CN112442555A - 一种防止气溶胶污染的可视化lamp检测体系及其制备方法、使用方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种防止气溶胶污染的可视化的LAMP检测体系及其制备方法、使用方法和应用，该油脂相指示剂为将指示剂包埋于一定的固定油脂制成封闭指示剂油脂相微环境。另外一部分为含Bst DNA聚合酶、dNTP、引物混合物、保护剂等成分制成的低温冻干粉。本发明公开的防止气溶胶污染的可视化的LAMP检测体系在进行检测时，只需要向反应管中加入等体积的待测样品及反应缓冲液，盖上管盖，上下颠倒混匀后，即可进行恒温扩增检测。与目前的单独加入各个反应成分相比，此种方法更加简便、省时，并且获得的LAMP反应结果更容易判读，阳性结果和阴性结果的显色差异更加明显，极大地避免了对LAMP反应结果的误判，并且不易引起假阳性。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种防止气溶胶污染的可视化的LAMP 检测体系及其制备方法、使用方法和应用。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的爆发给全球卫生带来了巨大的挑战，严重威胁着人类的生命健康和财产，其传播速度远远超过了同为冠状病毒引发的严重急性呼吸综合征(SARS)和中东呼吸综合征(MERS)。新型冠状病毒主要经过呼吸道飞沫传播，亦可通过接触传播。人群普遍易感，其中老年人、免疫力低下、有基础性疾病人群更容易感染或变为重症，另外儿童及婴幼儿也有发病。新型冠状病毒的临床症状表现为发烧、咳嗽、浑身无力，严重者出现急性呼吸窘迫综合征等症状，甚至也发现了一些无明显症状的病毒携带者，因此尽早的筛查出病毒感染者和潜在的携带者，及时阻断病毒的来源和传播途径，针对性的治疗是战“疫”的关键。
目前针对新型冠状病毒的检测方法主要为RT-PCR，由于该方法检测周期长，需要昂贵的设备及训练有素的专业人员。所以亟待需要开发一种快速、准确并且能够在现场即时检测病毒的方法。
环介导等温扩增(LAMP)技术是由日本科学家Notomi等首次于2000年开发的一种新型的体外等温核酸扩增技术。该技术主要利用具有链置换反应活性的 DNA聚合酶，通过1对外引物(F3/B3)和1对内引物(FIP/BIP)与靶基因的6 个不同区域退火杂交，使产物自我配对形成一种特殊的哑铃状结构，再通过内引物与哑铃状结构的互补配对引发指数级扩增。该方法克服了传统PCR依赖反复高温变性获得单核苷酸片段的缺点，大大节省了反应升降温所需要的时间，能够在60℃-65℃恒温条件下，1h内实现对靶基因序列的指数级(109～1010)扩增。由于其具有灵敏度高、特异性强、反应快速等特点，目前已被广泛应用于临床微生物检测、遗传诊断、传染病检测、SNP分型、甲基化检测和转基因食品鉴定等多个领域。
LAMP技术主要基于对特定DNA序列的扩增，通过对各待检生物DNA的扩增及结果判定，达到快检的目的。常规的LAMP检测体系主要由DNA聚合酶、特异性引物、dNTP、金属离子及指示剂等配制成的液体状态。在进行实验前，需要单独将每一种LAMP反应体系成分添加到特定的PCR管中，最后加入待检测的模板样品，使各组分彻底混匀后，再进行恒温扩增。这种操作方法看起来简单易行，但在实际操作过程中，往往受制于待检样本数目和实验操作人员的专业技能水平的影响，一旦临床样本增多，难以满足快速旁检的要求，并且由于加样环节的增多，容易造成交叉污染。同时，反应结束后的“意外”开盖，极易造成气溶胶污染，给结果判定造成了严重的影响。
