CN111719019A

CN111719019A - 新型冠状病毒环介导等温扩增检测方法及试剂盒

Info

Publication number: CN111719019A
Application number: CN202010538256.3A
Authority: CN
Inventors: 常凌乾; 王杨; 耿佳; 应斌武
Original assignee: Beihang University; West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: Beihang University; West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2020-06-12
Filing date: 2020-06-12
Publication date: 2020-09-29

Abstract

本申请提供了一种新型冠状病毒环介导等温扩增检测方法，并提供了相应检测试剂盒；本申请的检测方法和试剂盒中的引物基于新型冠状病毒的ORF1ab基因部分区域设计，具有较高的特异性和灵敏度。

Description

新型冠状病毒环介导等温扩增检测方法及试剂盒

技术领域

本申请属于分子生物学检测和传染病检测控制领域，具体地，本申请提供了一种新型冠状病毒环介导等温扩增检测方法，并提供了相应检测试剂盒。

背景技术

在曾被寄予厚望的瑞德西韦、氯喹、莲花清瘟胶囊等药物临床效果并不理想，疫苗研发尚需很长周期的情况下，新冠病毒感染的控制主要依赖于严格的物理隔离切断病毒传播途径，使用隔离方法控制疾病时，及时、准确的诊断疾病/甄别感染者是快速控制疾病，并减少经济损失和社会影响的关键。

虽然有一些免疫检测方法得到报道和应用，但目前，新型冠状病毒的检测仍然主要依赖于分子生物学检测方法。我国现有报道的已研发或上市的分子诊断即时检测(POCT)设备，主要是基于实时荧光PCR技术，其在临床诊断和疑似患者排查中发挥了重要的作用，然而由于耗时长、对检测仪器要求高(需要沉重且昂贵且需电力支持的PCR仪器)，需要集中送检等限制，不利于开展大规模的筛查，并不能完全满足当前即时快速的检测需求；另一方面，由于传统核酸检测手段操作相对繁琐，容易出现操作疏漏，而且新冠病毒的常见检测样本—咽拭子中病毒含量经常较低，传统核酸检测手段容易出现遗漏感染者的假阴性问题(Huanqin Han et al.，SARS-CoV-2 RNA More Readily Detected in Induced SputumThan in Throat Swabs of Convalescent COVID-19 Patients，Lancet InfectDis.2020)。

综上，研究灵敏度、特异性更好，耗时短，操作简单地新分子生物学新冠病毒检测方法对于控制该疾病有着重要而紧迫的意义。

发明内容

环介导等温扩增技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。本发明针对新冠病毒的ORF1ab基因区域，设计了用于特异性的识别该区域的环介导等温扩增引物，构建和相应检测方法和试剂盒。新冠病毒的ORF1ab基因区域相较于病毒的其他区域，包括E基因和N基因区域，具有更高的检测特异性，能够有利于提升检测准确度。

一方面，本申请提供了检测新型冠状病毒的环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于，其中包含检测新型冠状病毒的环介导等温扩增引物，所述引物针对新型冠状病毒的ORF1ab基因设计。

进一步地，其中引物针对SEQ ID NO.1设计。

进一步地，其中引物序列为：

1-F3：SEQ ID NO.2；

1-B3：SEQ ID NO.3；

1-FIP：SEQ ID NO.4

1-BIP：SEQ ID NO.5

1-LoopF：SEQ ID NO.6

1-LoopR：SEQ ID NO.7。

进一步地，其中还包含反应缓冲液和荧光染料。

进一步地，其中还包含BRAC1对照阳性对照引物：

BRAC1 F3：SEQ ID NO.20；

BRAC1 B3：SEQ ID NO.21；

BRAC1 LPF：SEQ ID NO.22；

BRAC1 LPR：SEQ ID NO.23；

BRAC1 FIP：SEQ ID NO.24；

BRAC1 BIP：SEQ ID NO.25。

另一方面，本申请提供了使用上述试剂盒检测新型冠状病毒的非诊断方法。

进一步地，其检测对象为咽拭子样本。

进一步地，其中使用目视判断检测结果。

另一方面，本申请提供了上述试剂盒在制备检测新型冠状病毒芯片中的应用。

本申请所检测的病毒种类包括但不限于已知的新型冠状病毒毒株，经过相应调整后本申请也适用于申请日之后发现的新型冠状病毒新毒株和变体。

本申请所适用的样本包括但不限于咽拭子、痰液、口腔/鼻腔拭子、血液、其他体液样本、组织样本、环境样本等，本领域技术人员已知这些样本的常规处理方法。

本申请中的非诊断用途包括但不限于环境卫生检测、疾病整体防控/流行趋势检测、食品、日用品检测。

ORF1ab基因序列可以在诸如Genbank、EMBL等网站检索到、从论文中获取、或者基于实际检测的样本测序获得，不局限于已知的ORF1ab基因序列，新毒株和变体的不同ORF1ab基因序列经过验证也可以使用。

本申请中的环介导等温扩增引物可以基于ORF1ab序列使用现有环介导等温扩增引物设计工具/网站设计，这些工具/网站包括但不限于Primer Explorer、BiosunLAMP、Premierbiosoft、LAMP designer等，也可以由相关公司提供设计。

