,0653	1,00	0,0669	0,0667	1,00
0,0655	0,0653	1,00	0,0665	0,0667	1,00
0,1274	0,1251	1,92	0,1271	0,1215	1,82
0,1228	0,1251	1,92	0,1159	0,1215	1,82
0,0756	0,0676	1,03	0,0847	0,0729	1,09
0,0595	0,0676	1,03	0,0611	0,0729	1,09
* Gefäß ID in Tabelle 11 und Tabelle 12 bezieht sich auf Bedingungen der Tabelle 10, wie: Formulierung 1 der Tabelle 10 ist Gefäß ID 1-1 & 1-2 in den Tabellen 11 & 12; Formulierung 2 der Tabelle 10 ist Gefäß ID 2E-1 & 2E-2 in den Tabellen 11 & 12; und Formulierung 3 der Tabelle 10 ist Gefäß ID 2F-1 & 2F-2 in den Tabellen 11 & 12.

Die zeigen die Wirkung der Erhöhung der Konzentration von KCl. Die Diagramme zeigen, dass die Gegenwart von 6,3 mM KCl den normalisierten Absorptionsparameter nicht wesentlich erhöhte. Somit geht aus diesen Daten hervor, dass niedrige Konzentrationen von KCl die Entfernung von Wasser während der Lyophilisierung nicht wesentlich hemmen. Hingegen bewirkten 126 mM KCl (20-fache Erhöhung) eine 2-fache Erhöhung des normalisierten Absorptionsparameters, was höhere Restfeuchtegehalte im Vergleich zur Referenz anzeigt. Somit beeinflussen höhere Konzentrationen von KCl die Feuchteentfernung.
Die Lyophilisierung des wässrigen Bulk-Reagenzes toleriert kleine Mengen an KCl (ungefähr 6,3 mM in diesem Beispiel). In höheren Konzentrationen kann KCl die Hygroskopie des getrockneten Pellets beeinflussen, was zur Absorption von Wasser aus der Umgebung führt und wiederum zu einer weniger robusten Reaktionsmischung führt.
Beispiel 10 Bestimmung der Stabilität nach der Lyophilisierung eines lyophilisierten Bulk-Reagenzes
Umgebungs- und kontrollierte Glovebox-Experimente unter Verwendung von post-lyophilisierten Aliquoten von Bulk-Reagenz zeigten, dass eine Formulierung mit minimiertem Salzgehalt/keinem Salz, die 10 % relativer Feuchte für weniger als 8 Stunden ausgesetzt wurde, zu einer annehmbaren Assay-Leistung führte. Formulierungen mit Salz und/oder Formulierungen, die einer höheren relativen Feuchte nach der Lyophilisierung ausgesetzt wurden, führten nicht zu einer annehmbaren Assay-Leistung.
Das Ziel dieses Beispiels war die Bestimmung der Stabilität nach der Lyophilisierung eines lyophilisierten Bulk-Reagenzes, das in Multiwellplatten abgedichtet und hermetisch abgedichtet ist, um vor Umgebungsfeuchtigkeit (in Beuteln) unter Umgebungsfeuchtebedingungen und unter kontrollierten Bedingungen mit 10 % relativer Feuchte zu schützen. Zusätzlich zu dem hier beschriebenen spezifischen Experiment wurden mehrere zusätzliche Studien unter Verwendung von zusätzlichen Zeitpunkten und Formulierungsvarianten abgeschlossen.
