KR101423936B1 - 실시간 핵산 분석 통합 장치 및 이를 이용한 타겟 핵산의 검출방법 - Google Patents

실시간 핵산 분석 통합 장치 및 이를 이용한 타겟 핵산의 검출방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101423936B1
KR101423936B1 KR1020100021532A KR20100021532A KR101423936B1 KR 101423936 B1 KR101423936 B1 KR 101423936B1 KR 1020100021532 A KR1020100021532 A KR 1020100021532A KR 20100021532 A KR20100021532 A KR 20100021532A KR 101423936 B1 KR101423936 B1 KR 101423936B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
nucleic acid
real
time
target nucleic
well
Prior art date
Application number
KR1020100021532A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20100102560A (ko
Inventor
김유정
구완림
김종훈
장대진
서진철
김성열
박해준
박한오
이양원
Original Assignee
(주)바이오니아
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by (주)바이오니아 filed Critical (주)바이오니아
Priority to BRPI1008957A priority Critical patent/BRPI1008957B8/pt
Priority to JP2011553957A priority patent/JP5774499B2/ja
Priority to CN201080011492.4A priority patent/CN102388148B/zh
Priority to AU2010221905A priority patent/AU2010221905B2/en
Priority to US13/255,646 priority patent/US20120135394A1/en
Priority to RU2011141128/10A priority patent/RU2532853C2/ru
Priority to EP10751036.4A priority patent/EP2407557B1/en
Priority to CA2755234A priority patent/CA2755234C/en
Priority to PCT/KR2010/001530 priority patent/WO2010104345A2/ko
Publication of KR20100102560A publication Critical patent/KR20100102560A/ko
Priority to CL2011002228A priority patent/CL2011002228A1/es
Application granted granted Critical
Publication of KR101423936B1 publication Critical patent/KR101423936B1/ko

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C1/00—Magnetic separation
    • B03C1/005—Pretreatment specially adapted for magnetic separation
    • B03C1/01—Pretreatment specially adapted for magnetic separation by addition of magnetic adjuvants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C1/00—Magnetic separation
    • B03C1/02—Magnetic separation acting directly on the substance being separated
    • B03C1/28—Magnetic plugs and dipsticks
    • B03C1/288—Magnetic plugs and dipsticks disposed at the outer circumference of a recipient
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C1/00—Magnetic separation
    • B03C1/02—Magnetic separation acting directly on the substance being separated
    • B03C1/30—Combinations with other devices, not otherwise provided for
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/36—Apparatus for enzymology or microbiology including condition or time responsive control, e.g. automatically controlled fermentors
    • C12M1/38—Temperature-responsive control
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B99/00—Subject matter not provided for in other groups of this subclass
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C2201/00—Details of magnetic or electrostatic separation
    • B03C2201/26—Details of magnetic or electrostatic separation for use in medical applications
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/0098—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor involving analyte bound to insoluble magnetic carrier, e.g. using magnetic separation
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation

Abstract

본 발명은 실시간 핵산 분석 통합 장치 및 이를 이용한 방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 다양한 종류의 다수의 생물학적 시료로부터 시료에 상응되는 유전자의 정성분석 또는 정량분석을 동시에 수행하는 실시간 핵산 분석 통합 장치 및 이를 이용한 타겟 핵산의 검출방법으로, 상기 본 발명에 따른 실시간 핵산 분석 통합 장치 및 이를 이용한 타겟 핵산의 검출방법은 다양한 검체로부터 요구되는 다양한 타겟의 검사가 단 한번으로 신속하고 정확하게 처리되어 병의 진단이 필요한 병원 등에서 효율적으로 사용할 수 있는 장점이 있다.

