CN104937108A - 利用pH敏感染料的扩增反应产物的检测 - Google Patents
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Abstract
提供快速、低成本监测扩增反应的方法。这包括利用彩色或荧光的pH敏感染料监测等温或PCR扩增反应的进程至完成。描述了包括DNA聚合酶、脱氧核苷酸三磷酸和小于1mM Tris或等价物的弱缓冲剂或没有缓冲剂的混合物的组合物。
Description
发明背景
序列特异的等温和聚合酶链式反应(PCR)核酸扩增技术代表分子诊断学的快速增长部分,提供快速、灵敏的DNA样品检测。
电泳是检测扩增后步骤中的DNA产物的传统方法,其利用劳动密集的手动处理和仪器。最近,等温扩增的发展已提供了可选的检测方法,例如,具有嵌入或镁敏感的荧光基团的双链DNA(dsDNA)的荧光检测(Notomi,et al.,Nucleic Acids Res.,28:E63(2000);Tomita,et al.,Nat.Protoc,3:877-82(2008);Goto,et al.,BioTechniques,46:167-72,(2009));通过焦磷酸盐转化的生物发光(Gandelman,et al.,PLoS One,5:el4155(2010);或沉淀的焦磷酸镁的浊度检测(Mori et al.,Biochem.Biophys.Res.
Commun.,289:150-4(2001))。然而,这些可视方法通常需要长的温育时间(>60分钟),需要专门的检测仪器,或针对在实验室外强大的检测,变化太微细。实时PCR设备和化学的进展已允许在PCR反应期间同时监测许多样品。检测原理通常基于利用具有嵌入染料的dsDNA的荧光检测或利用需要昂贵仪器的序列特异的荧光探针。可选地,已发展了用于检测在聚合酶依赖性扩增过程中释放的氢离子的仪器。这些氢离子的检测已利用复杂的电子检测和微流体装置实现,例如如美国专利号7,888,015中所示,用于高通量下一代测序(Ion TorrentTMSequencing,Life Technologies,Grand Island,NY)。
床边和现场诊断学需要快速和简单的测试,理想地,在小于30分钟里检测靶核酸而无需复杂和昂贵的设备。
概述
在本发明的实施方式中,提供这样的制剂(制备物,preparation),其包括在含有小于1mM Tris弱缓冲剂或等价物或没有缓冲剂的配制物(formulation)中的pH敏感染料、DNA聚合酶、dNTPs。
一方面,制剂包括一种或多种引物;和模板DNA。另一方面,pH敏感染料是视觉上可检测的彩色染料或荧光染料。
在本发明的一个实施方式中,提供检测核酸扩增的方法,其包括:提供含有模板DNA的扩增反应混合物;在弱缓冲或非缓冲溶液中的DNA聚合酶和pH敏感染料;和检测由靶DNA扩增产生的染料的光谱性质变化。
一方面,核酸扩增是等温扩增或PCR。
另一方面,等温核酸扩增选自环介导的等温扩增(LAMP)、解旋酶置换扩增(HDA)、链置换扩增(SDA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)和缺口酶扩增反应(NEAR)。
一方面,pH敏感染料是可溶性的,另一方面,可溶性的染料是可见光中可检测的彩色染料。合适染料的实例是甲酚红、酚红、间甲酚紫、溴甲酚紫、中性红、萘酚酞、百里酚蓝、萘酚酞。
另一方面,pH敏感染料是荧光染料,例如,2',7'-双-(2-羧乙基)-5-(和-6)-羧基荧光素或羧基半萘罗丹明荧光剂(seminaphthorhoda fluor)。
另一方面,弱缓冲溶液含有小于1mM Tris缓冲剂或等价的缓冲剂。
在方法的另一个方面,检测扩增依赖于比较扩增发生之前和之后染料的光谱或荧光性质的变化。
在本发明的一个实施方式中,提供监测靶序列——如果存在于样品中——的核酸扩增的方法,其中在存在靶序列的情况下在扩增进行超过阈值数量的循环时测定pH的变化,通过将pH敏感彩色或荧光染料加入到反应混合物实现监测;和确定扩增之前与扩增已发生时相比的颜色变化。
