JPH11512602A - Ｐｃｒのための対照 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＤＮＡの調製の段階、陽性対照および標的特異的配列のみにアニーリングしかつ増幅するプライマーを使用するＰＣＲ増幅、ならびに、単純なゲルならびに電気泳動および染色処置を使用する検出もしくは均質系検出を含んで成る細菌試験法が記述される。陽性対照試薬を包含するＰＣＲ試薬が錠剤化された形態で増幅反応に引き渡される。

Description

【発明の詳細な説明】 ＰＣＲのための対照 発明の分野 本発明は分子生物学の分野に、および具体的には、選択された微生物の迅速な 検出方法に関する。 発明の背景 細菌を検出することおよび同定することは、多様な医学的および公衆衛生の分 野において重要であり、また、食物連鎖の品質を制御することにおいて重要であ る。無数のプロトコール、専売の装置およびキットが、急速に成長する細菌検出 の分野の欲求に合致するよう、徐々に発展している。これらは、必要な処置を実 施するための高度に訓練されかつ熟練した人員、また、結果を評価するためのよ り高度に訓練されかつ熟練した人員さえ必要とする。さらには、存在する試験の 多くは、成長および保存の条件ならびに他の細菌もしくは微生物の存在およびそ れらからの競合のような環境因子に極めて感受性である。これは、精密さを要求 する処置および高度に熟練した熟練工の必要性をさらに重要視させる。従来技術 の試験は、しばしば、試薬におよび試験が行われる装置の双方に関して高価であ る。加えて、これらの試験は確認を必要とする。なぜなら、それらは、しばしば 、十分に選択的もしくは包括的でなく、偽陽性および偽陰性双方の結果をもたら すからである。 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ある核酸もしくはその混合物に含有され るいずれか所望の特異的な核酸配列の増幅を可能にする強力な分析手段である。 細菌の検出のためのこの処置の使用は文献で報告されている。しかしながら、そ れは普遍的に実施されるので、信頼できる結 果を達成するためには、厳密な条件下での厳密なプロトコールの厳守の要求を負 わせそして高等な技術がありかつ訓練を受けた人員を必要とする処置である。 生物体の検出のためのＤＮＡに基づく全ての方法で、および具体的にはＰＣＲ 試験処置で、試験反応を高めもしくは阻害しうる外来成分が、信頼できる結果を 得ることを困難にする。これは、病原体、損傷、および異味増進物などのような 、品質に影響を及ぼす細菌性汚染物質について食物由来のマトリックスを試験す ることにおいて起こる。こうした情況下での試験結果は非常に重要であるため、 いずれか特定の試験の有効性を評価することが重要である。本発明は、試験の妥 当性を確立することにおいて有用である陽性対照を提供する。 本発明の試験処置はＰＣＲに基づく。その技術に対し基本的な米国特許第4,68 3,202号で、マリス(Mullis)は、核酸の別個の相補鎖が１モル過剰の２個のオリ ゴヌクレオチドプライマーで処理され、そしてそのプライマーが伸長されて所望 の核酸配列を合成するための鋳型としてはたらく相補的プライマー伸長産物を形 成する手順を記述する。反応の段階すなわち一連の熱処理は、段階的にもしくは 同時に実施され、そして所望される限りしばしば反復される。典型的には、35回 程度もしくはより多くのサイクルが、さらなる操作に足りる多数の複製を得るの に必要である。 米国特許第4,683,195号で、マリス(Mullis)らは、特定の核酸配列が、それら の非相補的末端に制限酵素切断部位を含有する配列を増幅するプライマーを使用 することによりベクター中にクローニングすることができ、また、核酸断片が、 増幅過程を使用して存在するより短い断片 から調製されうることを教示する。 ＰＣＲは、増幅によって特定のＤＮＡ配列のみの存在を検出するよう設計され たいくつかの応用を有する。いかなるそうしたＰＣＲ試験でも対照反応を包含す ることが極めて有利であるとみられる。なぜなら、試験が標的について陰性であ る場合、その結果が真であるかどうか、または、その反応が、器具の不調もしく はサンプルマトリックスの影響による反応の阻害により失敗したかどうかを知る ことが重要だからである。後者は、特に、病原体もしくは製品の品質に有害な他 の生物体の存在を決定するために食物サンプルを試験することにおいて共通する 。例えば、ＰＣＲの強力な阻害物であるココアを含有するサンプルは、対照をお かないＰＣＲに基づく試験では隠蔽されることがある病原体を含む場合がよくあ る。対照の反応体および方法が本発明の主題である。 "DNA Polymorphisms Amplified by Arbitrary Primers are Useful as Geneti c Markers"、Nucleic Acid Research、Vol．18、No．22、p．6531-6535のウィリ アムズ(Williams)ら、およびウェルシュ(Welsh)ら、"Fingerprinting Genomes u sing PCR with Arbitrary Primers"、Nucleic Acid Research、Vol．18、No．22 、p．7213-7218の双方は、細菌を包含する多様な供給源からのゲノムＤＮＡから の増幅産物の特徴的なパターンを発生させるＤＮＡ増幅反応での単一の任意のプ ライマーの使用を示す。WO93/11264で、ジェンセン(Jensen)らは、微生物の幅広 いスペクトルの全域での単一の任意のプライマーの使用を教示する。対照反応は 扱われない。 シュルディナー(Shuldiner)らは、PB92-100932 NTISで、逆転写の間に特有の 無作為のヌクレオチド配列で配列を標識する(tagging)こと によりＲＮＡ配列を検出することを教示する。この特有のヌクレオチド配列は、 その後、外因性供給源からもしくは持ち越し(carry-over)からのような汚染する ＤＮＡの結果として得られる偽陽性の数を低下させる、生じるＤＮＡ配列を選択 的に増幅するのに利用される。この処置は、偽陰性ならびに偽陽性を避けること を許容する本発明の対照の見地を欠く。 テルセロ(Tercero)ら（EP 586112）は、ＰＣＲ増幅での陽性対照として有用な ベクターを教示する。当該ベクターは、増幅後に標的により生成される産物と大 きさの異なるものを生じる処置で使用されるプライマーの配列と本質的に同一な 配列を含有する。当該ベクターのみが増幅される場合、結果は真の陰性であるが 、しかし、ベクターも標的もいずれも増幅されない場合、その場合は試験は不完 全であるはずである。異なる大きさの産物を分離する一定の手段がこうした対照 のプロトコールで必須である。対照および標的の反応が同じ容器で実施されそし て共増幅されるため、ある環境下では当該処置の感受性を低下させる競合反応が 存在する。これは標的の１個の優先的増幅に起因する。また、産物ＤＮＡの大き さのための参照も必要とされる。なぜなら、単一の増幅産物のみの場合には、そ れが試験産物かもしくは対照産物かが決定されなければならないからである。か ように、テルセロ(Terocero)らの開示は均質系検出を扱わず、そしてそれに適応 されない。 要約すると、文献は、１）試薬を調製しかつ取り扱うことにおいて、およびプ ロトコールを実施することにおいて、特別の熟練を必要としない簡単な分子生物 学技術を使用する、２）表現型の発現に影響を与える環境因子に反応しない、そ して３）選択的および包括的の双方でありか つプロトコールに統合された陽性対照を有する、細菌試験法を開示しない。 発明の概要 発明者らは、複雑な混合物中の特定の生物体の存在の信頼できる検出方法を提 供した。当該方法の段階は、 ｉ）ａ）逆方向で相互に相補的である末端の下位配列(sub-sequence)で構築され た特徴づけるＤＮＡ配列の合成構築物の有効な数 ｂ）前記構築物の各鎖の３’末端に対し相補的な単一プライマーの有効な単位数 ｃ）場合によっては、有効濃度のインターカレーション色素、 ｄ）場合によっては安定化剤、 ｅ）有効量のポリメラーゼ、および ｆ）有効量のデオキシヌクレオチド のアリコートを含んで成るポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための錠剤化され た対照試薬を提供すること、 ii）有効な数の761プライマーおよび35プライマー、ならびに上のｃ〜ｆのアリ コートを含んで成る錠剤化された試験試薬を提供すること、iii）標的生物体を 含有すると疑われる天然のマトリックスからの溶解された細菌を含んで成る、非 選択的に強化された(enriched)試験溶液を提供すること、iv）段階ｉの錠剤を単 一用量で含む段階iiiの溶液の有効な溶液を提供すること、ｖ）段階iiの錠剤を 単一用量で含む段階iiiの溶液の有効な溶液を提供すること、vi）段階ivおよび ｖの溶液を有効な数のＰＣＲサイクルにかけること、vii）段階viの結果として 生じる溶液に追跡色素(tracking dye)を添加すること、viii）段階vii の結果として生じる溶液を、マーカー溶液と平行して電気泳動分離（ＰＡＧＥも しくはアガロースゲルのいずれか）にかけ、次いで、同定する像を生成させるた めに、核酸特異的色素で染色するが、場合によって、前記ゲルが核酸特異的色素 で予め染色されない場合には前記核酸特異的色素で予め染色すること、ならびに ix）段階viiiの結果として生じる像を光学的に分析して標的生物体の存在もしく は非存在を最終的に同定すること、である。 好ましくは、本方法は、効果的には、最低約10個の構築物を使用する。単一プ ライマーの最終濃度は約0.01マイクロモルから約0.5マイクロモルまでである。 任意のインターカレーション色素は、好ましくは、核酸色素および非対称シアニ ン色素から成る群から選択され、また、好ましい有効濃度は、約0.1マイクロモ ルから約6.0マイクロモルまでである。好ましい任意の安定化剤はトレハロース である。好ましい合成配列は、相補的末端とともにサルモネラ属(Salmonella)の 配列をもつ改変組み換えｐＵＣ１８である。 本方法で使用される対照および試験試薬は、低温の液体によって粒子に凍結さ れ、前記粒子が錠剤化のための供給原料を提供する。 段階iii）の非選択的に強化された試験溶液からの標的細菌サンプルの回収は 、一片のポレックス［Porex］（商標）高密度ポリエチレンの存在下のインキュ ベーションにより達成され、それにより除去および前記小片の処理が前記標的細 菌サンプルを効果的に処理する。 本発明のさらなる態様はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための対照反応体 を作成する方法であり、その段階は、ａ）特徴づけるＤＮＡ配列を同定すること 、ｂ）特徴づける配列の構築物であって、前記の特徴 づける配列の増幅された産物からクローニングされた前記配列を終結させる逆方 向で相互に相補的である末端の下位配列により特徴づけられる前記構築物を合成 すること、ｃ）有効な数の段階ｂ）の構築物を提供すること、ｄ）当該構築物に 対して特有でありかつ末端の下位配列のプライミング部位に対して相補的である 、単一プライミングＤＮＡ配列を同定すること、ｅ）有効な単位数の単一プライ マーを提供すること、ｆ）場合によっては、有効量のインターカレーション色素 を提供すること、そしてｇ）場合によっては有効量の安定化剤を提供すること、 である。 好ましくは、標的細菌サンプルは、その10倍希釈による段階iii）の非選択的 に強化された試験溶液から回収され、次いで段階iii）の溶液の有効な溶液を提 供する有効な戻し(grow-back)インキュベーションされる。好ましくは、対照試 薬は錠剤化される。