Description

실시간 핵산 분석 통합 장치 및 이를 이용한 타겟 핵산의 검출방법{Universal automatic apparatus for real time monitoring of products of nucleic acid amplification reaction and method thereof}
본 발명은 실시간 핵산 분석 통합 장치 및 이를 이용한 타겟 핵산의 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 다양한 종류의 다수의 생물학적 시료로부터 시료에 상응되는 유전자의 정성분석 또는 정량분석을 동시에 수행하는 실시간 핵산 분석 통합 장치 및 이를 이용한 타겟 핵산의 검출방법에 관한 것이다.
체외진단검사(in vitro diagnostic testing: IVD testing)는 질병감염 여부 등을 판정할 목적으로 혈액, 뇨(urine), 타액(saliva) 등 인체에서 유래하는 시료를 검체로 하여 특정 지표물질을 검출하거나 정량 분석하는 검사이다. 분자진단검사(Molecular diagnostic testing) 또는 핵산진단검사(NAT; nucleic acid testing)는 체외진단검사 시장 중 가장 빠른 속도로 성장하는 분야이나 조작의 복잡성으로 인해 대형병원과 임상검사 전문기관을 중심으로 검사가 이루어지고 있다.
분자진단검사는 현재 감염질환 즉 바이러스, 세균 등의 정성, 정량검사가 주종을 이루고 있고 감염질환의 진단 검사의 결과를 독립적으로 확인하거나 변이주를 확인하기 위한 확진 검사(confirmatory test) 등이 이루어지고 있다. 종양의 조기확인, 치료법의 효능증가를 위한 진단검사(diagnostic test)도 빠른 속도로 늘어나고 있고 개인의 유전자 유전적 소인(genetic predisposition)에 따른 질병과 관련된 이상 유전자를 검출하거나 치료법의 결정과 약물 선택 및 약효 평가를 위한 개인맞춤의학(personalized medicine)의 분야에서 다양하게 응용이 되고 있다.
현대 이용되고 있는 분자진단검사의 자동화 시스템은 핵산추출, 증폭, 확인의 전 과정을 자동화한 방식으로 발전되어 가고 있다. 그 중 한 예로 Gen-Probe의 티그리스 다이렉트 튜브 샘플링(TIGRIS Direct 튜브 Sampling, TIGRIS DTS) 시스템은 미식약청의 승인을 받은 최초의 자동화 시스템으로 표적포획, 증폭, 확인, 검사결과 출력 과정이 자동화되어 있고, 대표적인 성병 중 하나인 임질의 원인균인 임질균(Neisseria gonorrhoeae)과 성 감염질환 원인균인 클라미디아 드라코마티스(Chlamydia trachomatis)의 감염여부를 검사할 수 있다. 다른 예로 로슈 분자 시스템(Roche Molecular Systems)의 COBAS 시스템(Ampliprep, Taqman analyzer), Abbott의 m2000 시스템(m2000sp, m2000rt), Cepheid의 GeneXpert 시스템, IQuum Inc의 Liat(Lab-in-a-튜브) analyzer 등도 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 기반의 자동화 시스템으로 개발되어 시장에 출시되어 있다.
그러나 상기 기존의 자동화 시스템은 한 종류의 시료를 가지고 시료의 준비(prep)-실시간 정량 분석-기록(report)까지 하나의 스텝으로 이루어져 있기 때문에 여러 가지 상이한 종류의 시료를 가지고 시료의 준비-실시간 정량, 정성분석-기록까지 동시에 한꺼번에 검사를 진행하는 것이 불가능하다.
특히, B형 간염의 경우에는 환자수가 많이 발생하는 반면, 결핵의 경우에는 환자수가 많지 않다. 이런 경우 검체가 일정 수량이 획득될 때까지 며칠 동안 기다린 후 검사를 진행하여야 하는 불편함이 있다. 여러 가지 종류의 검체를 진단검사 하는 경우에는 매 종류마다 다르게 검사를 해야 하므로 반복적으로 실험을 수행해야하기 때문에 하루에 많은 검사를 할 수 없는 번거로운 단점이 있다. B형 간염 바이러스 검출을 위해 B형 감염 검출을 위한 검체시료를 모아서 핵산을 분리정제하고, 증폭하기에는 시간이 많이 걸리게 된다.
상기의 경우와 같이 동일 종류의 검체시료를 다수 얻기까지는 시간이 많이 걸리며, 단지 몇 개의 B형 간염 검출시료를 분석하기에는 현재의 96웰 핵산증폭반응기를 사용하기에는 많은 낭비가 생기게 된다. 이 경우에는 결국 장치 작동을 낭비하게 되거나 며칠 더 검체시료가 얻어질 때까지 기다려야 한다. 이러한 이유로 중소규모의 병원에서는 비교적 적은 수의 임상검체로부터 다양한 임상검사를 수행하는 것은 경제적으로 시간적으로 제한이 되어, 외부의 검사기관에 위탁하게 됨에 따라 오히려 더 많은 시간, 비용 및 노력이 들어가는 문제점이 있었다.
이에 본 발명자들은 한 번에 여러 종류의 타겟을 동시에 추출하고 분석하여 보고(report)까지 가능한 자동화 시스템을 연구하던 중 비교적 검체 시료수가 많지 않은 중소 규모의 병원에서 다양한 진단 검사들을 효율적으로 수행하기 위하여 여러 종류의 검체시료를 모아서 당일에 여러 종류의 검체로부터 핵산을 추출하고 하나의 핵산 증폭기에서 동시에 검출하는 실시간 핵산 분석 통합 장치 및 이를 이용한 타겟 핵산의 분석방법을 개발하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 다양한 종류의 다수의 생물학적 시료로부터 시료에 상응되는 유전자의 정성분석 또는 정량분석을 동시에 수행하는 실시간 핵산 분석 통합 장치를 제공하고자 한다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 실시간 핵산 분석 통합 장치를 이용한 타겟 핵산의 검출방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 다양한 종류의 생물학적 시료에 상응되는 핵산의 정성분석 또는 정량분석을 동시에 수행하는 실시간 핵산 분석 통합 장치를 제공한다.
또한, 본 발명은 핵산을 포함하는 생물학적 시료로부터 상기 본 발명의 실시간 핵산 분석 통합 장치를 이용한 타겟 핵산의 검출방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은
다양한 종류의 생물학적 시료에 상응되는 타겟 핵산의 정성분석 또는 정량분석을 동시에 수행하는 실시간 핵산 분석 통합 장치로서,
타겟 핵산을 포함하는 다양한 생물학적 시료들로부터 각 시료에 포함된 타겟 핵산을 분리 정제하는, 다수의 자동정제분주장치(100);
멀티웰 온도순환블록(210)을 포함하며, 상기 다수의 자동정제분주장치(100)로부터 수득된 서로 다른 타겟 핵산의 양을 실시간으로 측정하는 실시간 핵산 증폭기(200)를 포함하고,
각각의 상기 자동정제분주장치(100)별로 분리 정제되는 서로 다른 타겟 핵산의 종류에 상응하도록 상기 실시간 핵산증폭기(200)의 온도순환블록(210)의 멀티웰 영역을 열 단위로 분할하여 타겟 핵산 종류별로 영역을 설정하고, 상기 설정된 영역의 각각의 웰 별로 상기 자동정제분주장치(100)에 따른 생물학적 시료들의 정보를 저장하고, 상기 온도순환블록을 동일한 조건하에서 동시에 증폭하여 각각의 타겟 핵산을 정성 분석 또는 정량 분석하는 증폭결과가 상기 자동정제분주장치(100)에서 분리 정제되는 각각의 생물학적 시료에 상응하도록 통합적으로 관리하는 제어부; 및
상기 제어부의 정성 분석 또는 정량 분석의 결과를 실시간으로 출력하는 디스플레이부(300)를 포함하는 것을 특징으로 하는 실시간 핵산 분석 통합 장치를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 실시간 핵산증폭기의 온도순환블록(210)의 멀티웰 영역은 열 단위로 분할하여 타겟 핵산 종류별로 영역을 설정하고, 설정된 영역의 각각의 웰 별로 상기 자동정제분주장치(100)에 따른 생물학적 시료들의 정보를 저장함에 있어서, 양성표준시료, 음성표준시료 또는 정량표준시료 정보를 추가로 저장하는 것을 특징으로 하는 실시간 핵산 분석 통합 장치를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기의 실시간 핵산 증폭기(200)는 상기 멀티웰 온도순환블록(210)에 다수의 자동정제분주장치(100)로부터 수득된 서로 다른 핵산을 함유하는 진단키트가 안착되는 것을 특징으로 하는 실시간 핵산 분석 통합 장치를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 멀티웰 온도순환블록(210)은 12열×8행의 웰로 된 96웰 온도순환블록인 것을 특징으로 하는 실시간 핵산 분석 통합 장치를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 멀티웰 온도순환블록(210)은 열의 단위로 선택적으로 측정항목이 설정되는 것을 특징으로 하는 실시간 핵산 분석 통합 장치를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 제어부는 각각의 상기 자동정제분주장치(100)에서 다양한 종류의 생물학적 시료와 함께 인터널 컨트롤(IPC)을 함께 분리하는 경우, 상기 자동정제분주장치(100)로부터 핵산 분리의 성공 여부를 상기 실시간 핵산 증폭기(200)에서의 증폭산물로부터 판단하여 핵산 분리의 재수행 여부를 결정할 수 있는 것을 특징으로 하는 실시간 핵산 분석 통합 장치를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 제어부는 상기 실시간 핵산 증폭기(200)를 동일한 조건하에서 동시에 증폭하여 얻어지는 각각의 생물학적 시료의 타겟 핵산의 Ct값을 임계 Ct값과 비교하여 타겟 핵산의 존재여부를 정성적으로 검출하는 것을 특징으로 하는 실시간 핵산 분석 통합 장치를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 제어부는 상기 실시간 핵산 증폭기(200)에서 동일한 조건으로 기지의 농도의 정량표준시료와 각각의 생물학적 시료를 동시에 증폭하여 얻어지는 각각의 Ct값을 정량표준시료의 Ct값 정량그래프와 비교하여 타겟 핵산의 수를 환산하여 시료내의 타겟 핵산을 정량적으로 결정하는 것을 특징으로 하는 실시간 핵산 분석 통합 장치를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 자동정제분주장치(100)는 핵산을 포함하는 다양한 생물학적 시료들과 이들로부터 핵산을 추출하는데 사용되는 버퍼들이 함유되어 있는 카트리지, 냉장블록, 고온블록, 폐액통, 피펫카트리지가 구비된 기판상으로 이동이 가능하며 피펫의 장착 및 탈착이 가능하며, 상기 피펫의 자기장 인가 또는 해제를 위한 자기장 인가수단을 구비하는 피펫블록을 포함하고, 상기 자동정제분주장치(100)에 따른 각각의 표준시료 및 생물학적 시료의 정보와 타겟 핵산의 정보가 제어부에서 저장되는 것을 특징으로 하는 실시간 핵산 분석 통합 장치를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 실시간 핵산 증폭기(200)는 설정된 온도로 변환되는 멀티웰 온도순환블록(210), 상기 온도순환블록에 장착된 반응튜브로의 광을 조사하기 위한 조사광원, 상기 반응튜브로부터 발생되는 광을 수광하기 위한 형광검출센서를 구비하며 상기 설정된 열 별로 측정항목이 설정되어 저장되는 것을 특징으로 하는 실시간 핵산 분석 통합 장치를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 실시간 핵산 분석 통합 장치는 분석결과를 저장하는 저장 데이터 베이스장치(400)를 더 구비하는 것을 특징으로 하는 실시간 핵산 분석 통합 장치를 제공한다.
본 발명은,
1) 다수의 자동정제분주장치(100)에서 표준시료와 핵산을 포함하는 다양한 생물학적 시료들로부터 각 시료에 포함된 핵산을 분리 정제한 후 분리 정제된 용액을 핵산증폭반응 혼합물 반응튜브에 가하여 혼합하는 단계;
2) 상기 핵산증폭반응 혼합물 반응튜브가 장착될 멀티웰 온도순환블록(210)과 상기 자동정제분주장치(100)에서 분리 정제되는 각각의 타겟 핵산이 상응하도록 멀티웰 온도순환블록(210)의 멀티웰을 타겟핵산 종류별로 열 단위로 분할하여 블록을 설정하고, 상기 설정된 블록내의 각각의 웰별로 상기 자동정제분주장치(100)에서 분리되는 표준시료와 생물학적 시료 정보를 저장하는 단계;
3) 단계 2)에서 저장된 실시간 핵산 증폭기의 멀티웰 온도순환블록(210)의 각 웰의 생물학적 시료 정보에 일치하도록 단계 1)에서 준비된 반응튜브를 각 웰에 장착하는 단계;
4) 상기 실시간 핵산 증폭기의 온도순환블록(210)에 장착된 각각의 타겟 핵산을 동일한 조건하에서 동시에 증폭하여 다수의 생물학적 시료들에 대한 각각의 타겟 핵산을 정성분석 또는 정량 분석하여 증폭결과를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 실시간 핵산 분석 통합 장치를 이용한 타겟 핵산의 검출방법를 제공한다.
본 발명에서 있어서, 상기 단계 2)와 단계 3)은 동시에 또는 단계 3)이 단계 2)보다 먼저 실행될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 자동정제분주장치(100)에서 생물학적 시료에 인터널 컨트롤(IPC)을 첨가하여 핵산을 분리하여, 상기 증폭결과로부터 자동정제분주장치(100)에서의 타겟 핵산 분리의 성공 여부와 증폭 효율을 판단하여 타겟 핵산의 검출의 유효성을 결정하는 것을 특징으로 하는 실시간 핵산 분석 통합 장치를 이용한 타겟 핵산의 검출방법를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 1) 단계에서 반응튜브는 핵산증폭에 필요한 성분들이 건조된 형태로 함유된 것으로서 여기에 분리 정제된 핵산 용액을 가하여 혼합하여 핵산증폭반응 혼합물 반응튜브를 제조하는 것을 특징으로 하는 실시간 핵산 분석 통합 장치를 이용한 타겟 핵산의 검출방법를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 인터널 콘트롤은 타겟핵산이 RNA인 경우에, 담배모자이크 바이러스 입자인 것을 특징으로 하는 실시간 핵산 분석 통합 장치를 이용한 타겟 핵산의 검출방법를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 인터널 콘트롤은 타겟핵산이 DNA인 경우에, 플라스미드 DNA 또는 PCR 증폭산물(PCR product)인 것을 특징으로 하는 실시간 핵산 분석 통합 장치를 이용한 타겟 핵산의 검출방법를 제공한다.
본 발명에 따른 실시간 핵산 분석 통합 장치는 적어도 두개 이상의 자동정제분주장치를 이용하여 다양한 종류의 생물학적 시료로부터 핵산의 분리 및 정제를 자동으로 할 수 있고, 실시간 핵산 증폭기에서 다양한 시료를 동일한 조건에서 한꺼번에 동시에 분석할 수 있으며, 자동정제분주장치와 실시간 핵산 증폭기를 관리하는 제어부에 의해 검사시간을 단축하고 비용을 절약할 수 있는 장점이 있다.
본 발명에 따른 실시간 핵산 분석 통합 장치를 이용한 타겟 핵산의 검출방법은 자동정제분주장치에서 생물학적 시료와 함께 본 발명의 인터널 콘트롤을 첨가하여 분리정제 함으로써 생물학적 시료 각각에 대한 핵산 분리의 유무 및 실시간 핵산 증폭기에서의 핵산 증폭과정의 문제를 확인할 수 있는 장점이 있다.
또한, 각각의 자동정제분주장치에서 분리 정제되는 서로 다른 타겟 핵산의 종류에 상응하도록 열 단위로 멀티웰 온도순환블록의 멀티웰 영역을 타겟 핵산의 종류별로 설정할 수 있어, 다양한 검체로부터 요구되는 다양한 타겟의 검사가 일련의 한 단계 과정으로 병렬적으로 처리되어 병의 신속한 진단이 필요한 병원 등에서 효율적으로 사용할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 본 발명에 따른 실시간 핵산 분석 통합 장치의 개략도이고,
도 2는 본 발명에 따른 실시간 핵산 증폭기(200)에 구비된 멀티웰 온도순환블록(210)의 도면이며,
도 3은 본 발명에 따른 디스플레이부(300)에 대한 도면이고,
도 4는 본 발명에 따른 실시간 핵산 분석 통합 장치의 전체 플로우 다이아그램(flow diagram)을 보여주는 도면이고,
도 5는 본 발명에 따른 자동정제분주장치에 있어서, 카트리지의 시료 로딩웰 부분을 나타낸 도면이며,
도 6은 본 발명에 따른 담배 모자이크 바이러스 입자(IPC)에 따른 담배 모자이크 바이러스(TMV) 표준 주형의 실시간 중합효소 연쇄반응의 그래프를 보여주는 도면이고,
도 7은 본 발명에 따른 담배 모자이크 바이러스 입자(IPC)에 따른 담배 모자이크 바이러스(TMV) 표준 주형의 실시간 중합효소 연쇄반응의 그래프에 대한 표준곡선(기울기: -0.283, R2:1)을 보여주는 도면이며,
도 8은 본 발명의 HBV Quantitative PCR Kit를 실시간 핵산 증폭기에서 HBV 표준 주형 DNA에 대한 실시간 중합효소 연쇄반응의 그래프를 보여주는 도면이고,
도 9는 본 발명의 HBV Quantitative PCR Kit를 실시간 핵산 증폭기에서 HBV 표준 주형 DNA에 대한 실시간 중합효소 연쇄반응의 그래프에 대한 표준곡선(기울기: -0.2882, R2: 0.9997)을 보여주는 도면이며,
도 10은 본 발명의 HCV Quantitative RT-PCR Kit를 실시간 핵산 증폭기에서 HCV 표준 주형 RNA의 실시간 중합효소 연쇄반응의 그래프를 보여주는 도면이고,
도 11은 본 발명의 HCV Quantitative RT-PCR Kit를 실시간 핵산 증폭기에서 HCV 표준 주형 RNA의 실시간 중합효소 연쇄반응의 그래프에 대한 표준곡선(기울기: -0.2970, R2: 0.9998)을 보여주는 도면이다.
이하 첨부한 도면들을 참조하여 본 발명의 실시간 핵산 분석 통합 장치를 상세히 설명한다. 다음에 소개되는 도면들은 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이며 과장되어 도시될 수 있다.
이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
[실시예 1]
실시예 1은 본 발명에 따른 실시간 핵산 분석 통합 장치에 관한 것으로 도 1은 본 발명에 따른 실시간 핵산분석 통합 장치의 개략도를 보여주는 것으로 이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
상기 실시간 핵산분석 통합 장치는 핵산을 포함하는 다양한 종류의 생물학적 시료로부터 서로 다른 핵산을 분리 정제하기 위한 다수의 자동정제분주장치(100)를 구비한다. 상기 생물학적 시료는 자연 환경에서 분리되고 핵산을 포함하는 생물학적 물질을 의미한다. 본 발명에 따른 생물학적 시료는 정제되거나 분리된 핵산용액, 미생물, 조직, 생물학적 유체 또는 세포일 수 있다. 생물학적 유체에는 혈액, 혈장, 가래, 뇨, 뇌 척수액, 위세척액, 루코포레시스(leukophoresis), 인체로부터 얻어진 각종 검체시료 등이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 시료는 핵산을 포함하는 임의 식물, 동물, 인체, 세균 또는 바이러스로부터 유래되는 샘플로 구성될 수 있다. 본 발명에서 핵산은 통상 DNA, RNA, PNA, DNA와 RNA의 hybrid 및 이들을 함유하는 물질을 의미하나 이에 한정되는 것은 아니며 본 발명의 장치를 단백질 같은 물질을 분리, 검출하는데 채택하여 사용할 수 있을 것이다.
도 1을 참조하면 본 발명의 자동정제분주장치(100)는 단일 또는 복수, 여러종류의 시료로부터 핵산을 분리하기 위해서 바람직하게는 2 내지 6개로 다수 장착하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 자동정제분주장치(100)는 많은 수의 생물학적 시료용액으로부터 핵산을 분리하기 위하여 자성입자를 이용하여, 자성입자와 핵산을 가역적으로 결합시켜 핵산을 분리하는 것이 특징이다.
상기 자동정제분주장치(100)는 핵산을 자동으로 정제하고 분주하는 장비로서 핵산을 포함하는 다양한 생물학적 시료들과 이들로부터 핵산을 추출하는데 사용되는 버퍼들이 함유되어 있는 카트리지, 냉장블록, 고온블록, 폐액통, 피펫카트리지 및 피펫의 장착 및 탈착이 가능하며 상기 피펫의 자기장 인가 또는 해제를 위한 자기장 인가수단을 구비하고, 상기 블록들 및 카트리지가 구비된 기판상으로 이동이 가능한 피펫블록을 포함한다. 또한, 상기 피펫블록은 8 내지 16개의 피펫이 장착 및 탈착이 가능하다.
많은 수의 생물학적 시료용액으로부터 핵산 분리에 이용되는 자성입자들은 버퍼용액 내에서 핵산과 결합하게 되고, 피펫내부로 자성입자와 결합된 핵산이 흡입된 상태에서 자기장을 피펫에 인가한 경우 핵산이 결합된 자성입자들은 피펫내부에 응집되어 부착되게 되며, 그 밖의 다른 용액들은 피펫 밖으로 배출되게 된다.
본 발명의 자성입자는 표면적이 넓은 미세한 자성 입자를 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 피펫에 자기장을 가하기 위한 자기장 인가수단으로서는 영구자석 또는 전자석이 사용될 수 있으며 피펫에 가역적으로 자기장을 가하게된다. 피펫의 작동은 피펫에 연결된 피스톤에 의하여 용액이 배출될 수 있으며, 피펫 이동수단에 의하여 이동이 가능하도록 할 수 있다.
본 발명의 자동정제분주장치(100)는 통상의 공지된 자동정제분주장치를 사용할 수 있으며, 예를 들면 한국등록특허 148239호, US5702590, US5647994, EP 0691541, US 5336760호, US5897783호, US6187270호, 한국특허출원 10-2008-0032904호에 기재된 장치가 사용될 수 있다. 또한 바이오니아사의 ExiPrepTM 16-fully Automated DNA/RNA/Proteins Purification System이 본 발명의 자동정제분주장치(100)로 바람직하게 사용될 수 있다.
상기 자동정제분주장치(100)에서 분리/정제된 핵산은 미리 장착된 단위 반응튜브로 된 진단키트에 분주되게 되고, 사용자는 자동정제분주장치(100) 내에서 분주된 8-웰 스트립튜브로 된 진단키트들을 꺼내어 투명필름으로 밀봉을 한 후, 실시간 핵산정량증폭기의 설정된 열에 안착시킨 후 동작을 하여 결과를 자동으로 도출시킨다.