附图简述
专利或申请文件含有至少一个彩色制作的图。具有彩图的该专利或专利申请公开的复印件将在请求和支付必需的费用之后由专利局提供。
图1A和1B显示利用多种指示剂染料完成的扩增反应的可见的颜色变化检测。这里,LAMP用于在pH 9下的低缓冲溶液中扩增λ噬菌体DNA靶序列,以便在扩增结束时,pH降低,颜色变化发生。
图1A显示在反应开始时在存在50μΜ或100μΜ的酚红、甲酚红、中性红和间甲酚紫的情况下样品的颜色。
图1B显示当Bst 2.0(New England Biolabs,Ipswich,MA)DNA聚合酶被包括在反应混合物中而不是当它被省略时,响应由扩增引起的渐降的pH,在65℃在30分钟LAMP反应之后样品的颜色。在存在酚红和甲酚红的情况下,样品从红色变成黄色;利用中性红从无色变成红色;用间甲酚紫从紫色变成黄色。
图2A和2B显示扩增反应之前和之后染料颜色的比较。利用LAMP在如所指示的最初的pH 10或pH 7.5的低缓冲溶液中扩增λ噬菌体DNA靶,以便颜色变化在扩增反应结束时发生。
图2A显示在反应开始时的样品颜色。这里使用的染料是在pH 10下的较高碱度的指示剂(百里酚蓝、萘酚酞、酚酞),或在pH 7.5下的更中性的指示剂(溴甲酚紫),全部以50μΜ或100μΜ包括,如所显示的。
图2B显示当Bst 2.0DNA聚合酶被包括在反应混合物中而不是当它被省略时,响应由扩增引起的渐降的pH,在65℃在60分钟LAMP反应之后样品的颜色。含有Bst 2.0的样品在存在百里酚蓝的情况下从蓝色变成黄色;在存在萘酚酞的情况下从蓝色变成无色(50uM)或浅蓝色(100uM);在存在酚酞的情况下从粉色变成无色(50uM)或浅粉色(100uM);在存在溴甲酚紫的情况下从紫色变成黄色。
图3A-C显示扩增反应中的颜色变化检测对靶DNA的扩增是特异的。这里两种不同的DNAs在扩增时显示反应相似。LAMP反应在具有针对秀丽隐杆线虫(C.elegans)lec-10或人BRCAl序列靶的引物的低缓冲剂反应溶液中进行,如所指示的。
使含有Bst 2.0DNA聚合酶和靶基因组DNA(+Temp)或非模板对照(NTC)和100μΜ的指示剂染料(酚红、甲酚红、中性红或间甲酚紫)的反应在65℃温育(a)0分钟、(b)15分钟或(c)60分钟。
图3A显示特定指示剂的所有管在时间=0分钟以相同颜色开始。
图3B显示只有含有模板DNA的样品在扩增开始之后15分钟改变颜色,指示靶DNA的阳性扩增。
图3C显示扩增的含有模板DNA的样品的颜色变化已在扩增开始之后60分钟加剧。一些NTC由于非特异扩增而显示颜色变化的中间水平,虽然暂时与阳性(靶)扩增清楚地区分。
图4A-C显示在利用四种pH敏感染料的扩增期间响应模板量随着反应时间的颜色变化敏感性。
LAMP反应利用模板DNA(HeLa)的连续10倍滴定(100ng-0.1ng或0.01ng)在具有针对人CFTR序列的引物的低缓冲剂反应溶液中进行,如所指示的。
图4A显示在时间=0分钟时指示剂染料(每种100μΜ)的颜色。
图4B显示在时间=利用酚红和中性红染料的100ng-0.1ng靶DNA,和针对甲酚红和间甲酚紫染料的100ng-0.01ng DNA扩增之后15分钟的颜色变化。
图4C显示在时间=30分钟时与图4A和4B中相同的反应,其中针对所有染料所有模板量观察完全的颜色变化,而所有非模板对照保持最初的颜色。
图5显示利用低缓冲剂反应中100μΜ酚红的PCR扩增反应的检测。只有含有DNA模板的一式三份的反应(标记的1、2和3)颜色从粉色变成黄色,而无DNA模板的反应(4、5和6)保持粉色。
图6显示通过利用含有100μΜ酚红的PCR反应,菌落中特异质粒DNA的鉴定。PCR之后,具有来自三个含有靶质粒的菌落的细菌的阳性样品(1-3)颜色从粉色变成黄色。三个具有来自含有无关质粒的菌落的细菌的阴性对照(a-c)不这样。这与具有质粒DNA的阳性(+)反应和只具有水的阴性对照(-)的结果匹配,并显示颜色变化检测针对特定质粒的存在筛选菌落的适用性。