好ましくは、「スノーガン法」が、対照反応体の凍結粒子を 生成するのに使用され、当該粒子は錠剤化のための供給原料を提供する。 本発明は、さらに、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための対照反応体を使 用する標的細菌の試験方法を包含し、当該段階は、Ａ）ｉ）標的ＤＮＡ配列のた めの単一プライマーの有効なコピー数を含んで成る有効量の対照反応体、逆方向 で相互に相補的である末端群をもつ同定配列の構築物を含んで成る有効なコピー 数の前記標的ＤＮＡ配列；ii）場合によっては、ＰＣＲ増幅に悪影響を及ぼさな い適合性インターカレーション色素の有効量；iii）有効量のポリメラーゼ；iv ）有効量のヌクレオチド；およびｖ）場合によっては、有効量の安定化剤、の混 合物を対照ウェルに導入すること、Ｂ）ｉ）標的配列のためのプライマーの有効 量を含んで成る、有効量の試験反応体；ii）ＰＣＲ増幅に悪影響を 及ぼさないインターカレーション色素の有効量；iii）有効量のポリメラーゼ；i v）有効量のデオキシヌクレオチド；およびｖ）場合によっては、有効量の安定 化剤、の混合物を試験ウェルに導入すること；Ｃ）試験ウェルおよび対照ウェル の双方に、前記ポリメラーゼと適合する緩衝液であって、標的細菌ならびに有機 および／もしくは無機の外来物質をおそらく含有する供給源からのサンプルが添 加された前記緩衝液、前記添加段階の前に溶解段階に場合によってはさらされる 被検体であって、希釈および再生の処置により場合によっては調製される被検体 のライセート、を包含する液体担体を含んで成る前記被検体を単一用量で添加す ること；Ｄ）場合によっては、前記ウェルのそれぞれの内容物を混合すること； Ｅ）段階Ｃ）で溶解が前記導入前になされなかった場合には双方のウェルを溶解 温度にさらすことにより被検体の細菌細胞を溶解すること；Ｆ）各ウェルの溶解 された内容物を有効なＰＣＲ温度に加熱し、そして選択されたサイクル数を循環 させて、検出に十分な多数のＤＮＡコピーを提供すること；Ｇ）段階Ｆ）の後、 各ウェルの色素に蛍光を発生させること；Ｈ）前記ウェルのそれぞれから放出さ れる光を測定すること；そしてＩ）十分な測定可能な光の放出が双方のウェルで 観察される場合に標的細菌を存在として記録すること、もしくは前記試験ウェル に十分な測定可能な放出が存在せずかつ前記対照ウェルに十分な放出が存在する 場合に標的細菌を非存在として記録すること、または前記試験ウェルからの十分 な放出が存在しない場合に不完全な試験を記録すること、を包含し、前記の測定 可能な光の放出が十分なことは、対照反応体からの光の放出の予備較正ならびに 段階Ｈ）後の対照ウェルおよび試験ウェルからの光の放出のその較正との比較に より決定され、試験ウェル での予備較正値からの光の放出の逸脱は、前記試験ウェルで観察された値が前記 較正値の上であるかもしくは下であるかに依存して、加えるべきもしくは減ずべ き外来物質の影響に起因するものとされ、前記影響の排除を可能にするものであ る。 好ましくは、対照反応体および前記試験反応体は錠剤化される。好ましくは、 インターカレーション色素は、10％エタノール／水溶液で、１×10⁷に本質的に 同等もしくはより小さいＤＮＡ分配係数を有する。 本発明は、さらに、対照反応体を使用する標的細菌の試験方法を包含し、当該 段階は、Ａ）ｉ）標的ＤＮＡ配列のための単一プライマーの有効量を含んで成る 、有効量の対照反応体；ii）反対の鎖上にある末端群をもつ同定配列の構築物を 含んで成る、前記標的ＤＮＡ配列の有効なコピー数；iii）有効量のポリメラー ゼ；iv）有効量のヌクレオチド；およびｖ）場合によっては有効量の安定化剤、 を対照ウェルに添加すること；Ｂ）ｉ）標的ＤＮＡに特異的なプライマーの有効 量を含んで成る、有効量の試験反応体；ii）有効量のポリメラーゼ；iii）有効 量のヌクレオチド；およびiv）場合によっては有効量の安定化剤、を試験ウェル に添加すること；Ｃ）試験ウェルおよび対照ウェルの双方に、前記ポリメラーゼ に適合する緩衝液であって、有機および／もしくは無機の外来物質をおそらく含 有する供給源由来の疑わしい標的細菌のサンプルが添加された前記緩衝液、前記 導入前に溶解段階に場合によってはさらされる被検体、を包含する液体担体を含 んで成る前記被検体を添加すること；Ｄ）場合によっては各ウェルの内容物を混 合すること；Ｅ）段階Ｃ）で任意の溶解が前記導入前になされなかった場合には 双方のウェルを溶解温度にさらすことにより試験ウェルの細菌性の内容物を溶解 すること ；Ｆ）双方のウェルの溶解された内容物を有効なＰＣＲ温度に加熱しそして選択 されたサイクル数を循環させて検出に十分な多数のＤＮＡ複製物を提供すること ；Ｇ）双方のウェルに、有効量のインターカレーション色素を添加すること；Ｈ ）段階Ｇ）の後、各ウェルの色素に蛍光を発生させること；Ｉ）前記ウェルのそ れぞれから放出されるいかなる光も測定すること；およびＪ）十分な測定可能な 放出が双方のウェルで観察される場合に標的細菌を存在として同定すること、も しくは前記試験ウェルに十分な測定可能な放出が存在せずかつ前記対照ウェルに 十分な放出が存在する場合に標的細菌を非存在として同定すること、または前記 試験ウェルからの十分な放出が存在しない場合に試験を不完全として同定するこ と、を包含し、前記の十分であることは、対照反応体からの放出の予備較正なら びに段階Ｈ）後の対照ウェルおよび試験ウェルからの放出のその較正との比較に より決定され、試験ウェルでの予備較正値からの放出の逸脱は、前記試験ウェル で観察された値が前記較正値の上であるかもしくは下であるかに依存して、加え るべきもしくは減ずべき外来物質の影響に起因するものとされ、前記影響を排除 するものである。 好ましくは、疑わしい標的細菌の混ぜられたサンプルは、その後に有効な被検 体を提供する有効な戻しインキュベーションが続く、その10倍希釈による非選択 的な強化(enrichment)処理から回収される。好ましくは、試験反応体および前記 対照反応体は錠剤化され、また、これらの反応体は、低温の液体によって粒子に 凍結され、当該粒子は錠剤化のための供給原料を提供する。 図面、生物学的寄託および配列表の簡単な記述 図１は本発明の段階の全般的流れ線図である。 図２は２個の761プライミング部位を含有する組み換えｐＵＣを示す、対照構 築物のブロック線図である。 図３は図２の構築物を作成するよう企てられた段階のブロック線図である。 図４は当該構築物を調製する段階のゲル電気泳動パターンである。 図５は、全てのクローンが挿入物のないことを示す見かけ上同じ大きさであっ た試験結果を示す、ゲル電気泳動パターンである。 図６ａ、ｂおよびｃは挿入物を有するようであったゲル電気泳動パターンのレ ーンである。 図７は、581bpにHind III切断部位をもつ２個のクローン中の適正な大きさに された挿入物を示す、ゲル電気泳動パターンである。 図８は本発明の構築物の存在を確認するゲル電気泳動パターンである。 図９ａ〜ｃは、761のプライミング部位の、以前に構築されたクローンへのク ローニングを示すゲル電気泳動パターンである。 図１０は対照としての構築物プラスミドの利用性を立証する試験プロトコール である。 図１１ａ〜ｄは、図１０のプロトコールの結果を示しかつ本発明の対照プラス ミドの利用性を確認するゲル電気泳動パターンである。これは内部対照IVである 。 図１２ａおよびｂは、本発明の実際を例証する実施例１で得られたゲル電気泳 動パターンである。 図１３ａ〜ｃは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動および通常は制御するのが 困難な食物に基づく系での均質系検出の双方で本発明の対照を使用する陽性（ａ ）、陰性（ｂ）および無効な（ｃ）結果を例証する実 施例５のゲル電気泳動パターンおよび蛍光測定を示す。 図１４ａ〜ｆは実施例７での試験実施のＰＡＧＥに基づくブロットである。 図１５は、ネズミチフス菌(S．typhimurium)についての閾値試験およびバック ス（BAX）［商標］システムの確認の結果を示す。 図１６は、本発明の実際を例証する実施例８で得られたゲル電気泳動パターン を示す。 本出願のデータを申請することにより、発明者らは、特許手続きの目的のため の微生物の寄託の国際的承認(International Recognition of the Deposite of Micro-organisms for the Purposes of Patent Procedure)に関するブダペスト 条約の状況下に、以下の生物学的寄託をなしている： 寄託者の同定の照合 国際的な寄託の呼称 寄託日 ｐＵＣ１８（サルモネラ （1996年９月19日と 属(Salmonella)の配列、 期待される） 配列番号１をもつ） 本明細書で使用されるような「ＡＴＣＣ」は、12301 Parklawn Drive，Rockvi lle，MD 20852 U.S.A.に所在するアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ ン(American Type Culture Collection)国際供託所を指す。「ＡＴＣＣ番号」は 、ＡＴＣＣへの寄託に際しての培養系に対する受託番号である。 発明者らは、37 C.F.R．1.821-1.825ならびに付録ＡおよびＢ（「ヌクレオチ ドおよび／もしくはアミノ酸配列を含有する出願の開示のための必要条件(Requi rements for pplication Disclosures Conta ining Nucleotides and/or Amino Acid Sequences)）に従い、また、「特許出願 におけるヌクレオチドおよびアミノ酸配列の標準的表示のための規則(Rules for the Standard Representation of Nucleotide and Amino Acid Sequences in P atent Applications)」ならびに1992年12月のOJ EPOへの補遺No.２で発表された EPO会長決定への付属書類ＩおよびIIに従って、１個の配列表を提供した。 発明および最良の様式の詳細な記述 本発明は、選択的かつ包括的であり、プロトコールに統合され、試薬を調製す ることおよび取り扱うこと、ならびにプロトコールを実施することにおいて特別 の熟練を必要としない簡単な分子生物学技術を使用し、そして表現型の発現に影 響を与える環境因子に反応しない、ＰＣＲのための対照を提供する。 本発明の方法は、標的生物体を含有すると疑われる被検体サンプルの慣習的な 非選択的強化後に実行される３段階を含んで成る。それはＤＮＡに基づく試験で あり、また、それ自体、当該生物体の表現型の発現に影響を与える環境因子に反 応せず、そして従って高レベルの信頼性および再現性を提供する。 連続の段階は、ＤＮＡ調製、標的生物体に特異的なプライマーを使用するＰＣ Ｒ増幅、および陽性対照である。当該プライマーは標的特異的配列のみにアニー リングしそして増幅し、また、検出は、単純なゲル電気泳動および染色の処置を 使用してなされる。ＰＣＲを使用することの複雑さは、予め混合された溶解試薬 、ならびに、ＰＣＲチューブに直接包装される試験錠剤および対照錠剤の双方を 包含する錠剤化されたＰＣＲ試薬の使用により簡単にされている。 本発明はまた、対照反応体、その作成方法およびその使用方法にも関する。試 験反応体と平行して対照反応体を使用することにより、処理サイクルが機能的に 作用していたという保証が提供される。錠剤の形態の対照反応体は、好ましくは 改変組み換えｐＵＣ１８プラスミドに含有される相補的末端をもつサルモネラ属 (Salmonella)からの特徴づけるＤＮＡ断片の遺伝子的に工作された（合成）構築 物である。それは、指示薬、単一プライマーおよび好まれるように錠剤化される 場合は安定化剤とともに使用される。 ２種の一般的な分析処置が使用されうる。 第一は、簡単なゲル電気泳動処置である。大きさで分離する多くのＤＮＡ断片 の代わりに、本発明のプロトコールでは、単一のＤＮＡ断片のみが複雑なＰＣＲ 反応混合物から分離されることが必要である。このサンプルは、その後、臭化エ チジウム染色によるように染色される断片により形成されるバンドの存在もしく は非存在について検査される。予め混合されかつ錠剤化された試薬に加え、成形 済みゲルが使用される。 使用においては、第二の一般的処置に従い、被検体が、単独プライマーの対照 反応体を保持する対照ウェルおよび標準的な２プライマーの試験反応体を保持す る平行する試験ウェルの双方に導入される。適する指示薬、好ましくは蛍光色素 が、ウェルに入る前もしくは後に添加される。同様に、被検体が、ウェルに入る 前もしくは後に溶解される。双方のウェルは適切な数のＰＣＲサイクルにかけら れる。その後に検出が続く。内容物は適切な波長の光にさらされ、そしていかな る蛍光も測定される。試験ウェルでの陽性の結果は、常に、対照ウェルでの結果 に関係なく、陽性の結果とみなされる。対照ウェルでの陽性の結果は、試験ウェ ルの 結果に関係なく、この方法の機能を確言する。双方のウェルでの陰性の結果は決 定的でないとみなされなくてはならない。いくつかの条件下で、試験ウェルの反 応が較正されることができ、そして、補正が、いくつかの食料品で普遍的である ような、最初のサンプルからの外来物質による蛍光の増強もしくは抑制の影響に ついてなされた。 本発明はサルモネラ属(Salmonella)のスクリーニング製品に特別の方法であり 、作業の流れ(work flow)、および、この病原体が消費者に対する重大な健康の 危険を構成する極めて普遍的な(all-too-common)汚染物である食品工業のサンプ リングの必要に緊密に合致する微生物の同定方法に対しWO93/11264に開示される 非特異的技術を改善する。 本明細書で使用される錠剤化方法は「スノーガン法」と呼ばれ、また、安定化 剤としてトレハロースを使用する。当該技術は、米国特許第5,307,640号(フォー ゼイ(Fawzey)ら)、同第4,762,857号（ボリン(Bollin，Jr.)ら）、同第4,678,812 号（ボリン(Bollin，Jr.)ら）、同第3,932,943号（ブリッグズ(Briggs)ら）、お よび米国特許第5,475,984号（出願第08/298,231号）（フェルマニ(Fermani)ら） に記述される。一般に、対照および試験の試薬は、低温の液体によって粒子に凍 結され、当該粒子は錠剤化のための供給原料を提供する。 本明細書で使用される場合、「ＰＣＲ」は、米国特許第4,683,195号にマリス( Mullis)ら、および米国特許第4,683,202号にマリス(Mullis)らにより記述される ようなポリメラーゼ連鎖反応を意味する。 「ＢＡＭ」は、分析化学者協会(the Association of Analytical Chemists)、 Suite 400、2200 Wilson Blvd、Arlington、VA 22201-3301により発表されかつ 配布された、ＦＤＡの細菌学的分析マニュア ル(Bacteriological Analytical Manual)を意味する。 「ＢＨＩ培地」は脳-心注入培地を意味する。 「等級別に配列した質量ラダー(Graduated Mass Ladder)」は、水（CAS No．7 732-18-5）96.6276重量％；「フィコール(FICOLL)、タイプ400-DL」としてシグ マ ケミカル カンパニー(Sigma Chemical Company)、英国ドーセット、から入 手可能なポリエピクロロヒドリン（CAS No．26837-85-8）2.5重量％；フィシャ ー サイエンティフィク(Fisher Scientific)から入手可能なトリス（CAS No．7 7-86-1）0.54重量％；ホウ酸（CAS No．10043-35-3）0.27％；エチレンジアミン 四酢酸（ＥＤＴＡ）（CAS No．60-00-4）0.029重量％；キシレンシアノール Ｆ Ｆ（CAS No．2650-17-1）0.016重量％；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（CA S No．151-21-3）0.016重量％；およびライフ テクノロジーズ インコーポレ ーテッド(Life Technologies，Incorporated)、メリーランド州ゲイタースバー グ、からのＤＮＡ0.0014重量％を含んで成るマーカー溶液を意味する。 「溶解(lysis)緩衝液」は、水（CAS No．7732-18-5）99.51重量％；塩化カリ ウム（CAS No．7447-40-7）0.208重量％；トリス（CAS No．77-86-1）0.12重量 ％;塩化マグネシウム（CAS No．7791-18-6）0.061重量％；およびユニオン カ ーバイド(Union Carbide)から入手可能なトリトン［TRITON］Ｘ-100（商標）（ オクチルフェノキシポリエトキシエタノール非イオン性界面活性剤）（DP-17-67 -8）0.1重量％の溶液を意味し、これに当該プロトコールでプロテイナーゼＫ（ ベーリンガー マンハイム(Behringer Mannheim)、インジアナ州インジアナポリ スから入手可能）が添加される。プロテイナーゼＫを含まない溶液 は、Ｅ．Ｉ．デュポン ド ネムル アンド カンパニー(E.I．du Pont de Nem ours and Company)、デラウェア州ウィルミントン、によりＤＤＳ-24 溶解試薬 として出荷される。 「追跡色素」は、Ｅ．Ｉ．デュポン ド ネムル アンド カンパニー(E.I． du Pont de Nemours and Company)、デラウェア州ウィルミントン 19898、から 入手可能な、水84.61重量％；フィコール(FICOLL)15.0重量％；ＥＤＴＡ0.19重 量％；ＳＤＳ0.1重量％；キシレンシアノール ＦＦ0.1重量％およびＥＤＴＡ0. 19重量％の溶液を意味する。 「ＰＡＧＥ」はポリアクリルアミドゲル電気泳動を意味する。 図１は、慣習的な非選択的強化の後に続く３段階を含んで成る本発明の方法を 示す。すなわち、錠剤を水和する（その結果単独用量の添加を可能にする）のに 使用される総体積を表し得る溶液をもたらすＤＮＡ調製、対照が標的ＤＮＡの非 存在（もしくは存在）と反応しない錠剤化された試薬を使用するサンプルおよび 対照双方のＰＣＲ増幅、ならびに検出である。発明者らは検出に均質系検出もし くはゲル電気泳動のいずれかを使用し、むしろ後者を選ぶ。 等級別に配列した質量ラダーは各ゲル上で電気泳動される。この試薬は、大き さの範囲および大量負荷を表すラダーが、電気泳動分離に際して特異的な位置に 入れられそして変動する強度のマーカーを生ずることをもたらすように、６個の 異なる大きさのＤＮＡ断片を含有する。すぐ下の段階１１を参照。その後に続く 電気泳動ならびに記述される方法でのゲルの染色およびＤＮＡラダーを含有する レーンの全６個のバンドの可視化は、この検出システムの十分な感度を示す。 本発明の決定的な検出方法のプロトコールが次に来る。それは連続的 段階にある。 １．ＢＡＭ（もしくは他の対照方法（１個もしくは複数））のプロトコールに従 い、最低20時間、検討中の食物マトリックスを非選択的に強化する。 ２．最初にＢＨＩ培地を37℃に予め温め、ＢＨＩ培地を使用して１：10の係数に より（すなわち９mLのＢＨＩ培地へ１mLの予備強化培地）非選択的強化培地を希 釈する。 ３．希釈された培地を37℃で３時間インキュベーションする。 ４．最初に溶解緩衝溶液を使用前に室温に予め温め、５μLの希釈された非選択 的強化培地を、195μLの溶解緩衝溶液を含有する２mLのポリプロピレンのねじ蓋 チューブ（密閉のためのＯ-リングをもつ）に移す。 溶液を混合する。 ５．溶解チューブを水浴中37℃で20分間インキュベーションする。 ６．溶解チューブを第二の水浴中95℃で10分間加熱する。 ７．50μLのライセートをサルモネラ属(Salmonella)のＰＣＲ錠剤を含有するサ ンプルＰＣＲチューブに移す。試験サンプルとしてそれを区別するため、透明な チューブを使用する。 ８．追加の50μLのライセートを陽性対照錠剤を含有するＰＣＲチューブに移す 。われわれは、対照としてそれを区別するため、ピンク色のチューブを使用する 。 注意：ライセートは、ＰＣＲ錠剤が十分に湿らされる限りは混合することなしに 当該錠剤を溶解することができる。錠剤およびライセート溶液の下に空気が捕捉 されることを避ける。 ９．ＰＣＲチューブを、パーキン エルマー サイクラー(Perkin Elm er Cycler）（モデル 9600）中に置き、そして、94℃で２分15秒で開始し、次 いで35サイクルの２種の温度プロトコールすなわち94℃で15秒および72℃で３分 の増幅プログラムを開始する。72℃での最後のサイクルの後、72℃で７分の保持 期間が存在する。 １０．同等である２個の列挙される経路のいずれかを使用して以下のようなＰＡ ＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を行う： ａ）バージョンＩ。1.7μLの追跡色素および8.3μLのＰＣＲ産物を、空の500 μLミクロ遠心チューブ中に添加し、そして遠心分離により混合する。 ｂ）バージョンII。「10添加10負荷(add-10-load-10)」：10μLの追跡色素を 、増幅されたサンプルを含有するＰＣＲチューブ中に添加し、そして、全体で４ サイクルの、当該溶液の反復される取り込みおよび追い出しにより当該溶液を混 合する。 １１．等級別に配列した質量ラダー10μLを、ゲルのレーン１にピペットで加え る。 １２．10μLのＰＣＲ／追跡色素混合物を、ゲルの他のレーンに（ピペットによ り）負荷する。 注意：各食物サンプルの試験はゲルの２レーンにより表示される。１個はサンプ ル錠剤のため、また、１個は陽性対照錠剤のためである。 １３．標準的なＰＡＧＥの分離および検出の処置に従う。対照産物を検出するこ との失敗は、試験ウェルでの陰性の結果についての試験の失敗を示す。陽性の試 験サンプルでの対照産物を検出することの失敗は、スクリーニング目的に関して 陽性の試験とみなされる。こうした場合は、おそらく、十分な産物を生成する、 小さな程度の阻害および試験サンプ ル中の標的ＤＮＡの高レベルの結果であるとみられる。ＰＡＧＥ以外の電気泳動 のプロトコールが、当業者によく知られるように、この段階に適応されうる。例 えば、臭化エチジウムのような核酸特異的色素を含有する予め染色されたゲルが 使用されうる。これは電気泳動段階直後にバンドの可視化を可能にする。 従来技術の欠陥、すなわち、対照、および被検体中の陽性の標的の存在で作用 することができる単純な対照処置の非存在が、以下の利点すなわち ・単一プライマーを使用して増幅されることが可能である ・増幅産物の量がサンプル中に含有されるいかなるＤＮＡにも独立である ・人手によるおよび自動化された試験処置の双方での使用の容易さおよび高程度 の再現性のために錠剤化され得る ・均質系検出で、すなわち反応体からの産物ＤＮＡの分離なしに使用され得る ・疑われる標的および対照に別個の試験容器を使用することにより競合反応を避 ける を提供する平行する反応で、本発明のＤＮＡ構築物を使用することにより除外さ れる。 本発明の対照ＤＮＡすなわち構築物は、サルモネラ属(Salmonella)に特異的な ＤＮＡ配列の挿入を含有するＤＮＡベクター（ｐＵＣ１８）から成る。当該配列 のｐＵＣ１８は、塩基対35から塩基対786まで伸長するサルモネラ属(Salmonella )の断片と連結されて、プラスミド中に35および761のプライミング部位をもつ組 み換えｐＵＣ１８を形成する。 