상기 핵산을 함유하는 생물학적 시료로부터 핵산을 분리, 정제하기 위한 다수의 자동정제분주장치(100)는 바코드(bar code)인식 장치(도면 미부여)를 추가할 수 있다. 바코드인식 장치에 의해 인식된 생물학적 시료 정보는 데이터베이스화되어 실시간 핵산 분석 통합 장치 내 시스템 관리(manager) 소프트웨어인 제어부에 저장되며, 이러한 정보는 실시간 핵산 증폭기(200)에도 자동 적용될 수 있다. 상기 바코드는 생물학적 시료의 성별, 나이, 종류 등 시료 사이에 식별이 가능하고 필요한 내용을 바탕으로 분류할 수 있는 내용을 나타낸다.
본 발명은 상기 다수의 자동정제분주장치(100)로부터 수득된 서로 다른 타겟 핵산을 실시간으로 증폭하는 실시간 핵산 증폭기(200)를 포함한다.
본 발명의 실시간 핵산 증폭기(200)는 상기 자동정제분주장치(100)로부터 분리 및 정제된 핵산에 상응하는 진단키트가 안착되며, 설정된 온도로 변화되는 멀티웰 온도순환블록(210), 상기 온도순환블록에 장착된 반응튜브 내로 광을 조사하기 위한 광원 및 반응튜브 내의 검출표지로부터 발생되는 광을 수광하기 위한 형광검출센서를 포함하여 구성된다. 상기 형광검출센서의 결과들로부터 타겟 핵산에 대한 정량 및 정성 분석이 실시간으로 가능하다.
본 발명의 실시간 핵산 증폭기(200)는 실시간 중합효소 연쇄반응을 할 수 있는 장치로서, 공지된 실시간 핵산 중합효소 연쇄반응용 장치가 사용될 수 있으며, 바람직하게는 한국특허 제 794703호에 기재된 장치, PCT/KR2008/064558호에 기재된 장치, 또는 바이오니아의 Exicycler™ 96 Real-Time Quantitative Thermal Block 제품을 채택하여 사용할 수 있다.
상기 실시간 핵산 증폭기(200)는 멀티웰 온도순환블록(210)을 포함하며, 상기 멀티웰 온도순환블록은 12열×8행의 웰로 된 96웰로 되어 있고, 상기 멀티웰 온도순환블록은 열의 단위로 멀티웰 온도순환블록의 영역이 설정되며, 상기 멀티웰 온도순환블록의 열의 단위로 서로 다른 타겟 핵산의 종류에 따른 각각의 타겟 핵산의 증폭양 및 타겟 정보를 실시간으로 디스플레이부(300)에 표시되도록 할 수 있다. 본 발명에서는 열의 단위로 타겟 핵산의 검출항목이 설정되었지만 이에 한정되지 않고, 행 또는 웰 별로 변형하여 설정하는 것이 가능하다.
본 발명에 있어서, 상기 실시간 핵산 분석 통합 장치는 분석결과를 저장하는 저장 데이터 베이스장치(400)를 더 구비할 수 있다.
본 발명의 실시간 핵산 증폭기(200)는 상기 자동정제분주장치(100)에서 분리 정제되는 타겟 핵산의 종류 및 생물학적 시료에 대한 정보를 저장한다. 또한 상기 실시간 핵산 증폭기(200)는 각각의 자동정제분주장치(100)에서 분리된 각각의 타겟 핵산의 종류에 따라 열 단위로 멀티웰 온도순환블록(210)의 멀티웰 영역을 설정한다. 상기 멀티웰 온도순환블록에서 1개 이상의 열로 설정하는 것이 바람직하다. 동일한 검출타겟을 가지는 설정된 영역내의 각 웰은 웰은 생물학적 시료로부터 분리된 핵산과 표준시료가 들어가며 이들에 대한 정보가 각 웰 마다 저장된다.
본 발명에서 ‘웰(211a)’은 진단키트 반응튜브가 안착될 수 있는 멀티웰 온도순환블록(210)의 각 웰을 의미한다. 진단키트 종류에 따라 핵산증폭기의 온도순환블록상의 열 단위로 각각의 검출타겟을 설정한다.
본 발명은 자동정제분주장치(100)를 콘트롤하고 실시간 핵산증폭기(200)를 콜트롤하며, 상기 자동정제분주장치로부터의 정보를 실시간 핵산 증폭기에 전달하여 주고, 상기 실시간 핵산 증폭기의 정보를 저장하며 관리해 주는 실시간 핵산 분석 통합 장치 관리(manager) 소프트웨어를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 진단키트는 검출 가능한 표지를 포함하며, 특정 타겟 핵산을 증폭하기 위한 프라이머와 완충용액이 동량으로 들어있는 반응튜브(500)로 되어 있다.
본 발명에서 ‘반응튜브(500)’는 시료를 포함할 수 있는 용기를 의미하며, 1 내지 96개, 바람직하게는 8개, 12개, 16개, 96개로서, 이는 플라스틱 또는 유사 재료에 형성된 함몰 또는 튜브일 수 있고, 바람직하게는 규칙적인 패턴, 예를 들면, 격자형으로 96웰 반응 플레이트(12열×8행), 384웰 반응플레이트 또는 8-웰 스트립 형태로 된 튜브일 수 있다.
상기 진단키트 반응튜브(500)에는 타겟 핵산을 증폭하기 위한 프라이머, 검출가능한 표지 및 완충용액을 포함하며, 상기 분리된 핵산이 가해지며, 총 양은 10 내지 50 ㎕가 바람직하나 이에 한정되지는 않는다. 여러 진단키트의 서로 다른 프라이머 및 또는 프로브는 동일한 어닐링(T1) 온도에 의하여 증폭되며, 상기 진단키트의 단위 반응튜브 마다 서로 다른 타겟 핵산을 증폭하도록 조작된 프라이머와 프로브를 포함한다.
본 발명에서는 진단키트는 핵산의 특정부분을 증폭하기 위한 specific 프라이머, 형광이 부착된 프로브, DNA 중합효소, dNTP을 혼합한 조성물을 건조하여 제조된다. 안정화제를 추가하여 건조할 수 있다. 건조방법은 동결건조, 가온건조, 진공감압건조 등이 사용될 수 있다. 따라서 본 발명에서는 건조된 형태이기 때문에 용량의 조절없이 분리 정제된 핵산 용액의 일정량을 첨가하여 바로 핵산증폭 반응 혼합물을 만들 수 있다.
본 발명에서 각각의 진단키트에 사용되는 타겟 핵산의 검출을 위한 프라이머는 각 타겟 핵산의 진단검사를 위해 Tm(melting point, ℃)이 유사하도록 디자인된 염기서열을 이용한다. 상기 Tm(melting point, ℃)은 타겟 핵산의 일부 염기서열을 기초로 하여 설계되며, 어닐링(annealing) 온도를 바탕으로 하여 다양한 타겟 핵산을 동시에 선택적으로 증폭하기위해 동일한 반응온도 조건으로 설정하는 것이 중요하다. 본 발명에 따라서 한 사람으로부터의 검체시료 또는 여러 사람으로부터의 검체시료로부터 동시에 여러 타겟 핵산을 검출해 낼 수 있다. 예를 들면, AIDS, B형 간염, C형 간염, 성병진단을 동일한 증폭 조건에서 한꺼번에 하나의 실시간 핵산증폭기상에서 할 수 있게 된다.
도 2는 상기 다수의 진단키트 반응튜브(500)가 각각 대응되어 안착되는 다수의 웰을 구비하는 멀티웰 온도순환블록(210)의 도면이다. 본 발명에서 반응튜브(500)는 바람직하게는 8 스트립, 16 스트립 또는 96웰 플레이트 형태로 이루어질 수 있다.
도 2를 참조하면, 상기 설정된 영역의 열의 웰(211a)은 동종의 생물학적 시료로부터 분리 정제된 핵산이 주입된 반응튜브가 안착되고, 각각의 블록 중 동일한 열에 안착된 반응튜브에는 동일한 타겟 핵산을 증폭하도록 조작된 프라이머 및/또는 프로브가 함유되어 있다.
도 2를 참조하면 상기 멀티웰 온도순환블록(210)은 다수개의 웰(211)로 되어 있다. 각각의 웰(211a)에 진단 키트의 반응튜브(500)가 안착될 수 있다. 본 발명에서는 멀티웰 온도순환블록상에 서로 다른 여러 개의 진단키트 반응튜브가 안착될 수 있으며, 열 단위로 멀티웰 온도순환블록의 멀티웰 영역을 타겟 핵산 종류별로 설정한다. 멀티웰 온도순환블록상에 타겟 핵산이 서로 상이한 다수의 진단키트가 안착되고, 이에 따라서 서로 다른 타겟 핵산의 종류에 상응하도록 열 단위로 멀티웰 온도순환블록상의 멀티웰 영역을 타겟 핵산 종류별로 지정하여 주지만, 증폭반응 조건은 동일하게 진행되는 것이 특징이다.
본 발명의 실시간 핵산 증폭기의 멀티웰 온도순환블록(210)은 96웰(12열×8행) 형태일 수 있고, 상기 멀티웰 온도순환블록의 멀티웰 영역은 인접한 한개 내지 두개의 열의 단위로 검출 타겟을 설정하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 실시간 핵산 증폭기(200)는 후술하는 제어부의 제어하에 제1 온도인 어닐링(T1) 온도와 제2 온도인 확장(T2) 온도로 반복하여 변화된다.
따라서, 웰(211a)에 안착되는 진단키트 반응튜브는 제1 온도인 어닐링(T1) 온도와 제2 온도인 확장(T2) 온도사이에서 변화됨에 따라 핵산이 증폭되어지며, 제3 온도가 변성을 위해 더 요구될 수도 있다. 상기 멀티웰 온도순환블록(210)은 제1 온도인 어닐링(T1) 온도, 제2 온도인 확장(T2) 온도 및 제3 온도는 타겟 핵산에 따라 다양하게 설정될 수 있다.
실시간 핵산 증폭기(200)는 멀티웰 온도순환블록상에 설정된 영역의 타겟 핵산의 종류 및 생물학적 시료에 대한 정보를 바탕으로 하여, 동시에 각각의 타겟 핵산의 증폭 정도 및 양을 측정하며, 상기 타겟 핵산의 측정은 반응튜브에 함유된 검출 가능한 검출표지의 시그날의 수치에 의해 측정된다.
상기 표지에 의해 발생된 시그날의 수준은 증폭되는 표적 핵산의 양에 비례한다. 검출 표지의 시그날은 예를 들면 발광 시그날, 색 염료 시그날 또는 방사성 시그날을 포함한 어떠한 종류의 시그날일 수 있다. 바람직한 양태로서, 검출가능한 시그날은 발광 시그날이다. 발광 시그날은 형광 시그날 또는 화학발광 시그날일 수 있다. 이는 타겟 핵산의 증폭이 시작되면서 빛이 발광되기 시작하며 타겟 핵산의 증폭 양에 따라 발광되는 시기 및 발광의 세기가 달라지게 되어 타겟 핵산의 증폭된 양을 모니터링 할 수 있게 한다.
본 발명에서는 시그날 검출을 위해 형광다이가 결합된 프로브 또는 인터컬레이팅 다이와 같은 형광다이가 사용될 수 있다. 바람직하게는 핵산 증폭을 위해 주로 dual-labeled probe를 사용할 수 있다.
상기 실시간 핵산 증폭기(200)는 제어부가 구비된다. 상기 제어부는 상기 자동정제분주장치(100)에서 분리되는 타겟 핵산의 종류 및 상기 자동정제분주장치(100)에서 분리 정제되는 각각의 생물학적 시료에 대한 정보를 저장하며, 각각의 자동정제분주장치(100)에서 분리 정제되는 서로 다른 타겟 핵산의 종류에 상응하도록 열 단위로 멜티웰 온도순환블록의 멀티웰 영역을 타겟 핵산 종류별로 설정하며, 상기 온도순환블록상의 모든 타겟 핵산이 동일한 조건하에서 동시에 증폭되도록 하고, 상기 설정된 열에 상응하는 타겟 핵산 종류 및 각각의 웰에 대한 생물학적 시료에 대한 정보를 바탕으로, 동시 증폭된 각각의 타겟 핵산을 측정하여 판단하게 된다.
상기 제어부에 유지되는 모든 정보들은 사용자로부터 입력되고 입력된 정보를 저장 유지할 수 있도록 셋팅된다.
상기 실시간 핵산증폭기(200)는 상기 멀티웰 온도순환블록(210)에 장착된 열별 또는 웰 별로 서로 다른 타겟 핵산을 검출하기 위한 진단키트 종류에 따라 각각의 타겟 핵산의 증폭 양 및 타겟 정보가 실시간으로 디스플레이부(300)에 표시된다.
도 3은 본 발명에 따른 디스플레이부(300)에 대한 도면이다. 도 3을 참고하면, 디스플레이부(300)는 실시간 핵산 증폭기(200)의 상기 설정된 열의 정보를 디스플레이 하는 제1 디스플레이부(302), 단위 반응튜브에서 증폭되는 타겟 핵산의 양을 측정하여 도시화 하는 제2 디스플레이부(301) 및 사용자가 웰(211a)을 개별적으로 선택하여 볼 수 있는 웰 선택부(303)로 구비되며, 사용자의 선택에 의해 상기 웰 선택부(303)를 하나 또는 그 이상의 단위 반응튜브의 진단 결과들을 다양한 색상으로 한 번에 디스플레이하여 그 차이를 명료하게 구분하여 디스플레이 할 수 있다.
본 발명에 따른 실시간 핵산 분석 통합 장치는 자동정제분주장치 및 실시간 핵산증폭기를 통합적으로 관리하며, 보다 상세하게는 생물학적 시료의 데이터를 자동정제분주장치로부터 실시간 핵산 증폭기에 전달해주고 실시간 핵산 증폭기로부터 얻어지는 서로 다른 타겟 핵산의 종류에 따른 각각의 타겟 핵산 정보 및 증폭결과를 정성 분석 또는 정량 분석하는 제어부를 포함한다.
본 발명의 실시간 핵산 분석 통합 장치는 제어부의 소프트웨어로 도 4에 제시된 바와 같이 크게 1. 정보 입력, 2. 자동정제분주장치(100)에서의 핵산분리정제, 3. 실시간 핵산 증폭기(200)에서의 작동(RUN), 4. 결과분석(Update Result/Analysis) 4가지로 분류된다. 본 발명의 제어부의 소프트웨어는 전체적인 운영을 관장한다. 소프트웨어의 역할은 크게 DB 역할 및 유지, 자동정제분주장치의 제어유지, 실시간 핵산 증폭기 작동 및 분석 제어유지 등의 역할을 수행한다.
본 발명의 실시간 핵산 분석 통합 장치는 2대의 컴퓨터와 3대의 자동정제분주장치와 1대의 실시간 핵산 증폭기로 구성된다. 먼저 제어부의 소프트웨어는 사용자가 실시간 핵산 분석 통합장치 관리 소프트웨어에 입력한 데이터를 기반으로 한다. 2대의 컴퓨터 중 1대는 로컬 DB, 실시간 핵산 분석 통합시스템 관리 소프트웨어 및 자동정제분주장치 프로그램이 설치되는 실시간 핵산 분석 통합 장치 관리 소프트웨어용 컴퓨터이다. 나머지 1대의 컴퓨터는 실시간 핵산 증폭기 프로그램 용이다. 각 컴퓨터는 TCP/IP 통신으로 데이터를 주고받는다. 실시간 핵산 분석 통합 장치 관리(manager) 소프트웨어용 컴퓨터는 자동정제분주장치 3대와 TCP/IP로 통신을 주고받는다. 실시간 핵산 증폭용 컴퓨터는 핵산 증폭기와 USB통신으로 주고받는다. 상기의 실시간 핵산 분석 통합 장치는 컴퓨터 간에 클라이언트 서버환경, 실시간 핵산 분석 통합 장치 관리 소프트웨어 및 자동정제분주장치간의 클라이언트 서버환경으로 구성된다.
보다 상세하게는 각 병원 사이트에는 메인 DB가 존재한다. 메인 DB로에서 실시간 핵산 분석 통합 장치 관리 소프트웨어에 시료 입력 작업을 수행한다. 이 작업은 본 실시간 핵산 분석 통합 장치에 사용되는 로컬 DB에 작업리스트(worklist)를 탑제하는 과정이다. 탑제된 워크리스트는 사용자가 바코드를 통해서 혹은 자동 할당 방식을 통해서 각 자동정제분주장치에 할당된다. 모두 할당이 되었으면 자동정제분주장치를 운영한다. 운영이 모두 완료되면, 끝남과 동시에 동작 완료에 따른 업데이트를 수행한다. 실시간 핵산 분석 통합 장치 관리 소프트웨어용 컴퓨터는 업데이트를 체크해서 로컬 DB에 완료 갱신한다.본 발명의 통합관리 소프트웨어는 여러대의 핵산정제분주장치의 동시에 각각 제어할 수 있으며, 이들의 동작상태를 제공한다.
상기 실시간 핵산 분석 통합 장치 관리(Manager) 소프트웨어용 컴퓨터는 실시간 핵산 증폭기가 준비되었음을 사용자에게 알린다. 사용자가 알림지시를 받고, 96웰 멜티웰 온도순환블록에 반응튜브를 장착한다. 반응튜브의 장착이 완료되면 실시간 핵산 증폭기의 작동을 수행한다. 동작이 완료되면 사용자에게 분석(analysis) 프로그램을 띄울 것인지 고지한다. 분석이 완료되면 사용자가 완료 및 종료를 수행한다. 통합 관리 소프트웨어용 컴퓨터는 모든 작동 및 분석이 완료되었음을 체크한다. 체크 완료 후 로컬 DB를 갱신한다.
먼저 본 발명의 실시간 핵산 분석 통합 장치가 작동되기 위해서 정보(데이터)가 입력이 되어야 한다. 데이터 정보의 입력은 사용자가 검체 시료별로 실시간 핵산 분석 통합 장치로서 실시간 핵산 분석 통합 장치 관리 소프트웨어용 컴퓨터의 통합 관리 프로그램 내 데이터베이스에 맞게 입력을 한다는 의미이다. 데이터 정보의 입력에 따라서 해당 진단키트 별로 사용되는 프로토콜이 정해져 있다. 즉, 시료의 이름을 입력하고, Diagnosis kit, 핵산 유형, sample source type, 분리 프로토골을 선택한다. 입력할 시료 개수를 선택하고 ‘input' 버튼을 누른다. 자동정제분주장치에서는 입력된 정보(데이터)를 가지고 각 자동정제분주장치의 카트리지 웰에 ‘Assign’을 한다. 본 발명에서 ‘Assign’ 은 ‘Auto assign’과 바코드 ‘assign’을 지원한다. 본 발명은 정제할 시료를 클릭하는 순서대로 자동으로 'assign'한다. 각 자동정제분주장치의 ‘assign’이 완료되면 자동정제분주장치가 동작할 수 있는 상태가 된다. 사용자는 자동정제분주장치에서 각각의 장치를 동작시킨다. 자동정제분주장치 소프트웨어에서는 동작에 관련된 모든 정보를 저장한다. 자동정제분주장치 소프트웨어는 작동시에 시간, 진행상태 등 진행정보를 사용자에게 제공하게 되어있다. 자동정제분주장치의 동작시간은 약 40 내지 50분이 소요된다. 자동정제분주장치 작동이 완료 되면 실시간 핵산 분석 통합 장치 관리 소프트웨어가 자동 감지를 수행한다. 자동감지에 따라 다음공정인 실시간 핵산 증폭기의 작동을 지시한다.
본 발명의 실시예에서는 실시간 핵산 증폭기의 해당 컴퓨터가 별도로 나누어져 있기 때문에 사용자가 실시간 핵산 증폭기 프로그램을 실행한다. 실행시 작업 리스트가 자동정제분주장치로부터 실시간 핵산 증폭기로 사용자에게 자동으로 제공된다. 통합관리소프트웨어에서 핵산증폭기 소프트웨어를 클릭하여 실험한 진단키트를 선택한다. 본 발명에서는 선택된 진단키트에 따라 콘트롤은 자동으로 assign 되도록 되어 있다. 사용자는 핵산정제분주장치에서 수행된 작업리스트를 가져와서 실행한다. 샘플을 클릭하는 순서에 맞게 멀티웰에 ‘assign'된다. 해당 설정된 정보에 맞는 진단키트를 장착한다. 핵산증폭기 동작을 수행한다. 실시간 핵산 증폭기의 동작은 약 2 내지 3시간 소요되게 된다. 핵산증폭기 작동 s/w의 동작이 끝나면, 해당 결과파일을 관리 s/w로 전송한다. 동작이 완료 되면 실시간 핵산 분석 통합 장치의 ‘관리(Manager)’ 소프트웨어에서 동작 상태를 자동으로 인지하고 결과를 업데이트 하며, 작업리스트를 다음공정으로 이관한다. ‘Manager’ 프로그램은 결과 업데이트를 수행함으로써 모든 결과를 업데이트 한다. 멀티웰의 웰별로 업데이트할 시료를 클릭한다. 실패한 것은 업데이트를 하지 않고 분리공정 도는 증폭공정의 해당공정으로 다시 되돌린다. 현재 동작시킨 모든 분속을 다시 볼 수 있는‘Analysis’를 창에 띄워서 사용자가 증폭된 상태를 분석할 수 있다.
본 발명의 실시간 핵산 분석 통합 장치의 제어부는 ‘work list’ 로컬 데이터베이스, 실시간 핵산 분석 통합장치 관리(manager) 소프트웨어, 자동정제분주장치 소프트웨어, 실시간 핵산 증폭기 작동 소프트웨어, 실시간 핵산 증폭기 분석 소프트웨어의 5가지 프로그램을 자동으로 연결시켜서 일련의 자동화 공정을 제공한다. 동작시 휴먼에러를 방지하기 위해서 ‘assign’시 관련 화면을 제공하며, 모든 데이터를 추적 가능하게 하고 있다. 모든 장비 운용시 로그 파일이 생성되게 한다.
본 발명에 따른 실시간 핵산 분석 통합 장치는 상기의 각각의 진단키트 단위 반응튜브의 분석결과를 저장하는 저장 데이터 베이스장치(400)를 더 구비할 수 있다.
[ 실시예 2]
실시예 2는 본 발명에 따른 실시간 핵산 분석 통합 장치를 이용한 타겟 핵산의 검출방법에 관한 것으로 이하 더욱 상세히 설명한다.
본 발명은 1) 다수의 자동정제분주장치(100)에서 표준시료와 핵산을 포함하는 다양한 생물학적 시료들로부터 각 시료에 포함된 핵산을 분리 정제한 후 분리 정제된 용액을 핵산증폭반응 혼합물 반응튜브에 가하여 혼합하는 단계;
2) 상기 핵산증폭반응 혼합물 반응튜브가 장착될 멀티웰 온도순환블록(210)과 상기 자동정제분주장치(100)에서 분리 정제되는 각각의 타겟 핵산이 상응하도록 멀티웰 온도순환블록(210)의 멀티웰을 타겟핵산 종류별로 열 단위로 분할하여 블록을 설정하고, 상기 설정된 블록내의 각각의 웰별로 상기 자동정제분주장치(100)에서 분리되는 표준시료와 생물학적 시료 정보를 저장하는 단계;
3) 단계 2)에서 저장된 실시간 핵산 증폭기(200)의 멀티웰 온도순환블록(210)의 각 웰의 생물학적 시료 정보에 일치하도록 단계 1)에서 준비된 반응튜브를 각 웰에 장착하는 단계;
4) 상기 실시간 핵산 증폭기(200)의 온도순환블록에 장착된 각각의 타겟 핵산을 동일한 조건하에서 동시에 증폭하여 다수의 생물학적 시료들에 대한 각각의 타겟 핵산을 정성분석 또는 정량 분석하여 증폭결과를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 실시간 핵산 분석 통합 장치를 이용한 타겟 핵산의 검출방법을 제공한다.
본 발명에서 있어서, 상기 단계 2)와 단계 3)은 동시에 또는 단계 3)이 단계2)보다 먼저 실시될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 1) 단계의 자동정제분주장치(100)에서 정제 및 분주되는 핵산은 각각 서로 다른 핵산이거나 여러 가지의 종류의 생물학적 시료가 핵산 분리에 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 자동정제분주장치(100)에서 생물학적 시료에 인터널 컨트롤(internal positive control, IPC)을 첨가하여 핵산을 분리하여, 상기 증폭결과로부터 자동정제분주장치(100)에서의 타겟 핵산 분리의 성공 여부와 증폭 효율을 판단하여 타겟 핵산의 검출의 유효성을 결정하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 1) 단계에서 반응튜브는 핵산증폭에 필요한 성분들이 건조된 형태로 함유된 것으로서 여기에 분리 정제된 핵산 용액을 가하여 혼합하여 핵산증폭반응 혼합물 반응튜브를 제조하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 진단키트는 건조 조성물로 되어 있기 때문에 분리 정제된 핵산 용액을 가하여 바로 혼합물을 제조할 수 있다. 용액 상태의 진단키트는 분리된 핵산 용액을 첨가할 경우 반응용량이 많아지는 문제가 있게 되고 분리된 핵산 농도가 낮아지게 된다.
본 발명에 있어서, 상기 인터널 콘트롤은 타겟핵산이 RNA인 경우에, 담배모자이크 바이러스 입자인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 인터널 콘트롤은 타겟핵산이 DNA인 경우에, 플라스미드 DNA 또는 PCR 증폭산물(PCR product)인 것을 특징으로 한다. PCR 증폭산물은 PCR 증폭에 의해 만들어진 DNA를 의미한다.
상기 1)단계에서 인터널 콘트롤은 기지의 농도별로 추가한 정량표준시료를 더 포함하여 분리하는 것을 특징으로 한다.
상기 1)단계에서 표준시료로서 음성콘트롤(NTC)과 양성 콘트롤(PC)을 추가로 사용하여 분리하는 것을 특징으로 한다.