图7A和7B显示在存在和缺少Bst 2.0聚合酶的情况下利用100μΜ可见pH指示剂,针对人DNA和BRCA1基因引物的SDA反应的检测。颜色变化在含有Bst 2.0的样品中观察到,在缺少Bst 2.0的样品中没有观察到颜色变化。
图7A显示在存在或缺少Bst 2.0的情况下在反应开始时反应的颜色。
图7B显示在存在或缺少Bst 2.0的情况下在65℃温育1小时之后反应的颜色。颜色变化只发生在存在聚合酶的情况下,提示扩增的检测。
图8A-C显示利用荧光pH指示剂的实时测量的LAMP反应的检测。数据被绘制为减去的RFU,其中将背景值从最终的RFU(图8A和8B)或最初的RFU(图8C)减去以产生基线(0RFU)。在没有DNA聚合酶的情况下,几乎没有观察到荧光变化(虚线),显示检测对扩增是特异的并且pH漂移在等温条件下是最小的。
图8A显示在存在Bst 2.0DNA聚合酶的情况下对应于DNA扩增反应,针对BCECF-AM的荧光的显著下降(CFX96TM荧光计(Bio-Rad,HerculesCA)FAM波道中测量的)。
图8B显示响应DNA扩增,针对高pH形式的(LifeTechnologies,Grand Island,NY)(ROX波道)的荧光下降。
图8C显示响应DNA扩增,针对低pH形式的SNARF-1(HEX波道)的荧光的增加。
图9A-C显示LAMP反应中pH变化的荧光检测的灵敏度。反应含有针对人CFTR的引物和不同量的模板HeLa DNA,如所指示的。观察pH变化是以模板浓度依赖性方式,其中荧光变化需要的时间与反应中存在的模板DNA的量关联。较高的模板量产生更迅速的pH变化,并因此荧光变化,较低的模板量导致较低的pH变化,而NTC在最初的pH和荧光值下保持稳定。
图9A显示DNA扩增期间对应于针对BCECF-AM的pH下降的荧光下降。
图9B显示DNA扩增期间对应于针对SNARF-1(高pH)的pH下降的荧光下降。
图9C显示DNA扩增期间低pH形式的SNARF-1的荧光增加。
图10A和10B显示利用SNARF-1扩增不同大小靶DNA的PCR反应的检测。扩增具有不同大小(114bp、308bp、1278bp)的三个片段。反应中模板DNA的存在导致PCR期间荧光读数的显著变化(超过背景变化>5000RFU)。信号下降的水平与扩增子大小成比例,针对114bp具有~5000RFU减少,针对300bp为6000RFU,针对1278bp扩增子为8000RFU。所有扩增子都导致针对~20个循环的背景校正的荧光下降的阈值时间。
图10A显示PCR循环中记录的原状的、未校正的RFU。
图10B显示在减去来自无Taq DNA聚合酶的管的信号之后PCR循环期间的净RFU变化以校正由于PCR反应的热循环而引起的背景pH和荧光下降。
实施方式的描述
DNA合成期间的三磷酸核苷掺入事件产生在DNA聚合酶催化的反应期间的焦磷酸盐基团以及氢离子。
在没有缓冲条件的情况下,质子在DNA扩增反应中累积,以至于随着渐增的DNA扩增,溶液变得愈加酸性。
虽然最初关注pH指示剂染料——其是大量的有机分子——可干扰扩增反应,或扩增期间质子浓度的增加不足以允许pH指示剂中颜色或荧光的可检测变化,但是显示这些分子可用于监测DNA扩增。观察到LAMP反应中pH变化高达4pH单位,不论溶液的缓冲能力,和来自dNTPs、核酸、酶和从储存溶液延续的缓冲剂的缓冲贡献。监测扩增反应的化学和荧光染料的效用得到一系列不意欲被限制的实例的支持。荧光染料和包括优选地眼可看见的pH指示剂染料的化学染料在:各个时间点;不同浓度的染料和DNA靶;不同类型靶DNA和利用聚合酶和核苷酸的任何类型的扩增程序——如,例如,SDA、LAMP和定性和定量分析的PCR——的扩增产物形成的检测中是有效的。显著地,扩增终点的检测可明确地实现。