35プライマー部位内へのプライマー761配列の挿入は、その後、２個の761プライ ミング部位を含有するさらに改変組み換えｐＵＣ１８を形成する。 結果として生じるプラスミドは、プライマー761のみを使用して増幅されるこ とが可能である一方、天然のサルモネラ属(Salmonella)の標的配列は35および76 1のプライマー双方を必要とする。こうして、試験と一緒に行われそして対照反 応ウェル中に試験被検体を包含する陽性対照反応は、存在する場合はサルモネラ 属(Salmonella)のＤＮＡを指数関数的に増幅することができない。代わりに、対 照反応は、標的としてプラスミドを使用する産物のみを生成させ、そして従って 、標的ＤＮＡの存在もしくは非存在により影響されない一定の産物レベルを与え る。 当該構築物は、であるから、効果的に、それらが相互の逆相補物であるという ことでのみ異なる２個の末端をもつサルモネラ属(Salmonella)特異的なＤＮＡ断 片である。すなわち、プライミング配列は逆の方向で相補的である。「効果的に 」は、実際上、５’末端での挿入が末端配列内にあり、そしてそれは、実際には 、全く末端にはないがしかしまるでそれがそこにあるかのように機能するため、 使用される。 これがｐＵＣ１８にクローニングされる配列である。 配列番号：１ 陽性対照錠剤は、 トレハロース 90.15重量％ カーボワックス 9.82 ｄＡＴＰ（デオキシヌクレオチド三リン酸） ＜0.10 ｄＣＴＰ（デオキシヌクレオチド三リン酸） ＜0.10 ｄＧＴＰ（デオキシヌクレオチド三リン酸） ＜0.10 ｄＴＴＰ（デオキシヌクレオチド三リン酸） ＜0.10 761プライマー ＜0.001 プラスミドＤＮＡ ＜0.001 ＴＡＱ（商標）ポリメラーゼ ＜0.001 から成る。 試験錠剤は、 トレハロース 90.15重量％ カーボワックス 9.82 ｄＡＴＰ（デオキシヌクレオチド三リン酸） ＜0.10 ｄＣＴＰ（デオキシヌクレオチド三リン酸） ＜0.10 ｄＧＴＰ（デオキシヌクレオチド三リン酸） ＜0.10 ｄＴＴＰ（デオキシヌクレオチド三リン酸） ＜0.10 761プライマー ＜0.001 35プライマー ＜0.001 Ｔａｑ（商標）ポリメラーゼ ＜0.001 から成る。 陰性対照錠剤は、所望される場合は、 トレハロース 90.15重量％ カーボワックス 9.82 ｄＡＴＰ（デオキシヌクレオチド三リン酸） ＜0.10 ｄＣＴＰ（デオキシヌクレオチド三リン酸） ＜0.10 ｄＧＴＰ（デオキシヌクレオチド三リン酸） ＜0.10 ｄＴＴＰ（デオキシヌクレオチド三リン酸） ＜0.10 761プライマー ＜0.001 35プライマー ＜0.001 から成る。 上で挙げられるように、対照および試験の双方の錠剤は、フェルマニ(Fermani )ら（米国特許第5,475,984号）で述べられるような「スノーガン法」を使用して 調製される。当該方法は、ハウジング中で液体産物の凍結粒子を生成させるのに 低温の液体を使用する。これは、（ａ）本質的に連続的な下方に向けられる、低 温の液体の円周の壁を創造する環状の下向き方向にハウジング内に低温の液体を 導入して、内部捕捉帯の限界を定めること；および（ｂ）液体産物の小滴を捕捉 帯内に導入して、それにより低温の液体が液体産物の小滴を凍結させて凍結粒子 を生成させること、の段階を含んで成る。 使用において、サンプルは、構築物ならびにサンプルを含有する対照と平行し て試験ＰＣＲ処置にかけられる。対照が増幅を示す場合は、当該処置は平行する 試験で達成された陽性もしくは陰性の結果に関係なく有効であったという肯定的 な指摘が存在する。 食物を包含するサンプルマトリックスの成分が、ＰＣＲの阻害、ならびに従っ て産物の形成およびシグナルでの生じる減少を引き起こし得る ことがよく知られている。他方、ＰＣＲ反応でのある食物成分の存在はまた、反 対の結果をもたらすことも見出されている。すなわち、蛍光色素検出が採用され る場合のシグナルの増強である。非均質系検出系において、こうした増強は言及 されなくてもよく、また、分析で困難を引き起こさないとみられる。しかしなが ら、均質系検出系では、適正な対照の非存在下でのシグナル増強は偽陽性の結果 につながり得るとみられる。本明細書に記述されるような対照の使用はこうした 偽陽性の結果を排除するとみられる。さらに、対照での応答のレベルを較正する ことにより、多くの食物由来のマトリックスで見出されるような外来物質により 引き起こされる試験での反応のいかなる抑制もしくは強化についても評価および 補償することが可能である。 繰り返すと、本発明は、対照反応体、その作成方法およびＰＣＲでのその使用 方法に関する。当該対照反応体を試験と平行して使用することにより、処理サイ クルが機能的に作用していたという保証が提供される。好ましくは錠剤の形態の 反応体は、１）下位配列に対し相補的な単一プライマーと一緒に相互の相補物で ある末端の下位配列をもつ特徴づけるＤＮＡ配列の合成構築物、２）指示薬（Ｐ ＣＲ循環後に添加されうるインターカレーション色素）、および３）より好まし くは、噴霧凍結すなわち「スノーガン」法を使用する米国特許第5,475,984号で 改善されるような米国特許第5,307,640号（フォージー(Fawzy)ら）の教示に全体 として従って処理された安定化剤(ボリン(Bollin，Jr.)ら、米国特許第4,762,85 7号に記述されるようなトレハロース）、を含んで成り、双方の明細書は本明細 書に引用により組み込まれる。 使用（単独用量の方法論による）においては、溶液中の被検体は溶解 にかけられ、そして、結果として生じる溶液は、一方は試験材料を含みかつ他方 は対照材料を含む２個のバイアルに導入される。 対照バイアルでの陽性の結果は、当該処理が作用したことおよび試験バイアル 中の試験結果が標的ＤＮＡを検出することにおいて信用を与えられうることを意 味する。可能性のある結果の組み合わせおよびこれらの結果から生ずる結論が上 に論考されている。 対照反応を較正することにより、また、被検体が対照バイアルならびに試験バ イアルに提供されるため、補正が、最初のサンプルからの外来物質による蛍光の 増強もしくは抑制の影響についてなされ得る。試験結果に活動性の影響を有する 外来物質の存在は、食品に関わる応用を包含するＰＣＲに基づく試験の実際の応 用で極めて普遍的である。 対照ウェルでの構築物および単一プライマーの使用は、無効な対照結果を生じ うる被検体中の標的細菌のいかなるＤＮＡの増幅なしに、対照ウェル中にその被 検体を導入することを可能にする。同時に、試験ウェルでの被検体の存在は、平 行する試験ウェルで見られる結果に対する補正を可能にする指標反応を生じる。 実施例１ 実施例１は、食物サンプル中の病原体の存在を決定することにおける本発明の 実際的な使用を立証するために行われた。 １．25gの食物（地域のスーパーマーケットで購入された牛挽肉）を、225mLの乳 糖培地を含有するフラスコ中に入れた。当該混合物をホモジェナイズ（ストマッ カー(stomacher)で）し、そしてその後、37℃で24時間インキュベーションした （プロトコールでは±２時間は許容される）。 ２．段階１の24時間非特異的強化の後、一片のポレックス［Porex］ （商標）高密度ポリプロピレン（ＨＤＰ）（ポレックス テクノロジーズ(Porex Technologies)、ジョージア州フェアバーン、カタログ番号6949）をフラスコ中 に入れた。このフラスコをその後、渦を起こさせ(swirled)、ポレックス［Porex ］（商標）ＨＤＰの小片を非選択的強化培地で完全に湿らせた。 ３．フラスコをその後37℃で20分間インキュベーションした。 ４．インキュベーション後、ポレックス［Porex］（商標）ＨＤＰをそこで培地 から取り出し、そして10mLの洗浄緩衝液（10mMトリス-塩酸、28mM塩化カリウム および３mM塩化マグネシウム、ｐＨ＝8.3）を含有した15mLチューブに入れた。 このチューブに蓋をし、そして25回倒立させてポレックス［Porex］（商標）Ｈ ＤＰを完全に洗浄した。 ５．ポレックス［Porex］（商標）ＨＤＰを15mLチューブから取り出し、そして 、過剰の洗浄緩衝液を、ポレックス［Porex］（商標）ＨＤＰの小片をワットマ ン(Whatman)No.１濾紙上に５秒間置くことにより除去した。 ６．ポレックス［Porex］（商標）ＨＤＰを２mLのねじ蓋チューブに入れた。溶 解試薬の200μLのアリコート（１mLあたり0.25mgのプロテイナーゼＫを含有する 、10mMトリス-塩酸、28mM塩化カリウムおよび３mM塩化マグネシウム、ｐＨ＝8.3 ）をチューブに添加した。このチューブに蓋をし、そして55℃の水浴中に20分間 置いた。（溶解試薬が錠剤に取り込まれ得る。） ７．55℃のインキュベーションの後、チューブを95℃に10分間置いた。 ８．ポレックス［Porex］（商標）ＨＤＰを処理することから得られたライセー トの50μLを使用して、0.2mLの反応チューブ中のサルモネラ 属(Salmonella)特異的なＰＣＲ試薬錠剤（下に詳細に記述される）を水和した。 ９．同じライセートの第二の50μLのアリコートを使用して、第二の0.2mLの反応 チューブ中で対照ＰＣＲ錠剤（下に詳細に記述される）を水和した。 １０．双方の反応チューブを、以下の条件下で熱的に循環させた。 ａ．94℃、２分 １サイクル ｂ．94℃、15秒 65℃、1.5分 72℃、0.5分 シークェンスｂ．を全部で35サイクル反復した。 ｃ．72℃、７分 １サイクル ｄ．４℃そして使用されるまでこの温度で保持。 １１．サンプルの熱的循環の後、ＤＮＡ増幅産物を４％ポリアクリルアミドゲル （29：１）上でのゲル電気泳動により分離した。この電気泳動は、100ボルトの 定電圧で30分間、0.5×ＴＢＥ緩衝液（45mMトリス塩基、45mMホウ酸および１mM ＥＤＴＡ）を使用して行った。 １２．分離されたＤＮＡバンド（繰り返された試験を示す図１２ａおよび１２ｂ を参照）を、臭化エチジウムの溶液(0.1μg/mL)中で15分間染色し、そしてその 後、このゲルをＵＶ透光器(UV transilluminator)（フォトダイン インク(Foto dyne，Inc.)、ウィスコンシン州ニューベルリン、から入手可能なフォト(FOTO) ＵＶ 300のような）上に置くことにより可視化した。 １３．そのサンプルがサルモネラ属(Salmonella)を含有したかどうか の決定を、以下の基準に基づいてなした。すなわち、 ａ．サンプルおよび対照の双方のレーンの750bpに対応するバンド−−そのサン プルがサルモネラ属(Salmonella)について陽性であったことを示す。 ｂ．サンプルレーンにバンドがなく、かつ、対照レーンに750bpに対応する１個 のバンド−−そのサンプルがサルモネラ属(Salmonella)について陰性であったこ とを示す。 ｃ．サンプルレーンに１個のバンド、かつ対照レーンにバンドがない−−この場 合は、ＰＣＲ反応は仮定されるマトリックスの影響により損なわれ、その結果、 対照反応を表す典型的な10⁴CFU/mLの感度が達せられなかった。試験レーンでの 陽性の結果は、そのサンプルが10⁴CFU/mLの感度限界より高濃度でサルモネラ属( Salmonella)を含有したことを示す。結果は、そのサンプルがサルモネラ属(Salm onella)について陽性であったことを示した。 ｄ．サンプルレーンもしくは対照レーンのいずれにも750bpに対応するバンドが ない−−結果は報告され得ない。化学的もしくは機械的（熱的を包含する）な異 常のいずれかにより、ＰＣＲ過程が損なわれ、その結果、10⁴CFU/mLを含有する サンプルが検出されるように十分に増幅されていなかったとみられた。 図１２ａおよびｂに示されるバンドの分析は、750bpのバンドがサンプルレー ンおよび対照レーンに存在したことを示した。上の基準１３ａ．に従い、当該プ ロトコールの機能性が立証され、そして、当該サンプルはこの生物体について陽 性であった。 