상기 인터널 콘트롤의 증폭을 위한 프라이머, 프로브는 하기 표 1에 제시된 서열을 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서는 상기 인터널 콘트롤(또는 내부 대조군, internal positive control, IPC)을 핵산분리정제 단계부터 적용하여 시료로부터 핵산을 분리한 후에 실시간 핵산 증폭기에서 증폭을 수행하는 것이다. 이는 핵산의 증폭시에 핵산이 제대로 증폭이 되지 않았을 경우, 정제과정에서 문제가 있는지, 증폭과정에서 문제가 있는 건지 확인이 어려운 문제점으로부터 고안된 것이다. 본 발명에서는 분리과정에서부터 기지의 농도의 인터널 콘트롤(internal positive control, IPC)을 시료에 첨가하여 함께 분리, 정제함으로써 자동핵산 정제분주장치에서 분리가 제대로 이루어졌는지 확인할 수 있을 뿐만 아니라, 분리 후에 증폭과정에서 핵산 증폭이 제대로 나타나지 않았을 경우 분리단계에서부터 문제가 있는지, 핵산증폭 단계에서 문제가 있는 것인지 쉽게 원인을 알 수 있게 된다. 본 발명에서는 담배 모자이크 바이러스를 인터널 콘트롤(IPC)로 사용하였다. 담배 모자이크 바이러스(TMV)는 RNA 바이러스로서 신종인플루엔자 H1N1 바이러스와 같은 RNA 바이러스 검출을 타겟으로 할 때에 적절하게 인터널 콘트롤(IPC)로 사용할 수 있다.
담배 모자이크 바이러스(TMV)를 사용하는 이점은 다음과 같다. 기존의 경우 검체시료로부터 핵산을 분리할 경우 인터널 콘트롤(IPC)을 함께 사용하지 않았으며, 핵산증폭 반응시에만 특정 종류의 RNA를 분리된 핵산시료에 첨가하여 반응시켰다. 본 발명에서는 바이러스 입자 자체를 검체시료의 분리단계에서부터 함께 분리, 정제하고, 실시간 핵산증폭반응까지 함께 진행하기 때문에 효율 검정에 유용하다. 식물 바이러스인 담배 모자이크 바이러스(TMV)는 대량정제가 가능하고, 취급상 위험부담이 없다. 인체 바이러스와 식물 바이러스는 반응하는 ‘receptor’가 각각 달라 식물 바이러스가 사람에게 감염되지는 않고, 타겟으로 하는 인체 바이러스와는 유연관계가 멀어, 프라이머 및 탐침 제작 시 또는 핵산 증폭 반응시 원하는 인체 핵산 타겟과 염기서열이 일치하는 현상이 적거나 거의 없는 장점이 있다.
본 발명에 있어서, 진단키트는 단위 반응튜브에 인터널 컨터롤(IPC)과 증폭되는 타겟 핵산에 상응하는 프라이머, 타겟 핵산을 검출하기 위한 검출표지 및 완충용액이 동량으로 구비되는 것을 특징으로 한다. 단위 반응튜브로는 8-웰 스트립이 사용될 수 있다. 또한 상기 단위 반응튜브 내 핵산증폭의 반응물은 건조된 형태인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 실시간 핵산 증폭기(200)에서 생물학적 시료에 인터널 콘트롤(internal positive control, IPC)을 첨가하여 핵산을 분리하고 확인하는 증폭결과는 상기 자동정제분주장치(100)에서 수득된 핵산 분리의 유무 및 상기 실시간 핵산 증폭기(200)를 동일한 조건하에서 동시에 증폭하여 얻어지는 증폭과정을 확인할 수 있다.
본 발명에 따른 실시간 핵산 분석 통합 장치는 실시간 핵산 증폭기(200)를 통하여 다수의 자동정제분주장치로부터 분리된 핵산을 한 번에 동시에 증폭할 수 있다.
또한 동시에 증폭된 각각의 핵산으로부터 검출하고자 하는 타겟 핵산의 정보를 수집하는 단계를 더욱 포함한다.
예를 들면 혈액, 소변, 객담, 세포 등에서 핵산을 분리하는 과정은 다를 수 있지만, 그러나 이로부터 분리된 핵산은 하나의 증폭기에서 동시에 증폭을 할 수 있다. 본 발명에서는 여러 대의 핵산 자동정제분주장치로부터 핵산을 분리한다. 3개의 자동정제분주장치에서 각각 혈액, 소변, 객담시료로부터 핵산을 분리한다. 분리된 핵산은 예를 들면, AIDS, B형 간염, C형 간염, 말라리아, 결핵, 성병 진단키트를 이용하여 이들을 동시에 검출하는데 적용될 수 있다.
실시간 핵산 증폭기에서 이들 질병원인을 동시에 검출하기 위해서 본 발명에서는 멀티웰 온도순환블록을 열별로 구획을 나누어 특정 영역을 지정할 수 있다. 예를 들면 1열은 AIDS, 2열은 B형 간염, 3열은 C형 간염, 4열은 성병으로 멀티웰 온도순환블록의 열을 지정한 후 이들의 증폭조건을 동일하게 설정한 후, 분리된 핵산을 함유한 각각의 진단키트들을 멀티웰 온도순환블록상의 각각의 설정된 영역에 맞게 장착하여 증폭반응을 수행하였다. 증폭반응 조건을 동일하게 설정하기 위해서 각 진단키트 반응조건의 Tm 값을 모두 동일 또는 유사하게 설정하였다. 사용되는 프라이머 또는 프로브의 Tm 값을 동일하게 설정되도록 함으로서 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 반응조건을 동일하게 하여 동시에 96웰 핵산증폭기에서 증폭되도록 함으로써, 편리성을 증가시키고, 검출시간을 단축시키고, 무엇보다도 여러 가지 종류의 타겟을 검출하여야 하는 경우, 한 종류씩 순서대로 함에 따라서 발생되는 시간의 오차를 줄이고, 한 번에 한 종류의 타겟 병원균을 검출하던 것을 동시에 동일한 조건으로 실시간 핵산 증폭기에서 다수의 타겟 DNA 또는 RNA를 동시에 검출함으로써 쉽게 확인이 가능하게 되었다. 한 사람으로부터 유래된 여러 종류의 시료 또는 여러 사람으로부터 유래된 시료로부터 핵산을 분리하고, 이들로부터 다양한 타겟 핵산을 한꺼번에 동시에 검출할 수 있게 됨으로서 여러 병원체를 동시에 빠른 시간 내에 확인이 가능한 장점이 있다. 본 발명에서는 멀티웰 온도순환블록의 열 단위로 특정 병원체의 검사항목을 지정할 수 있도록 하였다.
본 발명에 따라 다수의 자동정제분주장치(100)를 사용하여 생물학적 시료로부터 핵산을 분리, 정제 과정은 다음과 같다. 본 발명의 실시예에서는 자동핵산분주장치로서 바이오니아사의 ExiPrepTM Fully automated nucleic acid extraction instrument를 채택하여 사용하였고, 바이오니아사의 ExiPrepTM extraction kit를 핵산정제키트로 채택 및 변형하여 사용하였다.
본 발명에 있어서, 자동정제분주장치의 핵산정제키트는 핵산을 포함하는 다양한 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하는데 사용되는 버퍼들이 함유되어 있는 카트리지 세트와 정제하는데 사용되는 플라스틱 소모품 세트로 구성된다. 카트리지 세트는 세포내 단백질분해용 단백질 분해효소, 세포를 분해하기 위한 분해용액, 용출된 핵산을 결합시키기 위한 실리카 자성입자와 용출된 핵산과 실리카 자성입자의 결합을 위한 결합용액이 함유되어 있는 카트리지 ①과 실리카 자성입자 표면에 부착된 핵산외의 기타 물질의 세척을 위한 1종 이상의 세척 용액과, 실리카 자성입자 표면으로부터 핵산을 효율적으로 분리시키기 위한 용출용액을 함유하고 있는 카트리지 ②로 구성된다. 플라스틱 소모품 세트는 핵산 정제 과정에서 각종 완충용액을 운반, 이송하는데 사용되는 일회용 필터 팁과 단백질 분해효소에 의한 세포 분해과정에서 사용하기 위한 반응용 튜브, 최종 정제된 핵산을 저장하기 위한 일루션(elution) 튜브로 구성된다.
핵산정제키트의 카트리지는 멀티웰 카트리지로서, 96 웰형 카트리지가 바람직하게 사용된다. New influenza A(H1N1) RNA의 분리를 위한 핵산정제키트로는 바이오니아사의 ExiPrep™ viral DNA/RNA kit를 채택하여 사용할 수 있다. Viral RNA 추출 과정은 샘플 전처리 과정과 표준시료로서 양성 콘트롤(Positive Control), 음성 콘트롤(Negative Control), 인터널 콘트롤(IPC), 검체시료의 첨가 과정, 자동정제분주장치를 이용한 핵산 추출 과정으로 이루어진다. 추출된 핵산은 자동으로 real time RT-PCR용 진단키트와 혼합되므로, 핵산 추출 후 매뉴얼로 진단키트에 viral RNA를 넣을 필요가 없게 된다.
구체적인 일예로, 실시간 핵산 분석 통합 장치의 핵산 자동정제분주장치와 핵산정제키트를 이용하여 신종 인플루엔자 A 바이러스의 바이럴 리보핵산의 정제 과정은 다음과 같다.
환자의 구강 및 비인강으로부터 면봉을 이용하여 검체를 채취한다. 핵산 정제에 사용하기 전, 바이러스운송배지(VTm media, Virus Transport Media)가 들어있는 검체 보관용 튜브를 볼텍스 믹서를 이용하여 1분간 강하게 흔들어 바이러스가 면봉으로부터 바이러스운송배지로 효과적으로 떨어져 나올 수 있도록 한다. 면봉에 묻어있는 바이러스가 용액(PBS, normal saline, transport media 등)으로 옮겨 나올 수 있도록 볼텍스 믹서를 이용하여 1분 이상 잘 섞어 준다. 1.5 ml 테스트 튜브에 혼합된 시료 용액 1 ml을 옮겨 넣고, 13,000 rpm에서 5초 내지 10초간 원심분리한다. 상층액 200 ㎕를 따서 viral RNA 추출에 사용한다.
자동정제분주장치의 전원을 눌러 초기화를 진행한다. 본 발명의 실시간 핵산 분석 통합 장치의 관리 소프트웨어(Manager Software)는 크게 두 부분으로 나누어지는데 하나는 자동핵산정제분주장치를 제어하는 부분과 실시간 핵산 증폭기를 제어하는 부분으로 되어 있다. 바이러스 RNA를 추출하기 위하여 소프트웨어 메인화면의 왼쪽의 자동정제분주장치 그림을 클릭하여 검사에 사용할 진단키트를 선택한다. 진단키트 입력칸을 클릭하여 신종플루 검사용 진단키트를 선택하면 추출해야 할 핵산의 종류가 자동으로 선택된다. ‘sample source type’ 입력창에 환자검체 유형에 따른 검체종류를 입력한다. 검체종류를 입력하면 자동으로 카트리지 상태를 묻는 팝업창이 나타난다. 버퍼 카트리지 ①을 참고하여 사용된 웰이 있는지 확인하고, 사용한 웰이 있으면 더 이상 사용하지 않도록 해당 웰을 클릭하여 표시한다. 자동으로 카트리지 ①의 남아있는 웰에 음성 콘트롤(Negative control), 양성 콘트롤(Positive control) 위치가 표시된다. 기본 설정은 NTC, PC 각 1개씩이며 2개씩으로 변경하려 셋팅할 수 있다. 만일 재검할 리스트가 있는 경우, 이 스텝에서 재검할 리스트가 보여지고, 리스트 중 재검할 검체번호를 선택하면 순서대로 ‘assign’이 완료된다. ‘sample name’ 칸을 클릭하여 바코드 리더나 키보드를 이용하여 검체정보를 입력한다. 지금까지 입력된 정보를 실시간 핵산 분석 통합 장치에 적용시키기 위하여 'Apply' 버튼을 클릭한다.
작업대에서 핵산정제키트의 카트리지 ①의 1열과 2열에 인터널 콘트롤(IPC)을 각각 20 ㎕씩 넣어준다. 실시간 핵산 분석 통합 장치에서 입력한 내용에 맞게 카트리지 ①의 음성 콘트롤(NTC), 양성 콘트롤(PC) 위치에 즉, A-1의 위치에 표준물질(positive control, PC)을 200 ㎕ 넣고, 카트리지 ①의 B-1의 위치에 DEPC 처리된 3차 멸균수(negative control, NTC) 200 ㎕를 넣는다. 그 외 나머지 C-1에서 H-1, A-2에서 H-2의 위치에는 환자의 검체를 200 ㎕씩 넣는다. 이때 반드시 실시간 핵산 분석 통합 장치에서 입력한 위치에 맞게 핵산시료를 카트리지에 넣어주어야 한다. 각각 표준물질, DEPC 처리된 3차 멸균수, 환자의 검체가 들어있는 카트리지의 웰 위치에 맞추어 일회용 필터 팁, 단위 반응튜브를 각 자동정제분주장치내의 랙에 장착한다.
또한, 정제된 핵산이 담긴 일루션(elution) 튜브와 신종플루 진단검사용 진단 키트를 냉장블록에 장착한다. 준비된 카트리지 세트와 플라스틱 소모품 세트를 자동정제분주장치에 장착한 후 실시간 핵산 분석 통합 장치 관리 소프트웨어의 ‘RUN' 버튼을 클릭하여 자동정제분주장치를 작동시켜 환자의 검체로부터 신종플루 바이러스의 RNA를 정제한다. 핵산 정제가 완료되면 핵산 보관을 위한 일루션(elution) 튜브와 진단검사용 진단키트를 냉장블록에서 분리하고, 핵산 보관용 튜브는 제공된 튜브 캡을 이용하여 캡핑한 후 -80℃에서 보관한다. 진단키트는 광학 접착제(adhesive optical) 필름을 이용하여 스트립 튜브 상단을 실링한 후 실시간 핵산 증폭기로 옮겨 Real-Time RT-PCR을 수행한다. 추출이 완료되면 핵산분주정제장치내의 elution 튜브와 진단키트 반응튜브에는 50uL씩의 추출된 핵산용액의 들어 있다.
본 발명의 실시예에서 실시간 핵산증폭기로 exicyclerTM 96 Real-Time Quantitative Thermal Block을 채택하여 사용하였고, 바이오니아사의 AccuPowerDiagnostics Kit를 진단키트로 채택하여 사용하였다.
실시간 핵산 증폭기에서의 얻어지는 증폭결과는 다음과 같은 과정으로 이루어진다. 먼저 실시간 핵산 통합 분석 장치에서 실시간 핵산 증폭기 그림을 클릭한다. 관리 소프트웨어에는 추출이 끝난 검체 리스트가 왼쪽 상단에 키트별로 저장되어 있다. 해당하는 리스트를 선택하여 ‘Get Sample List' 버튼을 클릭한다.
이때 선택된 진단키트를 멀티웰 온도순환블록의 어디 위치에 넣을지를 지정하기 위한 팝업창이 생긴다. 반응튜므 스트립별 샘플리스트의 check box를 선택하여 멀티웰에 검체를 aasign한다. 각 웰을 선택하면 위치를 지정할 수 있게 되고 화면의 멀티웰 그림을 보고 원하는 위치를 선택한다.
진단키트 스트립의 개수에 맞춰 온도순환블록의 어디에 스트립을 장착할지 열과 행 숫자를 선택한다. 예를 들어 핵산이 분주된 진단키트가 8-스트립인 경우 핵산증폭기의 멀티웰 온도순환블록의 가운데 부분에 위치하도록 96웰의 해당위치를 버튼을 클릭한다. 선택이 완료되면 데이터 이름을 입력할 수 있는 창이 보이고, 원하는 이름을 입력후 번튼을 클릭하면 핵산증폭할 작업리스트가 생성된다.
진단키트를 ‘Assign’된 위치에 맞게 실시간 핵산 증폭기의 멀티웰 온도순환블록에 장착한 후 실시간 핵산증폭기 run software를 실행한다. 실시간 핵산 증폭기에서 작동이 완료되면 관리 소프트웨어로 결과 데이터가 전송된다. 실시간 핵산 분석 통합 장치에 있어서, 제어부의 관리 소프트웨어의 메뉴부에서 확인할 수 있는 ‘tap’을 클릭하여‘update result’를 선택하여 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 결과를 불러온다. 새로 열린 창의 왼쪽 위에서 생성된 ‘work list’를 선택하여 결과를 불러온다. 결과 값은 ‘assign’된 순서대로 엑셀파일 형식으로 확인한다. 각 검체별 결과 그래프를 볼 경우 연결되어 있는 분석 프로그램과 연동되어 그래프를 분석할 수 있다. 결과가 확인된 검체는 관리 프로그램상으로 결과를 업데이트하고, 그렇지 않은 경우 증폭단계부터 재검사 또는 분리(prep)단계부터 재검사를 yjsxor하여 재검 리스트가 생성된다.
보다 상세하게는 BSC(biological safety cabinet) 내에서 준비된 자동정제분주장치의 플레이트에 각 반응(Reaction) 튜브 랙, 일회용 팁(Disposable tip) 랙, 일루션(Elution) 튜브 랙, 버퍼 카트리지(Buffer Cartridge) ①번을 올려놓는다. 검체 시료의 개수에 맞추어 반응튜브, 일회용 필터 팁(Disposable filter tip), 일루션(Elution) 튜브, 진단키트를 각 랙에 꽂아 준다. 제공된 ‘hole-punch’를 이용하여 검체시료의 개수와 표준시료로 사용될 양성 콘트롤(PC)과 음성 콘트롤(NTC) 개수에 맞추어 버퍼 카트리지(Buffer Cartridge) ①과 버퍼 카트리지(Buffer Cartridge) ②의 씰링 필름에 구멍을 뚫어 준다. 도 5에 나타낸 그림을 참조하여 검체시료와 양성 콘트롤(PC), 음성 콘트롤(NTC)을 넣는 위치에 맞추어 20 ㎕의 식물성 인터널 콘트롤(IPC)를 웰에 넣는다. 음성 콘트롤(NTC) 웰에 DEPC를 처리한 증류수 200 ㎕를 넣는다. 양성 콘트롤(PC) 웰에 200 ㎕의 양성 콘트롤(PC)를 첨가한다. 카트리지 웰에 상기에서 준비한 환자 검체시료 200 ㎕를 넣는다. 투명 아크릴 뚜껑을 닫은 후 자동정제분주장치에 넣는다.
자동정제분주장치를 가동시켜 신종플루 검사용 프로그램을 불러온다. 사용할 장비를 확인한 후 표준시료로 사용되는 양성 콘트롤(PC)과 음성 콘트롤(NTC)이 들어간 웰을 표시한다. 양성 콘트롤(PC), 음성 콘트롤(NTC)이 들어간 웰을 제외한 검체 웰에 바코드 리더 또는 매뉴얼로 환자 검체시료에 대한 환자정보(성명, 성별, 담당과 등)를 입력한다. RUN 버튼을 눌러 Viral RNA 추출을 시작한다.
상기 Viral RNA 추출과정이 완료되면 ‘Door’를 열어 ‘Base plate’를 앞으로 당기면 elution 튜브와 진단키트가 장착된 Elution 튜브 랙을 볼 수 있다.
일루션(Elution) 튜브와 진단키트에는 추출된 viral RNA가 각각 50 ㎕씩 들어있다. 그러므로 추가로 RNA를 넣거나 DEPC를 처리한 증류수를 넣어주는 과정은 필요 없다. 신종플루 검사에 필요한 진단키트는 일루션(Elution) 튜브 랙에서 꺼내어 곧바로 실시간 핵산 증폭기를 이용하여 real time RT-PCR에 적용할 수 있으며, 일루션(Elution) 튜브에 들어있는 viral RNA는 재검시 사용한다. 추출된 viral RNA는 가급적 사용 시까지 -80℃에서 보관해 둔다. 일루션(Elution) 튜브 랙은 추출된 핵산을 보관하기 위하여 4℃ 상태로 유지된다.
본 발명에 사용되는 진단키트에 함유되어 있는 핵산증폭 분석시약은 타겟 핵산증폭에 필요한 모든 성분들이 들어가 있는 분석시약을 포함하며, 상기 분석시약은 실시간 핵산증폭기를 이용하여 검체시료내의 타겟 DNA 또는 RNA를 실시간 정성 또는 정략적으로 검출하기 위해 ‘ready-to-use’ 방식으로 구성 되어 있다.
상기 본 발명에 사용되는 진단키트 내 분석시약은 핵산증폭에 필요한 반응용 완충용액, MgCl2, 4종의 dNTP, 중합효소, 프라이머 및 검출표지, 및 선택적으로 안정제를 포함하며, 건조된 상태로 되어 있다. 검출표지는 형광염료 또는 형광염료가 표지된 프로브인 것을 특징으로 한다. 또한 본 발명에 따르면 분석시약 조성물은 동결건조, 진공건조, 가온건조, 또는 감압건조 등을 통하여 건조된 형태인 조성물인 것이 바람직하다.
본 발명에 사용되는 진단키트는 예를 들면 바이오니아사의 AccuPower PCR kit를 채택하여 사용할 수 있다. 바이오니아사의 New InfA(H1N1) & Inf A Premix에는 New Influenza A(H1N1)와 Influenza A virus의 게놈의 특정 부분을 증폭하기 위한 프라이머, dual-labeled fluorogenic probe, DNA polymerase, dNTPs 및 안정제가 포함되어 있다. 증폭 산물은 열 사이클링(thermal cycling)동안 특정 프로브에 결합된 형광을 측정하여 알 수 있다. 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 산물의 사이클에 따른 증폭은 프로브로부터 떨어져 나온 리포터 다이(reporter dye)를 측정하는 것을 통해 실시간 측정된다. 또한 진단키트에는 시료의 정성분석을 위해서 New Inf A H1N1 & Inf A Positive controls이 포함되어 있다.
핵산증폭 분석시약을 증폭단계에서 사용할 경우, 분석시약이 담긴 스트립(Strip)에 분리된 핵산을 넣어준다. 이때, New Inf A H1N1 & Inf A 양성 콘트롤 RNA와 인터널 콘트롤(IPC) RNA 시약을 튜브에 첨가한다. DEPC를 처리한 증류수와 인터널 콘트롤(IPC) RNA 를 계산된 수량만큼 섞어 혼합액을 만들고, 스트립의 각 웰에 45 ㎕ 씩 분주한다.
모든 시약 및 RNA 분주가 완료된 스트립은 뚜껑을 덮거나, 실링 필름으로 실링을 한 후, 혼합액의 내용물들이 완전히 섞이도록 한다. 이때 바이오니아사의 ExispinTM(Cat.No : A-7040, Bioneer Co., KOREA) 을 이용하여 혼합 후 스핀 과정을 수행하는 것이 좋다. 이 후, 스트립을 실시간 핵산 증폭기(ExicyclerTM 96 Real-Time Quantitative Thermal Block, 바이오니아사)의 멀티웰 온도순환블록에 안치하여, 실시간 핵산 증폭기를 실행시킨다.
상기 실시간 핵산 증폭기(ExicyclerTM 96)의 뒷편 하단에 있는 메인 파워 스위치를 켠다. 96 웰 멀티웰 온도순환블록이 기계 앞으로 나오면 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 스트립 또는 플레이트를 멀티웰 온도순환블록의 웰 방향을 맞추어 넣는다. ‘door’버튼을 다시 누르면 96 웰 멀티웰 온도순환블록(thermal block)이 안쪽으로 들어간다. Exicycler™ 96의 operating program(Run ExiDiagnosis icon)을 실행한다. 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 반응에 필요한 작동방법을 실행하기 위해 상단의 ‘File - Design Experiment’를 클릭한다.
다음으로 ‘Select Diagnostics Kit window’가 나타나면 ‘New Inf A and InfA Real-Time PCR Kit’를 선택한다. 상기 ‘Select Diagnostics Kit’ 선택이 완료되면 96웰 멀티웰 온도순환블록 내의 스트립 위치 정보가 입력된 엑셀 파일을 선택하여 연다.
모든 선택이 끝나면 키트에 적합한 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 반응 조건과 선택한 위치 정보를 볼 수 있는 프로토콜과 플레이트 정보 디스플레이 창을 확인 할 수 있다.
‘Run tap’ 또는 ‘’ 버튼을 클릭하면 결과를 저장할 파일명을 입력할 수 있는 새로운 창이 나타난다. 실험 날짜 및 샘플에 관한 정보를 입력하고 ‘OK’버튼을 누르면 중합 효소 연쇄 반응(PCR)이 시작 된다. 입력한 파일명으로 분석 프로그램에서 결과를 확인할 수 있다.