由于LAMP反应体系的Bst DNA聚合酶、dNTP、引物等需要在低温条件下运输和保存，为了简化加样环节，最小化气溶胶引起的污染，我们采用了一种在低温情况下快速冷冻的LAMP检测成分，该成分为Bst DNA聚合酶、引物、dNTP、引物混合物、保护剂等组成的冻干粉，可在常温情况下保存和运输。在制备冻干体系过程中发现，将Bst DNA聚合酶、dNTP、引物混合物、保护剂以及指示剂混匀冻干后，在检测时，对含有靶片段的试样扩增结果显色比较浅，不易区分非非特异性扩增和阳性。当将Bst DNA聚合酶、引物、dNTP、引物混合物、保护剂这几种成分组合起来混合冻干，将指示剂和反应缓冲液配置成混合溶液，单独将加入反应管中，在检测时发现，配制的含有显色剂的溶液长时间放置容易产生沉淀，使得有效显色成分大大降低，影响阳性样本的显色。另外LAMP加样时，长时间开盖易引起气溶胶污染的假阳性，给检测工作带来极大的不便。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种新型冠状病毒 SARS-CoV2现场检测试剂盒及其制备方法、使用方法和应用。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开了一种防止气溶胶污染的可视化LAMP检测体系，由油脂相指示剂和低温冻干粉组成；
所述油脂相指示剂为将指示剂包埋于固定油脂中形成封闭的油脂相指示剂微环境；所述低温冻干粉中含有Bst DNA聚合酶、dNTP、引物混合物及保护剂；
未检测时，所述油脂相指示剂与低温冻干粉隔离；
检测时，将待测样本与低温冻干粉混匀后进行扩增，反应过程中受加热影响，封闭的油脂相指示剂微环境中的指示剂被释放至反应体系中，发生颜色变化，实现可视化监测，同时熔化的固体油脂将反应体系与外界空气隔绝防止气溶胶污染。
优选地，所述固定油脂是由固体油脂和脂溶性液体按照3g:1mL的用量比配制而成；
其中，所述固体油脂包括硬蜡、软蜡、蜂蜡、动物脂肪和凡士林中的一种或几种；所述脂溶性液体为液体石蜡或食用油。
优选地，所述指示剂为中性红染液，其浓度为5～10mM，所用体积为0.5～1μL。
优选地，所述低温冻干粉是由Bst DNA聚合酶、AMV反转录酶、dNTP、引物混合物及保护剂按照(1～2)：1：(3～7)：(1～2)：(5～8)的体积比混合制成的预混试剂经过冷冻干燥处理后获得。
优选地，所述引物混合物中包含引物FIP、引物BIP、引物LF、引物LB、引物F3和引物B3，且引物FIP、LF和F3的物质的量浓度之比为(4～8):(2～ 4):(1～2)，引物BIP的浓度与引物FIP相同，引物LB的浓度与引物LF相同，引物F3的浓度与引物B3相同。
优选地，所述保护剂是由牛血清白蛋白、大豆卵磷脂、甘露醇和羟乙基淀粉按照质量比为(50～150):(1～40):(10～50):(5～25)的比例混合而成。
本发明还公开了上述的防止气溶胶污染的可视化LAMP检测体系的制备方法，包括以下步骤：
1)将固定油脂在高温条件下熔化，导入至柱型模具中，室温冷却待其中的固定油脂凝固后切分为直径为4mm，厚度为3mm的蜡饼，即制得固定油脂；
2)将步骤1)制得的固定油脂加入PCR反应管中，熔化后、离心，快速加入指示剂，指示剂被包被在固定油脂中，形成封闭的油脂相指示剂微环境；
3)制备包含Bst DNA聚合酶、AMV反转录酶、dNTP、引物混合物及保护剂的预混试剂；
4)将步骤3)制得的预混试剂分装至步骤2)制得的封闭的油脂相指示剂微环境的上层，先在-80℃预冷2-4h，然后在-70～-80℃下冷冻干燥8～16h，制得防止气溶胶污染的可视化的LAMP检测体系。
本发明还公开了上述的防止气溶胶污染的可视化LAMP检测体系的使用方法，检测时，向PCR反应管中加入等体积的待测样本以及反应缓冲液，与低温冻干粉充分混匀后，放入检测仪中进行扩增处理；
在整个核酸扩增处理过程中，固定油脂经预热熔化为液态，将封闭的指示剂快速释放到反应体系中，熔化的油脂混合物在整个反应过程中漂浮于PCR反应管上空，形成油脂相封闭层，将反应体系和外界空气完全隔离；另外释放的指示剂通过与扩增的核酸产物形成颜色物质，用于监测反应进程；反应结束后，将检测管移至室温条件，通过肉眼能够判断阳性和阴性结果。
