JP5774499B2 - リアルタイム核酸分析統合装置及びそれを利用したターゲット核酸の検出方法 - Google Patents
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Description
実施例1は、本発明によるリアルタイム核酸分析統合装置に関するものである。図1は本発明によるリアルタイム核酸分析統合装置の概略図を示すものであり、以下、本発明をより詳細に説明する。
実施例2は、本発明によるリアルタイム核酸分析統合装置を利用したターゲット核酸の検出方法に関するものであり、以下、より詳細に説明する。
実施例3は、本発明によるリアルタイム核酸分析統合装置を利用したターゲット核酸の検出方法において、核酸の分離精製に用いられるインターナルコントロール及び多数の検体の同時検出に関するものであり、以下、本発明をより詳細に説明する。
植物性インターナルコントロール(Internal Positive Control、IPC)は、タバコモザイクウイルス(Tobacco mosaic Virus、TMV)のゲノムRNA(GeneBank.ACCESSION No.NC001367)の塩基配列4903から5709(Movement protein gene、MP)、5712から6191(Coat protein gene、CP)の間で、長さは18〜28bp、Tm値は55℃〜62℃となるように、任意で塩基配列を選択して正方向及び逆方向プライマーとして用いた。
生物学的試料とともに使用可能な植物性インターナルコントロールを製造するために、まず、タバコモザイクウイルスを増殖した。タバコNicotiana tabaccum cv.Samsun種子(韓国農村振興庁の植物ウイルス研究室で分譲)を100〜200粒播種した後、10日後に芽が生じるとそれから10日後に各個体毎に小さな植木鉢に移植し、さらに10日間育てた。タバコモザイクウイルス(TMV)罹病葉(韓国農村振興庁の植物ウイルス研究室で分譲)をモルタルに入れて0.01M リン酸塩バッファー(Phosphate Buffer)(pH7.2)とともに粉砕して汁液を製造し、カーボランダム(carborundum)を吹き付けたタバコ葉に汁液を塗布し、傷を介してTMVの接種がなされるようにした。
多様な生物学的試料から分離精製された互いに異なる種類のターゲット核酸を、同時に検出及び診断することが可能であるかを確認した。本発明のリアルタイム核酸分析統合システム内に構成されている核酸増幅器としてはExicyclerTM Quantitative Thermal Block(バイオニア社製、韓国)を使用し、バイオニア社の診断キットを用いた。リアルタイム重合酵素連鎖反応に使用された診断キットは、HBV Quantitative PCR Kit(バイオニア社製、Cat.No.HBV−1111)、HCV Quantitative RT−PCR Kit(バイオニア社製、Cat.No.HCV−1111)、New InfA(H1N1)Real−Time RT−PCR Kit(バイオニア社製、Cat.No.SIV−1111)、CT&NG Real−Time PCR Kit(バイオニア社製、Cat.No.STD2A−1111)の4種を使用した。
200 リアルタイム核酸増幅器
300 ディスプレイ部
400 保存データベース装置
Claims (14)
- 多様な種類の生物学的試料に相応するターゲット核酸の定性分析または定量分析を同時に行うリアルタイム核酸分析統合装置であって、ターゲット核酸を含む多様な生物学的試料からターゲット核酸を分離精製する、多数の自動精製分注装置100と、
列単位で選択的に測定項目が設定されるマルチウェル温度循環ブロック210を含み、前記多数の自動精製分注装置100から得られた互いに異なるターゲット核酸を含む夫々の診断キットが前記マルチウェル温度循環ブロック210に載置され、前記多数の自動精製分注装置100から得られた互いに異なるターゲット核酸の量をリアルタイムで測定するリアルタイム核酸増幅器200と、を含み、
夫々の前記自動精製分注装置100毎に分離精製される互いに異なるターゲット核酸の種類に相応するように、前記リアルタイム核酸増幅器200の温度循環ブロック210上のマルチウェルをターゲット核酸の種類によって列単位で設定し、前記自動精製分注装置100による生物学的試料の情報を、前記列単位で設定された夫々のウェルに対応して保存し、前記温度循環ブロックの同一の条件下で同時増幅を行って、夫々のターゲット核酸を定性分析または定量分析する増幅結果が、前記自動精製分注装置100で分離精製される夫々の生物学的試料に相応するように統合的に管理し、多様な種類の生物学的試料から求められる多様なターゲットの検査が一連の一段階過程により並列的に処理される制御部と、
前記制御部の定性分析または定量分析の結果をリアルタイムで出力するディスプレイ部300と、
を含むことを特徴とするリアルタイム核酸分析統合装置。 - 前記リアルタイム核酸増幅器の温度循環ブロック210上のマルチウェルをターゲット核酸の種類によって列単位で設定し、前記自動精製分注装置100による生物学的試料の情報を、前記列単位で設定された夫々のウェルに対応して保存するにあたり、陽性標準試料、陰性標準試料、または定量標準試料の情報をさらに保存することを特徴とする請求項1に記載のリアルタイム核酸分析統合装置。