Die Multiwellplatten wurden mit Aliquoten von Bulk-Reagenz gefüllt, während die Platten bei 2°-8 °C auf Eis gehalten wurden. Es wurden ausreichende Mengen von allen erforderlichen Komponenten gemischt, um ein Bulk-Reagenz zu erzeugen, das ein ausreichendes Volumen aufweist, um 30 Multiwellplatten aufzufiillen, sowie 5 % Überschuss. Das Mischen erfolgte gemäß den folgenden Anleitungen. Zugeben in folgender Reihenfolge: Nuklease-freies Wasser, 2 X Glycerol-freien GoTaq Master-Mix (Formulierungen sind nachstehend gezeigt), 1,2 M Trehalose, 10 X Sonde/Primer-Mix und 50 X Promega RT (0,5 % Glycerolformulierung für die Lyophilisierung). Die Wells von mehreren Multiwellplatten wurden mit 24 ul Bulk-Reagenz pro Well innerhalb 1 Stunde befiillt. Die Multiwellplatten wurden auf Eis gelegt, um sie vor dem Befüllen der Röhrchen bei 2 °C-8 °C zu äquilibrieren. Das flüssige Bulk-Reagenz wurde auf dem Boden von jedem Röhrchen abgegeben. Während des Befüllens innerhalb 1 Stunde wurden die Multiwellplatten auf Eis gehalten. Gefüllte Multiwellplatten wurden innerhalb von 30 Minuten nach Beendigung des Befüllens in die Lyophilisierungskammer eingebracht. Die gefüllten Multiwellplatten wurden dann den Lyophilisierungsbedingungen ausgesetzt. Nach dem Lyophilisierungsprozess wurden die Multiwellplatten bedeckt/verschlossen bevor sie aus der Lyophilisierungskammer wieder entnommen wurden. Es wurden zwei Multiwellplatten auf den Labortisch gestellt. Die verbleibenden Multiwellplatten wurden in eine voräquilibrierte Glovebox mit 10 % relativer Feuchte überführt, um als Proben mit T = 0 zu dienen; sie wurden freigelegt/geöffnet und dann nach verschiedenen Zeitspannen, wie in Tabelle 13 angegeben, hitzeversiegelt. Es wird eine Versiegelungszeit von 6 Sekunden und eine Versiegelungstemperatur von 169 °C angewendet. Innerhalb von 5 Minuten wurden die versiegelten Multiwellplatten in einen Druckverschlussfolienbeutel, der ein Trockenmittelkissen enthielt, überführt und dann hitzeversiegelt. Die anderen Multiwellplatten auf dem Labortisch wurden freigelegt/geöffnet und der Umgebungsatmosphäre für verschiedene Zeiträume, wie in Tabelle 13 nachstehend gezeigt, ausgesetzt.
Die relative Feuchte und Temperatur zur Zeit der Aussetzung, Versiegelung und Überführung in Beutel wurde aufgenommen. Nach der Aussetzung wurden die Multiwellplatten mit Folienmaterial unter Verwendung einer Versiegelungszeit von 6 Sekunden und einer Versiegelungstemperatur von 169 °C hitzeversiegelt. Der Hitzeversiegelungsprozess erfolgte bei Expositionsbedingungen (d. h. die Multiwellplatten, die der Laboratmosphäre ausgesetzt waren, wurden im Labor versiegelt und die Multiwellplatten, die einer entfeuchteten Bedingung ausgesetzt waren, wurden unter der entfeuchteten Bedingung versiegelt) unter Verwendung der gleichen Versiegelungszeit-/-temperaturparameter wie vorstehend. Innerhalb von 5 Minuten wurden die versiegelten Multiwellplatten in einen Druckverschlussfolienbeutel, der ein Trockenmittelkissen enthielt, überführt und der Beutel wird hitzeversiegelt. Alle versiegelten Beutel wurden dann bei 2-8 °C gelagert.
Es wurden zwei Multiwellplatten pro Zeitpunkt untersucht. Unter Umgebungsbedingungen, nach der Lyophilisierung, waren die Multiwellplatten für 0, 4 und 8 Stunden abgedichtet (siehe Tabelle 13). Unter Bedingungen mit 10 % relativer Feuchte, nach der Lyophilisierung, waren die Multiwellplatten für 0, 4, 8 und 24 Stunden abgedichtet (siehe Tabelle 13). Zwei Multiwellplatten pro Zeitpunkt mal der Zahl der Bedingungen = 2 * 3 (Umgebung = 6) bzw. 2 * 4 (Glovebox mit 10 % relativer Feuchte = 8).