本发明还公开了上述的防止气溶胶污染的可视化LAMP检测体系在检测新型冠状病毒中的应用，在检测时，用于2019新型冠状病毒扩增检测的基因为E 基因；在LAMP扩增体系中另外加入逆转录酶和特异性扩增引物混合物；
所述特异性扩增引物混合物包括：
2019-nCoV-E3 F3，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；
2019-nCoV-E3 B3，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；
2019-nCoV-E3 FIP，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示；
2019-nCoV-E3 BIP，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示；
2019-nCoV-E3 LF，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示；
2019-nCoV-E3 LB，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明公开了一种有效防止LAMP气溶胶污染的可视化的核酸检测体系，为能够有效防止气溶胶污染的油脂相指示剂，该油脂相指示剂将指示剂包埋于一定的固定油脂制成封闭的油脂相指示剂微环境。另外一部分为含Bst DNA聚合酶、 dNTP、引物混合物、保护剂等成分制成的低温冻干粉。本发明利用固体油脂的低熔点和低密度等特点，将固体油脂与指示剂在常温下形成封闭指示剂油脂相微环境。在温度达到65℃时，熔化的固体油脂盖于反应液面上层，形成足够厚的油脂相。隔绝了核酸扩增反应液的弥散以及与外部空气的直接接触，有效避免核酸扩增过程中的溢出引起的气溶胶污染。此外，释放的指示剂可对反应产物进行动态实时监测，在反应结束后混合体系可直接通过肉眼判读结果，无需开盖检测，极大地提高了检测结果的准确性和可靠性。
本发明公开的上述防止气溶胶污染的可视化的LAMP检测体系的制备方法，首先制备独创的低熔点的固定油脂，当其处于凝固态与液态临界点时，向其中小心加入指示剂，最终形成封闭的油脂相指示剂微环境，达到与外界彻底隔绝的目的。在此基础上，将LAMP扩增体系的其余成分(Bst DNA聚合酶、dNTP、引物混合物、保护剂等)充分混匀后悬空加入到油脂相指示剂微环境的油脂相指示剂的正上方，将配置好的体系预冷后再进行冷冻干燥，取出反应管，可见下层为含指示剂的油脂相指示剂层，紧贴油脂相指示剂的上层的为LAMP扩增体系的低温冻干粉。此方法制备的LAMP检测体系对指示剂的包埋效果好，PCR管壁与固定油脂的粘附效果好，能够抵抗剧烈颠簸而不脱落。
本发明公开的防止气溶胶污染的可视化的LAMP检测体系在进行检测时，只需要向反应管中加入等体积的待测样品及反应缓冲液，盖上管盖，上下颠倒混匀后，即可进行恒温扩增检测。另外，固定油脂在温度稍微升高时即可快速溶解释放包埋于其中的指示剂，在整个扩增反应过程中成液态悬浮于扩增体系的上方，而不影响扩增反应(对扩增的特异性和灵敏性不影响)。与目前的单独加入各个反应成分相比，此种方法更加简便、省时，并且获得的LAMP反应结果更容易判读，阳性结果和阴性结果的显色差异更加明显，极大地避免了对LAMP反应结果的误判，并且不易引起假阳性。
附图说明
图1为含中性红指示剂的油脂相指示剂微环境；
图2为含1μL指示剂的冻干效果图；
图3为含2μL中性红指示剂的冻干效果图；
图4为本案例制备的体系扩增结果；
图5为冻干后指示剂溢散的扩增结果；
图6为利用现配的核酸扩增成分进行的扩增结果；