本发明的实施方式提供组合物和方法,其单独或一起利用充当检测DNA扩增的手段的宽范围的pH敏感的可见的或荧光染料,以低成本和强大效率迅速和可靠地检测扩增产物的形成和任选地其量。由于聚合酶通常在5-10的pH下起作用,所以染料的选择反映该范围内的变化。对于可见的染料,颜色变化在不同的pH被确定,而对于荧光染料,当pH减少时荧光的增加或减少可被检测,取决于众所周知的荧光染料的性质(参见例如,BCECF-AM对SNARF-1)。
利用指示剂染料,在缺少反应缓冲剂和在存在一些残留缓冲剂(例如,达,至少约1mM缓冲剂,例如150μΜTris)——如当从酶储存缓冲液延续时可出现——的情况下,扩增反应的pH可被可靠地测量。在一个实施方式中,利用标准条件在缺少反应缓冲剂或在存在残留缓冲剂(150μΜTris)的情况下进行PCR反应,获得相似的结果。
利用对至少pH 5-10的pH范围耐受的链置换聚合酶,在具有<.l mM缓冲剂的溶液中进行LAMP。通过在碱性条件(pH 8-10)在存在中性pH范围转变指示剂的情况下启动反应,观察到最初的高pH颜色(参见例如,表1)。当扩增进行时,溶液pH在少至10分钟里基本上下降到第二酸性pH(pH5-7),导致可检测的颜色变化。该颜色差异容易用眼看见。
存在具有不同颜色的宽范围的pH颜色指示剂,其任何一种都适合用于本实施方式(例如紫色至黄色、红色至黄色、黄色至红色)。本文提供8种不同pH敏感染料的实例,其在不同pH改变颜色。这些实例不意欲被限制。
指示剂染料的光谱性质的变化的检测可利用例如,操作者的眼、荧光计或分光光度计,由它们的光化学性质而实现。术语"检测"可与术语"监测"可互换地使用。
合适的可见的染料包括:中性红,当pH高于8时其具有净黄色,当pH小于6.8时是红色;酚红,当pH高于8时其具有红色,当pH小于6.4时是黄色;甲酚红,当pH高于8.8时其具有微红-紫色,当pH小于7.2时是黄色;百里酚蓝,当pH高于9.6时其具有蓝色,当pH小于8.0时是黄色;酚酞,当pH高于10时其具有深紫红色,当pH小于8.3时无色;和萘酚酞,当pH高于8.7时其具有浅绿色,当pH小于7.3是淡微红色。用于本文的染料的这些性质被总结在表1中。
指示剂 | 高pH颜色 | pH转变 | 低pH颜色 |
溴甲酚紫 | 紫色 | 6.5-5.2 | 黄色 |
中性红 | 净黄色 | 8.0-6.8 | 红色 |
酚红 | 红色 | 8.2-6.8 | 黄色 |
甲酚红 | 红色 | 8.8-7.2 | 黄色 |
萘酚酞 | 蓝色 | 8.8-7.3 | 净红色 |
间甲酚紫 | 紫色 | 9.0-7.4 | 黄色 |
百里酚蓝 | 蓝色 | 9.6-8.0 | 黄色 |
酚酞 | 红色 | 10-8.0 | 红色 |
pH指示剂的其它实例包括:甲基黄、甲基橙、溴酚蓝、萘基红、溴甲酚绿、甲基红、石蕊素、尼罗蓝、百里酚酞、茜素黄、水杨酰基黄、硝基胺。这些指示剂可在传统的DNA聚合酶耐受范围外转变,但是扩增检测的原理可用于使用适合期望pH范围的指示剂的可选检测方法。
需要检测装置的一类染料是荧光染料。如同上面提到的可见染料,pH敏感荧光染料在不同pH下具有不同水平的荧光发射或最大发射波长转换。亮度变化和最大吸收移位(shift)均可利用装备有适当过滤装置的系统容易地检测。
用于本发明实施方式的荧光染料包括5-(和-6)羧基SNARF-1,其特征是基于pH的荧光移位。在高pH(pH 9)下,SNARF-1最大吸光度/发射在Amax 575nm/Emmax 650nm。当pH降低时,这些值显著地蓝移(blue-shift)到Amax 525/Emmax 590。该荧光移位允许两种状态的染料同时监测,其中一个荧光波道匹配高pH形式(显示荧光随着扩增减少,图5),另一个波道匹配低pH形式(荧光增加)。我们测量了在pH从pH 10下降到pH 6校准溶液之后高pH形式荧光90%丧失(在CFX96仪器的ROX波道中测量或荧光的200%增加(HEX波道)。与SNARF-1相关的其它合适的荧光染料已被发展用于监测pH变化,包括SNARF-4F和SNARF-5F、SNAFRs、SNAFL、5-(和-6)-羧基萘基荧光素(carboxynaphthofluorescein)、6-JOE、Oregon(Life Technologies,Grand Island,NY)。