Die Formulierung ohne Salz wurde unter Verwendung von 2 X GoTaq Master-Mix, Glycerol-frei + 10 x Sonde/Primer + Trehalose + 50 X RT hergestellt. Für beispielsweise 30 Multiwellplatten ist die Zugabe in folgender Reihenfolge notwendig: 449 µl Nuklease-freies Wasser, 4,81 ml 2 X GoTaq Master-Mix (B, kein Salz) (1,25 X End-), 1,28 ml 1,2 M Trehalose (0,2 M End-), 963 µl 10 X Sonde/Primer-Mix (1,25 X End-), 193 µl 50 X RT (1,25 X End-) = 7,70 ml Mischung ohne Salz; Abgabe von 24 ul für 300 Röhrchen unter Verwendung einer Repetierpipette.
Die Formulierung mit Salz wurde unter Verwendung von 2 X GoTaq Master-Mix, Glycerol-frei + 10 x Sonde/Primer + Trehalose + 50 X RT hergestellt. Für beispielsweise 38 Multiwellplatten ist die Zugabe in folgender Reihenfolge notwendig: 560 µl Nuklease-freies Wasser, 6,00 ml 2 X GoTaq Master-Mix (B, enthält Salz) (1,25 X End-), 1,60 ml 1,2 M Trehalose (0,2 M End-), 1,20 ml 10 X Sonde/Primer-Mix (1,25 X End-), 240 µl 50 X RT (1,25 X End-) = 9,60 ml Salz-enthaltende Mischung; Abgabe von 24 ul für 380 Röhrchen unter Verwendung einer Repetierpipette.
Die Multiwellplatten wurden auf die Leistung gemäß Tabelle 13 untersucht. Im Schritt A von Tabelle 13 wurde die Formulierung ohne Salz in die Multiwellplatten gegeben und lyophilisiert. Nach der Lyophilisierung wurden die Multiwelleinsätze nach Aussetzung gegenüber der Bedingung und für die angegebenen Zeiträume abgedichtet. Im Schritt B von Tabelle 13 wurde die Formulierung ohne Salz in die Multiwelleinsätze gegeben und lyophilisiert. Nach der Lyophilisierung wurden die Multiwelleinsätze nach Aussetzung gegenüber der Bedingung und für die angegebenen Zeiträume abgedichtet. Im Schritt C von Tabelle 13 wurde die Formulierung mit Salz in die Multiwelleinsätze gegeben und lyophilisiert. Nach der Lyophilisierung wurden die Multiwelleinsätze nach Aussetzung gegenüber der Bedingung und für die angegebenen Zeiträume abgedichtet.
Umgebungs- und Glovebox-Temperaturen betrugen ungefähr 25 °C. Die Ergebnisse von diesem und zugehörigen Experimenten zeigten, dass die Aussetzung der Formulierung ohne Salz gegenüber 10 % relativer Feuchte für weniger als 8 Stunden zu einer annehmbaren Assay-Leistung führte. In diesem Beispiel führte ein Zeitraum von weniger als 8 Stunden bei 10 % relativer Feuchte (2,3 g/m³ bei 25 °C) mit einer Formulierung mit minimalem/keinem Salzgehalt zu einer annehmbaren Assay-Leistung.
Die vorliegende Offenbarung ist nicht durch Zusammensetzungen, Reagenzien, Verfahren, Diagnostik, Labordaten und dergleichen der vorliegenden Offenbarung zu beschränken und die vorliegende Offenbarung ist nicht durch jedwede bevorzugte Ausführungsformen, wie hierin offenbart sind, zu beschränken. Sofern nicht anders aus dem Kontext offensichtlich können jedwede Ausführungsform, jedweder Schritt, jedwedes Merkmal, jedweder Aspekt oder dergleichen zusammen mit jedwedem/jedweder anderen verwendet werden. Alle hierin angeführten Verweise sind unter Bezugnahme in gleichem Umfang eingeschlossen, als ob jedes einzelne Patent und jede veröffentlichte Patentanmeldung sowie Abbildungen, Zeichnungen, Sequenzprotokolle, Compactdiscs und dergleichen zum Einschluss unter Bezugnahme speziell und einzeln angegeben wären.