상기 핵산증폭에 대한 증폭결과는 Exicycler™ 96 analysis program을 이용하여 분석된다. 분석하고자 하는 ‘PCR data file(.ex3)’을 선택한다. 증폭결과의 ‘Flu. Graph’ 화면에서 ‘Baseline subtraction(manual 방식)’을 통해 맞춤형 분석이 가능하며, ‘auto scale button’을 사용하여 분석 프로그램에서 제공하는 기본적인 분석 결과를 확인할 수도 있다. 음성 콘트롤(NTC) 웰의 경우 New Inf A & Inf A RNA가 첨가되지 않았으므로, FAM과 Texasred 형광 값이 측정되지 않아야 한다. 인터널 콘트롤(IPC) RNA 웰의 경우 모든 웰 에서 TAMRA 형광 값이 측정되어야만 한다.
중합 효소 연쇄 반응(PCR)을 수행할 때 웰 중 일정 웰을 지정하여, 예를 들면, A1, B1은 음성 콘트롤(NTC), C1, D1은 양성 콘트롤(PC)으로 지정한다. 양성 콘트롤과 음성콘트롤은 표준 시료로서 사용된다. 상기 두 가지 콘트롤이 기준에 맞지 않을 경우 분석 프로그램에서 에러(error) 메시지가 발생할 수 있다. 본 발명에서는 진단 분석시 소프트웨어가 ‘Auto’ 분석 기능을 한다. 결과 분석을 자동으로 분석하여 보여준다.
[ 실시예 3]
실시예 3는 본 발명에 따른 실시간 핵산 분석 통합 장치를 이용한 타겟 핵산의 검출방법에 있어서, 핵산의 분리 정제에 사용되는 인터널 콘트롤 및 여러 검체의 동시 검출에 관한 것으로 이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
(1) 식물성 인터널 콘트롤 프라이머 , 프로브 디자인 및 적용
식물성 인터널 콘트롤(Internal Positive Control, IPC)은 담배 모자이크 바이러스(Tobacco mosaic virus, TMV)의 게놈 RNA(GeneBank.ACCESSION No. NC001367)의 염기서열 4903 부터 5709(Movement protein gene, MP), 5712 부터 6191(Coat protein gene, CP) 사이에서 길이는 18 내지 28 bp, Tm 값은 55℃ 내지 62℃가 되도록 임의로 염기서열을 선택하여 정방향 및 역방향 프라이머로 하였다.
또한, 상기 염기서열들 사이에서 길이는 19 내지 30 bp 사이, Tm 값은 67 내지 72℃ 사이에서 임의로 염기서열을 선택하여 탐침으로 하였고[표 1], Tm 값은 Primer3 Plus 프로그램을 사용하여 체크하였다.
Figure 112010015309643-pat00001
우선, 담배 모자이크 바이러스(TMV)의 프라이머 세트별로 조합하여 SYBR Green(핵산 검출 용도의 염색 시약)과 실시간정량증폭기로서 ExicyclerTM Quantitative Thermal Block(바이오니아사제, 한국)를 이용하여 적합한 프라이머 조합을 찾기 위한 과정을 수행하였다.
6 세트로 조합한 담배 모자이크 바이러스(TMV) 프라이머, 핵산 염색용 시약, 증류수(D.W.), 담배 모자이크 바이러스 주형을 첨가하여 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 실행하였다. 이를 95℃에서 10분간 변성시킨 후, 95℃에서 20초, 55℃에서 30초씩 45 사이클을 반응시켰다. 증폭된 형광 값은 각 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 사이클이 진행됨에 따라 55℃ 30초 반응 후에 1회씩 지속적으로 측정된다.
결과, 상기 프라이머 세트 중 1, 2, 3번(MP1,2,3 set)이 4, 5, 6(CP1,2,3 set)에 비해 증폭반응 속도가 빨라, 전자 세트를 선택하였다.
이 후 실험에서는 비특이적인 핵산염색용 시약 대신 특이적 서열의 핵산을 검출해내는 프로브를 이용하여 적합한 프로브 세트 선발 과정을 추가 수행하였다. 10×Buffer 5㎕, MMLV 600U, Taq 7.5 unit, dNTP 20mM 3 ㎕, stabilizer, 최적화된 농도(15p)의 프라이머, 프로브 등과 이병잎에서 추출한 담배 모자이크 바이러스(TMV) RNA를 첨가하고 증류수로 총 용량이 50 ㎕가 되도록 한 튜브에 넣어 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 실시하였다. 이를 45℃에서 15분간 역전사반응을 시킨 뒤 95℃에서 5분간 변성시킨 후, 95℃에서 5초, 55℃에서 5초씩 45 사이클을 반응시켰다.
담배 모자이크 바이러스 프라이머 및 프로브 세트 1, 2, 3 중 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 증폭효율이 가장 좋은 것은 세트 1(MP1)이었으며, 다음으로는 세트 3(MP3), 세트 2(MP2)의 순으로 나타났다.
이들 중 세트 1, 3 두 세트를 이용하여 상기와 같은 조성의 RT-PCR 혼합액에 담배 모자이크 바이러스를 인터널 컨트롤 RNA로 사용하고 신종 인플루엔자 RNA를 주형으로 첨가하여 표준주형 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응 적용 실험을 해 보았다. 실험 결과 세트1(MP1), 세트3(MP3) 모두 1×106 copy 인터널 컨트롤 RNA를 함께 반응시켰음에도 신종 인플루엔자 RNA주형의 증폭에 큰 영향을 주지 않고 인터널 컨트롤 증폭이 독립적으로 잘 이루어짐을 확인하였다.
(2) 식물성 인터널 콘트롤 제조 및 핵산추출과정에서의 적용 및 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응 적용
생물학적 시료와 함께 사용가능한 식물성 인터널 콘트롤을 제조하기 위하여, 먼저 담배모자이크바이러스를 증식하였다. 담배 Nicotiana tabaccum cv. Samsun 종자(농촌진흥청 식물바이러스 연구실에서 분양)를 100 내지 200립 파종한 뒤 10일 후 싹이 나면 그로부터 10일 뒤 각 개체별로 작은 화분에 옮겨 이식하여 주었고,10일 더 키웠다. 담배 모자이크 바이러스(TMV) 이병잎(농촌진흥청 식물바이러스 연구실에서 분양)을 막자사발에 넣고 0.01 M Phosphate Buffer(pH 7.2)와 함께 갈아 즙액을 만들어 카보런덤(carborundom)을 뿌린 담배 잎에 즙액을 발라 주었고 상처를 통한 TMV의 접종이 이루어지게 하였다.
접종 10일 후 담배 잎에서 모자이크 얼룩과 잎 기형 등이 관찰 되었으며 20일 가량 더 키워 담배 모자이크 바이러스 증식량을 늘였다. 이 후 TMV 이병엽 30 g을 수확하여 바이러스 입자를 정제하기 위한 실험을 수행하였다.
구체적으로, 믹서기에 담배 모자이크 바이러스(TMV) 이병엽 30 g, 0.1M Phosphate Buffer(pH7.2) 90 ml, β-머캅토에탄올(β-mecaptoethanol) 0.6 ml을 넣어 잎을 마쇄하고 거즈로 걸러준 뒤, 12 ml의 n-부탄올을 첨가하여 1시간 30분 동안 섞어주었다(4℃유지). 혼합액을 8000 rpm, 4℃에서 20분간 원심분리기에서 분리한 뒤, 상층액만 회수하여 Mira fiber cloth에서 걸러주고, 상층액 부피의 8% PEG, 0.1M NaCl을 첨가하여 3시간 동안 섞어주었다(4℃유지).
상기 이 후 혼합액을 10000 rpm, 4℃에서 20분간 원심분리기에서 분리한 뒤, 상층액은 제거하고 펠릿을 0.1M Phosphate buffer 7.5 ml에 잘 녹여주었다. 이를 다시 10000 rpm, 4℃에서 20분간 원심분리기에서 분리한 뒤, 상층액을 취하여 초원심분리기에서 28000 rpm, 4℃에서 2시간 30분 동안 분리시켰다. 상층액을 제거한 후 남은 펠릿을 300 ㎕의 DEPC를 첨가한 증류수로 녹여주어 담배 모자이크 바이러스(TMV) 입자를 추출하였다. 추출한 입자는 SDS-PAGE와 전자현미경 사진을 통하여 확인하였고, UV 분광계(Shimazu사제, 일본)로 흡광도(260nm)를 측정한 뒤 아래와 같은 공식을 이용하여 바이러스 농도 정량을 하였다.
[260 nm에서 흡광도/ 3.0(TMV 흡광계수)]×희석배수
농도 정량 결과를 바탕으로 RNA 카피 수(copy number)를 아래의 공식에 의하여 계산하였다.
6.02×1023×농도(UV 분광계로 측정된 농도 mg/ml)/6395(담배 모자이크 바이러스 genome의 크기(bp))×330
상기 실험에서 추출한 담배모자이크바이러스 입자를 RNA 추출단계인 분리(Preparation)에서부터 적용하기 위한 적정 농도 선정 실험을 수행하였다. 먼저 담배 모자이크 바이러스 입자를 농도별로 희석하여 200 ㎕을 첨가하여 핵산분리정제장치(ExiPrepTM , 바이오니아사제, 한국)로 50 ㎕ 추출한 후, 이를 인터널 컨트롤 RNA로 1 ㎕사용하고 10×Buffer 5㎕, MMLV 600U, Taq 7.5 unit, dNTP 20 mM 3 ㎕, stabilizer, 최적화된 농도(15p)의 프라이머, 프로브 등과 신종 인플루엔자 RNA를 표준주형으로 첨가하여 증류수로 총 용량이 50 ㎕가 되도록 한 튜브에 넣어 핵산증폭기에서 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 실시하였다. 이를 45℃에서 15분간 역전사반응을 시킨 뒤 95℃에서 5분간 변성시킨 후, 95℃에서 5초, 55℃에서 5초씩 45 사이클을 반응시켰다.
결과, 분리 정제시 한 반응액 당 2×108 내지 2×109/200 ㎕ 이 인터널 컨트롤 RNA 로써의 적정한 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 효율을 나타냄을 확인하였다.
다음으로는 RNA 추출 단계부터 담배모자이크입자를 신종 인플루엔자 검체시료와 함께 추출하여 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응까지의 적용실험을 해 보고, 기존에 사용되던 인터널 컨트롤(바이오니아사 AccuPower Diagnostics kit 에 함유된 인터널 컨트롤(마우스 DVL 유전자 플라스미드)과 비교를 해 보았다. RNA 추출 시, 상기 실험으로 선정한 두 농도에 맞추어 2×108 내지 2×109 copy/20 ㎕를 신종 인플루엔자 검체시료 200 ㎕와 섞어서 함께 핵산분주정제장치에서 분리, 추출하였으며, 핵산증폭기에서 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응시에는 상기 실시예 2에서 선발한 프라이머, 프로브 세트 1, 3(MP1, MP3)을 이용하였다,
실험결과, 먼저 RNA 추출 적용시의 담배 모자이크 바이러스 입자의 적정농도는 2×108 copy/20 ㎕이며 따라서 정제(Prep)단계에서 1×107 copy/㎕의 담배 모자이크 바이러스 입자를 20 ㎕ 첨가하여 검체시료 200 ㎕와 섞어 함께 진행하면 되는 것을 확인하였다. 또한, TMV 인터널 콘트롤을 증폭하기 위한 프라이머, 프로브 세트로는 1번(MP1)이 좀 더 효율성이 높은 것으로 나타났다.
그리고 이를 같은 신종 인플루엔자 검체시료에 대한 기존 인터널 컨트롤 반응 결과와 비교 시, 담배 모자이크 바이러스를 검체시료와 함께 추출, 반응시켰음에도 신종 인플루엔자 RNA 주형의 증폭에 영향을 주지 않고 식물성 인터널 콘트롤 증폭이 독립적으로 잘 이루어짐을 확인하였고, 결과가 잘 나오는 것을 확인하였다. 더불어 기존 바이오니아사에서 진단키트에 사용하던 인터널 컨트롤에 비하여 형광 값이 더 높게 나와 반응 강도가 높음을 확인하였다.
또한, 정량적 분석이 가능함을 확인하기 위해 담배 모자이크 바이러스 입자를 102 내지 108 copy/reaction 농도로 각각 사용하여 핵산분리정제장치로 RNA를 추출하고 핵산증폭기에서 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 실시하였다.
그 결과, 102 내지 108 copy/reaction 농도를 적용한 TMV 입자는 최저 103 카피까지 검출이 가능하였고[도6], 표준 주형 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응의 표준 그래프를 작성했을 때, 기울기는 -0.28, R2 값은 1이었다[도 6]. 여기서, R2 는 실시간 중합효소 연쇄반응의 표준 그래프를 그렸을 때 그래프의 직선성을 나타내는 상관계수로 1에 가까울수록(직선에 가까울수록), 중합 효소 연쇄 반응(PCR)이 제대로 진행되었음을 의미한다. TMV RNA로 표준 주형 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 실시한 표준그래프와 비교 시, 담배 모자이크 바이러스 입자의 농도는 RNA로 추출되고 나서 1/10 정도로 감소되는 경향이 있기는 하나, 농도별로 일정한 간격을 지니며 표준 그래프를 나타내므로 이로써 정량적 분석이 가능함을 확인하였다.
(3) 서로 다른 4종의 핵산(DNA/RNA)을 이용한 실시간 중합효소 연쇄반응
다양한 생물학적 시료로부터 분리 정제된 서로 다른 종류의 타겟핵산을 동시에 검출 및 진단하는 것이 가능한지 확인하였다. 본 발명의 실시간 핵산 분석 통합 시스템 내에 구성되어 있는 핵산 증폭기로서 ExicyclerTM Quantitative Thermal Block(바이오니아사제, 한국)를 사용하였고, 바이오니아사의 진단 키트를 사용하였다. 실시간 중합효소 연쇄반응에 사용된 진단키트는 HBV Quantitative PCR Kit(바이오니아사제, Cat. No. HBV-1111), HCV Quantitative RT-PCR Kit(바이오니아사제, Cat. No. HCV-1111), New InfA(H1N1) Real-Time RT-PCR Kit(바이오니아사제, Cat. No. SIV-1111), CT&NG Real-Time PCR Kit(바이오니아사제, Cat. No. STD2A-1111)의 4종을 사용하였다.
HBV Quantitative PCR Kit 는 B형 간염의 감염여부를 확인하기 위해 혈청검체 시료로부터 추출된 HBV DNA를 증폭하여 정량적인 분석이 가능하도록 구성된 키트로써, 10×PCR Buffer 5 ㎕, wTfi polymerase 5U, dNTP 20 mM 5 ㎕, Thermostable Pyrophosphatase, PPi,안정화제 등의 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 혼합액과 HBV DNA만을 특이적으로 증폭하도록 디자인 한 프라이머 및 프로브가 동결 건조되어 있다(표2).
CT&NG Real-Time PCR Kit 는 성병의 감염여부를 확인하기 위해 Urine 또는 Swab 검체 시료로부터 추출된 CT(Chlamydia Trachomatis) DNA와 NG(Neisseria gonorrhoeae) DNA를 한 반응튜브 내에서 동시에 증폭하는 키트로써, HBV 진단키트와 동일한 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 혼합액을 포함하며 CT DNA 또는 NG DNA만을 특이적으로 증폭하도록 디자인된 프라이머 및 프로브가 동결 건조되어 있다(표2).
상기의 두 키트는 타겟으로 DNA를 증폭한다는 유사점을 갖고 있으나, HBV 진단키트의 경우에는 혈청으로부터 추출한 viral DNA를 단일 증폭하고, CT&NG 진단키트의 경우에는 소변으로부터 추출한 CT와 NG 두 종류의 bacterial DNA를 한 번에 동시 증폭할 수 있는 차이점을 가지고 있으며, HBV 진단키트의 경우 DNA의 정량적 분석을 위해, CT&NG 키트의 경우 DNA의 정성적 분석을 위해 고안되었다는 차이가 있다.
Figure 112010015309643-pat00002
C형 간염의 감염여부를 진단하기 위해 개발된 HCV Quantitative RT-PCR Kit는 혈청으로부터 추출한 핵산을 증폭하여 정량적 분석을 할 수 있다는 점에서 HBV 진단 키트와 유사하나 HBV 진단키트의 경우는 viral DNA를 증폭하고, HCV 진단키트의 경우는 viral RNA를 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 통해 증폭한다는 차이점을 가진다.
최근 신종플루의 감염 여부를 진단하기 위해 개발된 New InfA(H1N1) Real-Time RT-PCR Kit는 RNA 타겟을 증폭한다는 점에서 HCV 진단키트와 유사하나 혈청이 아닌 호흡기 검체로부터 RNA를 추출하여야 하는 차이점이 있으며, 정량분석이 가능한 HCV 진단키트와 다르게 정성분석을 위해 고안되었다는 차이가 있다. RNA 역전사 중합효소 연쇄반응을 위한 HCV 진단키트 또는 New InfA(H1N1) 진단 키트에는 구체적으로 10× RT Buffer 5 ㎕, MMLV 600U, wTfi 5 unit, dNTP 20 mM 3 ㎕, DTT 50 mM, RNasin 15U, 안정화제 등의 RT-PCR 혼합액과 HCV RNA 또는 New InfA(H1N1) RNA를 선택적으로 증폭하도록 디자인 된 프라이머 및 프로브가 동결건조 되어있다(표 2). 각 진단키트에 포함된 프라이머 및 프로브는 55℃ 내지 57℃ 범위로 유사한 Tm 값을 갖도록 디자인되어 있어 서로 다른 4종의 키트도 동시에 중합효소 연쇄반응을 진행하는 것이 가능하다.
상기의 4종 키트를 이용한 실시간 중합효소 연쇄반응 또는 역전사 중합효소 연쇄반응을 핵산증폭기에서 동시에 진행하기 위해 우선, 각 키트의 건조 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 혼합물에 주형 DNA 또는 RNA 5 ㎕, 인터널 콘트롤 용(내부 대조군, IPC) DNA 또는 RNA 1 ㎕, 증류수 44 ㎕를 넣어 총 용량이 50 ㎕가 되도록 혼합 하였다. 주형 DNA 또는 RNA는 각 타겟의 특정 부위를 alignment 과정을 통해 선발한 뒤 유전자합성법(NBiochem. Biophys. Res. Commun. 1998, 248, 200-203)을 이용하여 바이오니아에서 합성하여 pGEM-T-Easy Vector(Promega 사, 미국)에 클로닝 한 것이다.
하나의 실시간 핵산증폭기(ExicyclerTM, 바이오니아사)의 온도순환블록에 총 용량 50 ㎕ 로 혼합 되어진 HBV, HCV, CT&NG, New InfA(H1N1) 진단키트를 장착하고, 장착된 영역과 맞도록 소프트웨어 프로그램상에서 열과 웨을 설정하고, 중합효소 연쇄 반응 조건은 45℃에서 15분간 역전사 반응을 진행하고 95℃에서 5분간 변성과정을 거친 후, 95℃에서 5초, 55℃에서 5초씩 45 사이클로 프로그램을 설정하여 한꺼번에 반응시켰다. HBV 진단키트와 HCV 진단키트의 경우 정량적 분석을 위해 주형 DNA 101 내지 107 copy/reaction 농도를 각각 사용하였으며, CT&NG 진단키트와 New InfA(H1N1) 진단키트의 경우 정성 분석을 위한 양성 컨트롤 주형 DNA 또는 RNA의 한 가지 농도만을 사용하였다.
인터널 콘트롤용 DNA 또는 RNA는 주형 DNA 또는 RNA의 증폭에 아무런 영향을 주지 않고 독립적으로 증폭이 이루어지도록 고안된 유전자이며, 주형 DNA 또는 RNA 증폭이 전혀 이루어 지지 않는 음성 콘트롤 결과에서 인터널 콘트롤 DNA 또는 RNA의 증폭이 제대로 이루어졌는가 여부를 확인함으로써 중합효소 연쇄반응에는 아무런 문제가 없었음을 검증해주기 위함이다.
그 결과, 정량적 분석을 위해 101 내지 107 copy/reaction 농도를 적용한 HBV 진단키트의 주형 DNA는 최저 10 카피까지 검출이 가능하였고(도 8), 표준 주형 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응의 표준 그래프를 작성했을 때, 기울기는 -0.28, R2 값은 0.9997이었다(도 9). 여기서, R2 는 실시간 중합효소 연쇄반응의 표준 그래프를 그렸을 때 그래프의 직선성을 나타내는 상관계수로 1에 가까울수록(직선에 가까울수록), 중합효소 연쇄반응(PCR)이 제대로 진행되었음을 의미한다. HCV 진단키트의 경우에도 최저 10카피 주형 RNA 검출이 가능하였으며(도 10), 표준 주형 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응의 표준 그래프를 작성했을 때, 기울기는 -0.29, R2 값은 0.9998이었다(도 11). 상기 결과로부터 RNA 와 DNA의 차이에 상관없이 1대의 실시간 핵산 증폭기에서 중합효소 연쇄반응을 동시 진행할 수 있다는 점을 확인하였다.
정성적 분석을 위해 고안된 CT&NG 진단키트의 경우에도 정량분석 키트인 HBV, HCV 진단 키트와 중합효소 연쇄반응을 동시 진행하였을 경우 CT 양성 콘트롤 DNA, NG 양성 콘트롤 DNA 및 인터널 콘트롤용 DNA 모두 정상적으로 증폭되었다. 검출 가능한계 확인을 위해 101 내지 107 copy/reaction 농도의 CT 및 NG 주형 DNA를 준비하여 반응을 진행한 결과 CT 및 NG 모두 10카피 검출 가능함을 확인하였고, 표준 주형 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응의 표준 그래프를 작성했을 때, CT의 기울기는 -0.28, R2 값은 0.9997이었고 NG의 기울기는 -0.30, R2 값은 0.9996이었다.
CT&NG 키트와 유사한 방법으로 New InfA(H1N1)키트를 적용 하였을 경우에도 양성 컨트롤 RNA가 정상적으로 증폭됨을 확인하였다. 검출 가능한계 확인을 위해 101 내지 107 copy/reaction 농도의 New InfA(H1N1) 주형 RNA를 준비하여 반응을 진행한 결과 10카피 검출 가능함을 확인하였고, 표준 주형 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응의 표준 그래프를 작성했을 때, 기울기는 -0.28, R2 값은 0.9996이었다.이로써 정량적 분석 또는 정성적 분석을 위해 고안된 키트라도 중합효소 연쇄반응을 동시 진행할 수 있다는 점을 확인하였다.
상기의 실험결과들을 통해 실시간 핵산 분석 통합 시스템 내에 구성되어 있는 1대의 실시간 핵산 증폭기를 사용하여 중합효소 연쇄반응 및 역전사 중합효소 연쇄반응을 진행하는데 있어서, 정량 분석 및 정성 분석을 위해 고안된 서로 다른 4종의 진단 키트를 적용하여 혈청, 소변. 호흡기 등의 서로 다른 검체로부터 추출된 DNA 및 RNA를 동일한 조건으로 동시에 증폭할 수 있음을 확인하였다.
100: 자동정제분주장치 200: 실시간 핵산 증폭기
300: 디스플레이부 400: 저장 데이터 베이스장치