其它的荧光pH指示剂包括2',7'-双-(2-羧乙基)-5-(和-6)-羧基荧光素、乙酰氧甲基酯(BCECF-AM)(LifeTechnologies,Grand Island,NY),其在pH 9下具有Amax 500nm/Emmax535nm的吸光度/发射分布。它还具有的特征是当pH下降时光谱蓝移,但是低pH形式在激发中不太有效,并且有效的读出限于来自高pH形式的荧光减少。针对BCECF-AM(CFX96的FAM波道)测量从pH 10到pH 6荧光减少大约80%。BCECF源自荧光素,许多与荧光素相关的染料显示对pH变化的相似敏感性。
包括上面提到的那些的可见和荧光染料可被化学修饰以响应pH变化而具有改变的色度性质。这些修饰可产生这样的染料,其在更窄的pH范围更亮或改变颜色,因此允许更好的检测。
等温聚合酶依赖性扩增反应如LAMP和SDA、HAD、RPA和NEAR可通过利用可见和荧光染料测量pH变化而容易监测。例如,LAMP扩增,参见例如,Gill,et al.,Nucleos.Nucleot Nucleic Acids,27:224-43(2008);Kim,et al,Bioanalysis,3:227-39(2011);Nagamine et al.,Mol.Cel.Probes,16:223-9(2002);Notomi et al.,Nucleic Acids Res.,28:E63(2000);和Nagamine et al.,Clin.
Chem.,47:1742-3(2001)——其通常利用Bst 2.0聚合酶,可通过利用化学或荧光染料测量在视觉上可检测的相伴的pH变化而被监测。
温度循环扩增程序如PCR可通过利用化学或荧光染料的pH变化而被监测,不管扩增中使用何种聚合酶。PCR可利用聚合酶如DNA聚合酶、DNA聚合酶、(New England Biolabs,Ipswich,MA(Phusion是Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA的注册商标))。
这些聚合酶毫无例外地扩增DNA,具有染料检测的相伴的pH变化。实际上,任何合适的聚合酶可用于扩增DNA,导致质子的释放,质子然后可利用pH敏感的指示剂染料来检测。
存在该DNA扩增检测方法的许多应用。它可用作标准的分子生物学程序中指示成功的扩增反应的方法,消除跑凝胶电泳的需要。该检测可包括指示期望的DNA种类的存在或缺乏,如在筛选质粒中携带正确插入物的菌落中。种类的检测延伸到诊断应用,因为特异DNA或RNA靶种类的存在或缺乏可由循环或温育时间之后的颜色变化来指示。这特别地适合等温扩增方法如现场或床旁检测(point-of-care testing)中的LAMP。颜色变化的迅速和强烈(robustness)使得诊断的靶能够快速有效检测而无需高级设备。颜色或荧光变化可实时监测,允许靶核酸量的定量,其中需要这样的信息,例如测序文库制备、转录分布、和负荷测量。
该pH依赖性检测方法可用于需要DNA合成如DNA测序的其它应用。每种核苷酸的添加将产生质子,DNA混合物中产生的全部质子使得反应变成酸性。pH的该变化可利用pH敏感染料来检测。询问四种dNTPs之一反过来将决定哪种碱基可加入,因此允许在多轮反应之后的序列装配。
缓冲剂通常提供稳定性给用于储存的反应混合物和组分。本文描述的检测方法需要最少至无缓冲剂但是在扩增期间还保持期望的pH(通常碱性的)用于适当的颜色变化。酶储存缓冲剂或反应溶液存在的少量缓冲剂为了该目的可以是足够的,或,可选地,反应混合物可被冻干以保持稳定性用于长期储存。
本发明的实施方式为核酸扩增的可视检测提供简单、强大、迅速、敏感和有成本效益的方法。
本文引用的所有参考文献通过引用被并入。
实施例
实施例1:利用pH敏感的可见染料的LAMP扩增的检测。