本申请中的反应缓冲液中可使用已知/研究中的环介导等温扩增反应用成分，这些成分包含但不限于Bst聚合酶、dNTPs、MgSO₄、KCl、Tris、甜菜碱、Tween、(NH₄)₂SO₄等。

本申请的荧光染料可以使用各种已知/研究中的荧光染料，包括但不限于Calcein/ 钙黄绿素、SYBR Green、Eva Green、HNB等；目视检测外，可以根据需要使用各种荧光检测仪、浊度仪检测颜色的变化。

本申请的反应参数可以参照现有技术、样本类型、检测要求常规确定。

本申请中的芯片可以使用激光蚀刻、化学蚀刻、机械加工、丝网印刷等方法在各种有机无机材料上加工制备，材料包括但不限于聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、玻璃、金属等；孔洞大小可以为锥形、圆柱形等，孔洞直径可以根据反应体系体积常规调整；基板材料厚度可选但不限于1-10mm；孔径可选但不限于0.5-10mm。

附图说明

图1为本发明的环介导等温扩增引物设计示意图；

图2为三组引物的在不同浓度拷贝下的扩增效果比较；

图3为环介导等温扩增芯片示意图；

图4为最低检测限测定结果；

图5为高通量微孔阵列芯片检测性能：(A)检测灵敏度测试；(B)多参数微孔阵列芯片检测扩增所需时间与商用八连管对比结果。

具体实施方式

实施例1环介导等温扩增引物设计和效果验证

如图1所示，针对ORF1ab基因片段(SEQIDNO.1)，分别设计了三套引物系统，如下表所示：

表1.新冠病毒引物序列设计

并且基于这三套引物系统，分别对ORF1ab基因的质粒高(10⁹拷贝/mL)、中(10⁸拷贝/mL)、低(10⁷拷贝/mL)三个浓度的检测目标进行检测。如图2所示，当目标检测物浓度较高时，不同组引物之间的扩增速度和性能基本一致，而当目标检测物浓度较低时，第一组引物实现扩增检测的速度要明显由于第二组以及第三组引物测试。结果表明这三套引物都可以用于新冠病毒的特异性、高灵敏度检测；相较而言，第一套引物系统，其灵敏度更高。

实施例2环介导等温扩增芯片的制备

采用CoreDrawX5软件设计，基于实施例1引物制备环介导等温扩增芯片(如图3 所示)：采用10×10结构排布，能够同时对100个样本进行恒温扩增检测。在芯片中加入阳性控制和阴性控制，阳性控制采用BRAC1基因作为对照；芯片的微孔采用激光刻蚀技术进行制备，微孔结构采用锥形结构(基于3mm厚度的聚甲基丙烯酸甲酯基片，微孔上下直径分别为2mm与5mm，计算微孔体积为30μL)；只需一步手工加样操作，规避可能的人工操作误差所产生的问题，加入恒温扩增反应溶液后，芯片上表面利用单面封口膜进行封闭。锥形结构可以有效降低恒温扩增反应时的溶液蒸发，从而有效提高检测准确度，避免不同检测位点之间的相互串扰。通过向恒温扩增反应溶液中加入染料，包括荧光染料和可视化染料，可实时监测恒温扩增反应进程，并对检测结果进行直接肉眼读取。

芯片使用过程为：先采用核酸检测试剂盒对检测样本中的RNA进行提取，具体的提取步骤为：标本在56℃灭活30min后，颠倒混匀，于生物安全柜内取300ul的样本溶液加入核酸提取试剂盒(磁珠法)(思路迪；批号20200219)的试剂板第1、7列，再加入20ul核酸裂解酶(思路迪；批号20200219)，将试剂板和磁棒套装入对应的卡槽，在核酸提取仪(思路迪；型号：NP968-C)提取核酸。设备运行参数设定：磁珠混合1min；裂解15min；洗涤I：2min；洗涤II：2min；核酸洗脱：5min；磁珠吸弃：1min。自动提取结束后，将试剂板从仪器取下，生物安全柜内从第6、12列收集RNA，用于后续实验或冻存。

在检测过程中，采用的核酸反应溶液体系为25μL。首先分别向微孔阵列芯片的检测区域和控制区域加入12.5μL反应缓冲液，0.5μL染料，3.4μL引物以及3.4μ L双蒸水。然后向控制区域的阴性控制中加入5μL双蒸水作为阴性对照，向阳性控制中加入5μLBRAC1基因作为阳性对照；向检测区域加入5μL提取的RNA溶液。采用单面封口膜对加入反应溶液的器件进行封闭，从而形成密闭的反应腔室，将上述器件放置在 60℃的热板上，实现恒温扩增检测，检测结果可直接肉眼读取。

利用高通量核酸检测微孔阵列芯片，对合成的不同浓度的Orf1ab基因质粒进行检测。核酸扩增反应后，阳性样本的颜色将由粉红色变为黄色，而阴性样本的颜色依旧保持粉红色。从图4和5中可以看出，检测灵敏度能达到1000拷贝/mL，且检测时间比一般PCR系统显著缩短。