图7为未添加石蜡的冻干粉扩增结果。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
1、油脂相指示剂微环境的制备
(1)固定油脂的配制
这里的固定油脂是常温条件下为固态，预热后能够很快熔化为液体的低熔点、无色物质。例如石蜡，石蜡是固态高级烷烃混合物，通常是白色、无色或淡黄色的无味蜡状固体，熔点在47℃-64℃，密度比水低，约0.9g/cm3，不溶于水。其物理化学性质稳定，几乎不与任何化学物质发生反应，是良好的绝缘物质。液蜡又称石蜡油，为无色、无臭、无味，无萤光的油状液体，其熔点一般低于40℃。将一定量的石蜡和液蜡按照一定的配比混合，可降低整个混合物的熔点。通过实验条件的反复摸索发现当固体油脂(m)与脂溶性液体(v)按照3:1混合时，其混合物的熔点显著降低为40℃左右。此方法获得的固定油脂可在室温条件下形成密度均一的固体蜡，当温度高于室温时即可迅速熔化为液态，并且熔化后的液体蜡混合物可在室温环境下保持液体状态20-30s，为后期指示剂的加入提供有利条件。
制备好的油脂相混合物在高温条件下熔化，导入一定体积的长柱型模具中，室温冷却2-3min后，液体蜡变为具一定形状的致密固体状，在固态蜡未完全凝固时尽快切分为直径为4mm，厚度为3mm，质量大小为35mg左右的小蜡饼。这里的小蜡饼即为制备好的固体油脂相。
上述的固定油脂为固体油脂(m)与脂溶性液体(v)按照质量体积比3:1混合而成。其中，固体油脂可为硬蜡、软蜡、蜂蜡、动物脂肪、凡士林等，脂溶性液体可为液体石蜡、食用油等。
(2)油脂相指示剂微环境的制备
将(1)中得到的固定油脂相加入PCR管中，在45℃条件下熔化，短暂离心后，在凝固态临界点时快速加入一定体积浓度的指示剂，指示剂由于密度相对较大，在半凝固态的酯相层中缓慢沉降，当酯相层完全凝固时，指示剂恰好被截留在固体酯相层的某个位置，形成完全包埋的质地密实的油脂相指示剂微环境。
这里的指示剂为中性红，其浓度为5mM-10mM。为防止含水量多对冷冻干燥过程中石蜡油脂相层冲击力的影响，加入的中性红的体积应当控制在0.5～1μL。
2、LAMP等温扩增混合试剂的制备
LAMP核酸扩增体系冻干粉为一种可常温运输的环介导等温扩增混合试剂，其特征在于，包括Bst DNA Polymerase、dNTP、引物混合物、保护剂。
所述的引物混合物中包含引物FIP、BIP、LF、LB、F3和B3。
所述的保护剂中包含牛血清白蛋白、大豆卵磷脂、甘露醇和羟乙基淀粉。
所述预混试剂是由Bst DNA Polymerase、AMV Reverse Transcriptase、dNTP、引物混合物、指示剂、保护剂防剂按照体积比例为1～2：1：3～7：1～2：1～2： 5～8的比例混合。
所述的引物混合物是由FIP、LF和F3按照物质的量浓度比例为4～8:2～ 4:1～2混合，引物BIP的浓度与FIP相同，引物LB的浓度与LF相同，引物F3 的浓度与B3相同。
所述的保护剂是由牛血清白蛋白、大豆卵磷脂、甘露醇和羟乙基淀粉按照质量比为50～150:1～40:10～50:5～25的比例混合。
根据上述方法得到的核酸扩增混合试剂，其特征在于，将Bst DNA Polymerase、AMV Reverse Transcriptase、dNTP、引物混合物、指示剂、保护剂按照上述比例混合
3、LAMP核酸扩增体系冻干粉的制备
将2中得到的环介导等温扩增混合试剂在低温条件下小心悬空分装到1中得到的含指示剂的固体油脂相微环境上层，先在-80℃预冷2-4h，然后在-70～-80℃下冷冻干燥8～16h，即为有效防止气溶胶污染的LAMP检测体系冻干粉。
4、具体的检测过程