用无缓冲剂的反应溶液:10mM(NH4)2S04、50mM KCI、8mMMgS04、1.4mM dNTPs、0.1%吐温-20,pH 7.5-10进行LAMP反应。最终的缓冲剂浓度是来自酶储存缓冲剂携带的0.026mM-0.4mM Tris。
用针对λ噬菌体DNA扩增子的引物和5ngλDNA进行反应(图1A-B,图2A-B;New England Biolabs,Ipswich,MA)。反应与如所显示的50μΜ或100μΜpH指示剂在存在或缺少DNA聚合酶(Bst 2.0)的情况下在65℃温育30-60分钟。颜色变化只在在存在DNA聚合酶的情况下发生,指示扩增产生足够的pH下降用于可见的识别。
在图3A-C中,在具有针对秀丽隐杆线虫lec-10或人BRCA1序列靶的引物的无缓冲剂的反应溶液中进行LAMP反应。反应含有82.5ng秀丽隐杆线虫DNA、100ng HeLa DNA(+Temp)或无(NTC)DNA。反应在存在pH指示剂的情况下在65℃温育30分钟,只有含有模板DNA的样品显示眼观察到的颜色变化。
在图4A-C中,反应含有针对人CFTR的引物和多种量的模板HeLa基因组DNA(100ng-0.01ng;29000-2.9拷贝)。在15分钟时,针对100ng-0.1ng用所有指示剂,和针对甲酚红和间甲酚紫模板浓度的所有浓度,都观察强烈的颜色变化。30分钟之后,针对所有模板浓度,所有指示剂都改变颜色,而阴性对照(无模板DNA)保持在最初高pH的颜色。使用的LAMP引物序列如下:
λFIP:CGAACTGTTTCGGGATTGCATTCTGGAACTCCAACCATCGCA(SEQID NO:l)
λBIP:
GGAGCCTGCATAACGGTTTCGTCGACTCAATGCTCTTACCTGT(SEQ ID NO:2)
λF3:GTTGGTCACTTCGACGTATCG(SEQ ID NO:3)
λB3:GCTCGCCGACTCTTCACGAT(SEQ ID NO:4)
λ环F:TTTGCAGACCTCTCTGCC(SEQ ID NO:5)
λ环B:GGA I I I I I I ATATCTGCACA(SEQ ID NO:6)
秀丽隐杆线虫FIP:
GATTCCACTTCCAACGTCGTTGCATAGGCATTGTATCCAGAGTG(SEQ ID NO:7)
秀丽隐杆线虫BIP:
CGAAGTGAACCTTGTCAACATGAGACTACCCACATCGTTACC(SEQ ID NO:8)
秀丽隐杆线虫F3:AG C AAC ATAG GTTTC AGTTC(SEQ ID NO:9)
秀丽隐杆线虫B3:CTGTGAACGGTCATCACC(SEQ ID NO:10)
秀丽隐杆线虫环F:ACGGACATGTCGATCATGGA(SEQ ID NO:11)
秀丽隐杆线虫环B:CGTCTCCCTTCAATCCGATGGC(SEQ ID NO:12)BRCA1FIP:
ATCCCCAGTCTGTGAAATTGGGCAAAATGCTGGGATTATAGATGT(SEQ ID NO:13)
BRCA1BIP:
GCAGCAGAAAGATTATTAACTTGGGCAGTTGGTAAGTAAATGGAAGA(SEQ ID NO:14)
BRCA1F3:TCCTTGAACTTTGGTCTCC(SEQ ID NO:15)
BRCA1B3:CAGTTCATAAAGGAATTGATAGC(SEQ ID NO:16)
BRCA1环F:AGAACCAGAGGCCAGGCGAG(SEQ ID NO:17)
BRCA1环B:AGGCAGATAGGCTTAGACTCAA(SEQ ID NO:18)CFTR FIP:
CCAAAGAGTAAAGTCCTTCTCTCTCGAGAGACTGTTGGCCCTTGAAGG
(SEQ ID NO:19)
CFTR BIP:
GTGTTGATGTTATCCACCTTTTGTGGACTAGGAAAACAGATCAATAG(SEQ ID NO:20)
CFTR F3:TAATCCTGGAACTCCGGTGC(SEQ ID NO:21)