实施例3实际临床样本检测

咽拭子样本有由武汉大学中南医院提供，具体检测在四川大学华西医院完成。所用样品已经经过多次RT-qPCT检测并结合临床症状得到了确定的阳性/阴性结果。采用前面实施例中的微孔阵列芯片和恒温扩增方式，对上述样本进行再次检测，将检测结果与 RT-qPCR检测结果对比，如果PCR检测呈阳性，而芯片检测为阴性，判定为假阴性结果；而PCR呈阴性，芯片检测为阳性，则判定为假阳性结果。

共进行了113例临床样本的测试，发现第一套引物系统具有94.7％的检测准确度，同时，对临床检测结果的灵敏度和特异性进行了计算，：

灵敏度＝真实阳性结果/(真实阳性结果+假阴性结果)；

特异性＝真实阴性结果/(真实阴性结果+假阳性结果)；

表2.临床检测结果

其中灵敏度表征能够真实检测出阳性结果的能力，而特异性表示能够真实检测出阴性结果的能力，计算发现我们的引物系统的灵敏度能达到95.4％，特异性达92.3％，证明我们设计的引物序列具有较好的检测性能。

SEQUENCE LISTING

<110> 申请人

<120> 新型冠状病毒环介导等温扩增检测方法及试剂盒

<160> 25

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 267

<212> DNA

<213> COVID-19

<400> 1

tccagatgag gatgaagaag aaggtgattg tgaagaagaa gagtttgagc catcaactca 60

atatgagtat ggtactgaag atgattacca aggtaaacct ttggaatttg gtgccacttc 120

tgctgctctt caacctgaag aagagcaaga agaagattgg ttagatgatg atagtcaaca 180

aactgttggt caacaagacg gcagtgagga caatcagaca actactattc aaacaattgt 240

tgaggttcaa cctcaattag agatgga 267

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aactcaatat gagtatggta ctg 23

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

catctctaat tgaggttgaa cc 22

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttgctcttct tcaggttgaa gagctgatta ccaaggtaaa cctttg 46

<210> 5

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgatgatagt caacaaactg ttggtgaata gtagttgtct gattgtcct 49

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gcagaagtgg caccaaatag 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

acggcagtga ggacaatcag 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tccagatgag gatgaagaag 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

caacaattgt ttgaatagta g 21

<210> 10

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

agagcagcag aagtggcacg gtgattgtga agaagaagag t 41

<210> 11

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tcaacctgaa gaagagcaag aagtctgatt gtcctcactg cc 42

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ctcatattga gttgatggct c 21

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

caaactgttg gtcaacaaga c 21

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tcatcacgta gtcgcaacag 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ttgctctcaa gctggttcaa 20

<210> 16

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

taaccacagc caggttaggt cgctcgtggt tacaatctgt caagcagcag caaag 55

<210> 17

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

caatctgtca agcagcagca aagtggaact tctcctgcta gaatggc 47

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

taaccacagc caggttaggt cgctc 25

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gagcagcatc accgccattg cc 22

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tccttgaact ttggtctcc 19

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

cagttcataa aggaattgat agc 23

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

agaaccagag gccaggcgag 20

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

aggcagatag gcttagactc aa 22

<210> 24

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

atccccagtc tgtgaaattg ggcaaaatgc tgggattata gatgt 45

<210> 25

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gcagcagaaa gattattaac ttgggcagtt ggtaagtaaa tggaaga 47

Claims

1.检测新型冠状病毒的环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于，其中包含检测新型冠状病毒的环介导等温扩增引物，所述引物针对新型冠状病毒的ORF1ab基因设计。

2.根据权利要求1的试剂盒，其中引物针对SEQ ID NO.1设计。

3.根据权利要求1的试剂盒，其中引物序列为：

1-F3：SEQ ID NO.2；

1-B3：SEQ ID NO.3；

1-FIP：SEQ ID NO.4

1-BIP：SEQ ID NO.5

1-LoopF：SEQ ID NO.6

1-LoopR：SEQ ID NO.7。

4.根据权利要求1-3任一项的试剂盒，其中还包含反应缓冲液和荧光染料。

5.根据权利要求1-4任一项的试剂盒，其中还包含BRAC1对照阳性对照引物。

6.根据权利要求5的试剂盒，其中BRAC1对照阳性对照引物为：

BRAC1 F3：SEQ ID NO.20；

BRAC1 B3：SEQ ID NO.21；

BRAC1 LPF：SEQ ID NO.22；

BRAC1 LPR：SEQ ID NO.23；

BRAC1 FIP：SEQ ID NO.24；

BRAC1 BIP：SEQ ID NO.25。

7.检测新型冠状病毒的非诊断方法，其中使用根据权利要求1-6任一项的试剂盒。

8.根据权利要求7的方法，其检测对象为咽拭子样本。

9.根据权利要求7或8的方法，其中使用目视判断检测结果。

10.根据权利要求1-6任一项的试剂盒在制备检测新型冠状病毒芯片中的应用。