Claims (16)

  1. 다양한 종류의 생물학적 시료에 상응되는 타겟 핵산의 정성분석 또는 정량분석을 동시에 수행하는 실시간 핵산 분석 통합 장치로서,
    타겟 핵산을 포함하는 다양한 생물학적 시료들로부터 각 시료에 포함된 타겟 핵산을 분리 정제하는, 다수의 자동정제분주장치(100);
    멀티웰 온도순환블록(210)을 포함하며, 상기 다수의 자동정제분주장치(100)로부터 수득된 서로 다른 타겟 핵산의 양을 실시간으로 측정하는 실시간 핵산 증폭기(200)를 포함하고,
    각각의 상기 자동정제분주장치(100)별로 분리 정제되는 서로 다른 타겟 핵산의 종류에 상응하도록 상기 실시간 핵산 증폭기(200)의 온도순환블록(210)의 멀티웰 영역을 열 단위로 분할하여 타겟 핵산 종류별로 영역을 설정하고, 상기 설정된 영역의 각각의 웰 별로 상기 자동정제분주장치(100)에 따른 생물학적 시료들의 정보를 저장하고, 상기 온도순환블록을 동일한 조건하에서 동시에 증폭하여 각각의 타겟 핵산을 정성 분석 또는 정량 분석하는 증폭결과가 상기 자동정제분주장치(100)에서 분리 정제되는 각각의 생물학적 시료에 상응하도록 통합적으로 관리하는 제어부; 및
    상기 제어부의 정성 분석 또는 정량 분석의 결과를 실시간으로 출력하는 디스플레이부(300);
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 실시간 핵산 분석 통합 장치.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 실시간 핵산증폭기의 온도순환블록(210) 멀티웰 영역은 열 단위로 분할하여 타겟 핵산 종류별로 영역을 설정하고, 상기 설정된 영역은 각각의 웰 별로 상기 자동정제분주장치(100)에 따른 생물학적 시료들의 정보를 저장함에 있어서, 양성표준시료, 음성표준시료 또는 정량표준시료 정보를 추가로 저장하는 것을 특징으로 하는 실시간 핵산 분석 통합 장치.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 실시간 핵산증폭기(200)는 상기 멀티웰 온도순환블록(210)에 다수의 자동정제분주장치(100)로부터 수득된 서로 다른 핵산을 함유하는 진단키트가 안착되는 것을 특징으로 하는 실시간 핵산 분석 통합 장치.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 멀티웰 온도순환블록(210)은 12열×8행의 웰로 된 96웰 온도순환블록인 것을 특징으로 하는 실시간 핵산 분석 통합 장치.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 멀티웰 온도순환블록(210)은 열의 단위로 선택적으로 측정항목이 설정되는 것을 특징으로 하는 실시간 핵산 분석 통합 장치.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 제어부는 각각의 상기 자동정제분주장치(100)에서 다양한 종류의 생물학적 시료와 함께 인터널 컨트롤(IPC)을 함께 분리하는 경우, 상기 자동정제분주장치(100)로부터 핵산 분리의 성공 여부를 상기 실시간 핵산 증폭기(200)에서의 증폭산물로부터 판단하여 핵산 분리의 재수행 여부를 결정할 수 있는 것을 특징으로 하는 실시간 핵산 분석 통합 장치.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 제어부는 상기 실시간 핵산 증폭기(200)를 동일한 조건하에서 동시에 증폭하여 얻어지는 각각의 생물학적 시료의 타겟 핵산의 Ct값을 임계 Ct값과 비교하여 타겟 핵산의 존재여부를 정성적으로 검출하는 것을 특징으로 하는 실시간 핵산 분석 통합 장치.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 제어부는 상기 실시간 핵산 증폭기(200)에서 동일한 조건으로 기지의 농도의 정량표준시료와 각각의 생물학적 시료를 동시에 증폭하여 얻어지는 각각의 Ct값을 정량표준시료의 Ct값 정량그래프와 비교하여 타겟 핵산의 수를 환산하여 시료내의 타겟 핵산을 정량적으로 결정하는 것을 특징으로 하는 실시간 핵산 분석 통합 장치.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 자동정제분주장치(100)는 핵산을 포함하는 다양한 생물학적 시료들과 이들로부터 핵산을 추출하는데 사용되는 버퍼들이 함유되어 있는 카트리지, 냉장블록, 고온블록, 폐액통, 피펫카트리지 및 피펫의 장착 및 탈착이 가능하며 상기 피펫의 자기장 인가 또는 해제를 위한 자기장 인가수단을 구비하고, 상기 블록들 및 카트리지가 구비된 기판상으로 이동이 가능한 피펫블록을 포함하고, 상기 자동정제분주장치(100)에 따른 각각의 표준시료 및 생물학적 시료의 정보와 타겟 핵산의 정보가 제어부에서 저장되는 것을 특징으로 하는 실시간 핵산 분석 통합 장치.
  10. 제 3항에 있어서,
    상기 실시간 핵산 증폭기(200)는 설정된 온도로 변환되는 멀티웰 온도순환블록, 상기 온도순환블록에 장착된 반응튜브로의 광을 조사하기 위한 조사광원, 상기 반응튜브로부터 발생되는 광을 수광하기 위한 형광검출센서를 구비하며, 상기 설정된 열 별로 측정항목이 설정되어 저장되는 것을 특징으로 하는 실시간 핵산 분석 통합 장치.
  11. 제 1항에 있어서,
    상기 실시간 핵산 분석 통합 장치는 분석결과를 저장하는 저장 데이터 베이스장치(400)를 더 구비하는 것을 특징으로 하는 실시간 핵산 분석 통합 장치.
  12. 1) 다수의 자동정제분주장치(100)에서 표준시료와 핵산을 포함하는 다양한 생물학적 시료들로부터 각 시료에 포함된 핵산을 분리 정제한 후 분리 정제된 용액을 핵산증폭반응 혼합물 반응튜브에 가하여 혼합하는 단계;
    2) 상기 핵산증폭반응 혼합물 반응튜브가 장착될 멀티웰 온도순환블록(210)과 상기 자동정제분주장치(100)에서 분리 정제되는 각각의 타겟 핵산이 상응하도록 멀티웰 온도순환블록(210)의 멀티웰을 타겟핵산 종류별로 열 단위로 분할하여 블록을 설정하고, 상기 설정된 블록내의 각각의 웰별로 상기 자동정제분주장치(100)에서 분리되는 표준시료와 생물학적 시료 정보를 저장하는 단계;
    3) 상기 2) 단계에서 저장된 실시간 핵산 증폭기의 멀티웰 온도순환블록(210)의 각 웰의 생물학적 시료 정보에 일치하도록 단계 1)에서 준비된 반응튜브를 각 웰에 장착하는 단계;
    4) 상기 실시간 핵산 증폭기의 온도순환블록(210)에 장착된 각각의 타겟 핵산을 동일한 조건하에서 동시에 증폭하여 다수의 생물학적 시료들에 대한 각각의 타겟 핵산을 정성분석 또는 정량 분석하여 증폭결과를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 실시간 핵산 분석 통합 장치를 이용한 타겟 핵산의 검출방법.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 1) 단계는 자동정제분주장치(100)에서 생물학적 시료에 인터널 컨트롤(internal positive control, IPC)을 첨가하여 핵산을 분리하여, 상기 증폭결과로부터 자동정제분주장치(100)에서의 타겟 핵산 분리의 성공 여부와 증폭 효율을 판단하여 타겟 핵산의 검출의 유효성을 결정하는 것을 특징으로 하는 실시간 핵산 분석 통합 장치를 이용한 타겟 핵산의 검출방법.
  14. 제 12항에 있어서,
    상기 1) 단계에서 반응튜브는 핵산증폭에 필요한 성분들이 건조된 형태로 함유된 것으로서 여기에 분리 정제된 핵산 용액을 가하여 혼합하여 핵산증폭반응 혼합물 반응튜브를 제조하는 것을 특징으로 하는 실시간 핵산 분석 통합 장치를 이용한 타겟 핵산의 검출방법.
  15. 제 13항에 있어서,
    상기 인터널 콘트롤은 타겟핵산이 RNA인 경우에, 담배모자이크 바이러스 입자인 것을 특징으로 하는 실시간 핵산 분석 통합 장치를 이용한 타겟 핵산의 검출방법.
  16. 제 13항에 있어서,
    상기 인터널 콘트롤은 타겟핵산이 DNA인 경우에, 플라스미드 DNA 또는 PCR 증폭산물인 것을 특징으로 하는 실시간 핵산 분석 통합 장치를 이용한 타겟 핵산의 검출방법.
KR1020100021532A 2009-03-11 2010-03-10 실시간 핵산 분석 통합 장치 및 이를 이용한 타겟 핵산의 검출방법 KR101423936B1 (ko)