上の本実施例の段階２〜４で、インキュベーションされた生物体がポ レックス［Porex］（商標）ＨＤＰを使用して分離されたことに注目せよ。発明 者らは、10倍希釈および再生が使用される好ましいプロトコールの方法を好む（ 上のプロトコールの段階２〜３を参照）。 実施例２ この実施例は、食品でのサンプル調製の好ましい希釈／再生方法の使用を示す 。 １．黒コショウおよびフローズンヨーグルトのサンプルを、標準的方法（ＢＡＭ −ＦＤＡ）により非選択的に強化した。 ２．インキュベーション（上の実施例１の段階３）の後、非選択的強化の一部を 、１mLあたり細胞10⁴個の濃度のネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)で攻 撃した(spiked)。 ３．攻撃されたおよび攻撃されない非選択的強化の1mLの部分を、９mLの脳-心注 入培地（ＢＨＩ）を含有する別個の15mLのねじ蓋チューブに添加した。 ４．チューブを37℃で３時間インキュベーションした。 ５．５μLの量を各チューブから取り出し、そして２mLのねじ蓋チューブ中の195 μLの溶解試薬（１mLあたり0.25mgのプロテイナーゼＫおよび0.1％のトリトン(T riton) Ｘ-100を含有する、10mMトリス-塩酸、28mM塩化カリウムおよび３mM塩 化マグネシウム、ｐＨ＝8.3）に添加した。このチューブを、37℃で20分間、そ の後95℃で10分間インキュベーションした。 ６．上で調製された各ライセートサンプルの50μLの部分を使用して、ＰＣＲサ ンプル錠剤およびＰＣＲ対照錠剤を水和した。 その後に続く処置は実施例１の段階１０〜１３でのようであった。 バンドの分析は、実施例１の図１２ａおよびｂでのように、同じ750bpのバン ドを示した。 対照ＰＣＲ錠剤の調製 １．トレハロース二水和物およびカーボワックスを750mLのオートクレーブされ た脱イオン水に溶解した。 ２．デオキシヌクレオチド類、プライマー、対照ＤＮＡ、およびＴａｑ（商標） ポリメラーゼをこの溶液に添加した。 ３．当該溶液を、オートクレーブされた脱イオン水で1357gの最終重量に調節し た。 ４．当該溶液を５μmカートリッジで濾過した。 ５．当該溶液をその後、米国特許第5,475,984号で改善されたような米国特許第5 ,307,640号（フォージー(Fawzy)ら）の教示すなわち「スノーガン法」と称され る方法に全般的に従って処理した。当該溶液を、125mL/分の試薬噴霧速度で液体 窒素チャンバー内に噴霧した。 ６．凍結された混和物を、重力により、チャンバーの端でトレイに収集した。 ７．凍結された混和物をその後、凍結乾燥機（ドイツのフィン アクア(Finn Aq ua)から入手可能なＧＴ６のような）で凍結乾燥した。凍結乾 燥プログラムは、−40℃の生成物温度および50ミクロンのチャンバー圧での50時 間の一次乾燥から成った。二次乾燥は25℃で20時間行った。 ８．凍結乾燥された混和物をその後、30メッシュの篩を通して大きさで分類した 。 ９．大きさで分類された混和物をその後、3/32インチの工作機械を使用して錠剤 化した。 サンプルＰＣＲ錠剤の調製 １．トレハロース二水和物およびカーボワックスを750mLのオートクレーブされ た脱イオン水に溶解した。 ２．デオキシヌクレオチド類、プライマーおよびＴａｑ（商標）ポリメラーゼを この溶液に添加した。 ３．当該溶液を、オートクレーブされた脱イオン水で1357gの最終重量に調節し た。 ４．当該溶液を５μmカートリッジで濾過した。 ５．当該溶液をその後、上のような「スノーガン」法に全般的に従って処理した 。当該溶液を、125mL/分の試薬噴霧速度で液体窒素チャンバー内に噴霧した。 ６．凍結された混和物を、重力により、チャンバーの端でトレイに収集 した。 ７．凍結された混和物をその後、凍結乾燥機（ドイツのフィン アクア(Finn-Aq ua)から入手可能なＧＴ６のような）で凍結乾燥した。凍結乾燥プログラムは、 −40℃の生成物温度および50ミクロンのチャンバー圧での50時間の一次乾燥から 成った。二次乾燥は25℃で20時間行った。 ８．凍結乾燥された混和物をその後、30メッシュの篩を通して大きさで分類した 。 ９．大きさで分類された混和物をその後、3/32インチの工作機械を使用して錠剤 化した。 以下は、上述の試験処置について、対照プラスミドを構築することおよびその 利用性を確認することにおいて従われた処置を記述する実施例である。 実施例３ 実施例３を、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)のＰＣＲ産物をクロー ニングすることにより図２に示されるように対照ＤＮＡプラスミドを構築するた めに行った。特別の目的は、0.7kbのＰＣＲ産物をｐＵＣ１８のSmal切断部位に クローニングし、その後、761（761ｃ）プライマー配列の相補物をクローニング された断片の５’末端（35端）近くに挿入することであった（761および35の双 方のプライマーは、注文に応じてリサーチ ジェネティクス(Research Genetics )、アラバマ州ハンツビル、により調製された）。こうして、最終産物を単一の7 61プライマーで増幅し得、ほぼ完全長の産物を発生させた。段階１および２は図 ３に示され、そして結果は図４に示される。 処置の段階は以下のようであった。すなわち、 ｉ）ｐＵＣ１８をSmalで直鎖状にした ii）ＰＣＲ産物のＤＮＡをゲル精製した iii）上および形質転換されたＤＨ５αを連結した iv）クローンをHpaIで切断した ｖ）761ｃを761とアニーリングした vi）ivおよびｖを連結した vii）材料を形質転換し、761プライマー単独で増幅されたクローンを選択した。 ｐＵＣ１８を、５μLのｐＵＣ１８ ＤＮＡ（ライフ テクノロジーズ イン ク(Life Technologies Inc.)）、２μLのリアクト(React)４緩衝液（ライフ テ クノロジーズ インク(Life Technologies Inc.)）、11μLの水および２μLのSm aI（ライフ テクノロジーズ インコーポレイテッド(Life Technologies Incor porated)）を使用して調製した。20μLの混合物を37℃で２時間加熱した。その 後、４μLの50mMＥＤＴＡを添加した。当該処置を反復し、そして２個の切断を プールした。結果として生じた生成物の４μLを以下のようにゲル分析した。 ｉ）アクリルアミドゲル上でレーンあたり20μLを泳動した（図３を参照） ii）透光器上でバンドを切り出した iii）1.5mLチューブ中でピペットの先端で小片を細切れにした iv）ＴＥ緩衝液中、４℃で一夜インキュベーションした（およそ20時間） ｖ）0.65μmのウルトラフリー(Ultrafree)カートリッジ（ミリポア(Millipore) ）を通して高速回転させた(spun) vi）エタノール沈殿した vii）アクリルアミドゲル上で分析した ３個のライゲーションを行った。すなわち ＃１．ｐＵＣ１８ SmaI＋精製されないＰＣＲ産物 ＃２．ｐＵＣ１８ SmaI＋精製された産物 ＃３．ｐＵＣ１８ SmaI これらは下に列挙されるように構成された。 ３個の10μLのアリコートを15℃で４時間インキュベーションし、そ して、形質転換を、大腸菌（E．coli） ＤＨ５αで調製しそして下に列挙され るようなプレート上で分析した。 ７個のコロニーを、形質転換ii）のアンピシリン100μg/mLプレートから拾い上 げ、挿入物についてチェックした。これらは全て白色もしくはかすかな青色のコ ロニーであった。HindIII酵素切断を実施した。７個のコロニーの「ウィザード( Wizard)」ミニプレップを、プロメガ(Promega)の説明書に従って調製し、そして それぞれの５μLをHindIIIで切 断した。結果は、全てのクローンは、見かけ上、挿入物がないことを示す同じ大 きさであったということであった（図５を参照）。従って、追加のスクリーニン グを行った。 36個のコロニーを、プールされかつ再培養されたコロニーの群から拾い上げ、 そして新たなプレートに移した。ループを使用して非常に少量のコロニーを拾い 上げ、そして約500μLの１×ＰＣＲ緩衝液に懸濁した。各懸濁液を95℃で10分間 加熱し、そしてクローンのそれぞれを、ＰＣＲを使用してサンプル錠剤とともに 増幅した。結果は図６ａ、ｂおよびｃに示される。クローン12および18を、これ らが挿入物を有すると思われたため、さらなる分析のために選択した（そしてＴ １２およびＴ１８と命名した）。分析はEcoRI/HindIII酵素切断により行った。 ミニプレップのそれぞれ５μＬ（ウィザード(Wizard) ミニプレップ、プロメガ (Prmega)）を、リアクト(React)２緩衝液中でEcoRIおよびHindIIIで切断した。 これらを、マーカーとしてバイオマーカー ロー(Biomarker Low）（バイオベン チャーズ(BioVentures)を使用する１％アガロースゲル上で挿入物についてチェ ックした。電気泳動は100ボルトで約１時間であった。結果については図７を参 照。適正な大きさで分類された挿入物が、予期されたように、581bpのHindIII切 断部位に対応して双方のクローンで見られた。挿入物上の制限酵素切断部位につ いては表Ｉを参照。 実施例４ 実施例４を、Ｔ１２に761プライミング部位をクローニングするために実施し た。その意図は、アニーリングされた761および761ｃ（761の相補物）を挿入物 ＤＮＡの57bpのHpaI切断部位に挿入することであった（表IIを参照）。 以下の段階を連続して実施した。すなわち、 ｉ）Ｔ１２をHpaIで切断する ii）上を脱リン酸化する iii）プライマー761を761ｃとアニーリングする iv）ベクターＴ１２をアニーリングされたプライマーと連結する ｖ）アンピシリン耐性について選択するＤＨ５αを形質転換する vi）761プライマーのみでの増幅によりプライマーの挿入についてスクリーニン グする Ｔ１２およびＴ１８のHpaIでの切断は であった。 これらを37℃で３時間保持した。 Ｔ１２のみの電気泳動である図８は切断が起きたことを示す。Ｔ１８もまたゲ ル分離し（しかしこの図で示されない）、そしてこの切断はより明瞭に見え、ま た、0.05μg/μLのそれぞれ25μLのプライマー761をその相補物と混合すること 、その後、パーキン エルマー サイクラー(Perkin Elmer cycler)で94℃で２ 分間加熱し次いで30分間にわたる3 7℃への傾斜(ramp)、その後４℃に８分、により調製されたプライマーとの以下 のようなライゲーションで使用した。 これらを15℃で４時間保持した。 各ライゲーションの３μLを使用して、アンピシリン耐性およびβ−ガラクト シダーゼ活性の喪失について選択するＤＨ５αを形質転換した。10個のコロニー を試験ライゲーションから拾い上げ、そしてプレートの残余を10個の混合物にプ ールした。全てのサンプルからのライセートを761プライマーのみを使用して増 幅した。Ｔ１２ベクター、ならびに陰性対照および陽性対照もまた増幅した。Ｔ １２ならびに陰性対照および陽性対照のＤＮＡの２種のプライマー錠剤での増幅 を包含した。結果は図９ａ〜ｅに示される。図９ａおよび９ｂのＳ１ないしＳ１ ０は単独コロニーの単離物である。図９ｂ、ｃおよびｄで、ｍ１ないしｍ１２は 約20コロニーの混合物である。図９ｅは対照を示す。Ｓ８およびＳ１０は、混合 物の全てがそうであったように、単一の761プライマー増幅について陽性であっ た。 実施例５ 実施例５を、対照ＤＮＡの性能を試験するため、対照としてのその利用性を確 認しそして対照錠剤への後の組み込みへのその適当性を判断するために行った。 この試験は、以下の実験パラメータで、図１０に示されたプロトコールに従って 行った。 