在实际检测时，一般具体的操作步骤为：向检测管中加入等体积反应缓冲液和待测模板(即核酸)，然后置于63～67℃恒温条件中反应30～60min，再升温至83～87℃反应5min即可；最后从扩增仪器中拿出反应管，水平垂直放置于 PCR管架上室温冷却2-3min后，自然光下，直接观察反应孔中的颜色变化。阳性扩增结果呈紫红色，阴性扩增结果为浅粉色。根据扩增后的颜色变化可直接对待测样本进行结果评判。这里的缓冲液由甜菜碱、KCl、Tris-HCl、(NH4)2SO4、 MgSO4按照物质的量之比为50～100:2～5:2～5:1～2:0.8～1混合而成，Tris-HCl 的pH值为6.8～8.8。
以下给出本发明的具体实施例，需要说明的是本发明并不局限于以下具体实施例中，凡在本申请技术方案基础上做的等同变换均落入本发明的保护范围。
制备中性红指示剂：称取100mg中性红粉末，加入50mL去离子水中，既得7mM中性红指示剂。
制备固定油脂：分别称取1份脂溶性液体和3份固体油脂于玻璃容器中，在 50℃条件下使其彻底熔化，充分混匀。快速注入到直径为4mm的模具中，待其凝固后，裁剪成厚度为3mm左右，质量35mg的小蜡饼，即为制得的固定油脂。
制备含中性红指示剂的油脂相指示剂微环境：将上述得到的固定油脂利用小镊子加入反应管中，在45℃条件下使其快速溶解，短暂离心后，在凝固态临界点时快速加入一定体积浓度的中性红指示剂，指示剂由于密度相对较大，在半凝固态酯相层中缓慢沉降，当酯相层完全凝固时，指示剂恰好被截留在固定油脂的某个位置，带石蜡层彻底凝固后，将形成完全包裹的酯相密闭微环境。
制备保护剂混合液，将0.75mL 5％牛血清白蛋白、0.75mL 0.05％大豆卵磷脂、0.5mL 100mM甘露醇、0.5mL 1％羟乙基淀粉得到2.5×保护剂混合液。
取预冷的15ml离心管，分别加入0.45mL无菌水、1.15mL 10mM dNTP、 1.6mL保护剂混合液、0.32mL Bst DNA Polymerase、0.16mL AMV Reverse Transcriptase、及0.32mL引物混合物充分混匀后，冰浴保存。
上述所使用的引物序列分别为：
2019-nCoV-E3 F3：CGTTAATAGTTAATAGCGTACTT
2020-nCoV-E3 B3：GACCAGAAGATCAGGAACTC
2019-nCoV-E3 FIP：
GCAGTACGCACACAATCGAAGCTTGCTTTCGTGGTATTCTTG
2019-nCoV-E3 BIP：
CAATATTGTTAACGTGAGTCTTGTGAAGAATTCAGATTTTTAACACG
2019-nCoV-E3LF：CAGTAAGGATGGCTAGTGTAA
2019-nCoV-E3LB：AACCTTCTTTTTACGTTTACTCT
将配制好的核酸扩增混合液在冰浴条件下分装到油脂相指示剂微环境的反应管中，每管12μL。将反应管转移至PCR管架上，于-80℃条件下冷冻2h，随后放置于低温冷冻干燥机中冻干8-16h。
图1所示为本实施例获得油脂相指示剂微环境，可以看出，中性红指示剂被固定油脂完全包裹于其中，分布于PCR管底部。
图2所示为含1μL中性红指示剂的油脂相指示剂微环境及扩增冻干粉体系，可以看出冻干粉完全分布于固定油脂的上层，产品管壁干净整洁，水分子去除效果明显。
图3所示为含2μL中性红油脂相指示剂微环境及扩增冻干粉体系，可以看出冻干粉与固定油脂呈现不均一化分布，在管壁内形成严重的“飞溅”现象，并且中性红指示剂完全裸露于固定油脂外面，冻干水分去除不彻底，冻干效果极差。可能在冻干过程中，中性红含水量的增多引起固定油脂形态发生崩解。
图4所示为本案例制备的含中性红油脂相指示剂微环境及核酸扩增冻干体系应用于实际检测过程中的结果，其中扩增结果为阳性，显色紫红色，阴性扩增结果为淡黄色。阳性结果与阴性结果显色差异极大，肉眼即可区分。