Claims

Zusammensetzung, die eine wässrige Lösung umfasst, die mindestens eine Polymerase, einen Füllstoff, einen Chelatbildner, ein Detergens und einen organischen Puffer enthält, wobei die wässrige Lösung eine Konzentration an anorganischem Salz von 7 mM oder weniger aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die wässrige Lösung weiter mindestens ein Oligonukleotid umfasst, das zur Durchführung eines molekularen Assays verwendbar ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei das mindestens eine Oligonukleotid aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Folgenden besteht: einem Amplifikationsoligonukleotid, einem Detektionssondenoligonukleotid, einem Zieleinfang-Sondenoligonukleotid, einem Adapteroligonukleotid und Kombinationen davon.
Zusammensetzung nach Anspruch 2 oder 3, wobei das mindestens eine Oligonukleotid ein Detektionssondenoligonukleotid einschließt und wobei das Detektionssondenoligonukleotid weiter mindestens eine Markierung umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei die Markierung aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem fluoreszierenden Molekül, einem Quencher-Molekül, einem lumineszierenden Molekül und Kombinationen davon besteht.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei die Markierung ein fluoreszierendes oder lumineszierendes Molekül ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder 6, wobei die Detektionssonde ein TaqMan-Detektionssondenoligonukleotid, ein Detektionssondenoligonukleotid „Molecular Beacon“ oder ein Detektionssondenoligonukleotid „molekulare Fackel“ ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 7, wobei das mindestens eine Oligonukleotid ein Zieleinfang-Sondenoligonukleotid einschließt.
Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei das Zieleinfang-Sondenoligonukleotid einen Ziel-hybridisierenden Teil aufweist, der mit einer Ziel-Nukleinsäure unter stringenten Bedingungen spezifisch hybridisiert.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 9, wobei die wässrige Lösung Oligonukleotide für die Durchführung eines molekularen Multiplex-Assays umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 10, wobei das mindestens eine Oligonukleotid ein Adapteroligonukleotid einschließt, das zur Bildung einer Haarnadel konfiguriert ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 11, wobei die wässrige Lösung Oligonukleotide für die Durchführung eines Nukleinsäuresequenzierungsassays umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei der Füllstoff Trehalose, Raffinose oder eine Kombination davon ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei der Füllstoff Trehalose ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1, 13 und 14, wobei der Füllstoff in einer Konzentration von etwa 0,16 M bis etwa 0,32 M vorliegt.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die wässrige Lösung eine Konzentration an anorganischem Salz von 5 mM oder weniger aufweist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei die anorganischen Salze in einer Masse pro Mikroliter von etwa 0,373 ug/ul etwa 0,029 ug/ul vorliegen.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei die wässrige Lösung von etwa 0,292 ug/ul an Natriumchlorid bis etwa 0,029 ug/ul an Natriumchlorid enthält.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei die wässrige Lösung von etwa 0,373 ug/ul an Kaliumchlorid bis etwa 0,019 ug/ul an Kaliumchlorid enthält.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei die wässrige Lösung von etwa 0,115 ug/ul an Natriumionen bis etwa 0,006 ug/ul an Natriumionen enthält.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder 20, wobei die wässrige Lösung von etwa 0,196 ug/ul an Kaliumionen bis etwa 0,010 ug/ul an Kaliumionen enthält.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, 20 oder 21, wobei die wässrige Lösung von etwa 0,355 ug/ul Chloridionen bis etwa 0,009 ug/ul Chloridionen enthält.