Priority Applications (10)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011553957A JP5774499B2 (ja) 2009-03-11 2010-03-11 リアルタイム核酸分析統合装置及びそれを利用したターゲット核酸の検出方法
CN201080011492.4A CN102388148B (zh) 2009-03-11 2010-03-11 实时核酸分析整合装置及利用该装置的靶核酸检测方法
AU2010221905A AU2010221905B2 (en) 2009-03-11 2010-03-11 Apparatus for integrated real-time nucleic acid analysis, and method for detecting a target nucleic acid using same
US13/255,646 US20120135394A1 (en) 2009-03-11 2010-03-11 Apparatus for integrated real-time nucleic acid analysis, and method for detecting a target nucleic acid using same
BRPI1008957A BRPI1008957B8 (pt) 2009-03-11 2010-03-11 método para detecção simultânea de uma pluralidade de ácidos nucleicos alvo executado por um sistema de análise integrada em tempo real de ácidos nucleicos alvo
RU2011141128/10A RU2532853C2 (ru) 2009-03-11 2010-03-11 Устройство для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени и способ определения целевой нуклеиновой кислоты с его использованием
EP10751036.4A EP2407557B1 (en) 2009-03-11 2010-03-11 Apparatus for integrated real-time nucleic acid analysis, and method for detecting a target nucleic acid using same
CA2755234A CA2755234C (en) 2009-03-11 2010-03-11 Method of integrated real-time nucleic acid analysis for simultaneously detecting a plurality of target nucleic acids
PCT/KR2010/001530 WO2010104345A2 (ko) 2009-03-11 2010-03-11 실시간 핵산 분석 통합 장치 및 이를 이용한 타겟 핵산의 검출방법
CL2011002228A CL2011002228A1 (es) 2009-03-11 2011-09-09 Aparato para el analisis integrado de acidos nucleicos en tiempo real, y metodo de detecicion de dichas moleculas.