実験：陽性対照プラスミド試験 目的：われわれが陽性対照錠剤で最後には使用することができる、新たに調製さ れた陽性対照ＤＮＡの性能を試験すること 材料：ミニプレップ精製されたＳ−８ Ｓ−８およびＳ−１０のライセート ｐＵＣ１８（内部参照Ｉ） Ｍ１のライセート、Ｓ−８ミニプレップ前に調製 プライマー：761試験（内部参照II） 761対照（93年8月10日 400倍希釈＝−２μM） 35対照 93年4月28日（10μM、１μMに10倍希釈） ｄＮＴＰ：93年6月15日 ５mM 水：等分され(aliquoted)かつオートクレーブされたＨＰＬＣ 10×：（内部参照IIａ） 結果は図１１に示される。この図のレーンは下に列挙されるようであった。 １および２ ミニプレップ精製されたＳ−８ ３ 分子量マーカー ４および５ Ｓ−８ライセート ６および７ Ｓ−１０ライセート ８ Ｍ１ライセート ９ ｐＵＣ１８ １０ ブランク 対照ＤＮＡが錠剤化に適しかつその候補であったことが結論された。 実施例６ 試験を、均質系検出のための錠剤の形態の対照の利用性を立証するために行っ た。２種の食物すなわちココアパウダーおよび全粉乳のホモジェネートを、25g のこれらの食物を225mlの乳糖培地と混合することにより調製した。このホモジ ェネートを、いくつかの場合で、１mLあたりおよそ細胞100個のネズミチフス菌( Salmonella typhimurium)で攻撃した。全てのホモジェネートを、37℃でおよそ2 0時間インキュベーションし、その後、食物のサンプルを、プロテイナーゼＫ、 トリトン Ｘ-100およびＰＣＲ緩衝液の溶液中で細菌を溶解することにより、Ｐ ＣＲのために調製した。次に、ライセートの50μLのアリコートを、上述のよう に調製された試験ＰＣＲ錠剤もしくは対照ＰＣＲ錠剤のいずれかを含有するチュ ーブに入れた。これらを実施例１に記述されたような熱的循環にかけた。循環後 、反応の５μLの部分をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分 析した。 また、同じサンプルを、以下のように均質系検出により分析した。反応の45μ Lに、20マイクロモルのＴＯＴＯ１色素（モレキュラー プローブス インク(Mo lecular Probes，Inc.)、オレゴン州ユージーン、から得られる）５μLを添加し 、その後室温で５分間インキュベーションした。混合物の蛍光測定を、513nmの 励起波長および533nmの測定波長の蛍光計を使用して達成した。蛍光（任意の蛍 光強度単位の）は50の閾値レベルより上であり、そして従って当該試験は乳サン プルについて妥当であった。試験錠剤の増幅が対照の蛍光より有意に大きい358 の蛍光を与えたという事実は陽性の試験結果を示す。これは、見られ得るように 、ゲル電気泳動により示されるＤＮＡ産物の存在により確かめられ、また、正確 な結果である。なぜなら、このサンプルはネズミチフス 菌(Salmoella typhimurium)で攻撃されたからである。 図１３ａ〜ｃはＰＣＲ反応のゲル電気泳動検出の結果を示す。レーン１および ２は陽性の結果を伴う妥当な試験を表す。レーン３および４は陰性の結果を伴う 妥当な試験を表す。対照の蛍光は50の閾値レベルより上であり、そして従って当 該試験は妥当であった。試験錠剤の蛍光は、しかしながら、陰性の試験結果を示 す対照と同等もしくはより大きくはなかった。再び、これは、ゲル上のＤＮＡ産 物の非存在により確かめられ、そして正しい結果であった。なぜならこのサンプ ルはサルモネラ属(salmonella)を含有しなかったからである。最後に、レーン５ および６は無効の試験を表す。対照錠剤は50の閾値の下である５の蛍光を与え、 そして従って試験は無効とみなされる。均質系検出の正確性は、再び、レーン５ および６でのＤＮＡのバンドの非存在により確かめられる。 実施例７ ＰＡＧＥに基づく決定的検出方法の評価 実施例７を、以下に従って、閾値の感度を確立するために行った。 サルモネラ属(Salmonella)の株1256（Ｓ．ウィルヒョウ(S．virchow)）、1261 （Ｓ．ニューポート(S．newport)）、（Ｓ．ハダー(S．hadar)）および1231を、 スーパーマーケットで購入された牛挽肉、ソーセージ、および豚挽肉のサンプル に約104/mLのレベルで攻撃した。これは、サンプルを適当に調製しそして標準的 なＢＡＭの24時間予備強化処置にかけた後に行った。これは、その後に、10倍希 釈および37℃で３時間のＢＨＩで中の最初のフラスコでの戻し、溶解、アリコー トへの分割、１部分はＰＣＲ試験のためおよび１部分はＰＣＲの陽性対照のため の２個へのそれぞれの分割、ならびに３レベルの希釈を有する各試 験が続いた。その後にＰＡＧＥに基づく分析が続いた。アリコートは以下のよう であった。 使用された錠剤は、内部参照IIおよび対照、内部参照VI、５μLサンプルでの 直接プロトコールであった。 この結果は図１４ａ〜ｆに示される。矢印は陽性のバンドを意味する。発明者 らは、これらの生物体についての閾値の感度が約10⁴であることを結論した。 これは、以下、すなわち脱脂乾燥乳、２％乳、牛挽肉、豚挽肉および鶏挽肉に 対する一連の試験により支持された。２ロットの試験試薬を使用し、結果には小 さな差異があるのみであった。試験は10⁴および10⁵で行い、ネズミチフス菌(S． typhimurium)について図１５に示される結果を典型的に確認した。10⁴の閾値は 全てのこれらの食物マトリックスについて十分なようである。 実施例８ 図１６は、地域のスーパーマーケットで購入されたイタリアンソーセ ージのサンプルでの試験実施を示す。上のプロトコール（ＢＡＭによった24時間 予備強化、37℃で３時間の（ＢＨＩ）中の最初のフラスコの1/10の戻し）の後、 サルモネラ属(Salmonella)が、電気泳動ブロットの典型であるバンドにより証明 されるように、店で見出されるような製品に存在したことが見られた。サンプル を、同時に、商業的研究所（ランカスター ラボラトリーズ インク(Lancaster Laboratories，Inc.)、2425 New Holland Pike，Lancaster，PA 17601）により 評価した。標準的ＢＡＭプロトコールにより報告された結果は陽性であった（サ ンプル番号MBN 2266669）。 双方の処置が病原体を示した。双方の予備強化時間は24時間であったが、しか し、本発明の決定的アッセイは３時間の戻し期間を包含して８時間以下かかる。 ＢＡＭプロトコール（選択的強化、プレート培養などを必要とする）は、陰性の 知見のために追加の96時間、およびその後、陽性の知見を確認するのに最小で付 加的な18時間がかかる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年１０月８日 【補正内容】 反応が、器具の不調もしくはサンプルマトリックスの影響による反応の阻害によ り失敗した（かどうかを知ることが重要だからである。）後者は、特に、病原体 もしくは製品の品質に有害な他の生物体の存在を決定するために食物サンプルを 試験することにおいて共通する。例えば、ＰＣＲの強力な阻害物であるココアを 含有するサンプルは、対照を置かないＰＣＲに基づく試験では隠蔽されることが ある病原体を含む場合がよくある。対照の反応体および方法が本発明の主題であ る。 ライト(Wright)ら（J．Pathol.、162、99、(1990)）はポリメラーゼ連鎖反応 （ＰＣＲ）を実行する方法を教示し、また、研究および診断の手段としての当該 方法の利点および限界を比較しかつ対照する。具体的には、ライト(Wright)らは 、ＰＣＲでの偽陽性を排除する方法を論考し、そして、偽陽性を排除するための 対照は、それらが反応のより大きな汚染につながりうるため禁忌を示されること に言及する。ライト(Wright)らは、対照および試験の反応の分離は汚染の問題を 排除する一方法であることを示唆するが、しかしながら、彼らは、産物の均質系 検出を促進する目的のためのこうした分離を示唆もしくは予期しない。 "DNA Polymorphisms Amplified by Arbitrary Primers are Useful as Geneti c Markers"、Nucleic Acid Research、Vol．18、No．22、p．6531-6535のウィリ アムズ(Williams)ら、およびウェルシュ(Welsh)ら、"Fingerprinting Genomes u sing PCR with Arbitrary Primers"、Nucleic Acid Research、Vol．18、No．22 、p．7213-7218の双方は、細菌を包含する多様な供給源からのゲノムＤＮＡから の増幅産物の特徴的なパターンを発生させるＤＮＡ増幅反応での単一の任意のプ ライマーの使用を示す。WO93/11264で、ジェンセン(Jensen)らは、 微生物の幅広いスペクトルの全域での単一の任意のプライマーの使用を教示する 。対照反応は扱われない。 シュルディナー(Shuldiner)らは、PB92-100932 NTISで、逆転写の間に特有の 無作為のヌクレオチド配列で配列を標識する(tagging)ことによりＲＮＡ配列を 検出することを教示する。この特有のヌクレオチド配列は、その後、外因性供給 源からもしくは持ち越し(carry-over)からのような汚染するＤＮＡの結果として 得られる偽陽性の数を低下させる、生じるＤＮＡ配列を選択的に増幅するのに利 用される。この処置は、偽陰性ならびに偽陽性を避けることを許容する本発明の 対照の見地を欠く。 テルセロ(Tercero)ら（EP 586112）は、ＰＣＲ増幅で陽性対照として有用なベ クターを教示する。当該ベクターは、増幅後に（標的により生成される産物）と 大きさの異なるものを生じる処置で使用されるプライマーの配列に本質的に同一 な配列を含有する。 本発明の対照プラスミドの利用性を確認する（ゲル電気泳動パターンである）。 これは内部対照IVである。 図１２ａおよびｂは、本発明の実際を例証する実施例１で得られたゲル電気泳 動パターンである。 図１３ａ〜ｃは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動および通常は制御するのが 困難な食物に基づく系での均質系検出の双方で本発明の対照を使用する陽性（ａ ）、陰性（ｂ）および無効な（ｃ）結果を例証する実施例５のゲル電気泳動パタ ーンおよび蛍光測定を示す。 図１４ａ〜ｆは実施例７での試験実施のＰＡＧＥに基づくブロットである。 図１５は、ネズミチフス菌(S．typhimurium)についての閾値試験およびバック ス（BAX）［商標］システムの確認の結果を示す。 図１６は、本発明の実際を例証する実施例８で得られたゲル電気泳動パターン を示す。 本出願のデータを申請することにより、発明者らは、特許手続きの目的のため の微生物の寄託の国際的承認(International Recognition of the Deposite of Micro-organisms for the Purposes of Patent Procedure)に関するブダペスト 条約の状況下に、以下の生物学的寄託をなしている： 寄託者の同定の照合 国際的な寄託の呼称 寄託日 ｐＵＣ１８（サルモネラ ＡＴＣＣ 97724 1996年９月19 日 属(Salmonella)の配列、 配列番号１をもつ） 本明細書で使用されるような「ＡＴＣＣ」は、12301 Parklawn Drive，Rockvi lle，MD 20852 U.S.A.に所在するアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ ン(American Type Culture Collection)国際供託所を指す。「ＡＴＣＣ番号」は 、ＡＴＣＣへの寄託に際しての培養系に対する受託番号である。 