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die wässrige Lösung eine Konzentration an anorganischem Salz von 4 mM oder weniger umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 23, wobei die wässrige Lösung eine Masse pro Mikroliter an anorganischem Salz von etwa 0,298 ug/ul bis etwa 0,234 ug/ul umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 23 oder 24, wobei die wässrige Lösung eine Masse pro Mikroliter an Chloridionen von etwa 0,284 ug/ul bis etwa 0,071 ug/ul umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die wässrige Lösung eine Konzentration an anorganischem Salz von 3 mM oder weniger umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 26, wobei die wässrige Lösung eine Masse pro Mikroliter an anorganischem Salz von etwa 0,224 ug/ul bis etwa 0,175 ug/ul umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 26 oder 27, wobei die wässrige Lösung eine Masse pro Mikroliter an Chloridionen von etwa 0,213 ug/ul bis etwa 0,053 ug/ul umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die wässrige Lösung eine Konzentration an anorganischem Salz von 2 mM oder weniger umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 29, wobei die wässrige Lösung eine Masse pro Mikroliter an anorganischem Salz von etwa 0,149 ug/ul bis etwa 0,117 ug/ul umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 29 oder 30, wobei die wässrige Lösung eine Masse pro Mikroliter an Chloridionen von etwa 0,142 ug/ul bis etwa 0,036 ug/ul umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die wässrige Lösung eine Konzentration an anorganischem Salz von 1 mM oder weniger umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 32, wobei die wässrige Lösung eine Masse pro Mikroliter an anorganischem Salz von etwa 0,075 ug/ul bis etwa 0,058 ug/ul umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 32 oder 33, wobei die wässrige Lösung eine Masse pro Mikroliter an Chloridionen von etwa 0,071 ug/ul bis etwa 0,018 ug/ul umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die wässrige Lösung eine Konzentration an anorganischem Salz von 500 uM oder weniger umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 35, wobei die wässrige Lösung eine Masse pro Mikroliter an anorganischem Salz von etwa 0,037 ug/ul bis etwa 0,029 ug/ul umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 35 oder 36, wobei die wässrige Lösung eine Masse pro Mikroliter an Chloridionen von etwa 0,036 ug/ul bis etwa 0,009 ug/ul umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die Konzentration an anorganischem Salz der wässrigen Lösung weniger als 1 mM Natriumchlorid beträgt.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die wässrige Lösung kein Natriumchlorid enthält.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die wässrige Lösung weniger als 1 mM Magnesiumionen enthält.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 40, wobei die wässrige Lösung weniger als 0,1 mM Magnesiumionen, geeigneterweise keine Magnesiumionen enthält.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 41, wobei die wässrige Lösung weiter Desoxynukleosidtriphosphate (dNTPs) umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 42, wobei die dNTPs dATP in einer Konzentration von 0,1 mM bis 0,3 mM in der wässrigen Lösung einschließen.
Zusammensetzung nach Anspruch 43, wobei das dATP in einer Konzentration von 0,2 mM in der wässrigen Lösung vorliegt.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 42 bis 44, wobei die dNTPs dGTP in einer Konzentration von 0,1 mM bis 0,3 mM in der wässrigen Lösung einschließen.
Zusammensetzung nach Anspruch 45, wobei das dGTP in einer Konzentration von 0,2 mM in der wässrigen Lösung vorliegt.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 42 bis 46, wobei die dNTPs dCTP in einer Konzentration von 0,1 mM bis 0,3 mM in der wässrigen Lösung einschließen.
Zusammensetzung nach Anspruch 47, wobei das dCTP in einer Konzentration von 0,2 mM in der wässrigen Lösung vorliegt.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 42 bis 48, wobei die dNTPs dTTP in einer Konzentration von 0,2 mM bis 0,6 mM in der wässrigen Lösung einschließen.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 42 bis 49, wobei die dNTPs dUTP in einer Konzentration von 0,2 mM bis 0,6 mM in der wässrigen Lösung einschließen.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 50, wobei die mindestens eine Polymerase eine Polymerase einschließt, die in der wässrigen Lösung in einer Konzentration von etwa 0,20 U/ul bis etwa 0,72 U/ul in der wässrigen Lösung vorliegt.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 50, wobei die mindestens eine Polymerase eine Polymerase einschließt, die in der wässrigen Lösung in einer Konzentration vorliegt, die aus folgenden ausgewählt ist: 0,25 U/ul, 0,30 U/ul bis 0,32 U/ul, 0,4 U/ul, 0,5 U/ul, 0,45 U/ul und 0.72 U/ul.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 52, wobei die mindestens eine Polymerase eine Polymerase einschließt, die eine Hot-Start-Polymerase ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 53, wobei die Hot-Start-Polymerase eine rekombinante Taq-DNA-Polymerase ist, die durch einen Antikörper gebunden ist, der die Polymeraseaktivität der Polymerase spezifisch blockiert.