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020090020913 2009-03-11
KR20090020913 2009-03-11
KR1020100002027 2010-01-08
KR20100002027 2010-01-08

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20100102560A KR20100102560A (ko) 2010-09-24
KR101423936B1 true KR101423936B1 (ko) 2014-07-29

Family

ID=43007600

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020100021532A KR101423936B1 (ko) 2009-03-11 2010-03-10 실시간 핵산 분석 통합 장치 및 이를 이용한 타겟 핵산의 검출방법

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20120135394A1 (ko)
EP (1) EP2407557B1 (ko)
JP (1) JP5774499B2 (ko)
KR (1) KR101423936B1 (ko)
CN (1) CN102388148B (ko)
AU (1) AU2010221905B2 (ko)
BR (1) BRPI1008957B8 (ko)
CA (1) CA2755234C (ko)
CL (1) CL2011002228A1 (ko)
RU (1) RU2532853C2 (ko)
WO (1) WO2010104345A2 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160148201A (ko) * 2015-06-16 2016-12-26 휴스텝스 주식회사 자동 정량 분주기 및 상기 분주기를 포함하는 연속식 유전자 추출-증폭 장비와 연속식 유전자 추출-증폭 방법
WO2018074614A1 (ko) * 2016-10-17 2018-04-26 휴스텝스 주식회사 자동 정량 분주기 및 상기 분주기를 포함하는 연속식 유전자 추출-증폭 장비와 연속식 유전자 추출-증폭 방법

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101420094B1 (ko) * 2010-10-27 2014-07-17 (주)바이오니아 다양한 생체시료분석을 위한 전자동실시간정량증폭장비, 다양한 생체시료분석을 위한 자동정제 및 반응준비 장치, 전자동 핵산정제 및 실시간 정량 유전자증폭 방법, 전자동 핵산정제방법, 실시간정량ｐｃｒ을 이용한 병원균의 전자동 생균수검사방법, 정량면역ｐｃｒ을 이용한 전자동 항원농도획득방법 및 타겟항원에 라벨링된 부착용 타겟핵산의 정제방법
KR101762295B1 (ko) * 2012-02-10 2017-08-04 (주)바이오니아 생체시료의 자동 분석 장치 및 방법
EP3006938B1 (en) 2013-05-30 2017-11-22 K-Mac Real time quantitative and qualitative analysis method for biosubstance
CN103484534A (zh) * 2013-06-19 2014-01-01 兰州百源基因技术有限公司 一组用于淋病奈瑟氏菌实时荧光pcr检测的引物和探针及其应用
CN110702933A (zh) * 2013-09-12 2020-01-17 西门子医疗保健诊断公司 动态测定选择和样本制备装置和方法及其机器可读介质
RU2761432C2 (ru) 2015-02-10 2021-12-08 Иллюмина, Инк. Способ и композиция для анализа клеточных компонентов
AU2017214675B2 (en) * 2016-02-05 2022-11-24 Gen-Probe Incorporated Dried amplification compositions
WO2017154567A1 (ja) * 2016-03-11 2017-09-14 パナソニック株式会社 試料分析方法及び試料分析装置
WO2019022753A1 (en) * 2017-07-28 2019-01-31 Hewlett-Packard Development Company, L.P. INTERROGATION AND DETECTION OF IONIC SPECIES
KR102531008B1 (ko) * 2017-09-28 2023-05-11 주식회사 씨젠 증폭 데이터 표시 방법 및 장치
CN109825416A (zh) * 2018-11-16 2019-05-31 苏州新波生物技术有限公司 一种全自动分子诊断系统及分子诊断方法
WO2021055123A1 (en) * 2019-09-20 2021-03-25 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Improved rotor mixer for agitation of fluids during sample preparation
CN110951580B (zh) * 2019-09-29 2022-05-20 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 高通量单细胞转录组与基因突变整合分析一体化装置
WO2021231687A1 (en) * 2020-05-13 2021-11-18 Ohio State Innovation Foundation Quadruplex-based detection of a target nucleic acid
CN111812131B (zh) * 2020-07-21 2020-12-25 中国科学院地质与地球物理研究所 水合物二次生成或分解过程的可视化试验系统及方法
CN111849758A (zh) * 2020-08-18 2020-10-30 上海基灵生物科技有限公司 全自动实时荧光定量pcr检测系统
KR102581063B1 (ko) * 2020-12-31 2023-09-22 한국기계연구원 고속 온도제어가 가능한 고속 분자진단장치 및 이를 이용한 고속 분자진단방법
JP2022109744A (ja) * 2021-01-15 2022-07-28 シスメックス株式会社 核酸分析方法および核酸分析装置
WO2023018085A1 (ko) 2021-08-10 2023-02-16 주식회사 루닛 병리 슬라이드 이미지와 관련된 정보를 출력하는 방법 및 장치

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080254467A1 (en) 2007-03-02 2008-10-16 John Frederick Regan Automated High-Throughput Flow-Through Real-Time Diagnostic System

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IE903354A1 (en) 1989-09-14 1991-04-10 Baxter Int Method and useful apparatus for preparing pharmaceutical¹compositions
CA2096198A1 (en) * 1992-06-26 1993-12-27 Christopher J. Macko Automated clinical analyzer with temperature control
US5897783A (en) 1992-09-24 1999-04-27 Amersham International Plc Magnetic separation method
FI932866A0 (fi) 1993-06-21 1993-06-21 Labsystems Oy Separeringsfoerfarande
BE1007049A3 (nl) 1993-05-05 1995-02-28 Dsm Nv Werkwijze voor het verwijderen van kwik.
JP3115501B2 (ja) 1994-06-15 2000-12-11 プレシジョン・システム・サイエンス株式会社 分注機を利用した磁性体の脱着制御方法及びこの方法によって処理される各種装置
DE4423878A1 (de) 1994-07-07 1996-01-11 Boehringer Mannheim Gmbh Vorrichtung und Verfahren zum Abscheiden von magnetischen Mikropartikeln
DE69738605T2 (de) * 1996-06-04 2009-04-30 University Of Utah Research Foundation, Salt Lake City Behälter zum Durchführen und Beobachten biologischer Prozesse
EP1671703A3 (en) * 1998-03-19 2006-07-05 Precision System Science Co., Ltd. Method for making substances in carriers
US6153412A (en) * 1998-12-07 2000-11-28 Bioneer Corporation Lyophilized reagent for polymerase chain reaction
WO2000056872A2 (en) * 1999-03-22 2000-09-28 Pangene Corporation High-throughput gene cloning and phenotypic screening
US20010039014A1 (en) * 2000-01-11 2001-11-08 Maxygen, Inc. Integrated systems and methods for diversity generation and screening
JP2001269160A (ja) * 2000-03-24 2001-10-02 Bioneer Corp 自動核酸精製装置
US20020155587A1 (en) * 2001-04-20 2002-10-24 Sequenom, Inc. System and method for testing a biological sample
US20040053318A1 (en) * 2002-09-17 2004-03-18 Mcwilliams Diana R. Preservation of RNA and reverse transcriptase during automated liquid handling
WO2004044221A2 (en) * 2002-11-08 2004-05-27 Pharmacia Corportion High throughput automatic nucleic acid isolation and quantitation methods
US20050089875A1 (en) * 2002-11-21 2005-04-28 Sention Inc. Quantitative analysis of expression profiling information produced at various stages of an amplification process
KR100794703B1 (ko) 2003-04-03 2008-01-14 (주)바이오니아 생화학적 반응의 실시간 모니터링 장치
DE102004021822B3 (de) * 2004-04-30 2005-11-17 Siemens Ag Verfahren und Anordnung zur DNA-Amplifikation mittels PCR unter Einsatz von Trockenreagenzien
US20070042354A1 (en) * 2005-08-19 2007-02-22 Engelhard Eric K Detecting pathogens in companion animals
US7629124B2 (en) * 2006-06-30 2009-12-08 Canon U.S. Life Sciences, Inc. Real-time PCR in micro-channels
KR20080032904A (ko) 2006-10-11 2008-04-16 삼성전자주식회사 표시패널
KR101350056B1 (ko) 2007-01-05 2014-01-15 엘지전자 주식회사 냉장고

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080254467A1 (en) 2007-03-02 2008-10-16 John Frederick Regan Automated High-Throughput Flow-Through Real-Time Diagnostic System

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160148201A (ko) * 2015-06-16 2016-12-26 휴스텝스 주식회사 자동 정량 분주기 및 상기 분주기를 포함하는 연속식 유전자 추출-증폭 장비와 연속식 유전자 추출-증폭 방법
KR101707987B1 (ko) 2015-06-16 2017-02-21 휴스텝스 주식회사 자동 정량 분주기 및 상기 분주기를 포함하는 연속식 유전자 추출-증폭 장비와 연속식 유전자 추출-증폭 방법
WO2018074614A1 (ko) * 2016-10-17 2018-04-26 휴스텝스 주식회사 자동 정량 분주기 및 상기 분주기를 포함하는 연속식 유전자 추출-증폭 장비와 연속식 유전자 추출-증폭 방법

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI1008957A2 (pt) 2016-03-15
CL2011002228A1 (es) 2012-03-23
CA2755234C (en) 2020-06-30
RU2532853C2 (ru) 2014-11-10
US20120135394A1 (en) 2012-05-31
KR20100102560A (ko) 2010-09-24
CA2755234A1 (en) 2010-09-16
AU2010221905A1 (en) 2011-10-06
CN102388148A (zh) 2012-03-21
AU2010221905B2 (en) 2015-04-16
CN102388148B (zh) 2017-05-17
EP2407557A2 (en) 2012-01-18
BRPI1008957B1 (pt) 2020-04-22
RU2011141128A (ru) 2013-04-20
WO2010104345A3 (ko) 2011-01-13
JP5774499B2 (ja) 2015-09-09
BRPI1008957B8 (pt) 2021-07-27
JP2012523820A (ja) 2012-10-11
WO2010104345A2 (ko) 2010-09-16
EP2407557A4 (en) 2016-05-25
EP2407557B1 (en) 2020-05-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101423936B1 (ko) 실시간 핵산 분석 통합 장치 및 이를 이용한 타겟 핵산의 검출방법
US8979770B2 (en) Extraction and diagnostic fluid devices, systems and methods of use
JP5258835B2 (ja) ポリヌクレオチドの検出及び定量装置
WO1997031105A1 (fr) Procede de traitement de biopolymeres, de micro-organismes ou de matieres a l'aide de plusieurs types de particules magnetiques
JP2007101351A (ja) 表示方法と表示装置、該表示装置を備えた全自動検査装置
WO2007106552A2 (en) System and method for diagnosis of infectious diseases
JP2003050242A (ja) 生体試料処理装置
US20180023127A1 (en) Visually determinable genetic testing
CN106967837A (zh) 一种7q11.23缺失的检测方法
WO2004044243A1 (ja) 核酸の増幅方法及びその装置
US20240117404A1 (en) Automatic Phagogram
US11453918B2 (en) Method for detecting live Mycobacterium tuberculosis
EP4000729A1 (en) Method for determining the presence of a pathogen
Bai et al. A gamepad-like nucleic acid testing device for rapid detection of SARS-CoV-2 via visible nested RPA amplification
WO2024086856A2 (en) System for automation of chemical and biological analytical processes
WO2024050362A2 (en) Dynamic melt detection
CN116802476A (zh) 即时微流体体外诊断系统
CN102876783A (zh) 焦磷酸测序法检测oct2基因多态性的试剂盒及方法
US20180023116A1 (en) Method for preparing single-stranded dna product
US20100151442A1 (en) Method for detecting emerging pandemic influenza
Immundiagnostik MutaPLATE® Cystic Fibrosis

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170621

Year of fee payment: 4