発明者らは、37 C.F.R．1.821-1.825ならびに付録ＡおよびＢ（「ヌクレオチ ドおよび／もしくはアミノ酸配列を含有する出願の開示のための必要条件(Requi rements for pplication Disclosures Containing Nucleotides and/or Amino A cid Sequences)）に従い、また、（「特許出願におけるヌクレオチドおよびアミ ノ酸配列の）標準的（表示の）ための規則(Rules for the Standard（Represent ation of Nucleotide and Amino Acid Sequences in Patent Applications)」な らびに1992年12月のOJ EPOへの補遺No.２で発表されたEPO会長決定への付属書類 ＩおよびII）に従って、１個の配列表を提供した。 請求の範囲 １．ｉ）ａ）逆方向で相互に相補的である末端の下位配列で構築された特徴づけ るＤＮＡ配列の合成構築物の有効な数； ｂ）前記構築物の各鎖の３’末端に対し相補的な単一プライマーの有効な単位数 ； ｃ）場合によっては、有効濃度のインターカレーション色素； ｄ）場合によっては、安定化剤； ｅ）有効量のポリメラーゼ；および ｆ）有効量のデオキシヌクレオチド のアリコートを含んで成る、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための対照試薬 を提供すること； ii）有効な単位数の一対のプライマーであって、その対の一構成物は標的ＤＮＡ の３’末端の一方に対し相補的、そして、その対の他の構成物は標的ＤＮＡの他 方の３’末端に対し相補的で、その対の一構成物は上の段階ｉ（ｂ）の単一プラ イマーと同じである一対のプライマー、ならびに上のｃ〜ｆのアリコートを含ん で成る試験試薬を提供すること； iii）標的生物体を含有すると疑われる天然のマトリックスからの溶解された細 菌を含んで成る、非選択的に強化された試験溶液を提供すること； iv）段階ｉの試薬を単一用量で含む段階iiiの溶液の有効な溶液を提供すること ； ｖ）段階iiの試薬を単一用量で含む段階iiiの溶液の有効な溶液を提供すること ； vi）段階ivおよびｖの溶液を有効な数のＰＣＲサイクルにかけること ； vii）段階viの結果として生じる溶液に追跡色素を添加すること； viii）段階viiの結果として生じる溶液を、マーカー溶液と平行して電気泳動分 離（ＰＡＧＥもしくはアガロースゲルのいずれか）にかけ、次いで、同定する像 を生成させるために、核酸特異的色素で染色するが、場合によって、前記ゲルが 核酸特異的色素で予め染色されない場合には前記核酸特異的色素で予め染色する こと；ならびに ix）段階viiiの結果として生じる像を光学的に分析して、標的生物体の存在もし くは非存在を最終的に同定すること； を含んで成る、複雑な混合物中の特定の生物体の存在の信頼できる検出方法。 ２．構築物の前記有効な数が最低約10である、請求の範囲１の方法。 ３．前記単一プライマーの最終濃度が約0.01マイクロモルから約0.5マイクロモ ルまでである、請求の範囲１の方法。 ４．前記の任意のインターカレーション色素が核酸色素および非対称性シアニン 色素から成る群から選択され、そして、有効濃度が約0.1マイクロモルから約6.0 マイクロモルまでである、請求の範囲１の方法。 ５．前記の任意の安定化剤がトレハロースである、請求の範囲１の方法。 ６．前記合成配列が、相補的末端とともにサルモネラ属(Salmonella)の配列をも つ改変組み換えｐＵＣ１８である、請求の範囲１の方法。 ７．前記対照および試験の試薬が低温の液体によって粒子に凍結され、前記粒子 が錠剤化のための供給原料を提供する、請求の範囲１の方法。 ８．前記標的細菌サンプルが、一片のポレックス［Porex］（商標）高密度ポリ エチレンの存在下のインキュベーションにより段階iiiの非選 択的に強化された試験溶液から回収され、それにより除去および前記小片を処理 することが前記標的細菌サンプルを効果的に処理する、請求の範囲１の方法。 ９．前記標的細菌サンプルが、その10倍希釈により段階iiiの非選択的に強化さ れた試験溶液から回収され、次いで段階iiiの溶液の有効な溶液を提供するため の有効な戻しインキュベーションがされる、請求の範囲１の方法。 １０．前記試験反応体および前記対照反応体が錠剤化される、請求の範囲１の方 法。 １１．スノーガン法が前記対照反応体の凍結粒子を生成させるのに使用され、前 記粒子が錠剤化のための供給原料を提供する、請求の範囲７の方法。 １２．Ａ）ｉ）標的ＤＮＡ配列のための単一プライマーの有効なコピー数を含ん で成る有効量の対照反応体、逆方向で相互に対し相補的である末端群をもつ同定 配列の構築物を含んで成る有効なコピー数の前記標的ＤＮＡ配列；ii）場合によ っては、ＰＣＲ増幅に悪影響を及ぼさない適合性インターカレーション色素の有 効量；iii）有効量のポリメラーゼ；iv）有効量のヌクレオチド；およびｖ）場 合によっては、有効量の安定化剤、の混合物を対照ウェルに導入すること； Ｂ）ｉ）標的配列のための一対のプライマーの有効量を含んで成る有効量の試験 反応体であって、プライマーの対の一方のプライマーは上の段階Ａ（ｉ）の単一 プライマーと同じである反応体；ii）ＰＣＲ増幅に悪影響を及ぼさないインター カレーション色素の有効量；iii）有効量のポリメラーゼ；iv）有効量のデオキ シヌクレオチド；およびｖ）場 合によっては、有効量の安定化剤、の混合物を試験ウェルに導入すること； Ｃ）試験ウェルおよび対照ウェルの双方に、前記ポリメラーゼと適合する緩衝液 であって、標的細菌ならびに有機および／もしくは無機の外来物質をおそらく含 有する供給源からのサンプルが添加された前記緩衝液、前記添加段階の前に溶解 段階に場合によってはさらされる被検体であって、希釈および再生の処置により 場合によっては調製される被検体ライセート、を包含する液体担体を含んで成る 前記被検体を単一用量で添加すること； Ｄ）場合によっては、前記ウェルのそれぞれの内容物を混合すること； Ｅ）段階Ｃ）で溶解が前記導入前になされなかった場合には双方のウェルを溶解 温度にさらすことにより被検体の細菌細胞を溶解すること； Ｆ）各ウェルの溶解された内容物を有効なＰＣＲ温度に加熱し、そして選択され たサイクル数を循環させて、検出に十分な多数のＤＮＡコピーを提供すること； Ｇ）段階Ｆ）の後、各ウェルの色素に蛍光を発生させること； Ｈ）前記ウェルのそれぞれから放出される光を測定すること；および Ｉ）十分な測定可能な光の放出が双方のウェルで観察される場合に標的細菌を存 在として記録すること、もしくは前記試験ウェルに十分な測定可能な放出が存在 せずかつ前記対照ウェルに十分な放出が存在する場合に標的細菌を非存在として 記録すること、または前記試験ウェルおよび前記対照ウェルからの十分な放出が 存在しない場合に不完全な試験を記録すること、 を含んで成る、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための対照反応体を 使用する標的細菌の試験方法であって、前記の測定可能な光の放出の十分なこと は、対照反応体からの光の放出の予備較正ならびに段階Ｈ）後の対照ウェルおよ び試験ウェルからの光の放出のその較正との比較により決定され、試験ウェルで の予備較正値からの光の放出の逸脱は、前記試験ウェルで観察された値が前記較 正値の上であるかもしくは下であるかに依存して、加えるべきもしくは減ずべき 外来物質の影響に起因するものとされ、前記影響の排除を可能にする方法。 １３．前記対照反応体および前記試験反応体が錠剤化される、請求の範囲１２の 方法。 １４．前記インターカレーション色素が、10％エタノール/水溶液中で１×10⁷と 本質的に同等もしくはより小さいＤＮＡ分配係数を有する、請求の範囲１２の方 法。 １５．前記標的細菌が、前記細菌のポレックス［Porex］（商標）とのインキュ ベーションにより非選択的強化プロトコールから回収された、請求の範囲１２の 方法。 １６．Ａ）ｉ）標的ＤＮＡ配列のための単一プライマーの有効量を含んで成る、 有効量の対照反応体；ii）反対の鎖上にある末端群をもつ同定配列の構築物を含 んで成る、前記標的ＤＮＡ配列の有効なコピー数；iii）有効量のポリメラーゼ ；iv）有効量のヌクレオチド；およびｖ）場合によっては、効量の安定化剤、を 対照ウェルに添加すること； Ｂ）ｉ）標的ＤＮＡに特異的な一対のプライマーの有効量を含んで成る、有効量 の試験反応体であって、プライマーの対の一方のプライマーは上の段階Ａ（ｉ） の単一プライマーと同じである反応体；ii）有効量のポリメラーゼ；iii）有効 量のヌクレオチド；およびiv）場合によって は、有効量の安定化剤、を試験ウェルに添加すること； Ｃ）試験ウェルおよび対照ウェルの双方に、前記ポリメラーゼに適合する緩衝液 であって、有機および／もしくは無機の外来物質をおそらく含有する供給源由来 の疑わしい標的細菌のサンプルが添加された前記緩衝液、前記導入前に溶解段階 に場合によってはさらされる被検体、を包含する液体担体を含んで成る前記被検 体を添加すること； Ｄ）場合によっては各ウェルの内容物を混合すること； Ｅ）段階Ｃ）で任意の溶解が前記導入前になされなかった場合には双方のウェル を溶解温度にさらすことにより試験ウェルの細菌性の内容物を溶解すること； Ｆ）双方のウェルの溶解された内容物を有効なＰＣＲ温度に加熱しそして選択さ れたサイクル数を循環させて検出に十分な多数のＤＮＡ複製物を提供すること； Ｇ）双方のウェルに、有効量のインターカレーション色素を添加すること； Ｈ）段階Ｇ）の後、各ウェルの色素に蛍光を発生させること； Ｉ）前記ウェルのそれぞれから放出されるいかなる光も測定すること；および Ｊ）十分な測定可能な放出が双方のウェルで観察される場合に標的細菌を存在と して同定すること、もしくは前記試験ウェルに十分な測定可能な放出が存在せず かつ前記対照ウェルに十分な放出が存在する場合に標的細菌を非存在として同定 すること、または前記試験ウェルおよび前記対照ウェルからの十分な放出が存在 しない場合に試験を不完全として同定すること； を含んで成る、対照反応体を使用する標的細菌の試験方法であって、前記の十分 であることは、対照反応体からの放出の予備較正ならびに段階Ｈ）後の対照ウェ ルおよび試験ウェルからの放出のその較正との比較により決定され、試験ウェル での予備較正値からの放出の逸脱は、前記試験ウェルで観察された値が前記較正 値の上であるかもしくは下であるかに依存して、加えるべきもしくは減ずべき外 来物質の影響に起因するものとされ、前記影響を排除する方法。 １７．疑わしい標的細菌の前記混ぜられたサンプルが、一片のポレックス［Pore x］（商標）高密度ポリエチレンの存在下でのインキュベーションにより非選択 的強化過程から回収され、それにより除去および前記小片を処理することが前記 標的細菌サンプルを効果的に処理する、請求の範囲１６の方法。 １８．疑わしい標的細菌の前記混ぜられたサンプルが、その後に有効な戻しイン キュベーションが続くその10倍希釈により非選択的強化過程から回収されて有効 な被検体を提供する、請求の範囲１６の方法。 １９．前記反応体が低温の液体によって粒子に凍結され、前記粒子が錠剤化のた めの供給原料を提供する、請求の範囲１６の方法。 ２０．前記試験反応体および前記対照反応体が錠剤化される、請求の範囲１９の 方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 キング，ロバート・アレン アメリカ合衆国デラウエア州19707−9756 ホツケシン・クエイルリツジ・バーナード ブールバード46 (72)発明者 コパトシス，アレクサンダー・デメトリオ ス アメリカ合衆国デラウエア州19810−2733 ウイルミントン・ポールウインロード2314 (72)発明者 タイス，ジヨージ，ジユニア アメリカ合衆国ニユージヤージイ州08069 −1952ペンズグローブ・チヤーチストリー ト57 (72)発明者 アモレス，ダグラス・アラン アメリカ合衆国デラウエア州19707−9616 ホツケシン・オーバーンミルロード777 (72)発明者 ジヤクソン，レイモンド・エドウイン アメリカ合衆国デラウエア州19713ニユー アーク・サウススカイウオードドライブ93 (72)発明者 エクレツト，リサ・デイマージオ アメリカ合衆国ニユージヤージイ州08070 ペンズビル・ジエフアーソンロード15 (72)発明者 ザネコスキ，ヘイデイ・ガートロード アメリカ合衆国ペンシルベニア州17509ク リステイアナ・アツパーバリーロード125