图5所示为利用含2μL中性红的油脂相指示剂微环境及扩增冻干粉体系应用于实际检测过程中的扩增结果。前4孔为阳性扩增结果，后4孔为阴性扩增结果。阳性扩增呈现浅粉色，阴性扩增结果为淡黄色。阳性结果和阴性结果显色差异不明显，肉眼难以区分。可能由于在冻干过程中，固定油脂的崩解，引起中性红指示剂的飞溅，暴露在外的中性红指示剂在真空条件下与反应缓冲液在反应未知反应形成一定的沉淀，影响扩增结果的显色。
图6所示为本案例的对照试验即分别加入核酸扩增的各个成分，然后加入反应缓冲液和检测样品进行的扩增结果，可见阳性扩增结果呈现紫红色，阴性扩增结果为淡黄色。扩增效果与本案例制备的油脂相指示剂微环境的核酸扩增体系一致。可见油脂相指示剂微环境的加入不影响扩增结果，相比本案例制备的核酸扩增体系在实际检测环节中操作更为方便，阳性和阴性显色更容易区分，并且避免了多种可能性的气溶胶污染。
图7所示不含油脂相指示剂微环境，但添加有中性红指示剂的的核酸扩增体系冻干粉的检测结果。阳性扩增结果和阴性扩增结果颜色接近，不易区分。这种现象可能由于提前向扩增体系中引入的中性红指示剂在冷冻干燥过程中与反应液的发生某种未知的反应，形成少量的沉淀，降低了中性红对扩增产物的有效检测浓度，使得阳性和阴性扩增结果显色差异不明显。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
序列表
<110> 陕西师范大学
<120> 一种有效防止气溶胶污染的可视化的LAMP检测体系及其制备方法、使用方法和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgttaatagt taatagcgta ctt 23
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaccagaaga tcaggaactc 20
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcagtacgca cacaatcgaa gcttgctttc gtggtattct tg 42
<210> 4
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caatattgtt aacgtgagtc ttgtgaagaa ttcagatttt taacacg 47
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cagtaaggat ggctagtgta a 21
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaccttcttt ttacgtttac tct 23
Claims (9)
1.一种防止气溶胶污染的可视化LAMP检测体系，其特征在于，由油脂相指示剂和低温冻干粉组成；
所述油脂相指示剂为将指示剂包埋于固定油脂中形成封闭的油脂相指示剂微环境；所述低温冻干粉中含有Bst DNA聚合酶、dNTP、引物混合物及保护剂；
未检测时，所述油脂相指示剂与低温冻干粉隔离；
检测时，将待测样本与低温冻干粉混匀后进行扩增，反应过程中受加热影响，封闭的油脂相指示剂微环境中的指示剂被释放至反应体系中，发生颜色变化，实现可视化监测，同时熔化的固体油脂将反应体系与外界空气隔绝防止气溶胶污染。
2.根据权利要求1所述的防止气溶胶污染的可视化LAMP检测体系，其特征在于，所述固定油脂是由固体油脂和脂溶性液体按照3g:1mL的用量比配制而成；
其中，所述固体油脂包括硬蜡、软蜡、蜂蜡、动物脂肪和凡士林中的一种或几种；所述脂溶性液体为液体石蜡或食用油。
3.根据权利要求1所述的防止气溶胶污染的可视化LAMP检测体系，其特征在于，所述指示剂为中性红染液，其浓度为5～10mM，所用体积为0.5～1μL。
4.根据权利要求1所述的防止气溶胶污染的可视化LAMP检测体系，其特征在于，所述低温冻干粉是由Bst DNA聚合酶、AMV反转录酶、dNTP、引物混合物及保护剂按照(1～2)：1：(3～7)：(1～2)：(5～8)的体积比混合制成的预混试剂经过冷冻干燥处理后获得。