Zusammensetzung nach Anspruch 53, wobei die Hot-Start-Polymerase eine chemisch modifizierte rekombinante Taq-DNA-Polymerase ist, wobei die chemische Modifikation die Polymeraseaktivität der Polymerase inhibiert.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 55, wobei die mindestens eine Polymerase eine reverse Transkriptase einschließt, die in der wässrigen Lösung in einer Konzentration von etwa 0,1 U/ul bis etwa 0,6 U/ul vorliegt.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 56, wobei die reverse Transkriptase eine AMV-reverse-Transkriptase ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 56, wobei die reverse Transkriptase eine MMLV-reverse-Transkriptase ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 58, wobei die wässrige Lösung weiter einen RNase-Inhibitor umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 59, wobei der RNase-Inhibitor in der wässrigen Lösung in einer Konzentration von etwa 0,12 U/ul bis etwa 0,20 U/ul vorliegt.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 60, wobei der Chelatbildner aus der Gruppe ausgewählt, die aus EDTA, EDDS, MGDA, EGTA und DTPA besteht.
Zusammensetzung nach Anspruch 61, wobei der Chelatbildner EDTA ist und in der wässrigen Lösung in einer Konzentration von 1,5 mM bis 2,0 mM vorliegt.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 61, wobei das Detergens ein ionisches Detergens ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 63, wobei das Detergens ein kationisches Detergens ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 63, wobei das Detergens ein anionisches Detergens ist.
Getrocknete Form der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 65.
Getrocknete Zusammensetzung, die mindestens eine Polymerase, einen Füllstoff, einen Chelatbildner, einen organischen Puffer, ein oder mehrere anorganische Salze und ein Detergens umfasst, wobei das eine oder die mehreren anorganischen Salze in der getrockneten Zusammensetzung in einer Masse vorliegen, die 0,350 % oder weniger der Gesamtmasse der getrockneten Zusammensetzung beträgt.
Getrocknete Zusammensetzung nach Anspruch 67, wobei das eine oder die mehreren anorganischen Salze in der getrockneten Zusammensetzung in einer Masse vorliegen, die von etwa 0,311 % bis etwa 0,024 % der Gesamtmasse der getrockneten Zusammensetzung beträgt.
Getrocknete Zusammensetzung nach Anspruch 67, wobei das eine oder die mehreren anorganischen Salze aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Folgenden besteht: Natriumchlorid, Kaliumchlorid und sowohl Natriumchlorid als auch Kaliumchlorid.
Getrocknete Zusammensetzung nach Anspruch 67 bis 69, wobei die getrocknete Zusammensetzung weiter mindestens ein Oligonukleotid umfasst, das zur Durchführung eines molekularen Assays verwendbar ist.
Getrocknete Zusammensetzung nach Anspruch 70, wobei das mindestens eine Oligonukleotid aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Folgenden besteht: einem Amplifikationsoligonukleotid, einem Detektionssondenoligonukleotid, einem Zieleinfang-Sondenoligonukleotid, einem Adapteroligonukleotid und Kombinationen davon.
Getrocknete Zusammensetzung nach Anspruch 70 oder 71, wobei das mindestens eine Oligonukleotid ein Detektionssondenoligonukleotid einschließt und wobei das Detektionssondenoligonukleotid weiter mindestens eine Markierung umfasst.
Getrocknete Zusammensetzung nach Anspruch 72, wobei die Markierung aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem fluoreszierenden Molekül, einem Quencher-Molekül, einem lumineszierenden Molekül und Kombinationen davon besteht.
Getrocknete Zusammensetzung nach Anspruch 73, wobei die Markierung ein fluoreszierendes oder lumineszierendes Molekül ist.
Getrocknete Zusammensetzung nach Anspruch 73 oder 74, wobei die Detektionssonde ein TaqMan-Detektionssondenoligonukleotid, ein Detektionssondenoligonukleotid „Molecular Beacon“ oder ein Detektionssondenoligonukleotid „molekulare Fackel“ ist.