- 前記マルチウェル温度循環ブロック210は、12列×8行のウェルからなる96ウェルの温度循環ブロックであることを特徴とする請求項2に記載のリアルタイム核酸分析統合装置。
- 前記制御部は、夫々の前記自動精製分注装置100で多様な種類の生物学的試料とともにインターナルコントロール(IPC)を分離する場合、前記自動精製分注装置100による核酸分離の成功有無を前記リアルタイム核酸増幅器200での増幅産物から判断し、核酸分離の再遂行有無を決めることができることを特徴とする請求項1に記載のリアルタイム核酸分析統合装置。
- 前記制御部は、前記リアルタイム核酸増幅器200の同一の条件下での同時増幅により得られる夫々の生物学的試料のターゲット核酸のCt値を臨界Ct値と比較し、ターゲット核酸の存在有無を定性的に検出することを特徴とする請求項1に記載のリアルタイム核酸分析統合装置。
- 前記制御部は、前記リアルタイム核酸増幅器200で同一の条件で既知の濃度の定量標準試料と夫々の生物学的試料を同時に増幅して得られる夫々のCt値を定量標準試料のCt値の定量グラフと比較し、ターゲット核酸の数を計算して試料内のターゲット核酸を定量的に決めることを特徴とする請求項1に記載のリアルタイム核酸分析統合装置。
- 前記自動精製分注装置100は、核酸を含む多様な生物学的試料とこれから核酸を抽出するために用いられるバッファーが含まれているカートリッジ、冷蔵ブロック、高温ブロック、廃液筒、ピペットカートリッジが備えられた基板上への移動が可能で、ピペットの装着及び脱着が可能であり、前記ピペットの磁場の印加または解除のための磁場印加手段を備えるピペットブロックを含み、前記自動精製分注装置100による夫々の標準試料及び生物学的試料の情報とターゲット核酸の情報が制御部に保存されることを特徴とする請求項1に記載のリアルタイム核酸分析統合装置。
- 前記リアルタイム核酸増幅器200は、温度が所定温度に変更されるマルチウェル温度循環ブロックと、前記温度循環ブロックに装着された反応チューブへ光を照射するための照射光源と、前記反応チューブから発生する光を受光するための蛍光検出センサと、を備え、前記設定された列毎に測定項目が設定されて保存されることを特徴とする請求項2に記載のリアルタイム核酸分析統合装置。
- 前記リアルタイム核酸分析統合装置は、分析結果を保存する保存データベース装置400をさらに備えることを特徴とする請求項1に記載のリアルタイム核酸分析統合装置。
- 1)多数の自動精製分注装置100で、標準試料と核酸を含む多様な生物学的試料から各試料に含まれた核酸を分離精製した後、分離精製された溶液を核酸増幅反応混合物の反応チューブに加えて混合する段階と、
2)前記核酸増幅反応混合物の反応チューブが装着されるマルチウェル温度循環ブロック210と前記自動精製分注装置100で分離精製される夫々のターゲット核酸が相応するように、マルチウェル温度循環ブロック210のマルチウェルをターゲット核酸の種類によって列単位で設定し、前記列単位で設定された夫々のウェルに対応して、前記自動精製分注装置100で分離される標準試料と生物学的試料の情報を保存する段階と、
3)上記段階2)で保存されたリアルタイム核酸増幅器のマルチウェル温度循環ブロック210の各ウェルの生物学的試料の情報に一致するように、段階1)で準備された反応チューブを各ウェルに装着する段階と、
4)前記リアルタイム核酸増幅器の温度循環ブロック210に装着された夫々のターゲット核酸を同一の条件下で同時に増幅して、多様な種類の生物学的試料から求められる多様なターゲットの検査が一連の一段階過程により並列的に処理されることにより、多数の生物学的試料に対する夫々のターゲット核酸を定性分析または定量分析し、増幅結果を得る段階と、
を含むことを特徴とするリアルタイム核酸分析統合装置を利用したターゲット核酸の検出方法。 - 前記1)段階は、自動精製分注装置100で生物学的試料にインターナルコントロール(internal positive control、IPC)を添加して核酸を分離し、前記増幅結果から、自動精製分注装置100でのターゲット核酸分離の成功有無と増幅効率を判断して、ターゲット核酸の検出の有効性を決めることを特徴とする請求項10に記載のリアルタイム核酸分析統合装置を利用したターゲット核酸の検出方法。
- 前記1)段階において、前記核酸増幅反応混合物の反応チューブは、前記分離精製された核酸溶液を核酸増幅に必要な成分が乾燥された形態で含まれた反応チューブに加え、前記溶液と前記成分を混合することにより製造されることを特徴とする請求項10に記載のリアルタイム核酸分析統合装置を利用したターゲット核酸の検出方法。
- 前記インターナルコントロールは、ターゲット核酸がRNAである場合、タバコモザイクウイルス粒子であることを特徴とする請求項11に記載のリアルタイム核酸分析統合装置を利用したターゲット核酸の検出方法。
- 前記インターナルコントロールは、ターゲット核酸がDNAである場合、プラスミドDNAまたはPCR増幅産物であることを特徴とする請求項11に記載のリアルタイム核酸分析統合装置を利用したターゲット核酸の検出方法。
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