5.根据权利要求1或4所述的防止气溶胶污染的可视化LAMP检测体系，其特征在于，所述引物混合物中包含引物FIP、引物BIP、引物LF、引物LB、引物F3和引物B3，且引物FIP、LF和F3的物质的量浓度之比为(4～8):(2～4):(1～2)，引物BIP的浓度与引物FIP相同，引物LB的浓度与引物LF相同，引物F3的浓度与引物B3相同。
6.根据权利要求1或4所述的防止气溶胶污染的可视化LAMP检测体系，其特征在于，所述保护剂是由牛血清白蛋白、大豆卵磷脂、甘露醇和羟乙基淀粉按照质量比为(50～150):(1～40):(10～50):(5～25)的比例混合而成。
7.权利要求1～6中任意一项所述的防止气溶胶污染的可视化LAMP检测体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将固定油脂在高温条件下熔化，导入至柱型模具中，室温冷却待其中的固定油脂凝固后切分为直径为4mm，厚度为3mm的蜡饼，即制得固定油脂；
2)将步骤1)制得的固定油脂加入PCR反应管中，熔化后、离心，快速加入指示剂，指示剂被包被在固定油脂中，形成封闭的油脂相指示剂微环境；
3)制备包含Bst DNA聚合酶、AMV反转录酶、dNTP、引物混合物及保护剂的预混试剂；
4)将步骤3)制得的预混试剂分装至步骤2)制得的封闭的油脂相指示剂微环境的上层，先在-80℃预冷2-4h，然后在-70～-80℃下冷冻干燥8～16h，制得防止气溶胶污染的可视化的LAMP检测体系。
8.权利要求1～6中任意一项所述的防止气溶胶污染的可视化LAMP检测体系的使用方法，其特征在于：检测时，向PCR反应管中加入等体积的待测样本以及反应缓冲液，与低温冻干粉充分混匀后，放入检测仪中进行扩增处理；
在整个核酸扩增处理过程中，固定油脂经预热熔化为液态，将封闭的指示剂快速释放到反应体系中，熔化的油脂混合物在整个反应过程中漂浮于PCR反应管上空，形成油脂相封闭层，将反应体系和外界空气完全隔离；另外释放的指示剂通过与扩增的核酸产物形成颜色物质，用于监测反应进程；反应结束后，将检测管移至室温条件，通过肉眼能够判断阳性和阴性结果。
9.权利要求1～6中任意一项所述的防止气溶胶污染的可视化LAMP检测体系在检测新型冠状病毒中的应用，其特征在于，在检测时，用于2019新型冠状病毒扩增检测的基因为E基因；在LAMP扩增体系中另外加入逆转录酶和特异性扩增引物混合物；
所述特异性扩增引物混合物包括：
2019-nCoV-E3 F3，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；
2019-nCoV-E3 B3，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；
2019-nCoV-E3 FIP，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示；
2019-nCoV-E3 BIP，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示；
2019-nCoV-E3 LF，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示；
2019-nCoV-E3 LB，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示。
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2020
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