CFTR B3:TTTATGCCAATTAACATTTTGAC(SEQ ID NO:22)
CFTR环F:ATCCACAGGGAGGAGCTCT(SEQ ID NO:23)
CFTR环B:CTCCACCTATAAAATCGGC(SEQ ID NO:24)
实施例2:利用pH敏感的可见染料的PCR扩增的检测
在50mM KCI和2.25mM MgC中利用从pAII17质粒DNA扩增1.287kb片段的正向和反向引物每种500nM、四种dNTPs每种400μΜ、100μΜ酚红、0.025μΙ1M KOH、25μl中1.875U Taq DNA聚合酶进行PCR反应。PCR反应在95℃进行2分钟,95℃ 10秒、62℃ 15秒、68℃ 30秒进行36个循环。PCR循环之前,具有或没有DNA模板的所有管具有相同的粉色。在PCR反应结束时,具有DNA模板的一式三份的反应(标记为1、2和3;图5)颜色从粉色变成黄色,而没有DNA模板的反应(标记为4、5和6;图5)保持粉色。含有模板的反应中的DNA合成利用实时PCR机器和琼脂糖凝胶电泳来证实。因此,颜色变化为成功的PCR反应提供可靠的可见指示剂。引物序列如下:
1278bp_F:AAAATCCAG CG CATG GGCGCGG CGTTCGCGGTTG AAGTCAAG GG(SEQ ID NO:25)
1278bp_R:CGCTTCGTGGATTACCAGCTTTTCTGGCGGTACTTCGTACTTG C(SEQ ID NO:26)
实施例3:细菌菌落中质粒DNA的可见检测。
在存在酚红的情况下进行PCR反应以鉴定被转化携带特异质粒DNA的大肠杆菌菌落。将每个菌落少部分悬浮在10μl水中并将1μl加入PCR反应,其如实施例2中所描述的进行。检测六个菌落,其中三个菌落(1-3)来自携带与阳性对照(+)中使用的相同的质粒的板,三个菌落(a-c)来自含有无关质粒的细菌板。如在阳性对照中,含有靶质粒DNA的管颜色从粉色变成黄色(图6)。含有无关质粒的管保持粉色,如同没有任何模板(-)的管。因此,这些PCR反应中的颜色变化允许含有特异质粒DNA的菌落的测定。该方法避免了利用琼脂糖凝胶电泳来测定PCR扩增的常规步骤——其是麻烦和费时的。
实施例4:利用pH敏感的可见染料的SPA扩增的检测。
在无缓冲剂的反应溶液:8mM MgS04、50mM KCI、10mM(NH4)2S04、0.4mM dATP、0.4mM dGTP、0.4mM dTTP、0.8mM 2'-脱氧胞苷-5'-0-(l-硫代三磷酸盐)(dCTP-αS;TriLink BioTechnologies,SanDiego,CA)、0.5μΜSDA引物、0.2U/μl BsoBI(New England Biolabs,Ipswich,MA)、0.32U/μl Bst 2.0,pH 8.8中进行SDA反应。最终的缓冲剂浓度是来自酶储存缓冲液携带的0.23mM Tris。引物序列针对人BRCA1来设计,并含有BsoBI限制位点。反应在存在100μΜpH敏感染料的情况下在65℃温育60分钟,如图7A-B中所指示的,只有含有Bst 2.0DNA聚合酶的反应改变颜色。这提示基于pH降低的成功的扩增检测。引物序列如下:
SDAF:
ACCGCATCGAATGCATGTCTCGGGCAAAATGCTGGGATTATAGATGT(SEQ ID NO:27)
SDAR:GGATTCCGCTCCAGACTTCTCGGGCAGTTGGTAAGTAAATGGAAGA(SEQ ID NO:28)
BF:TCCTTGAACTTTGGTCTCC(SEQ ID NO:29)
BR:CAGTTCATAAAGGAATTGATAGC(SEQ ID NO:30)
实施例5:利用pH敏感荧光染料的LAMP扩增的检测。