Getrocknete Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 70 bis 75, wobei das mindestens eine Oligonukleotid ein Zieleinfang-Sondenoligonukleotid einschließt.
Getrocknete Zusammensetzung nach Anspruch 76, wobei das Zieleinfang-Sondenoligonukleotid einen Ziel-hybridisierenden Teil aufweist, der mit einer Ziel-Nukleinsäure unter stringenten Bedingungen spezifisch hybridisiert.
Getrocknete Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 70 bis 77, wobei die getrocknete Zusammensetzung Oligonukleotide für die Durchführung eines molekularen Multiplex-Assays umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 70 bis 78, wobei das mindestens eine Oligonukleotid ein Adapteroligonukleotid einschließt, das zur Bildung einer Haarnadel konfiguriert ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 70 bis 79, wobei die wässrige Lösung Oligonukleotide für die Durchführung eines Nukleinsäuresequenzierungsassays umfasst.
Getrocknete Zusammensetzung nach Anspruch 67, wobei der Füllstoff Trehalose, Raffinose oder eine Kombination davon ist.
Getrocknete Zusammensetzung nach Anspruch 81, wobei der Füllstoff Trehalose ist.
Getrocknete Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 67 bis 82, wobei die Zusammensetzung weiter Desoxynukleosidtriphosphate (dNTPs) umfasst.
Getrocknete Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 67 bis 83, wobei die mindestens eine Polymerase eine Hot-Start-Polymerase einschließt.
Getrocknete Zusammensetzung nach Anspruch 84, wobei die Hot-Start-Polymerase eine rekombinante Taq-DNA-Polymerase ist, die durch einen Antikörper gebunden ist, der die Polymeraseaktivität spezifisch blockiert.
Getrocknete Zusammensetzung nach Anspruch 84, wobei die Hot-Start-Polymerase eine chemisch modifizierte rekombinante Taq-DNA-Polymerase ist.
Getrocknete Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 67 bis 86, wobei die mindestens eine Polymerase eine reverse Transkriptase einschließt.
Getrocknete Zusammensetzung nach Anspruch 87, wobei die reverse Transkriptase eine AMV-reverse-Transkriptase ist.
Getrocknete Zusammensetzung nach Anspruch 87, wobei die reverse Transkriptase eine MMLV-reverse-Transkriptase ist.
Getrocknete Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 67 bis 89, wobei die Zusammensetzung weiter einen RNase-Inhibitor umfasst.
Getrocknete Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 67 bis 90, wobei der Chelatbildner aus der Gruppe ausgewählt, die aus EDTA, EGTA, DTPA, EDDS und MGDA besteht.
Getrocknete Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 67 bis 91, wobei das Detergens ein ionisches Detergens ist.
Getrocknete Zusammensetzung nach Anspruch 92, wobei das Detergens ein kationisches Detergens ist.
Getrocknete Zusammensetzung nach Anspruch 93, wobei das Detergens ein anionisches Detergens ist.
Verfahren zur Bildung einer Mischung für die Verwendung bei der Durchführung einer Nukleinsäure-basierten Amplifikationsreaktion, wobei das Verfahren die Vereinigung einer Rekonstitutionslösung und einer getrockneten Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 67 bis 94 umfasst, wobei die Rekonstitutionslösung mindestens ein anorganisches Salz umfasst.
Verfahren nach Anspruch 95, wobei die Rekonstitutionslösung eine Konzentration an anorganischem Salz von weniger als 1 mM umfasst.
Verfahren nach Anspruch 95 oder 96, wobei die Rekonstitutionslösung ein anorganisches Salz umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Natriumionen, Kaliumionen, Magnesiumionen, Manganionen, Chloridionen und Kombinationen davon besteht.