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ｉ）ａ）逆方向で相互に相補的である末端の下位配列で構築された特徴づけ るＤＮＡ配列の合成構築物の有効な数； ｂ）前記構築物の各鎖の３’末端に対し相補的な単一プライマーの有効な単位数 ； ｃ）場合によっては、有効濃度のインターカレーション色素； ｄ）場合によっては、安定化剤； ｅ）有効量のポリメラーゼ、および ｆ）有効量のデオキシヌクレオチド のアリコートを含んで成る、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための錠剤化さ れた対照試薬を提供すること； ii）有効な数の761プライマーおよび35プライマー、ならびに上のｃ〜ｆのアリ コートを含んで成る、錠剤化された試験試薬を提供すること； iii）標的生物体を含有すると疑われる天然のマトリックスからの溶解された細 菌を含んで成る、非選択的に強化された試験溶液を提供すること； iv）段階ｉの錠剤を単一用量で含む段階iiiの溶液の有効な溶液を提供すること ； ｖ）段階iiの錠剤を単一用量で含む段階iiiの溶液の有効な溶液を提供すること ； vi）段階ivおよびｖの溶液を有効な数のＰＣＲサイクルにかけること； vii）段階viの結果として生じる溶液に追跡色素を添加すること； viii）段階viiの結果として生じる溶液を、マーカー溶液と平行して電 気泳動分離（ＰＡＧＥもしくはアガロースゲルのいずれか）にかけ、次いで、同 定する像を生成させるために、核酸特異的色素で染色するが、場合によって、前 記ゲルが核酸特異的色素で予め染色されない場合には前記核酸特異的色素で予め 染色すること；ならびに ix）段階viiiの結果として生じる像を光学的に分析して標的生物体の存在もしく は非存在を最終的に同定すること； を含んで成る、複雑な混合物中の特定の生物体の存在の信頼できる検出方法。 ２．構築物の前記有効な数が最低約10である、請求の範囲１の方法。 ３．前記単一プライマーの最終濃度が約0.01マイクロモルから約0.5マイクロモ ルまでである、請求の範囲１の方法。 ４．前記の任意のインターカレーション色素が核酸色素および非対称性シアニン 色素から成る群から選択され、そして、有効濃度が約0.1マイクロモルから約6.0 マイクロモルまでである、請求の範囲１の方法。 ５．前記の任意の安定化剤がトレハロースである、請求の範囲１の方法。 ６．前記合成配列が、相補的末端とともにサルモネラ属(Salmonella)の配列をも つ改変組み換えｐＵＣ１８である、請求の範囲１の方法。 ７．前記の対照および試験の試薬が、低温の液体によって粒子に凍結され、前記 粒子が錠剤化のための供給原料を提供する、請求の範囲１の方法。 ８．前記標的細菌サンプルが、一片のポレックス［Porex］（商標）高密度ポリ エチレンの存在下のインキュベーションにより段階iiiの非選択的に強化された 試験溶液から回収され、それにより除去および前記小片を処理することが前記標 的細菌サンプルを効果的に処理する、請求の 範囲１の方法。 ９．ａ）特徴づけるＤＮＡ配列を同定すること； ｂ）前記の特徴づける配列の構築物であって、前記の特徴づける配列の増幅産物 からクローニングされた前記配列を終結させる、逆方向で相互に相補的である末 端の下位配列により特徴づけられる前記構築物を合成すること； ｃ）有効な数の前記構築物を提供すること； ｄ）前記構築物に対して特有でありかつ前記末端の下位配列のプライミング部位 に対して相補的である、単一のプライミングＤＮＡ配列を同定すること； ｅ）前記単一プライマーの有効な単位数を提供すること； ｆ）場合によっては、有効量のインターカレーション色素を提供すること；およ び ｇ）場合によっては有効量の安定化剤を提供すること； を含んで成る、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための対照反応体の作成方法 。 １０．前記標的細菌サンプルが、その10倍希釈により段階iiiの非選択的に強化 された試験溶液から回収され、次いで段階iiiの溶液の有効な溶液を提供するた めの有効な戻しインキュベーションがされる、請求の範囲１の方法。 １１．前記対照反応体を錠剤にすることをさらに含んで成る、請求の範囲８の方 法。 １２．スノーガン法が前記対照反応体の凍結粒子を生成させるのに使用され、前 記粒子が錠剤化のための供給原料を提供する、請求の範囲９の 方法。 １３．Ａ）ｉ）標的ＤＮＡ配列のための単一プライマーの有効なコピー数を含ん で成る有効量の対照反応体、逆方向で相互に相補的である末端群をもつ同定配列 の構築物を含んで成る有効なコピー数の前記標的ＤＮＡ配列；ii）場合によって は、ＰＣＲ増幅に悪影響を及ぼさない適合性インターカレーション色素の有効量 ；iii）有効量のポリメラーゼ；iv）有効量のヌクレオチド；およびｖ）場合に よっては、有効量の安定化剤、の混合物を対照ウェルに導入すること； Ｂ）ｉ）標的配列のためのプライマーの有効量を含んで成る、有効量の試験反応 体；ii）ＰＣＲ増幅に悪影響を及ぼさない、インターカレーション色素の有効量 ；iii）有効量のポリメラーゼ；iv）有効量のデオキシヌクレオチド；およびｖ ）場合によっては、有効量の安定化剤、の混合物を試験ウェルに導入すること； Ｃ）試験ウェルおよび対照ウェルの双方に、前記ポリメラーゼと適合する緩衝液 であって、標的細菌ならびに有機および／もしくは無機の外来物質をおそらく含 有する供給源からのサンプルが添加された前記緩衝液、前記添加段階の前に溶解 段階に場合によってはさらされる被検体であって、希釈および再生の処置により 場合によっては調製される被検体ライセート、を包含する液体担体を含んで成る 前記被検体を単一容量で添加すること； Ｄ）場合によっては、前記ウェルのそれぞれの内容物を混合すること； Ｅ）段階Ｃ）で溶解が前記導入前になされなかった場合には双方のウェルを溶解 温度にさらすことにより被検体の細菌細胞を溶解すること； Ｆ）各ウェルの溶解された内容物を有効なＰＣＲ温度に加熱し、そして 選択されたサイクル数を循環させて、検出に十分な多数のＤＮＡコピーを提供す ること； Ｇ）段階Ｆ）の後、各ウェルの色素に蛍光を発生させること； Ｈ）前記ウェルのそれぞれから放出される光を測定すること；および Ｉ）十分な測定可能な光の放出が双方のウェルで観察される場合に標的細菌を存 在として記録すること、もしくは前記試験ウェルに十分な測定可能な放出が存在 せずかつ前記対照ウェルに十分な放出が存在する場合に標的細菌を非存在として 記録すること、または前記試験ウェルからの十分な放出が存在しない場合に不完 全な試験を記録すること； を含んで成る、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための対照反応体を使用する 標的細菌の試験方法であって、前記の測定可能な光の放出の十分なことは、対照 反応体からの光の放出の予備較正ならびに段階Ｈ）後の対照ウェルおよび試験ウ ェルからの光の放出のその較正との比較により決定され、試験ウェルでの予備較 正値からの光の放出の逸脱は、前記試験ウェルで観察された値が前記較正値の上 であるかもしくは下であるかに依存して、加えるべきもしくは減ずべき外来物質 の影響に起因するものとされ、前記影響の排除を可能にする方法。 １４．前記対照反応体および前記試験反応体が錠剤化される、請求の範囲１３の 方法。 １５．前記インターカレーション色素が、10％エタノール/水溶液中で１×10⁷と 本質的に同等もしくはより小さいＤＮＡ分配係数を有する、請求の範囲１３の方 法。 １６．前記標的細菌が、前記細菌のポレックス［Porex］（商標）とのインキュ ベーションにより非選択的強化プロトコールから回収された、 請求の範囲１３の方法。 １７．Ａ）ｉ）標的ＤＮＡ配列のための単一プライマーの有効量を含んで成る、 有効量の対照反応体；ii）反対の鎖上にある末端群をもつ同定配列の構築物を含 んで成る、前記標的ＤＮＡ配列の有効なコピー数；iii）有効量のポリメラーゼ ；iv）有効量のヌクレオチド；およびｖ）場合によっては、有効量の安定化剤、 を対照ウェルに添加すること； Ｂ）ｉ）標的ＤＮＡに特異的なプライマーの有効量を含んで成る、有効量の試験 反応体；ii）有効量のポリメラーゼ；iii）有効量のヌクレオチド；およびiv） 場合によっては、有効量の安定化剤、を試験ウェルに添加すること； Ｃ）試験ウェルおよび対照ウェルの双方に、前記ポリメラーゼに適合する緩衝液 であって、有機および／もしくは無機の外来物質をおそらく含有する供給源由来 の疑わしい標的細菌のサンプルが添加された前記緩衝液、前記導入前に溶解段階 に場合によってはさらされる被検体、を包含する液体担体を含んで成る前記被検 体を添加すること； Ｄ）場合によっては各ウェルの内容物を混合すること； Ｅ）段階Ｃ）で任意の溶解が前記導入前になされなかった場合には双方のウェル を溶解温度にさらすことにより試験ウェルの細菌性の内容物を溶解すること； Ｆ）双方のウェルの溶解された内容物を有効なＰＣＲ温度に加熱しそして選択さ れたサイクル数を循環させて検出に十分な多数のＤＮＡ複製物を提供すること； Ｇ）双方のウェルに、有効量のインターカレーション色素を添加すること； Ｈ）段階Ｇ）の後、各ウェルの色素に蛍光を発生させること； Ｉ）前記ウェルのそれぞれから放出されるいかなる光も測定すること；および Ｊ）十分な測定可能な放出が双方のウェルで観察される場合に標的細菌を存在と して同定すること、もしくは前記試験ウェルに十分な測定可能な放出が存在せず かつ前記対照ウェルに十分な放出が存在する場合に標的細菌を非存在として同定 すること、または前記試験ウェルからの十分な放出が存在しない場合に試験を不 完全として同定すること、 を含んで成る、対照反応体を使用する標的細菌の試験方法であって、前記の十分 であることは、対照反応体からの放出の予備較正ならびに段階Ｈ）後の対照ウェ ルおよび試験ウェルからの放出のその較正との比較により決定され、試験ウェル での予備較正値からの放出の逸脱は、前記試験ウェルで観察された値が前記較正 値の上であるかもしくは下であるかに依存して、加えるべきもしくは減ずべき外 来物質の影響に起因するものとされ、前記影響を排除する方法。 １８．疑わしい標的細菌の前記混ぜられたサンプルが、一片のポレックス［Pore x］（商標）高密度ポリエチレンの存在下でのインキュベーションにより非選択 的強化過程から回収され、それにより除去および前記小片を処理することが前記 標的細菌サンプルを効果的に処理する、請求の範囲１７の方法。 １９．疑わしい標的細菌の前記混ぜられたサンプルが、その後に有効な戻しイン キュベーションが続くその10倍希釈により非選択的強化過程から回収されて有効 な被検体を提供する、請求の範囲１７の方法。 ２０．前記試験反応体および前記対照反応体が錠剤化される、請求の範 囲１７の方法。 ２１．前記反応体が低温の液体によって粒子に凍結され、前記粒子が錠剤化のた めの供給原料を提供する、請求の範囲２０の方法。