在如实施例1中无缓冲剂的溶液中利用λ(图8A-C)或CFTR(图9A-C)引物进行LAMP反应。pH敏感荧光染料BCECF-AM(2μΜ)和SNARF-1(10μΜ)被用于通过pH降低而报告扩增。荧光测量利用CFX-96实时荧光计进行,染料光谱对应:FAM波道,BCECF-AM;ROX波道,SNARF-1高pH形式;HEX波道,SNARF-1低pH形式。如通过荧光丧失(BCECF-AM,SNARF-1高pH形式)或荧光增加(SNARF-1低pH形式)所测量的,pH下降对扩增反应是特异的,如图8A-C所示,其中缺少DNA聚合酶的反应没有显示背景中的显著变化。荧光变化的时间是迅速的(<10分钟),指示LAMP反应的有效性和速度。检测还是定量的,如图9A-C所示,连续稀释的HeLa靶DNA量之间具有明确差别。
实施例6:利用pH敏感荧光染料的PCR扩增的检测。
三对引物被用于扩增不同大小的扩增子。309bp和1287bp(来自pAII17质粒DNA)和114bp(来自大肠杆菌基因组DNA)扩增子用于如实施例2中进行的PCR反应,除了10μΜpH敏感荧光染料SNARF-1代替可见的染料酚红包括在反应中。荧光读数在CFX96机器ROX波道中记录。PCR循环期间记录的信号的显著下降在含有DNA模板的反应中观察到(图10A)。由于来自热循环的pH变化,不含有Taq DNA聚合酶或DNA模板(阴性对照)的反应以恒定的速度缓慢减少。在减去来自阴性对照的信号之后,图10B中具有模板的反应显示显著的信号减少。信号下降水平与扩增子大小成比例。该实施例证明pH敏感荧光染料可用于实时监测PCR反应。除了上面列出的1287bp引物,引物序列如下:
114bp_F:AGCGGGGAGGAAGGGAGTAAAGTT(SEQ ID NO:31)
114bp_R:CAGTATCAGATGCAGTTCCCAGGTT(SEQ ID NO:32)
309bp_F:CTGGCCCACGAGGGCGAAGAGGCAGGCACCGGCCCGATCCTGATG(SEQ ID NO:33)
309bp_R:
CGCCGCGCCCATGCGCTGGATTTTCGGTTCGGAGCCGTCACGGC(SEQ ID NO:34)
Claims (15)
1.制剂,包括:在含有小于1mM Tris或等价物的量的弱缓冲剂或没有缓冲剂的配制物中的pH敏感染料、DNA聚合酶、dNTPs。
2.根据权利要求1所述的制剂,进一步包括引物。
3.根据权利要求1或2所述的制剂,进一步包括模板DNA。
4.根据权利要求1至3任一项所述的制剂,其中所述pH敏感染料是视觉上可检测的彩色染料或荧光染料。
5.检测核酸扩增的方法;
包括:
提供含有模板DNA的扩增反应混合物;弱缓冲或非缓冲溶液中的DNA聚合酶和pH敏感染料;和
检测由靶DNA扩增产生的所述染料的光谱或荧光性质的变化。
6.根据权利要求5所述的方法,其中扩增包括等温核酸扩增或聚合酶链式反应。
7.根据权利要求5或6所述的方法,其中等温核酸扩增是环介导的等温扩增、解旋酶置换扩增、链置换扩增、重组酶聚合酶扩增或缺口酶扩增反应。
8.根据权利要求7所述的方法,其中所述染料是可溶性的。
9.根据权利要求7或8所述的方法,其中所述可溶性的染料是可见光中可检测的彩色染料。
10.根据权利要求7至9任一项所述的方法,其中所述染料选自甲酚红、酚红、间甲酚紫、溴甲酚紫、中性红、萘酚酞、百里酚蓝、萘酚酞。
11.根据权利要求8所述的方法,其中所述染料是荧光染料。
12.根据权利要求11所述的方法,其中所述荧光染料是2',7'-双-(2-羧乙基)-5-(和-6)-羧基荧光素或羧基半萘罗丹明荧光剂。
13.根据权利要求5至12任一项所述的方法,其中所述弱缓冲溶液包括小于1mM的Tris缓冲剂或等价的缓冲剂。
14.根据权利要求5至13任一项所述的方法,进一步包括比较从所述扩增反应之前至之后的所述pH敏感染料的光谱或荧光性质变化。
15.监测靶序列,如果存在于样品中,的核酸扩增的方法,包括:在存在靶序列的情况下在扩增进行超过阈值数量的循环时监测pH的变化,所述监测通过将pH敏感彩色或荧光染料加入到所述反应混合物而实现;和确定扩增之前与扩增已发生时相比的颜色变化。
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