Verfahren nach Anspruch 95 oder 97, wobei die Rekonstitutionslösung MgCl₂ in einer Konzentration von etwa 3,8 mM bis etwa 4,4 mM, KCl in einer Konzentration von etwa 50 mM bis etwa 80 mM oder beide umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 95 bis 98, wobei die Rekonstitutionslösung Methylparaben in einer Konzentration von etwa 0,012 m/V-% bis etwa 0,020 m/V-%, Propylparaben in einer Konzentration von etwa 0,006 m/V-% bis etwa 0,010 m/V-%, absolutes Ethanol in einer Konzentration von etwa 0,20 V/V-% bis etwa 0,30 V/V-% oder eine Kombination davon umfasst.
Verfahren nach Anspruch 99, wobei die Konzentration des Methylparabens in der Rekonstitutionslösung 0,016 m/V-% beträgt.
Verfahren nach Anspruch 99, wobei die Konzentration des Propylparabens in der Rekonstitutionslösung 0,008 m/V-% beträgt.
Verfahren nach Anspruch 99, wobei die Konzentration des absoluten Ethanols in der Rekonstitutionslösung bei etwa 0,26 V/V-% vorliegt.
Verfahren für die Herstellung einer getrockneten Zusammensetzung für die Verwendung bei der Durchführung eines molekularen Assays, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (i) Gefrieren einer wässrigen Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 65, wodurch eine gefrorene Form der wässrigen Lösung gebildet wird; und (ii) Aussetzen der gefrorenen Form von Schritt (i) gegenüber Lyophilisierungsbedingungen, wodurch eine getrocknete Zusammensetzung gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 103, wobei die getrocknete Zusammensetzung einer feuchten Umgebung ausgesetzt wird, wobei die Höhe der absoluten Feuchte der feuchten Umgebung mehr als 2,3 Gramm Wasser pro Kubikmeter Luft beträgt.
Verfahren nach Anspruch 104, wobei die feuchte Umgebung eine Temperatur von 25 Grad Celsius hat.
Verfahren nach Anspruch 103, wobei die getrocknete Zusammensetzung der feuchten Umgebung für bis zu 3 Stunden ausgesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 103 bis 106, das weiter den Lagerungsschritt der getrockneten Zusammensetzung in einem abgedichteten Gefäß umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 103 bis 107, wobei die wässrige Lösung eine Einzeleinheitsdosis ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 103 bis 108, wobei die wässrige Lösung in einem Well einer Multiwellplatte vorliegt.
Verfahren für die Herstellung einer getrockneten Zusammensetzung für die Verwendung bei der Durchführung einer Nukleinsäure-basierten Amplifikationsreaktion, das den folgenden Schritt umfasst: Trocknen einer wässrigen Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 65 unter Verwendung eines Trocknungsverfahrens, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Folgenden besteht: Dehydratisierung, Desikkation, Lyophilisierung und Sprühtrocknung, wodurch eine getrocknete Zusammensetzung gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 110, wobei das Trocknungsverfahren Lyophilisierung ist und die getrocknete Zusammensetzung eine lyophilisierte Zusammensetzung ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 110 bis 111, das weiter den Lagerungsschritt der getrockneten Zusammensetzung in einem abgedichteten Gefäß umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 110 bis 112, wobei die wässrige Lösung eine Einzeleinheitsdosis ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 110 bis 113, wobei die wässrige Lösung in einem Well einer Multiwellplatte vorliegt.
Verwendung einer Mischung für die Durchführung eines molekularen Assays, wobei die Mischung eine Kombination aus einer Rekonstitutionslösung und der getrockneten Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 67 bis 94 ist und wobei die Rekonstitutionslösung mindestens ein anorganisches Salz umfasst.
Verwendung nach Anspruch 115, wobei der molekulare Assay ein molekularer Multiplex-Assay ist.
Verwendung nach Anspruch 115 oder 116, wobei der molekulare Assay ein Nukleinsäureamplifikationsassay ist.
Verwendung nach Anspruch 115 oder 116, wobei der molekulare Assay ein Nukleinsäuredetektionsassay ist.
Verwendung nach Anspruch 115 oder 116, wobei der molekulare Assay ein Nukleinsäureamplifikations- und -detektionsassay ist.
Verwendung nach Anspruch 115 oder 116, wobei der molekulare Assay ein Nukleinsäuresequenzierungsassay ist.